La présente invention concerne une composition adjuvante alimentaire destinée à être incorporée dans du sucre ou des produits sucrés contenant des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, permettant de diminuer l'adhérence du biofilm dentaire et l'apparition de caries tout en renforçant la dent et les tissus de soutien dentaires. La présente invention concerne également des produits alimentaires à base de sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci contenant cette composition adjuvante alimentaire ainsi qu'un procédé de fabrication d'un tel produit alimentaire contenant cette composition adjuvante alimentaire tel qu'un chocolat.

La carie est le troisième fléau mondial après le cancer et les maladies cardiovasculaires. Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, 60% à 90% des enfants scolarisés dans les pays industrialisés ont des caries, ainsi qu'une grande majorité des adultes. La carie dentaire est également la maladie bucco-dentaire la plus courante dans plusieurs pays d'Asie et d'Amérique latine.

Par ailleurs, les maladies du parodonte, telles que la gingivite, touchent 80% des adultes européens et 50% des adolescents de 15 ans.

Il existe un lien direct entre consommation de sucre et maladie carieuse.

Pour coloniser les tissus dentaires, les bactéries vont s'organiser en établissant une forte relation d'adhérence sur l'émail des dents mais aussi entre elles. Si l'on ne perturbe pas ce processus notamment par un brossage adapté, il se forme très rapidement et de façon visible un dépôt jaunâtre : la plaque dentaire ou biofilm. Ce biofilm est un ensemble complexe de différentes populations bactériennes englobées dans une matrice de polysaccharides et de glycoprotéines qui diminue l'accès des tampons salivaires aux surfaces dentaires proportionnellement à son développement. Les bactéries de la plaque dentaire fermentent les monosaccharides (ex : fructose, glucose et galactose), les disaccharides (ex : saccharose, maltose et lactose) et les polysaccharides (ex : l'amidon) apportés lors des prises de nourriture. Au cours de ce processus, des acides se forment au

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) plus près des dents provoquant ainsi des baisses répétées du pH qui entraînent une solubilisation des cristaux de l'hydroxyapatite formant l'émail des dents et à terme une déminéralisation des dents. Pour qu'une carie se développe, quatre conditions doivent être réunies : - La présence des bactéries de la plaque sur la surface de la dent [principalement le

Streptococcus mutans (S. mutans)] ;

- Une disponibilité de sucres fermentescibles (surtout le saccharose) ;

- L'hôte plus ou moins fragile (épaisseur de l'émail, malposition des dents etc...) ;

- Une durée suffisante (les produits adhérents sont donc plus cariogènes). Les bactéries de la plaque agissent aussi sur les tissus parodontaux en libérant des produits irritants (urée, ammoniaque...), des enzymes et des toxines qui déclenchent une réaction inflammatoire et immunologique des gencives, provoquant ainsi une gingivite. L'élimination des agents anti-infectieux peut conduire à une surproduction de cytokines qui au lieu d'être protectrices, deviennent destructrices des structures parodontales, et ainsi conduire à la parodontite, c'est-à dire une récession définitive du tissu de soutien, qui de façon extrême peut aboutir au déchaussement et à la perte des dents.

Les sucres sont ainsi le principal facteur alimentaire associé aux caries et plus généralement aux maladies parodontales.

Si le fluor joue un rôle indiscutable dans la prévention des caries, il n'élimine pas pour autant ces pathologies et de nombreuses communautés ne sont pas exposées à des quantités optimales de fluor. Par ailleurs, le dosage du fluor qui permet un effet de renforcement de la dent en transformant l'hydroxyapatite de l'émail en fluoroapatite ne fait pas l'unanimité à cause des risques de pathologies secondaires encourues (fluorose, conséquences neurologiques, etc .).

L'industrie alimentaire propose par ailleurs de nombreux produits dans lesquels le sucre est remplacé par des édulcorants qui sont peu ou pas cariogènes tout en présentant un fort pouvoir sucrant.

Toutefois, les édulcorants utilisés dans l'industrie alimentaire sont le plus souvent des produits de synthèse et bien que leur emploi ait été validé par les autorités

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) réglementaires, ils inquiètent les populations qui préfèrent éviter de tels produits chimiques et leur image cancérigène au profit des produits d'origine naturelle.

Afin de prévenir le développement des maladies parodontales et notamment des caries, l'Organisation Mondiale de la Santé recommande avant tout de diminuer la quantité de sucres libres, ainsi qu'un régime alimentaire riche en aliments, en fruits et en légumes contenant de l'amidon et des fibres, qui semblent être associés à un faible taux de caries, et pauvre en sucres libres et en graisses.

Une autre alternative est apparue dans les années 1970 avec l'emploi du xylitol pour la première fois dans une application dentaire (étude de Turku). Le xylitol est un alcool de sucre naturel à cinq carbones isolé des copeaux d'hêtre par le chimiste Fischer à la fin du 19 ^eme siècle. Celui-ci présente des propriétés intéressantes :

II inhibe la croissance des bactéries responsables de la plaque dentaire qui sont incapables de le métaboliser et donc ne produisent pas d'acides cariogènes,

Particulièrement sous forme de gomme, il stimule la sécrétion de salive et donc favorise ce système naturel de défense contre la carie (effet tampon augmentée, production d'amylase et de peroxydase...). Il est moins calorique que le saccharose à pouvoir sucrant égal.

Bien que son efficacité ne soit plus à prouver, l'utilisation du xylitol est toujours matière à débat en terme de coût et d'accessibilité à tous. En effet, le coût de sa production commerciale qui est réalisée à partir du bouleau, du maïs et de la canne à sucre par hydrolyse et hydrogénation du xylane, reste élevée. Par ailleurs, les effets de son efficacité anti-cariogène en tant que tel se mesurent sur la régularité des prises sur du long terme. Si des changements dans la flore bactérienne buccale s'observent dans les 24 heures suivants une prise de xylitol, on considère qu'il faut 2 à 3 ans d'une prise régulière pour garantir une protection résiduelle anti-caries durable. Une telle régularité implique une démarche volontaire sur une longue période et la mise en place d'un système de surveillance et d'encadrement dans un programme de prévention qui représentent un coût non négligeable.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) De plus, bien que présentant un pouvoir sucrant identique à celui du saccharose, le xylitol a un goût mentholé marqué qui réduit ses possibilités d'utilisation à des doses fortes, en remplacement du saccharose dans la plupart des produits alimentaires sucrés. Par ailleurs, sa consommation quotidienne ne doit pas dépasser la quantité de 10 g pour un adulte, selon la liste des excipients à effet notoire parue au Journal Officiel du 12 octobre 2007, quantité au delà de laquelle les risques de diarrhée osmotique sont élevés. Une croyance générale relève cependant très souvent ce seuil à 20 à 30 g pour un adulte.

En 2008, l'Autorité européenne de sécurité des aliments a rendu un avis sur la justification scientifique d'une allégation de santé concernant les chewing-gums / pastilles au xylitol et la diminution du risque de carie dentaire. Cette allégation faisait référence aux chewing-gums édulcorés contenant 100% de xylitol et à des pastilles édulcorées avec au moins 56% de xylitol. Il est ressorti que seuls les chewing-gums au xylitol diminuent le risque de carie dentaire chez les enfants, cet effet étant lié à une consommation quotidienne de 2-3 g de chewing-gums édulcorés au moins trois fois par jour après les repas.

L'utilisation actuelle du xylitol est donc associée à son effet anti-cariogène en tant que tel, c'est à dire en tant que substitut des sucres classiques (cariogènes) ne pouvant être métabolisé par les bactéries de la plaque dentaire et donc être à l'origine de la production d'acides responsables de l'initiation du processus carieux.

Son utilisation en tant que substitut des sucres classiques est cependant limitée par la dose d'ingestion maximale quotidienne égale à 10 g alors que la consommation journalière de sucres libres recommandée par l'OMS est de 62 à 94 g, consommation pouvant aller jusqu'à tripler dans les pays « suralimentés » (220 g par adulte par jour au Canada).

Son utilisation en tant que substitut des sucres classiques est également limité par son goût mentholé inadéquat dans de nombreux produits.

Par ailleurs, la consommation de xylitol sous forme de chewing-gums, formulation censée renforcer leur action par l'effet de mastication associé, présente de nombreuses limites :

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) - Elle doit être évitée chez les enfants âgés de moins de trois ans étant donné le risque d'étouffement élevé au sein de ce groupe d'âge,

Elle n'est pas contrôlable facilement en quantité et peut excéder la dose limite conseillée , provoquant des risques de diarrhées osmotiques, - Elle peut être à l'origine de pathologies gastro-oesophagiennes et intestinales,

La démarche doit être volontaire,

La consommation de tels produits n'est pas accessible facilement à tous car coûteuse,

L'accès au xylitol par ce biais se fait en association avec de nombreux additifs, colorants, humectants (E414, E222, E271, etc...).

La présente invention concerne une composition adjuvante alimentaire qui remédie à tous ces inconvénients. Celle-ci contient les éléments qui permettent de diminuer l'apparition de caries ainsi que les éléments qui renforcent la dent et les tissus de soutien dentaires. Cette composition est remarquable sous un premier aspect en ce qu'elle présente une synergie entre un agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, un agent reminéralisant et un agent antiseptique. Cette composition est remarquable sous un second aspect en ce qu'elle est destinée à être incorporée dans des produits sucrés contenant des sucres libres cariogènes ou des dérivés de ceux-ci, permettant ainsi de diminuer l'apparition de caries tout en renforçant la dent et les tissus de soutien dentaires, sans changement dans les habitudes alimentaires.

La présente invention a ainsi pour objet une composition adjuvante alimentaire comprenant : a) un agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, b) un agent minéralisant à base de silicium et/ou à base de calcium, c) un agent antiseptique.

On entend par « composition adjuvante alimentaire », une composition destinée à être ajoutée à un produit alimentaire, c'est-à-dire un produit qui est consommé par des êtres vivants (homme ou animaux) à des fins énergétiques ou nutritionnelles.

Selon la présente invention, on entend par « agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire », un agent qui est capable de réduire le nombre de S. mutons se fixant sur la surface dentaire et/ou la cohésion entre ces différents streptocoques et/ou la cohésion des polysaccharides formant ce biofîlm et qui donc limite l'adhésion et/ou le développement

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) du biofilm ou de la plaque dentaire. Dans l'expression « agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire » est également compris un mélange éventuel de plusieurs agents décrits dans la liste correspondante ci-après, pouvant exercer de façon individuelle la fonction d'« agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ». L'agent anti-adhésion selon la présente invention agit en interférant avec le métabolisme des bactéries qui composent le biofilm, notamment en perturbant leur processus d'adhésion et/ou de colonisation sur les surfaces dentaires ou les tissus parodontaux. Il existe de nombreuses méthodes permettant d'identifier des tels agents réducteurs d'adhérence du biofilm dentaire. Par exemple, des tests permettant d'évaluer l'adhésion de streptocoques mutans sur des supports solides ou des tissus ou bien permettant de constater une diminution de la plaque dentaire sur de l'hydroxyapatite sont décrits dans Bertrand et al. (Les cahiers de l'ADF, N° 14-15, 2 ^ème trimestre 2003), Engels-Deutsch et al. (Les cahiers de l'ADF, N° 16-17, 3 ^ème trimestre 2003) ou WO97/38670. Selon la présente invention, par « agent minéralisant », on entend un agent qui est capable d'apporter aux tissus organiques dentaires, en particulier à la dent, à l'email, à l'os dentaire ou aux tissus parodontaux, de préférence à l'os dentaire, des substances minérales sous une forme assimilables par lesdits tissus. L'agent minéralisant selon l'invention contient au moins du silicium et/ou du calcium, ou bien au moins un de leurs dérivés, notamment organiques, tels que la silice (SiO ₂ ). Dans l'expression « agent minéralisant » est également compris un mélange éventuel de plusieurs agents décrits dans la liste correspondante ci-après, pouvant exercer de façon individuelle la fonction d'« agent minéralisant ».

Selon la présente invention, par « agent antiseptique » on entend toute molécule ou extrait contenant cette molécule qui détruit les agents infectieux tels que bactéries par exemple, ou s'oppose à leur prolifération. En parodontie, de tels agents sont par exemple de façon non limitative la chlorhexidine, l'héxétidine, des phénols, des ammoniums quaternaires, des agents oxydants ou des extraits végétaux. Dans l'expression « agent antiseptique » est également compris un mélange éventuel de plusieurs agents décrits dans la liste correspondante ci-après, pouvant exercer de façon individuelle la fonction d'« agent antiseptique ».

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Dans un mode préféré, la composition selon la présente invention est entièrement constituée d'ingrédients d'origine naturelle.

Dans ce mode préféré, l'agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire de la composition selon la présente invention peut être notamment choisi parmi les polyols, la canneberge, le café, la chicorée, le thé ou le raisin, en particulier le raisin sec ou le vin rouge. Les polyols faisant office d'agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire peuvent être notamment choisis parmi :

- les monosacharrides hydrogénés, tels que le xylitol, le sorbitol, le mannitol ou l'érythritol ;

- les disacharrides hydrogénés, tels que le maltitol, le lactitol, l'isomaltulose hydrogéné (mélange equimolaire de glucopyranosyl-1,6 sorbitol et de glucopyranosyl-1,1, mannitol); l'inuline. De préférence, l'agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire est du xylitol, que l'on peut extraire de l'écorce de bouleau par exemple. Comme précédemment énoncé, plusieurs de ces agents réducteurs d'adhérence du biofilm peuvent être utilisés dans la composition selon la présente invention.

Dans ce mode préféré, l'agent minéralisant à base de silicium de la composition selon la présente invention est avantageusement une substance d'origine végétale contenant de la silice extraite des végétaux parmi la prêle {Equisetum arvense contenant environ 80 % de silice dans sa tige et 60 % de silice dans la plante entière), le lithotame, la luzerne, le soja, l'ortie, le bambou ou la reine des prés. Ces végétaux peuvent entrer directement dans la composition de la présente invention comme agent minéralisant apportant la silice, sous forme d'une poudre séchée de broyats de la totalité du végétal concerné ou d'une partie de celui-ci. Egalement, cette substance d'origine végétale peut être d'abord obtenue sous forme liquide à partir d'un broyât du végétal entier ou d'une partie de celui- ci, puis séchée dans un second temps pour l'obtention d'une poudre. Différentes méthodes d'extraction (hydrodistillation, extraction par solvants, extraction par ultrasons, pressage, décoction, macération, infusion, pressage, cryobroyage, enfleurage), de filtrage (ultrafiltration, nanofiltration) et de purification telle que la chromatographie peuvent être employées pour concentrer en agent minéralisant le broyât sous forme

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) liquide avant de la sécher ou lyophiliser pour l'obtention d'une poudre. De manière préférée, cet agent minéralisant à base de silice est de la prêle. Comme précédemment énoncé, plusieurs de ces agents minéralisants peuvent être utilisés dans la composition selon la présente invention.

Dans ce mode préféré, l'agent antiseptique ou antimicrobien de la composition selon la présente invention est avantageusement une substance extraite des végétaux parmi la sauge (Salvia officinalis), l'échinacée, la myrrhe, la propolis, le ratanhia du Pérou, le calendula, le yam, la camomille, l'aloes véra, l'acérola, la sanguinarine, le citron ou le pamplemousse. Ces végétaux peuvent entrer directement dans la composition de la présente invention comme agent antiseptique sous forme d'une poudre séchée de broyats de la totalité du végétal concerné ou d'une partie de celui-ci. Egalement, cette substance d'origine végétale peut être d'abord obtenue sous forme liquide à partir d'un broyât du végétal entier ou d'une partie de celui-ci, puis séchée dans un second temps pour l'obtention d'une poudre. Différentes méthodes d'extraction (hydrodistillation, extraction par solvants, extraction par ultra-sons, pressage, décoction, macération, infusion, pressage, cryobroyage, enfleurage), de filtrage (ultrafiltration, nanofiltration) et de purification telle que la chromatographie peuvent être employées pour concentrer en agent minéralisant le broyât sous forme liquide avant de la sécher ou lyophiliser pour l'obtention d'une poudre. De manière préférée, la composition selon l'invention contient de la sauge comme agent antiseptique. Comme précédemment énoncé, plusieurs de ces agents antiseptiques peuvent être utilisés dans la composition selon la présente invention.

Ainsi, dans ce mode préféré, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce que : a) l'agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire est choisi parmi le groupe constitué par : les polyols tels que le xylitol, le sorbitol, le mannitol, l'érythritol, les disacharrides hydrogénés, tels que le maltitol, le lactitol, l'isomaltulose hydrogéné, - la canneberge, le café, la chicorée, l'inuline, le thé, le raisin, le raisin sec, le vin rouge, b) l'agent minéralisant à base de silicium est choisi parmi le groupe constitué par :

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) la silice, les substances d'origine végétale extraites des végétaux parmi la prêle, le lithotame, la luzerne, le soja, l'ortie, le bambou ou la reine des prés, c) l'agent antiseptique est une substance extraite des végétaux choisis parmi la sauge, l'échinacée, la myrrhe, la propolis, le ratanhia du Pérou, le calendula, le yam, la camomille, l'aloes véra, l'acérola, la sanguinarine, le citron ou le pamplemousse.

La composition selon la présente invention peut également contenir en outre un agent renforçant les tissus de soutien dentaires, de préférence une huile notamment choisie parmi les huiles végétales telles que l'huile d'avocat, l'huile d'onagre, l'huile de bourrache ou l'huile de soja, ou bien parmi les huiles animales contenant des oméga 3 ou 6, en particulier les huiles de poissons gras. De manière préférée, la composition selon l'invention contient de l'huile d'avocat comme agent renforçant les tissus de soutien dentaires. A titre d'information l'huile d'avocat contient approximativement 42 à 63 % d'acide oléique, 17 à 29 % d'acide palmitique, 9 à 16 % d'acide linoléique, moins de 1 % d'acide linolénique ; de 1 à 2% d'insaponifiable constitué pour moitié d'hydrocarbures ramifiés avec 20 % de stérols et de triols réducteurs non identifiés. Dans ce cas, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce que la composition contient en outre un agent renforçant les tissus de soutien dentaires choisi parmi les huiles végétales d'avocat, d'onagre, de bourrache ou de soja, ou bien parmi les huiles animales de poissons gras contenant des oméga 3 ou 6.

De manière particulièrement préférée, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient du xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, de la prêle comme agent minéralisant à base de silice, de la sauge comme agent antiseptique.

En outre, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce qu' elle peut contenir en outre de l'huile d'avocat comme agent renforçant les tissus de soutien dentaires.

Dans un premier aspect, la composition selon la présente invention est remarquable en ce qu'elle présente une synergie entre un agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, un agent reminéralisant et un agent antiseptique.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Les bactéries responsables des pathologies dentaires (S. mutans) utilisent comme source primaire d'énergie les sucres à six carbones. Les streptocoques mutans de la cavité buccale colonisent les surfaces dentaires par l'intermédiaire des adhésines qui sont des constituants protéiques de la paroi bactérienne. S. mutans joue un rôle clé à la fois dans le déclenchement et le développement du processus carieux grâce à son métabolisme de type homofermentaire en dégradant les sucres alimentaires et produisant des acides, mais aussi à sa capacité de produire des polysaccharides qui participent à l'adhérence des bactéries (sur les surfaces dentaires et entre elles) pour former la plaque dentaire ou biofilm dentaire.

Des études montrent qu'à très faibles doses, le xylitol interfère avec le métabolisme des S. mutans de la cavité buccale. Le xylitol est transporté à l'intérieur des cellules de S. mutans via le système phosphotransférase du fructose, phosphorylé en xylitol 5- phopshate qui ne peut pas être fermenté ou métabolisé et s'accumule dans des vacuoles intracellulaires provoquant une inhibition rapide de la croissance de S. mutans. Egalement, un cycle futile du xylitol peut se mettre en place, inhibant également la croissance bactérienne de façon indirecte, par phosphorylation puis déphosphorylation successive du xylitol pour respectivement son entrée et son expulsion des cellules. Cependant, les S. mutans s'adaptent rapidement (environ 24 heures) et deviennent résistants au xylitol (on les appelle S. mutans XR). Lors de cette adaptation, les S ¹ , mutans XR modifient certaines de leurs voies métaboliques permettant ainsi l'entrée du xylitol dans les cellules via une perméase et sa non phosphorylation en xylitol 5-phosphate, évitant ainsi le déclenchement du cycle futile et tout effet inhibiteur sur la croissance des bactéries. Ces adaptations entraînent chez S. mutans XR une altération de la capacité à synthétiser les polysaccharides extra et intra cellulaires qui forment la trame du biofilm dentaire. En conséquence, ce biofilm devient moins adhérent aux surfaces dentaires. Les S. mutans XR ayant une capacité de reproduction plus rapide que les souches mères, ceux-ci deviennent donc majoritaires au sein du biofilm et le rendent ainsi progressivement moins adhérent et moins virulent.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Dans le cadre de la présente invention, les polyols, et en particulier le xylitol sont utilisés comme agents réducteurs d'adhésion du biolïlm et non à titre d'édulcorants non- cariogènes.

De manière surprenante, dans le cadre de la composition selon la présente invention, l'association du xylitol avec un agent minéralisant et un agent antiseptique comme définis précédemment crée une synergie permettant d'augmenter les effets bénéfiques de ces composants dans la lutte contre le processus carieux. Sans vouloir se limiter à une théorie particulière, il est possible que la déstabilisation du biofilm suscitée par l'agent réducteur d'adhérence facilite l'accès de l'agent minéralisant et de l'agent antiseptique à la surface dentaire et aux tissus parodontaux, ce qui permet de potentialiser leurs actions bénéfiques. Cet effet supplémentaire apportée par la composition selon la présente invention n'est donc pas une addition simple des effets des différents composants mais bien une combinaison d'effets permettant de limiter l'apparition des caries en renforçant la dent et les tissus de soutien dentaires par déstabilisation de l'adhérence du biofilm dentaire.

Le second aspect sous lequel la composition selon la présente invention est remarquable est qu'elle est destinée à être incorporée dans des produits sucrés contenant des sucres libres cariogènes ou des dérivés de ceux-ci, en permettant de diminuer l'apparition de caries tout en renforçant la dent et les tissus de soutien dentaires, sans changement dans les habitudes alimentaires.

Par sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, on entend tous les monosaccharides (sucres simples) et disaccharides (sucres composés de deux monosaccharides), y compris les sucres raffinés de canne, de betterave et de maïs, tels que le saccharose, le glucose, le fructose par exemple, mais également les dérivés de ceux-ci, présents naturellement dans certains aliments (miel, sirops, jus de fruits) ou ajoutés, et déclenchant le processus carieux. Sont également compris dans cette composition les sucres voisins des précédents dans la famille des oses (aldoses et cétoses), tels que les anomères et épimères de ceux-ci par exemple, pouvant déclencher le processus carieux ; ainsi que les dérivés des sucres précédents tels que les polyols dérivés des oses par la réduction du groupement aldéhyde ou cétone d'un glucide.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) De manière tout à fait surprenante, la synergie décrite ci-dessus entre le xylitol utilisé comme agent réducteur d'adhérence du biolilm dentaire, un agent reminéralisant et un agent antiseptique dans le cadre de la composition selon la présente invention, s'opère également lorsque la composition de la présente invention est ajoutée dans des produits à forte teneur en sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci. Ainsi, la composition selon la présente invention permet de réduire l'effet cariogène du produit sucré dans lequel elle est incorporée tout en exerçant une action bénéfique de renforcement au niveau de la dent et des tissus de soutien dentaires tels que les gencives et l'os dentaire.

La composition selon la présente invention est destinée à être incorporée dans des produits sucrés. Elle permet de réduire l'effet cariogène du produit sucré dans lequel elle est incorporée tout en exerçant une action bénéfique de renforcement au niveau des gencives et de l'os dentaire.

La composition selon la présente invention vainc ainsi un préjugé communément admis en permettant de réduire le processus carieux malgré l'absorption de sucres libres cariogènes ou des dérivés de ceux-ci par une réduction de la composition et de l'adhérence de la plaque dentaire malgré cette absorption de sucres libres cariogènes ou des dérivés de ceux-ci.

De façon surprenante, la composition selon la présente invention permet de passer outre un possible effet de compétition entre les polyols, et en particulier le xylitol, et les sucres libres cariogènes ou les dérivés de ceux-ci, présents dans les produits alimentaires auxquels est ajouté la composition selon la présente invention ; même dans les cas où les sucres libres cariogènes ou les dérivés de ceux-ci sont largement majoritaires dans les produits alimentaires auxquels est ajouté la composition selon la présente invention.

Par une action synergique, l'association des polyols et en particulier du xylitol, comme agent réducteur de l'adhérence du biofïlm dentaire, avec un agent reminéralisant et un agent antiseptique, permet de potentialiser la réduction de la cohésion et de l'adhérence de la plaque dentaire, le pouvoir reminéralisant et l'assainissement de la dent, des gencives et de l'os dentaire.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) L'effet réducteur de l'adhérence du biofilm par les polyols et en particulier le xylitol, ainsi que l'action synergique des différents composants est observable et donc utilisable pour un faible pourcentage final des différents composants de la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention, ajoutée à un produit alimentaire. Particulièrement, la quantité de xylitol présent dans la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention est tel que le pourcentage final de celui-ci dans un produit alimentaire contenant majoritairement des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci n'excède pas 0,8 % (w/w).

Par rapport aux solutions proposées dans l'art antérieur, la composition adjuvante alimentaire objet de la présente invention présente donc les avantages majeurs suivants :

• Elle est de fabrication facile et peu onéreuse ;

• Elle peut être entièrement fabriquée à partir d'éléments naturels d'origine végétale ; « Le produit alimentaire auquel elle est ajoutée conserve sa teneur habituelle en sucre ;

• Elle n'induit pas de modification de la saveur sucrée ou de la texture du produit alimentaire auquel elle est ajoutée.

• Elle ne présente pas le goût mentholé propre à l'utilisation d'un certain pourcentage de xylitol.

• Elle ne présente pas de risques de diarrhées osmotiques de par la faible prise de xylitol qu'elle entraîne.

• Elle ne présente pas de risques de pathologies gastro-oesophagiennes et intestinales liées à la consommation de chewing-gum

Egalement, cette composition adjuvante alimentaire :

• Convient à toutes les catégories d'âge y compris les plus jeunes.

• Ne change pas les habitudes alimentaires fortement tournées physiologiquement, psychologiquement et socialement vers la prise de sucre. • Ne nécessite pas une démarche volontaire pour être assimilée puisqu'elle est incorporée dans des produits alimentaires très courants.

• Garantit une prise régulière de xylitol.

• Est accessible à tous en terme de coût.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Par ailleurs, la composition adjuvante alimentaire permet une protection proportionnelle à la prise de sucre, quantitativement et qualitativement. En effet, la protection exercée par les composants de la composition de la présente invention sera d'autant plus élevée que la prise de sucre contenant cette composition selon la présente invention sera répétée, importante et à fort pouvoir cariogène (sucre collant des confiseries). Plus la prise de sucre contenant la composition de la présente invention sera régulière et s'étalera dans le temps, plus le sucre sera collant et plus les dents seront alors en contact avec les composants bénéfiques de la présente composition adjuvante alimentaire.

La composition adjuvante alimentaire selon la présente invention permet donc, sans changer les habitudes alimentaires des populations qui présentent de façon physiologique et psychologique et dès la naissance un goût prononcé pour le sucre ou tous les produits qui en contiennent, de diminuer le processus carieux par déstabilisation du biofilm dentaire, tout en renforçant la dent et les tissus de soutien dentaires. Cette composition permet donc, par son adjonction à des aliments sucrés courants, de profiter des habitudes alimentaires en place et de tirer partie des aspects destructeurs du sucre pour exercer des actions enrayant le processus carieux et réparatrices.

La composition objet de la présente invention comprend notamment : a. Environ 79 à 99 parts en poids, de préférence 90 à 96 parts en poids de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ; b. Environ 0,5 à 19 parts en poids, de préférence 2,5 à 10 parts en poids de silice ou d'une source de silice d'origine végétale telle que la prêle comme agent reminéralisant ; c. Environ 0,2 à 2 parts en poids, de préférence 0,4 à 1 parts en poids d'un agent antiseptique d'origine végétale telle que la sauge.

La composition objet de la présente invention peut comprendre en outre environ 0,2 à 2 parts en poids, de préférence 0,4 à 1 part en poids d'un agent renforçant les tissus de soutien dentaires.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Par part en poids, on entend la part de la masse d'un composant par rapport à la somme des masses des composants, multiplié par 100, autrement dit le pourcentage en masse d'un composant dans la composition totale.

Comme mentionné précédemment, la composition selon la présente invention est destinée à être incorporée dans des produits sucrés. A ce titre, elle peut être utilisée comme agent réducteur de pouvoir cariogène dans un produit alimentaire contenant des sucres libres et en outre comme agent renforçant les tissus de soutien dentaires.

Comme adjuvant alimentaire ou composition additive alimentaire, la composition selon la présente invention contient de préférence au moins 79 % en poids, de préférence au moins 85 % en poids, de manière encore plus préférentielle au moins 95 % en poids d'un agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, de préférence au moins 0,5 % en poids, de préférence au moins 2,5 % en poids, de manière encore plus préférentielle au moins 10 % d'un agent minéralisant à base de silicium et au moins 0,2 % en poids, de préférence 0,4 % en poids, de manière encore plus préférentielle 1 % d'un agent antiseptique.

Elle peut être utilisée sous une forme solide, par exemple sous forme de poudre ou de granulés, ou bien sous forme liquide en association avec un support liquide approprié.

Elle peut également être utilisée sous forme de gel. Elle peut être incorporée directement à un produit alimentaire déjà sucré ou bien au sucre lui-même, préalablement à son incorporation dans le produit alimentaire que l'on souhaite sucrer. Elle peut se présenter sous l'une des formes précédemment citées pour être ajoutée extemporanément, par le consommateur dans un produit de son choix.

Par exemple, la composition selon l'invention peut être avantageusement ajoutée à du sucre de canne ou du sucre de betterave qui contiennent du saccharose, à du sucre de lait qui contient du lactose, à du sucre de malt qui contient du maltose, à du sucre des fruits qui contient du fructose ou encore à du sucre de raisin qui contient du dextrose et du glucose.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Pour son utilisation comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire dans un produit alimentaire contenant des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention apporte audit produit alimentaire : a. De 0,1 à 0,8 % en poids, de préférence de 0,3 à 0,6 % en poids de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ; b. De 0,005 à 0,02 % en poids, de préférence de 0,01 à 0,02 % en poids de silice ou d'une source de silice d'origine végétale, telle que la prêle comme agent reminéralisant ; c. De 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence de 0,002 à 0,003 % en poids d'un agent antiseptique d'origine végétale tel que la sauge ;

Pour une utilisation plus spécifiquement orientée vers le renfort des tissus de soutien dentaires, la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention apporte, dans un produit alimentaire contenant des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, en outre de 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence 0,002 à 0,003 % en poids d'huile d'avocat comme agent renforçant les tissus de soutien dentaires.

La présente invention a également pour objet un produit alimentaire contenant des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, comprenant a) un agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, b) un agent minéralisant à base de silicium et/ou à base de calcium et c) un agent antiseptique, décrits précédemment, dans les proportions décrites précédemment pour chacun de ces composants à savoir : a. Environ 79 à 99 parts en poids, de préférence 90 à 96 parts en poids de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ; b. Environ 0,5 à 19 parts en poids, de préférence 2,5 à 10 parts en poids de silice ou d'une source de silice d'origine végétale telle que la prêle comme agent reminéralisant ; c. Environ 0,2 à 2 parts en poids, de préférence 0,4 à 1 parts en poids d'un agent antiseptique d'origine végétale telle que la sauge, ledit produit alimentaire contenant : a. De 0,1 à 0,8 % en poids, de préférence de 0,3 à 0,6 % en poids de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ;

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) b. De 0,005 à 0,02 % en poids, de préférence de 0,01 à 0,02 % en poids de silice ou d'une source de silice d'origine végétale, teϋe que la prêle comme agent reminéralisant ; c. De 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence de 0,002 à 0,003 % en poids . d'un agent antiseptique d'origine végétale tel que la sauge.

Dans un autre mode de réalisation, le produit alimentaire objet de la présente invention contenant des sucres libres cariogènes ou dérivés de ceux-ci, peut comprendre en outre de 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence 0,002 à 0,003 % en poids d'un agent renforçant les tissus de soutien dentaires choisi parmi les huiles végétales d'avocat, d'onagre, de bourrache ou de soja, ou bien parmi les huiles animales de poissons gras contenant des oméga 3 ou 6.

Pour son utilisation dans un produit alimentaire, les pourcentages précédents décrivent pour chaque composant de la composition adjuvante selon la présente invention, le pourcentage final de ce composant dans ledit produit alimentaire. Il est entendu que ce pourcentage reflète la masse du composant concerné pour 100 g de produit alimentaire solide, ou pour 100 g de produit alimentaire liquide le cas échéant. Selon la densité du liquide concerné, il est entendu que 100 g de ce liquide peuvent présenter un volume voisin mais différent de 100 ml qui est le volume qu'occupe 100 g d'eau.

De préférence, ledit produit alimentaire contient comme sucres libres du saccharose, du glucose, du fructose ou tout polyol cariogène. Il peut être notamment choisi parmi le sucre, les confiseries, telles que les produits cacaotés ou à base de chocolat y compris le chocolat, les barres chocolatées ou les pâtes à tartiner à base de chocolat, les gommes à mâcher, les produits de décorations pour pâtisserie ou de nappage ; les produits laitiers, tels que les boissons lactées, les produits laitiers fermentes ou emprésurés, les laits condensés, les desserts lactés; les sorbets ou crèmes glacées ; les produits à base de fruits, tels que les confitures, gelées, marmelades, pâtes à tartiner à base de fruits, les fruits confits, les pulpes, purées, nappages à base de fruits ou de lait de coco, les desserts à base de fruits; les céréales et produits à base de céréales ; les produits de boulangerie, tels que crêpes et gâteaux ; les édulcorants, y compris le miel; les préparations pour nourrissons, enfants en bas âges, jeunes enfants ou destinés un usage médical ou diététique ; les

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) enrobages de médicaments ; des boissons telles que les jus de fruits ou de légumes, les nectars, ies boissons à base d ^; eau aromatisée, les sodas, le café ou succédanées, thés ou infusions ; les aliments diététiques ; compléments alimentaires ; condiments tels que moutarde ou ketchup; soupes ou potages ; plats cuisinés ou semi-cuisinés ; surgelés ou bien aliments composites.

La composition selon la présente invention peut être tout particulièrement incorporée dans du chocolat ou plus généralement dans un produit chocolaté, sans induire aucune modification de saveur du produit.

Par chocolat ou produit chocolaté, on entend tout chocolat noir ou chocolat au lait ou tout produit à base de ou contenant de tels chocolats, c'est à dire composés de pâte de cacao, de beurre de cacao, de sucre, de lait dans le cas de chocolats du même nom et éventuellement de lécithine de soja et/ou d'autres matières grasses végétales, et/ou d'arômes. Par chocolat, on entend également tout chocolat blanc ou tout produit à base de ou contenant de tels chocolats, c'est à dire composés de beurre de cacao, de lait, de sucre et éventuellement de lécithine de soja et/ou d'autres matières grasses végétales, et/ou d'arômes. Sont également compris dans cette définition les différentes formes que peuvent prendre lesdits chocolats ou produits chocolatés à savoir solide et liquide.

Ledit chocolat ou produit chocolaté est caractérisé en ce qu'il contient : a. De 0,1 à 0,8 % en poids, de préférence de 0,3 à 0,6 % en poids de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire ; b. De 0,005 à 0,02 % en poids, de préférence de 0,01 à 0,02 % en poids de silice ou d'une source de silice d'origine végétale, telle que la prêle comme agent reminéralisant ; c. De 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence de 0,002 à 0,003 % en poids d'un agent antiseptique d'origine végétale tel que la sauge.

En outre, le dit chocolat ou produit chocolaté peut contenir de 0,001 à 0,01 % en poids, de préférence de 0,002 à 0,003 % en poids d'un agent renforçant les tissus de soutien dentaires.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) La présente invention a donc également pour objet un procédé de fabrication du chocolat permettant d'incorporer les composants précédemment décrits de la composition adjuvante alimentaire, caractérisé par la succession des étapes suivantes : a. Mélange des poudres de xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, de prêle comme source d'agent minéralisant et de sauge comme agent antiseptique ; b. Broyage du mélange obtenu à l'étape a), de préférence jusqu'à l'obtention d'une granulométrie inférieure ou égale à 20μm ; c. Réalisation des opérations de pétrissage, raffinage, conchage, tempérage à partir de pâte de cacao, sucre, et éventuellement de beurre de cacao et de lait en poudre ; d. Incorporation du mélange poudreux obtenu à l'étape b) à la pâte chocolatée obtenue à l'issue de l'étape c) ; e. Accessoirement, incorporation de l'huile d'avocat à la pâte chocolatée obtenue à l'issue de l'étape c) ; et f. Coulage ou moulage du produit chocolaté obtenu à l'étape d).

Dans les étapes du procédé précédent, on entend par pétrissage, l'étape qui vise à obtenir une pâte homogène à partir de sucre, de pâte de cacao et éventuellement de beurre de cacao et de poudre de lait. Cette étape s'effectue dans un pétrin mécanique. La pâte obtenue doit présenter une texture particulière, adaptée à l'opération ultérieure de raffinage. Il est possible d'ajuster celle-ci par le choix de la granulométrie du sucre et également par la teneur en matières grasses.

Par raffinage, on entend l'étape qui_consiste à laminer la pâte obtenue en sortie de pétrissage entre des cylindres en acier, de façon à réduire la taille des particules à moins de 25 microns. Cette opération transforme la pâte initiale en poudre fine.

Par conchage, on entend l'étape essentielle pour modifier l'arôme et améliorer les caractéristiques rhéologiques du chocolat. Cette étape peut durer de quelques heures à plusieurs jours. La poudre raffinée est malaxée à chaud, vers 75-80 ⁰ C dans le cas d'un chocolat noir et vers 65°C pour les chocolats blancs et au lait.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Par tempérage, on entend l'étape destinée à permettre une cristallisation du beurre de cacao sous forme stable. Pour cela, la pâte chocolatée est amenée à une température, voisine de 29 ⁰ C.

Par coulage ou moulage, on entend l'étape permettant d'obtenir la forme ou le motif désiré pour le chocolat. Celui-ci est directement versé dans des moules. Il s'agit du moulage du chocolat. Des ingrédients supplémentaires peuvent ajoutés à ce moment là. Les moules et le chocolat passent dans une machine appelée tapoteuse qui répartit le chocolat dans le moule. Enfin, il passe dans un tunnel réfrigéré qui le refroidit instantanément.

Comme expliqué précédemment, tout produit alimentaire sucré additionné de la composition selon l'invention, tel que du chocolat ou un produit chocolaté, peut être utilisé comme produit contenant des éléments bénéfiques pour la santé dentaire, en permettant notamment de limiter l'apparition des caries et de renforcer les dents, les gencives et l'os dentaire.

Exemple 1 :

Composition adjuvante au sucre

Lorsqu'elle est destinée à être incorporée dans du sucre, par exemple, la composition selon la présente invention contient de préférence du xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofilm dentaire, de la prêle comme source de la silice, et de la sauge comme agent antiseptique. A titre préférentiel, les proportions sont les suivantes :

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Exemple 2 :

Composition adjuvante au chocolat

Lorsqu'elle est destinée à être incorporée dans du chocolat ou dans un produit chocolaté, par exemple, la composition selon la présente invention contient de préférence du xylitol comme agent réducteur d'adhérence du biofïlm dentaire, de la prêle comme source de silice en tant qu'agent minéralisant, de la sauge comme agent antiseptique et éventuellement de l'huile d'avocat comme agent renforçant les tissus de soutien dentaires. A titre préférentiel, les proportions sont les suivantes :

Pour la réalisation du chocolat ou produit chocolaté contenant la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention et les proportions présentées dans le tableau précédent par exemple, le xylitol, les poudres de prêle et de sauge doivent êtres amenées à une granulométrie de 20 micron afin de ne pas être perceptible en bouche au moment de leur mélange avec le chocolat.

Sont ensuite mises en œuvre dans l'ordre suivant les étapes de :

Pétrissage, raffinage, conchage, tempérage, incorporation de la composition adjuvante, moulage.

Les étapes de pétrissage, raffinage, conchage, tempérage et moulage sont définis précédemment dans la description et sont bien connues de l'homme du métier spécialiste

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) dans la fabrication de chocolat et produits chocolatés. La présente invention propose d'ajouter une étape d'incorporation de ia composition adjuvante alimentaire selon la présente invention, après l'étape de tempérage, dans le processus classique de fabrication du chocolat.

L'introduction de la composition adjuvante ne doit pas se faire avant le conchage car les températures demandées par celui-ci (80°C pour le saccharose) risquent d'altérer la structure et l'efficacité des différents produits. En effet à haute température on peut s'exposer à une polymérisation de l'acide silicique de la prêle et à l'altération des principes actifs de la sauge et de l'huile d'avocat .

Le xylitol ne doit pas être introduit avec le saccharose (ou l'édulcorant choisi) lors de la phase de pétrissage sa température de conchage étant plus basse. Ces élévations de température peuvent conduire à une désorganisation des états cristallins par fonte des cristaux du xylitol.

A titre d'exemple, 1 kg de chocolat noir a été réalisé contenant la composition adjuvante alimentaire selon la présente invention. Pour l'étape de pétrissage, qui est également l'étape de mélange des ingrédients permettant d'obtenir une pâte brute de chocolat, 300 g de cacao, 400 g de beurre de cacao et 300 g de sucre ont été mélangés. L'étape suivante de broyage ou raffinage a été réalisée en laminant la pâte obtenue en sortie de pétrissage entre des cylindres en acier, de façon à réduire la taille des particules à moins de 25 microns et obtenir une pâte beaucoup plus fine et plus souple. L'étape de conchage a été réalisée dans des conches rotatives pendant 24 heures à 8O ⁰ C. A ce stade, on peut, le cas échéant, ajouter du beurre ou de la lécithine selon la fluidité requise. L'étape de tempérage a été réalisée en abaissant la température du mélange de 50 ⁰ C environ à 18°C; en 10 minutes, sous agitation constante. Cette température a été maintenue constante pendant 10 minutes avant de réchauffer le mélange jusqu'à atteindre la température de 29°C. Pendant cette étape de réchauffement, la composition adjuvante alimentaire, préparée par ailleurs selon les proportions données dans le tableau précédent et amenée à une granulométrie inférieure à 20 microns, a été incorporée ; 5 g de xylitol + 200 mg de silice extraite de prêle + 20 mg de sauge, mélangés et amenés à une granulométrie inférieure à 20 microns ont été incorporés progressivement et sous agitation constante pendant la phase de réchauffement décrite précédemment, jusqu'à incorporation

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) homogène et totale en maintenant la température constante à 29°C. A cette même température, 20 μL d'huile d'avocat ont été ajoutés tout en maintenant la température constante à 29°C. L'étape de moulage a été réalisée pour obtenir un chocolat en tablettes, en utilisant une tapoteuse pour répartir le chocolat dans les moules et un tunnel réfrigéré afin de le refroidir instantanément.Egalement à titre d'exemple, lkg de chocolat au lait a été réalisé selon le même protocole en utilisant cependant les proportions des ingrédients suivants lors de l'étape de pétrissage : 100 g de cacao + 200 g de beurre de cacao + 500 g de sucre + 200 g de lait en poudre.

Exemple 3 :

Modèle d'étude de la réduction d'adhérence d'un biofilm dentaire in vitro.

Le modèle d'étude utilisé pour mesurer la réduction d'adhérence d'un biofilm dentaire in vitro est une technique propriétaire de la société BioFilm control, le BioFilm Ring test®, protégée par plusieurs brevets (FR05/00427, FR06/00578, FR07/50891, FR07/55344). Le test utilise :

- des microbilles magnétisables ajoutées dans le milieu de cultures des microorganismes testés (S. mutans) ; un Bloc-Test où se positionne avec précision une plaque 96 puits à tester sur 96 aimants. Les microbilles sont alors attirées au fond du puits et forment un spot, sauf si un biofilm les immobilise (pas de spot) ; un lecteur scannant la plaque 96 puits avant et après aimantation ;

- un logiciel BioFilm Eléments® analysant l'image du fond des puits de la plaque 96 puits pour détecter ou non des spots de micro-billes. Cette technique est également décrite dans Chavant et al., J. Microbiol. Meth 68 (2007) 605-612.

Mesure de la réduction d'adhérence d'un biofilm de S. mutans en présence de différentes concentrations de xylitol in vitro.

Un biofilm de S. mutans est formé en milieu BHI dans différents puits de microplaques de polystryrène. Le nombre de puits ensemencés est fonction des conditions

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) expérimentales testées. Chaque condition expérimentale est testée en triplicate, à savoir dans trois puits indépendants.

Pour la préparation des cultures en microplaques, les bactéries S. mutans sont étalées sur boîte de Pétri. A partir d'un clone isolé, une préculture overnight (lδheures) est réalisée en milieu Luria Broth (LB) à 37°C et pH 6 ou pH 7. La densité optique (D. O. ) de la préculture est ensuite mesurée, ramenée à une D. O. de 1, puis diluée d'un facteur 250 dans un milieu de culture thermostaté. Une quantité suffisante de billes magnétiques est ajoutée à la dilution (environ 2μL par puits). La dilution de la préculture permet d'ensemencer les différents puits des microplaques destinés aux mesures des conditions expérimentales. Les puits témoins ne sont pas ensemencés.

Après ensemencement des puits par 200 μL de la préculture diluée, différentes conditions de culture sont testées pour mesurer l'effet du xylitol sur l'adhérence du biofilm de S. mutans. L'effet de plusieurs concentrations en xylitol comprises entre 0,05 et 5 % w/v (g/lOOmL), en particulier 0,1 ; 0,2 ; 0,4 0,8 et 5 % w/v (g/10OmL), sur l'adhérence du biofilm, est mesuré après des temps compris entre 2 et 48 heures d'incubation à 37°C (pH compris entre 6 et 7) comparativement à l'adhérence du même biofilm en absence de xylitol (0).

Comme décrit dans Chavant et al., J. Microbiol. Meth 68 (2007) 605-612, la mesure de la formation ou non de micro-spots de billes magnétiques au fond de chaque puits est révélatrice de la présence ou non de bactéries adhérentes et/ou d'un biofilm. De telles bactéries adhérentes empêchent la circulation des billes magnétiques en direction des aimants placés sous chaque puits et donc la formation de micro-spots de billes au fond de ces puits. A l'opposé, une réduction de l'adhérence de ces bactéries par le xylitol permet la circulation des billes magnétiques et la formation de micro-spots de billes.

La mesure de la déstructuration plus ou moins marquée du biofilm en présence de xylitol peut également être évaluée par agitation du biofilm formé comme précédemment après un temps d'incubation compris entre 2 et 48 heures en présence de microbilles magnétiques. Cette agitation est standardisée pour chaque microplaque de tests à l'aide d'un vortex. Le cisaillement provoqué par le mouvement du milieu de culture durant l'agitation permet une remobilisation des microbilles liée à la diminution de la résistance de la matrice du biofilm et donc un enregistrement de la déstructuration plus ou moins

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) marquée du biofilm par la libération des microbilles et leur visualisation ou non, au fond de chaque puits. Autrement dit, ces études permettent de quantifier la résistance à l'agitation du biofilm dans les différentes conditions expérimentales.

Ces études permettent ainsi de déterminer dans ce modèle in vitro une dose efficace minimale (D.E.M.) de xylitol permettant une réduction de l'adhérence du biofilm de S. mutans.

Mesure de la réduction d'adhérence d'un biofilm de S. mutons à différentes concentrations de xylitol en présence de différentes concentrations de saccharose ou de glucose in vitro.

Le protocole de formation et d'ensemencement du biofilm de S. mutans dans les différents puits des microplaques de polystyrène est identique à celui présenté dans le paragraphe précédent.

Les conditions expérimentales suivantes permettent de mesurer l'influence de différentes concentrations en saccharose sur la réduction d'adhérence du biofilm par le xylitol. L'effet de plusieurs concentrations en saccharose ou de glucose [comprises entre 0 et 20 % w/v (g/10OmL), particulièrement 0, 5, 10, 15 et 20 %] sur la réduction d'adhérence du biofilm par une concentration de xylitol est mesuré après des temps compris entre 2 et 48 heures d'incubation à 37°C (pH compris entre 6 et 7), comparativement à la réduction d'adhérence du même biofilm à cette même concentration de xylitol en absence de saccharose ou de glucose (0). L'effet du saccharose ou glucose est testé sur les concentrations suivantes de xylitol comprises entre 0,05 et 5 % w/v (g/10OmL), en particulier 0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,8 et 5 % w/v (g/10OmL), comme décrit précédemment, et encadrant la D.E.M. de xylitol réduisant l'adhérence du biofilm.

Ces différentes doses respectives de saccharose ou glucose et de xylitol permettent de mesurer la réduction de l'adhérence du biofilm de S. mutans pour différents ratios de concentrations « saccharose / xylitol » ou « glucose / xylitol ».

Comme précédemment mentionné, la mesure de la déstructuration plus ou moins marquée du biofilm en présence de xylitol et de saccharose ou glucose peut également

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) être évaluée par agitation du biofilm formé comme ci-dessus après un temps d'incubation compris entre 2 et 48 heures en présence de microbϋles magnétiques. Cette agitation est standardisée pour chaque microplaque de tests à l'aide d'un vortex. Le cisaillement provoqué par le mouvement du milieu de culture durant l'agitation permet une remobilisation des microbilles liée à la diminution de la résistance de la matrice du biofilm et donc un enregistrement de la déstructuration plus ou moins marquée du biofilm par la libération des microbilles et leur visualisation ou non, au fond de chaque puits. Ces études permettent de quantifier la résistance à l'agitation du biofilm dans les différentes conditions expérimentales.

Marquage d'un biofilm par l'acridine orange et simulation d'un effet « approche de support » augmenté suite à la réduction d'adhérence du biofilm par le xylitol in vitro.

En utilisant des marqueurs fluorescents, en particulier l'acridine orange connue pour ses qualités de marquage des structures cellulaires et des biofilms, traçable en microscopie confocale, il a été possible de visualiser la pénétration de ce marqueur fluorescent dans la matrice du biofilm dans différentes conditions expérimentales et donc de visualiser dans ces conditions la déstructuration des biofilms synonyme de leur réduction d'adhérence. Le marquage des biofilms par l'acridine orange dans les différentes conditions expérimentales sera proportionnel à cette déstructuration des biofilms.

Ces conditions expérimentales incluent l'utilisation de plusieurs concentrations en saccharose ou glucose [comprises entre 0 et 20 % w/v (g/ 10OmL), particulièrement 0, 5, 10, 15 et 20 %] en présence de xylitol à des taux compris entre 0,05 et 5 % w/v (g/10OmL), en particulier 0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,8 et 5 % w/v (g/10OmL), après des temps d'incubation des cellules compris entre 2 et 48 heures d'incubation à 37°C (pH compris entre 6 et 7), comparativement à des conditions en absence de saccharose ou glucose et de xylitol.

Le marquage par l'acridine orange sur des cellules incubées pendant un temps défini, puis lavées par Phosphate Buffer Saline (PBS) sera effectué pendant 5 minutes, par exemple, par une solution d'acridine orange à une concentration classique comprise entre

5 et 1000 μg / ml. Après marquage et lavage au PBS, les biofilms seront visualisés par un

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) microscope confocale (microscope inversé ZEISS LSM 510 Meta) et une quantification des marquage sera effectué à l'aide d'un logiciel adapté.

Par cette approche, il est ainsi possible de visualiser la déstructuration d'un biofilm par le xylitol et démontrer ainsi sa plus grande perméabilité vis à vis de potentiels principes actifs végétaux pour l'approche du support sur lequel est fixé ce biofilm. Cette approche permet donc de simuler ainsi une mesure d'approche d'un support par des principes actifs végétaux à travers un biofilm de S. mutans présentant une réduction d'adhérence.

Mesures complémentaires in vitro par utilisation du test de coloration au cristal violet.

Ce test, dérivé du test publié dans Musk et al. Chem. Biol. 12 (2005) 789-796, est un test colorimétrique qui permet de quantifier les bactéries adhérentes, dans un biofilm par exemple, par mesure du cristal violet incorporé par celles-ci après des étapes successives de lavage, marquage, décoloration et dissolution du biofilm coloré par de l'acide acétique.

Ainsi, en utilisant un protocole standardisé de rinçage de biofilms mis en croissance dans des conditions expérimentales particulières, en présence de xylitol, saccharose et/ou principes actifs végétaux par exemple, il est possible de comparer la résistance à l'agitation de ces biofilms et donc la déstructuration plus ou moins marqués de ceux-ci dans les différentes conditions expérimentales décrites dans le paragraphe précédent, utilisant du xylitol et du saccharose ou glucose.

Classiquement, ce test requiert une incubation minimale des bactéries pendant 48 heures dans des puits de microplaques. Celles-ci sont ensuite lavées par jet d'eau de laveur de microplaque permettant de tester la résistance des biofilms. Elles sont ensuite colorées par une solution de cristal violet ; à titre d'exemple non exclusif, le marquage peut être effectué par une solution à 0,1 % v/v dans l'eau pendant 45 minutes. Les puits sont ensuite rincés par de l'eau pour enlever l'excès de marquage. Les bactéries restantes et colorées dans les différents puits sont ensuite dissoutes par une solution d'acide acétique ; à titre d'exemple non exclusif, cette solution peut être une solution d'acide acétique glacial à 33 % v/v. Après dissolution, la densité optique de la solution récupérée de chaque puits est mesurée à 540 nm.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Les valeurs obtenues sont proportionnelles au nombre de bactéries adhérentes ayant résistées au rinçage. Elles permettent donc de quantifier la résistance de biofilms dans différentes conditions expérimentales.

Mesures de la réduction d'adhérence du biofilm par le xylitol en présence des principes actifs végétaux et de leur synergie, in vitro

L'effet des principes actifs végétaux provenant de la prêle et de la sauge sur la réduction de l'adhérence du biofïlm est mesuré en ajoutant ceux-ci dans les conditions expérimentales des différents tests et approches utilisés précédemment. Ces différents tests permettent donc de mesurer, en leur présence, outre la réduction d'adhérence du biofilm, la résistance à l'agitation de celui-ci. Concernant le marquage du biofilm par l'acridine orange, comme expliqué dans le paragraphe correspondant, ce test permet de visualiser et de simuler une mesure d'approche d'un support par ces principes actifs végétaux à travers un biofilm de 5". mutans présentant une réduction d'adhérence.

Ces différents tests permettent de mesurer la synergie entre les principes actifs végétaux, provenant en particulier de la prêle et de la sauge, et le xylitol sur la réduction d'adhérence d'un biofilm de S. mutans.

Références :

- Bertrand et al. Les cahiers de l'ADF, N° 14-15, 2 ^ème trimestre 2003.

- Chavant et ai, J. Microbiol. Meth 68 (2007) 605-612.

- Engels-Deutsch et al. Les cahiers de l'ADF, N° 16-17, 3 ^ème trimestre 2003.

- Musk et al. Chem. Biol. 12 (2005) 789-796.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)