Cette composition alimentaire ou diététique se caractérise essentiellement par le fait qu'elle contient au moins trois produits antioxydants spécifiques, en des concentrations choisies de telle manière que la consommation journalière moyenne de la composition fournisse à l'organisme une quantité en chacun de ces antioxydants propre à favoriser la prévention des maladies cardio-vasculaires. Cette prévention se traduit notamment par la diminution de la tendance à la formation de la plaque d'athérome.

Le fait d'ajouter des antioxydants dans des compositions alimentaires ou diététiques en vue de diminuer les risques d'athérosclérose est connu. Plusieurs auteurs ont en effet mis en évidence que l'oxydation des composants lipidiques polyinsaturés présents dans les lipoprotéines basse densité pouvait jouer un rôle dans l'athérosclérose (Witzum JL-"The oxidation hypothesis of atherosclerosis" -Lancet 1994 : 344 : 793-8). Des études sur animaux ont suggéré par ailleurs que certains antioxydants présentent un effet protecteur contre les agents carcinogènes.

Plusieurs publications récentes ont donc décrit ou mentionné l'intérêt de faire absorber par l'organisme humain des suppléments alimentaires comprenant des quantités élevées de divers agents antioxydants, ces

suppléments se présentant généralement sous la forme de gélules, de capsules ou de comprimés, ou ont décrit ou mentionné l'intérêt d'ajouter directement dans des produits alimentaires des doses, également élevées, de produits antioxydants.

Parmi les agents antioxydants les plus souvent cités, on peut mentionner les caroténoides en général, tels que ß-carotène, lycopène, cryptoxanthine, zéaxanthine et lutéine, les tocophérols dont en particulier l'a- tocophérol (vitamine E), l'acide ascorbique (vitamine C), la vitamine A, l'acide folique (vitamine B9), le sélénium, le zinc, le manganèse.

Les polyphénols, et en particulier les polyphénols extraits du vin rouge, ont été plus récemment cités, depuis la mise en évidence de ce qui a été dénommé"The French paradox". La consommation des polyphénols du vin rouge a ainsi été décrite comme ayant un effet réducteur sur la susceptibilité à l'oxydation in vivo des lipoprotéines basse densité (-NIGDIKAR et al-Am J. Clin. Nutr. 1998 : 68 : 258-65). D'autres auteurs ont par ailleurs fait mention de la possible action des polyphénols contre la maladie d'Alzheimer ou contre la dégénérescence oculaire due à l'âge, et de leur éventuel rôle protecteur contre le cancer.

La demande de brevet WO 97/06697 décrit ainsi des produits alimentaires comprenant des antioxydants et/ou des vitamines antioxydantes dans des quantités suffisantes pour accroître significativement la teneur en antioxydants dans le plasma sanguin humain, après consommation quotidienne d'une quantité journalière moyenne de ces produits alimentaires. En pratique, les produits alimentaires en

question contiennent des matières grasses et sont constitués de pâtes à tartiner, d'assaisonnements, de sauces, de crèmes glacées ou de sauces ketchup.

Les quantités d'antioxydants sont définies dans cette demande comme étant d'environ trois à dix fois les quantités journalières recommandées par le Codex Alimentarius, et les antioxydants utilisés sont choisis dans le groupe constitué de l'a-tocophérol ou vitamine E, de la vitamine C, des polyphénols, et des caroténoides comme l'a-carotène, le ß-carotène, le lycopène, la cryptoxanthine, la zéaxanthine, la lutéine et leurs mélanges.

Il apparaît que la-tocophérol est tout particulièrement recommandé, de préférence en association avec un antioxydant hydrosoluble, constitué préférentiellement par l'acide ascorbique. Lorsque des carotènes sont utilisés, des mélanges d'à et de p-carotène sont préférés. Tous les polyphénols dérivés d'une source végétale et ayant une activité antioxydante peuvent être utilisés, sans aucune distinction entre eux.

Les quantités recommandées, exprimées par rapport à la quantité journalière moyenne de produit alimentaire consommée, est de 30 à 100 mg pour l'a-tocophérol, de 100 à 600 mg pour l'acide ascorbique, de 0.5 à 2.5 g pour les polyphénols extraits du thé, de 25 à 125 mg pour les autres polyphénols, et de 2 à 18 mg pour les caroténoïdes.

Il est indiqué dans cette demande de brevet que dans une réalisation hautement préférentielle, le produit alimentaire conforme à l'invention consiste en une pâte à tartiner comprenant, pour 15 g de pâte, 30 à 100 mg d'a- tocophérol ou dérivés et 100 à 600 mg de vitamine C. Le

seul exemple décrit dans cette demande de brevet concerne d'ailleurs une margarine contenant, pour 100 g de produit, 200 mg d'a-tocophérol, 840 mg d'acide ascorbique et 180 mg de carotènes, ces derniers comprenant environ 18 mg d'a- carotène et 36 mg de ß-carotène.

La demande de brevet WO 98/11789 décrit quant à elle une composition sèche contenant des flavonols dérivés de plantes, et son utilisation dans la supplémentation ou l'alimentation humaine, dans le but d'inhiber l'oxydation des LDL (lipoprotéines de basse densité) plasmatiques. De préférence, les polyphénols issus du vin rouge sont utilisés comme source de flavonols et la dose journalière recommandée de polyphénols totaux extraits du vin rouge est de 0.1 à 4 g, la dose journalière de flavonols étant située dans la gamme de 0.1 à lg.

La composition décrite peut également comprendre un certain nombre de composants tels que oligo-éléments, vitamines, antioxydants, substances actives, édulcorants...

En ce qui concerne les caroténoïdes, la lutéine, le lycopène, l'a et/ou le ß-carotène peuvent indifféremment être utilisés et en ce qui concerne les vitamines, la vitamine A, la vitamine C et la vitamine E sont citées.

Il est mentionné que les antioxydants tels que les caroténoides et la vitamine E sont partiellement détruits par oxydation dans le tractus gastro-intestinal, mais que l'inclusion de ces composés dans la composition inhibe ce processus, et que plus d'antioxydants sont dès lors absorbés. L'utilisation d'une composition comprenant de l'a-tocophérol et/ou de l'aspirine est particulièrement préférée, car il est dit qu'une telle association exerce un effet synergique en présence des polyphénols. Les

compositions conformes à l'invention décrites dans cette demande de brevet se présentent de préférence sous la forme de capsules, chaque capsule contenant 500 mg de composition polyphénolique, et les doses journalières typiques des composants additionnels desdites compositions sont indiquées en page 13 de la demande de brevet. On peut noter que deux caroténoides sont cités : la lutéine, à une dose de 2 à 50 mg, et le P-carotène, à une dose de 2 à 20 mg.

Par ailleurs, deux vitamines sont présentes : la vitamine A, à une dose de 400 à 600 RE, et la vitamine C, à une dose de 75 à 250 mg. Ni le lycopène, ni la vitamine E n'apparaissent dans cette formulation préférée.

La demande WO 99/18814 décrit des mélanges d'antioxydants comprenant au moins deux caroténoides différents, en général un mélange de la plupart des types de caroténoides naturels est utilisé, sous forme d'une préparation lipidique. La demande WO 99/48386 concerne des suppléments diététiques comprenant obligatoirement un ou plusieurs agents émulsifiants, de préférence de la lécithine, en association avec des tocophérols et des extraits de raisin. D'autres antioxydants peuvent être présents et notamment des mélanges de caroténoides, les doses de caroténoides étant de l'ordre de 0,01 à 0, 1 parties en poids.

Le brevet US 5 290605 se rapporte à des compositions destinées à prévenir les effets sur la peau d'une exposition prolongée au soleil ; ces produits contiennent notamment, à des doses élevées, des mélanges de caroténoides naturels tels que (3-carotène, canthaxanthine, zéaxanthine, lycopène, lutéine, etc, en association avec d'autre antioxydants.

Il se trouve qu'à l'issue d'études approfondies, la Société Demanderesse a réussi à mettre en évidence qu'un caroténoïde particulier, le lycopène, associé en des proportions choisies avec à la fois la vitamine E et la vitamine C, présentait une action particulièrement efficace contre l'oxydation des LDL plasmatiques.

La présente invention est donc relative à l'utilisation de la combinaison lycopène-vitamine E- vitamine C dans la supplémentation ou l'alimentation quotidienne de l'être humain, afin de diminuer les risques d'oxydation des LDL plasmatiques et afin donc de favoriser la prévention des risques des maladies cardio-vasculaires.

L'invention a plus particulièrement pour objet une composition alimentaire ou diététique caractérisée par le fait qu'elle contient au moins trois antioxydants constitués par le lycopène, la vitamine E et la vitamine C, les concentrations de la composition en chacun de ces trois antioxydants étant choisies de telle manière que la consommation normale journalière moyenne de la composition fournisse à l'organisme une quantité d'environ 1 à environ 10 mg de lycopène, d'environ 5 à environ 25 mg de vitamine E et d'environ 5 à environ 25 mg de vitamine C. De préférence, lesdites quantités journalières de lycopène, de vitamine E et de vitamine C sont respectivement comprises entre 2 et 9 mg, 7 et 20 mg et 7 et 20 mg, et plus préférentiellement encore comprises entre 3 et 8 mg, 8 et 15 mg et 8 et 15 mg.

Au sens de la présente invention, on entend par composition alimentaire ou diététique tout type de produit destiné à être ingéré par l'organisme, qu'il se présente sous forme sèche, pâteuse, semi-pâteuse, liquide ou semi-

liquide. Il s'agit plus particulièrement des produits alimentaires et des boissons, mais les suppléments alimentaires et les produits nutraceutiques sont également visés. Parmi les produits alimentaires plus particulièrement concernés par la présente invention, on peut citer les produits fermentes, qu'ils soient d'origine végétale ou animale, les crèmes, les entremets, les crèmes glacées, les barres chocolatées, les barres de céréales, les gâteaux et biscuits, les substituts de repas, les compotes à base de fruits, les fromages, dont notamment les fromages frais et les produits dérivés, les produits de grignotage en général. De préférence, ces produits contiennent une teneur relativement faible en acides gras saturés.

Lorsque le lycopène, la vitamine E et la vitamine C sont utilisés en association dans les proportions respectives indiquées ci-dessus, on observe une efficacité remarquable dans l'inhibition de l'oxydation des LDL in vitro, des effets synergiques étant produits par les interactions entre les trois antioxydants.

Selon l'un des aspects de l'invention, le lycopène peut donc être présent dans les compositions selon l'invention, à l'exclusion de tout autre caroténoïde, tel que le p-caroténoide par exemple.

Cette efficacité du système antioxydant conforme à l'invention est encore exacerbée de par l'addition d'un quatrième produit antioxydant, constitué par les polyphénols.

On utilise alors les polyphénols en une concentration telle qu'une consommation journalière moyenne des compositions alimentaires ou diététiques qui les

comportent apporte à l'organisme une quantité d'environ 30 à 300 mg, de préférence de 40 à 250 mg, et plus préférentiellement encore de 50 à 220 mg par jour de polyphénols totaux.

De préférence, on utilise des polyphénols comportant une proportion élevée en substances polyphénoliques ayant une structure catéchine oligomérique, essentiellement dimérique et trimérique. Ces substances seront dénommées par la suite"OPC"ou oligomères procyanidoliques. La proportion en OPC des polyphénols utilisés conformément à l'invention est de préférence supérieure à 40%, plus préférentiellement supérieure à 50% et plus avantageusement encore supérieure à 60%, la plupart des compositions comprenant de 80 à 95% d'OPC. La dose journalière recommandée en OPC est comprise entre 12 et 150mg, de préférence entre 15 et 130 mg, et plus préférentiellement encore comprise entre 18 et 100 mg. On préfère utiliser des polyphénols extraits des pépins de raisin, ceux-ci étant particulièrement riches en OPC.

Il est connu, notamment de par le brevet US 5,648,377, d'utiliser des oligomères procyanidoliques en association avec du lycopène. Le brevet précité décrit ainsi l'inhibition de l'oxydation des LDL humaines par une association OPC et lycopène et conclut que cette association est plus efficace que chacun de ses composants pris séparément. Les rapports entre lycopène et OPC sont décrits comme étant compris entre 1 : 1 et 1 : 10, et les associations sont utilisées dans des capsules dont la dose de consommation est de 1 à 5 capsules par jour. Il faut souligner que le brevet en question ne décrit nulle part l'association entre le lycopène, les OPC et la vitamine E,

et encore moins l'association entre ces trois antioxydants et la vitamine C.

Or, il est du mérite de la Société Demanderesse d'avoir trouvé que c'est justement l'association, dans les proportions recommandées, des trois antioxydants constitués par le lycopène, la vitamine E et la vitamine C qui procurait l'inhibition la plus efficace de l'oxydation des LDL, et que l'addition des polyphénols, dont en particulier les OPC, également dans les proportions recommandées, permettait de renforcer l'action inhibitrice de ces trois antioxydants.

De façon générale, on choisit les concentrations d'un produit donné en chacun des antioxydants sélectionnés conformément à l'invention de telle façon que la consommation journalière d'une"ration"type dudit produit apporte à l'organisme des quantités d'antioxydants se situant à l'intérieur des intervalles indiqués. Ainsi par exemple, dans le cas d'un yoghourt, on considère généralement que c'est la consommation d'un pot qui devra amener la quantité requise en chacun des antioxydants. Dans le cas des biscuits, la ration sera le plus souvent constituée d'un emballage individuel comportant par exemple de 4 à 6 biscuits (biscuits de 25 à 50g, en moyenne de 30g).

Dans le cas d'une boisson, la ration type pourra être constituée d'une unité de contenance 250 ml ou 330 ml, plus rarement 125 ml ou 500mol.

Selon les types de produits dans lesquels l'utilisation du mélange d'antioxydants conforme à l'invention sera mise à profit, les concentrations en antioxydants pourront donc varier. Ceci d'autant plus que pour certains produits, le respect de la consommation

journalière voulue pourra nécessiter l'ingestion de plusieurs unités de vente. Il va de soi que l'homme du métier pourra déterminer ou ajuster aisément les concentrations et recommandations de consommation, sachant les quantités journalières cibles à respecter pour chacun des antioxydants utilisés conformément à l'invention.

Le plus généralement, les concentrations des compositions alimentaires ou diététiques en chacun des produits antioxydants utilisés conformément à l'invention sont comprises pour le lycopène entre 0,0005% p/p et0, 08% p/p, de préférence entre 0,001 et 0,015% p/p, pour la vitamine E entre 0,001% p/p et 0,05% p/p, de préférence entre 0,0015 et 0,02% p/p, pour la vitamine C entre 0,001% p/p et 0,05% p/p, de préférence entre 0,0015 et 0,02% p/p, et pour les polyphénols entre 0,02% p/p et 0,2% p/p, de préférence entre 0,02 et 0,1% p/p. Plus précisément, ces concentrations sont les suivantes, en fonction des catégories de produits alimentaires ou diététiques visés : -produits solides, tels que gâteaux, biscuits, sucreries, confiseries, barres de céréales, snacks, barres chocolatées,...... lycopène : de 0,0015 à 0,015% p/p, de préférence de 0,003 à 0, 08%, vitamine E : de 0,004% p/p à 0,02% p/p, de préférence de 0,006 à 0,02, vitamine C : de 0,004% à 0,02% p/p, de préférence de 0,006 à 0,02, polyphénols : de 0,02% p/p à 0,2% p/p, de préférence de 0,02 à 0,1.

-produits semi-liquides, pâteux ou semi-pâteux, tels que crèmes, confitures, compotes, crèmes glacées,

fromages frais, desserts lactés, produits fermentes d'origine végétale ou animale, dont plus particulièrement les yoghourts lycopène : de 0,001% p/p à 0, 01% p/p, de préférence de 0,003 à 0,008, vitamine E : de 0,005% p/p à 0, 02%p/p, de préférence de 0,008 à 0,015, vitamine C : de 0,005% p/p à 0, 02% p/p, de préférence de 0,008 à 0,015, polyphénols : de 0,01% p/p à 0, 1 p/p, de préférence de 0,02% p/p à 0,05.

-produits liquides, dont notamment boissons lactées, sirops, boissons rafraîchissantes, boissons pour l'effort,... lycopène : de 0,0005% p/p à 0, 01% p/p, de préférence de 0,001 à 0,008, vitamine E : de 0,001% p/p à 0, 02% p/p, de préférence de 0,0015 à 0,015, vitamine C : de 0,001% p/p à 0,02% p/p, de préférence de 0,0015 à 0,015, polyphénols : de 0,005% p/p à 0,2% p/p, de préférence de 0,01 à 0,05.

De façon générale, les compositions alimentaires ou diététiques selon l'invention comportent les proportions respectives suivantes en antioxydants (poids/poids) : -Vitamine E/lycopène de 0.5/1 à 25/1, de préférence de 0.8/1 à 10/1, et plus préférentiellement encore de 1/1 à 5/1.

-Vitamine C/lycopène de 0.5/1 à 25/1, de préférence de 0.8/1 à 10/1, et plus

préférentiellement encore de 1/1 à 5/1.

-Polyphénols totaux/lycopène de 3/1 à 300/1, de préférence de 5/1 à 125/1, et plus préférentiellement encore de 7/1 à 70/1.

De façon avantageuse, le rapport OPC/lycopène est quant à lui compris entre 1/1 et 150/1, de préférence entre 1.5/1 et 65/1 et plus préférentiellement encore entre 5/1 et 20/1 ; avantageusement le rapport OPC/lycopène est compris entre 12/1 et 17/1.

Un avantage procuré par le système antioxydant utilisé conformément à l'invention réside dans le fait qu'il permet de maintenir la dose de lycopène à des teneurs suffisamment faibles. Il faut rappeler, à cet égard, qu'il a été suggéré par plusieurs auteurs qu'il n'était pas souhaitable d'augmenter de façon trop importante la dose de caroténoides dans le sang. En effet, si à des doses inférieures à 3 WM dans le plasma sanguin, les caroténoides tels que le lycopène et le (3-carotène permettent de protéger 1'ADN cellulaire des dommages causés par l'oxydation, cette aptitude est rapidement perdue à des doses supérieures à 4 pJM.'A des doses de 4-10 JIM, la présence de caroténoïdes peut même conduire à l'aggravation des dommages causés par l'oxydation [LOWE G. M. et al. Free Rad. Res, 1999, Vol 30, pp. 141-151].

L'invention vise également l'utilisation, dans les produits alimentaires ou diététiques, pour la prévention des risques des maladies cardio-vasculaires, d'un système antioxydant comprenant du lycopène, de la vitamine E et de la vitamine C, les rapports vitamine E/lycopène et vitamine

C/lycopène étant compris entre 0.5 et 25/1, de préférence entre 8/1 et 10/1 et plus préférentiellement encore entre 1/1 et 5/1. Elle vise en outre l'utilisation pour le même but d'un système antioxydant contenant en outre des polyphénols, le rapport polyphénols totaux/lycopène étant de 3/1 à 300/1, de préférence de 5/1 à 125/1, et plus préférentiellement encore de 7/1 à 70/1.

Les polyphénols préférés étant des polyphénols riches en OPC, le rapport OPC/lycopène du système antioxydant préférentiellement utilisé conformément à l'invention est compris entre 1/1 et 150/1, de préférence entre 1.5/1 et 65/1, et plus préférentiellement encore entre 5/1 et 20/1.

L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition alimentaire ou diététique conforme à l'invention.

En toute généralité, ce procédé comprend des étapes de sélection de chacun des ingrédients, de leur composition, de mesure pondérale ou volumétrique des quantités voulues de chacun de ces ingrédients, de mélange, de traitement-cette étape pouvant elle-même comprendre des opérations telles que cuisson, fermentation, réfrigération, atomisation, solubilisation, dilution, extrusion-de mise en forme, et enfin de conditionnement.

Les antioxydants utilisés conformément à l'invention peuvent être ajoutés ensemble ou séparément au cours de l'une ou de plusieurs de ces étapes. Les antioxydants n'étant pas toujours compatibles entre eux, notamment du fait de la forme plus ou moins liposoluble ou plus ou moins hydrosoluble sous laquelle ils peuvent se présenter, on préfère combiner séparément les antioxydants

lipophiles avec les composants lipidiques ou liposolubles, et les antioxydants hydrophiles avec les composants aqueux ou hydrosolubles.

En ce qui concerne plus particulièrement le lycopène, celui-ci peut être commercialisé sous une forme hydrosoluble, mais celle-ci contient alors des émulsifiants dont l'utilisation n'est pas forcément souhaitable dans les produits alimentaires, notamment dans les produits fermentes ayant des objectifs santé. Du fait de son caractère hautement lipophile et de ses caractéristiques physico-chimiques, qui font que sous forme pure le lycopène fond à environ 105°C pour se solidifier de nouveau au refroidissement, l'incorporation de cet antioxydant s'avère difficile à réaliser. Ceci d'autant plus que les formes commerciales de lycopène ont des points de fusion plus élevés que la molécule purifiée, puisque se situant aux environs de 140°C.

Or, la Société Demanderesse a mis en évidence le fait que pour exercer le maximum d'efficacité, le lycopène devait se trouver sous la forme la plus dispersée et la plus homogène possible dans la composition alimentaire ou diététique finie. Ce point est particulièrement critique pour des compositions comportant des teneurs limitées en matière grasse, en particulier des concentrations inférieures à 60% et même à 50% de matière grasse, par exemple des émulsions H/E.

Elle s'est donc employée à rechercher et à mettre au point un procédé permettant d'incorporer une substance lipophile à point de fusion élevé, telle que le lycopène, dans des compositions alimentaires, en assurant une

répartition homogène de ladite substance lipophile dans lesdites compositions finies.

Ce procédé est caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : -traitement thermique de la substance lipophile à point de fusion élevé à une température voisine ou supérieure à son point de fusion, ou au moins supérieure à son point de cristallisation ; et mélange énergique avec un ou plusieurs produits de la composition alimentaire finale contenant des matières grasses, afin de fournir une phase grasse, -mélange, sous forte agitation, de la phase grasse avec une phase aqueuse contenant de l'eau et le plus généralement un ou plusieurs des autres constituants, comme le cas échéant, d'autres molécules actives du type antioxydants, de la composition alimentaire, -passage du mélange ainsi obtenu, chauffé à une température supérieure à 50°C, sur un appareil d'homogénéisation, de façon à permettre la formation d'une émulsion fine huile dans eau, -refroidissement de 1'émulsion, -constitution de la composition alimentaire finie, par mélange de l'émulsion avec d'autres composants s'il y a lieu, -optionnellement, ce mélange est alors éventuellement suivi d'un nouveau traitement d'homogénéisation et -application d'un ou plusieurs traitements technologiques tels que notamment fermentation, caillage, moulage, réfrigération ou congélation, -stockage et conditionnement du produit fini.

Ce procédé est non seulement adapté à l'incorporation de lycopène dans des compositions alimentaires, mais peut également être utilisé pour incorporer d'autres substances lipophiles à point de fusion élevé telles que notamment les stérols ou leurs dérivés, estérifiés ou non, en permettant d'assurer leur répartition homogène dans le produit fini, conduisant ainsi à une meilleure stabilité des produits, notamment fermentes. La seconde étape d'homogénéisation suivant le mélange de l'émulsion primaire avec les autres composants de la composition alimentaire est particulièrement adaptée à la préparation de compositions contenant des phytostérols, phytostanols, ou leurs dérivés.

Les substances lipophiles à point de fusion élevé dont il est question sont le plus généralement des substances ayant un point de fusion supérieur à 130°C et qui présentent une activité biologique intéressante lorsqu'elles sont incorporées en petites quantités dans des compositions alimentaires telles que notamment des produits à base de lait animal ou végétal, fermentes ou non. Parmi ces substances, on peut citer les phytostérols, les phytostanols et leurs dérivés, estérifiés ou non, ainsi que les composés choisis parmi : 5,7,22-cholestatriénol, 7-de- hydroxholestérol, 22-dehydroxhloestérol, 24- dehydrocholestérol, zymostérol, A7-cholestérol, 7- coprosténol, cholestanol, coprostanol, epicoprostanol, <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> cerebrostérol, 22-a-oxycholestérol, 22-dihydroerogostérol, 7,24 (28)-erogostadiénol, campestérol, neospongostérol, 7- ergosténol, cerebistérol, corbistérol, stigmastérol, focostérol, a-spinastérol, sargastérol, 7- dehydrocryonastérol, poriferastérol, chondrillastérol, ß-

sitostérol, cryonastérol (y-sitostérol), 7-stigmasténol, 22-stigmasténol, dihydro-Y-sitostérol, ß-sitostanol, 14- dehydroergostérol, 24 (28)-dehydroergostérol, ergostérol, brassicastérol, 24-methylènecholestérol, ascostérol, epistérol, fecostérol, 5-dihydroergostérol, et leurs mélanges et plus particulièrementP-sitostanol,(3- sitostérol, ß-sitostanol ester, campestérol et brassicatérol. Dans le cas des phytostérols, des phytostanols et des dérivés de ces substances, il suffira de se placer à des températures supérieures à leur point de cristallisation pour mettre en oeuvre le procédé, sous réserve d'un étape d'homogénéisation initiale bien maîtrisée et suffisamment efficace.

Grâce à leur traitement thermique, soit à une température voisine ou supérieure à leur point de fusion soit au moins supérieure à leur température de cristallisation, avant l'étape d'homogénéisation, les substances lipophiles en question se trouvent incluses dans les globules gras formés lors de l'homogénéisation, celle- ci étant conduite de façon à ce que lesdits globules gras présentent une taille inférieure à 10 microns, de préférence inférieure à 5 microns, et plus préférentiellement encore inférieure à 3 microns.

Les pressions d'homogénéisation sont choisies supérieures à 50 bars, de préférence supérieures à 100 bars et il peut être avantageux, dans certains cas, d'effectuer plusieurs opérations d'homogénéisation successives, de façon à obtenir des globules gras présentant une répartition de taille homogène.

Comme indiqué précédemment, on préfère mélanger, avant l'étape d'homogénéisation, les substances lipophiles

à point de fusion élevé avec des matières grasses ou, plus généralement, des composés lipophiles entrant dans la composition du produit final. Avantageusement, on utilise comme matière grasse une matière grasse laitière anhydre à bas point de fusion ou à une huile végétale riche en acides gras polyinsaturés et à bas point de fusion.

Le procédé selon l'invention permettant d'incorporer, de façon homogène et sous forme très dispersée, des substances lipophiles à point de fusion élevé dans des compositions alimentaires est particulièrement adapté aux compositions alimentaires présentant, sur produit fini, un taux de matière grasse compris entre 0,2% p/p et 6% p/p, de préférence compris entre 0,5% et 3% et, plus préférentiellement encore compris entre 0,8% et 1,5% La teneur de la composition alimentaire ou diététique finie en substances lipophiles à point de fusion élevé est généralement comprise entre 0,0005% p/p et 2%, de préférence entre 0,001% et 1% En ce qui concerne le lycopène, les études entreprises par la Société Demanderesse semblent indiquer que la biodisponibilité serait liée au degré de dispersion du lycopène, c'est-à-dire en fait à la taille des particules ou des cristaux de lycopène dans le produit fini.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut donc procéder tout d'abord à une émulsification du lycopène afin d'obtenir une dispersion très fine de celui- ci. Après refroidissement du produit à température ambiante ou à la température de réfrigération ou de congélation, selon le cas, le lycopène cristallise ou se solidifie dès

lors sous la forme de microparticules qui ne donnent pas lieu à la croissance de cristaux de taille trop importante.

L'émulsification du lycopène est préférentiellement effectuée dans un appareil d'homogénéisation à des pressions supérieures à 50 bars et de préférence supérieures à 100 bars, de façon à ce que les cristaux de lycopène dans le produit fini présentent une dimension inférieure à 10 microns, avantageusement inférieure à 5 microns. Ils sont inclus dans les globules gras et idéalement, les cristaux de lycopène ont une dimension d'environ 1 à 3 microns.

A titre d'exemple, lorsque l'on souhaite préparer un produit laitier, tel qu'un yoghourt, à l'invention, on peut tout d'abord préparer une pseudo- crème, en mélangeant d'une part du lycopène sous forme d'une cire liquéfiée par traitement thermique à température élevée, généralement supérieure à 120°C et de préférence supérieure à 140°C, et d'autre part de la matière grasse laitière anhydre chauffée à une température d'environ 80- 90°C, additionnée éventuellement de vitamine E. Ce mélange est alors émulsionné avec un lait reconstitué à partir de poudre de lait, chauffé à 70-80°C, par agitation violente, par exemple sur ultra-turrax. La pseudo-crème ainsi obtenue est ensuite homogénéisée, après une étape de flash- stérilisation, à une pression supérieure à 50 bars. Cette pseudo-crème peut être utilisée directement ou être refroidie puis stockée à 10°C avant d'être utilisée pour fabriquer le produit fini. Ce dernier, qui contient tous les antioxydants utilisés conformément à l'invention, peut être obtenu en mélangeant la pseudo-crème avec un lait éventuellement supplémenté en polyphénols, le mélange ainsi

obtenu étant pasteurisé et homogénéisé à une pression supérieure à 100 bars, puis refroidi et ensemencé avec des ferments et fermenté à une température comprise entre 35 et 44°C pendant 4 à 16h, dans le cas de la préparation de yoghourt. La vitamine C peut être introduite au cours des différentes étapes du procédé, notamment dans le lait de départ ou après fermentation, par l'intermédiaire par exemple d'une préparation de fruits.

L'invention pourra être mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, qui sont donnés à titre purement illustratif.

Exemple 1 : Résultats sur l'activité anti-radicalaire sur les LDL.

Méthodologie : La capacité antioxydante sur LDL est appréciée d'après la mesure de vitesse d'apparition des diènes conjugués par spectrophotométrie UV (234 nm) sur des lipoprotéines de basse densité humaines (LDL à la concentration de 100 um/ml), incubées en présence de cuivre (Cu++ = 1. 66, uM) pendant 8 heures à 30°C (une mesure est effectuée toutes les dix minutes).

Chaque essai est répété une fois (deux déterminations) et la seconde répétition est effectuée une journée différente, mais sur un même lot de LDL.

Les résultats peuvent être exprimés en durée de phase de latence (en minutes) et en écart (en pourcentage) de la phase de latence par rapport au témoin.

Préalablement, des essais ont été conduits, sur chacun des ingrédients pris isolément, essais qui ont

permis de déterminer la valeur IC50 exprimée en ug/ml, correspondant à la concentration en ingrédients capables d'oxyder 50% des LDL présentes dans la solution. Ces doses ont servi de points de repère pour le choix des concentrations en ingrédients testées au niveau du plan d'expérience.

Antioxydants testés Les antioxydants suivants sont testés : - lycopène : sous forme d'oléorésine LycoRed à 8% -polyphénols riches en OPC : extrait de polyphénols de raisin de DRT, Vitaflavan II -Vitamine E : a-tocophérol SIGMA -Vitamine C : acide ascorbique SIGMA Les valeurs d'IC50 trouvées sont respectivement de 7000 uM pour le lycopène, de 0,67 ug/ml pour les polyphénols, de 4.00 ug/ml pour la vitamine E et de 0,80 ug/ml pour la vitamine C.

Résultats : I1 apparaît que si l'on prend isolément le lycopène, sous forme d'oléorésine, et que l'on teste l'accroissement de l'activité antioxydante sur LDL, on obtient les résultats suivants : -200.10-7 M de lycopène : accroissement de la phase de latence de 7 % -300.10-7 M de lycopène : accroissement de la phase de latence de % -400.10-7 M de lycopène : accroissement de la phase de latence de 39%

-500. 10-7 M de lycopène : accroissement de la phase de latence de 65%.

Si l'on associe le lycopène en concentration de 0.5.10-7 M aux polyphénols riches en OPC, à la vitamine E et à la vitamine C, selon un plan d'expérience orthogonal qui fait varier les concentrations en polyphénols entre 0.01 ug/ml et 0.2 ug/ml, en vitamine E entre 1 et 4 ug/ml, en vitamine C entre 0.2 et 0.8 ug/ml, les accroissements de phase de latence se situent alors entre 32% et 117%, soit une efficacité de l'ordre de celle du lycopène multipliée par un facteur de 1000 environ, ce qui démontre la synergie obtenue grâce à l'interaction entre les antioxydants utilisés.

De même, si l'on prend isolément les polyphénols riches en OPC et qu'on les teste sur l'accroissement de l'activité antioxydante sur LDL, on obtient : -pour 0.1 pg/ml de polyphénols : un accroissement de la phase de latence de 5.7%, -pour 0.5 ug/ml de polyphénols : un accroissement de la phase de latence de 33,5%.

Si l'on associe désormais les polyphénols en concentration 0.01 ug/ml à du lycopène, de la vitamine E et de la vitamine C selon un plan d'expérience orthogonal qui fait varier les concentrations en lycopène entre 0.05 uM et 0.1 uM, en vitamine E entre 1 et 4 ug/ml, en vitamine C entre 0.2 et 0.8 ug/ml, alors les accroissements de phase de latence se situent entre 17% et 60%, soit une efficacité de l'ordre de celle des polyphénols, multipliée par un facteur de 50 environ.

Exemple 2 : Fabrication d'un yoghourt Une pseudo-crème est préparée en mélangeant du lycopène sous forme d'oléorésine liquéfiée par traitement thermique à 140°C avec de la matière grasse laitière anhydre (MGLA) chauffée entre 80 et 90°C et additionnée de vitamine E. Ce mélange est émulsionné avec un lait reconstitué à partir de poudre de lait, chauffé à 70-90°C, par agitation violente sur ultra-turrax. La pseudo-crème ainsi obtenue est soumise à une flash-stérilisation à 120°C, puis homogénéisée à environ 50-150 bars. La pseudo- crème est ensuite refroidie puis stockée à 10°C.

Le yoghourt contenant les quatre antioxydants du système antioxydant conforme à l'invention est obtenu en mélangeant les polyphénols riches en OPC préalablement broyés sur broyeur colloïdal avec du lait, ce lait supplémenté au dernier moment en vitamine C étant ensuite mélangé à la pseudo-crème préalablement préparée et ramenée à une température de 20°C. Le mélange ainsi préparé est pasteurisé à 95°C pendant 8 minutes, puis homogénéisé à 200 bars, puis refroidi à environ 39°C avant d'être ensemencé avec des ferments constitués par des ferments constitués d'une association bien choisie de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. La fermentation est poursuivie pendant 7 h 30 à une température de 38°C. Après lissage et refroidissement, le produit est conditionné. Il présente un taux de matière grasse d'environ %.

Le tableau 1 ci-après présente la nature des différents ingrédients, leurs quantités respectives, et leurs pourcentages dans la pseudo-crème.

Tableau 1 Ingrédients Quantité en g/kg de mix Quantité en % Eau 10,595 70,64 Poudre de lait écrémé 1,308 8,72 MGLA 2, 512 16, 74 Oléorésine lycopène 0, 525 3,50 Vit E covitol 1 100 0, 060 0, Total 15 100

Exemple 3 : Préparation d'un yoghourt contenant le système antioxydant selon l'invention De la poudre de lait écrémé et du casemate, préalablement réhydratés, sont mélangés à du lait à 0% de matière grasse. Les polyphénols riches en OPC sont additionnés au mélange obtenu et le tout est véhiculé à travers un broyeur Sylverson. Parallèlement, une pseudo- crème enrichie en lycopène et vitamine E est préparée de la façon suivante : une oléorésine de lycopène, préalablement chauffée à une température supérieure à 140°C, est ajoutée à la MGLA portée à une température supérieure à 70°C, puis le mélange est émulsifié sur ultra-turrax, à une température d'environ 75°C, puis réchauffé à environ 80- 120°C avant d'être homogénéisé à une température de 80°C.

La pseudo-crème ainsi obtenue présente un taux de matière grasse d'environ 20 à 30% et elle est mélangée au mélange lait/caséinate/OPC, avant d'être pasteurisée à 95°C pendant 8 minutes, puis homogénéisée à 100 bars. Le mix ainsi pasteurisé et homogénéisé est ensuite ramené à la température de fermentation, puis ensemencé par un mélange

de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus.

La fermentation est conduite à environ 38°C pendant 8 heures, jusqu'à atteindre un pH de 4.6.

La vitamine C est ajoutée via une préparation de fruits au produit qui est ensuite brassé puis refroidi à température inférieure à 20°C et dosé dans des pots de 125g.

Le tableau 2 ci-dessous présente les différents ingrédients et leurs quantités et pourcentages respectifs.

Tableau 2 Ingrédients Quantité en ka Quantité en % Lait à 0% de MG 35, 326 88,310 Poudre de lait écrémé 0, 370 0, 930 Lactal 70 0, 200 0, 500 Caséinate 0, 384 0, 960 Sucre 2, 000 5, 000 Crème laitière à 30 % de 0,720 1,800 Matière Grasse Pseudo-crème 0, 960 2, 400 Polyphénols 0, 024 0, 060 Ascorbate de sodium 0, 040 Exemple 4 : Etude contrôlée contre placebo de l'effet protecteur sur l'oxydation des LDL de l'administration de yoghourt comprenant un système oxydant conforme à l'invention Des yoghourts"nature sucrés"ont été préparés conformément au procédé décrit à l'exemple 3, le ferment

utilisé étant un mélange classique pour yoghourt de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus.

Ces yoghourts, présentant un taux de matière grasse égal à 1.2 %, contenaient à la fois du lycopène, de la vitamine E, de la vitamine C et des OPC en les quantités respectives indiquées dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 Antioxydants par pot de 125 g Lycopène (oléorésine lycopène 6 %, LYCORED) 5 mg Vitamine E (acétate de tocophérol, COVITOL 100 de 10 mg HENKEL) Vitamine C (ascorbate de sodium, ROCHE) 10 mg OPC de pépins de raisin (LEUCOSELECT HF (2) de 75 mg INDENA) La formulation de ces yoghourts était la suivante : Tableau 4 Ingrédients Formule masse blanche Lait (0.5 g/1 MG et 3.2% protéines) 88.84 % Crème (400 g/l) 1.66 % Poudre de lait écrémé 3. 38 % Caséinate de sodium 0. 5 % Sucre 5 % OPC (LEUCOSELECT HF (2) de INDENA) 0.075 % Vitamine C (ascorbate de sodium de ROCHE) 0.026 % MGLA (milk extra Corman) 0.36 % Lycopène (oléorésine 6% de LYCORED) 0.1233 % Vitamine E (COVITOL 1100 de HENKEL) 0. 0149 % Ferment 0. 02 % TOTAL 100 %

L'essai a été réalisé en double aveugle, contrôlé contre placebo, monocentrique en deux groupes parallèles, chez des sujets sains. Un yoghourt par jour enrichi aux antioxydants, ou un placebo, contenant un mélange de colorants (carmin et triazine) a été administré pendant une durée de 28 jours. Les échantillons de plasma ont été conservés à-80°C dès le jour de leur prélèvement. Le groupe de sujets ayant consommé les yoghourts selon l'invention a été dénommé groupe A, le groupe ayant consommé le placebo a été dénommé groupe B.

L'ensemble des résultats concernant les tests d'oxydation du plasma et des LDL montre qu'à l'issue de la période de prise, les échantillons (plasma et LDL)

appartenant au groupe A résistent mieux que ceux du groupe B à l'oxydation induite in vitro : 1) à l'issue de la période de prise, la résistance des LDL à 1'oxydation est diminuée dans le groupe B par rapport au groupe A (diminution significative de la lag-phase). De plus, la vitesse maximale de formation des diènes conjugués et la quantité totale de diènes conjugués formés sont significativement diminuées dans le groupe A à l'issue du test par rapport au début, alors que ces paramètres n'évoluent pas de façon significative dans le groupe B, 2) à la fin de la période de prise, les quantités de TBARs (ensemble des substances réactives à l'acide thiobarbiturique) formés dans le groupe A sont plus faibles que dans le groupe B après 1 heure et 2 heures d'oxydation des LDL. Le système antioxydant conforme à l'invention entraîne en réalité une diminution significative de la quantité de TBARs formés dans le groupe A (cette diminution est significative à la première heure), 3) dans le groupe A, les quantités d'hydroperoxydes formés dans les LDL après 1 heure d'oxydation sont plus faibles à la fin de la période de prise qu'au début, 4) le produit placebo diminue de façon significative l'activité antioxydante plasmatique totale dans le

groupe B alors qu'il n'y a aucun effet significatif dans le groupe A. Ces résultats suggèrent que le système antioxydant (groupe A) aurait augmenté de façon modérée la résistance des prélèvements biologiques à l'oxydation, alors que le produit "placebo" (groupe B) aurait au contraire diminué la résistance à l'oxydation des échantillons.

L'observance au produit, évaluée au milieu et à la fin de chaque période de prise, a été bonne et non significativement différente, que les différences soient analysées intra groupes ou inter groupes.

La durée d'exposition théorique de chacun des deux groupes était de 28 jours. La durée réelle n'a pas été significativement différente pour les deux groupes. La tolérance a été bonne et non significativement différente entre les groupes et les périodes. Aucun sujet n'a arrêté son traitement pour effet indésirable grave ou non.

L'ensemble des résultats concernant les tests d'oxydation du plasma et des LDL montre donc qu'à l'issue du traitement, les échantillons appartenant au groupe A résistent mieux que ceux du groupe B à l'oxydation induite in vi tro.

Exemple 5 Cet exemple illustre l'incorporation ß- sitostérol ((3-sitostérol du fournisseur DRT, titrant entre 95 et 100 % de stérols totaux, répartis sur les formes : 3- sitostérol, 5-sitostanol, campestérol, campestanol) dans

une composition alimentaire, sous une forme finement dispersée et répartie de façon homogène.

Cette substance lipophile se présente sous forme d'une poudre blanche, avec un point de fusion situé entre 139 et 142°C. Elle est insoluble dans l'eau, peu soluble dans l'alcool et soluble dans la matière grasse sous certaines conditions (chauffage fort supérieur à 100°C et agitation efficace).

Dans une première étape, une phase grasse a été préparée, comprenant 15 % de 5-sitostérol DRT et 85 % de matière grasse laitière anhydre à bas point de fusion (10°C) : MGLA 10 de la Société CORMAN. Le mélange a été réalisé par chauffage à une température de 100°C sous forte agitation dans un mini-fondoir.

Dans une seconde étape, la phase aqueuse a été préparée, contenant 60 % d'eau, 37 % de PLE (poudre de lait écrémé) et 3 % de caséinate de sodium (fournisseur ARMOR Protéines). Cette phase aqueuse a été préparée dans un fondoir couplé à une boucle d'eau surchauffée. Le mélange une fois effectué a été chauffé à 95°C avant d'être mélangé avec la phase grasse.

Dans une troisième étape, le mélange des phases grasse et aqueuse a été effectué (70 % de phase aqueuse + 30 % de phase grasse), sous forte agitation, à une température d'environ 95°C.

Dans une quatrième étape, le mélange ainsi obtenu, maintenu à une température de 95°C, a été introduit en tête d'un homogénéisateur 400 bars/100 bars, conduisant à l'obtention d'une crème homogénéisée. Cette crème a ensuite été refroidie et mélangée avec du lait à 0 % de matière grasse, le mélange obtenu étant préchauffé à 75°C,

pasteurisé à une température de 95°C, avant d'être homogénéisé à une pression de 100 bars. Après chambrage pendant 8 minutes et prérefroidissement à 39°C, le mélange a été ensemencé avec 0.02 % de ferment lactique (le même qu'à 1'exemple précédent). Après fermentation à 38°C, lissage et refroidissement, le produit a été conditionné dans des pots de 125 g.

Les tableaux 5 et 6 ci-dessous présentent respectivement la formulation de la crème reconstituée et la formulation du produit fini.

Tableau 5 Ingrédients % Eau 42 PLE 25. 9 Caséinate de sodium (ARMOR Protéines) 2.1 5-sitostérol DRT 4.5 MGLA 10 25. 5 TOTAL 100 Tableau 6 Ingrédients% Lait 0 90. 39 PLE 2 Casemate de sodium (ARMOR Protéines) 0.5 Crème reconstituée 7.11 TOTAL 100 Le tableau 7 présente quant à lui les qualités physico-chimiques de la crème et du produit fini.

Tableau 7 Crème Produit fini Extraitsec 57 % 14. 7 % Matière grasse 30% 1. 8% Protéines 10. 9 % Stérols 4. 5 % 0. 32 %

Avant homogénéisation, on a pu observer de très longs et fins cristaux de stérol, d'une taille supérieure à 20 microns. Après homogénéisation, les cristaux de stérol sont petits, arrondis et inclus dans les globules gras. Il peut y avoir également présence d'eau à l'intérieur des globules gras (= globules doubles) ce qui augmente la densité du globule gras et ralentit ainsi le phénomène de crémage pendant la fermentation. Une homogénéisation efficace donne une émulsion très fine et homogène, avec des globules gras d'environ 1 à 3 microns.