Produit alimentaire et son procédé d'obtention

La présente invention concerne un produit alimentaire et son procédé d'obtention. Les sous-produits, résidus ou déchets des industries agricoles et agroalimentaires représentent 30% de la production agricole mondiale. Parmi ces déchets, les résidus lignocellulosiques sont les plus importants. Le développement de technologies vertes pour réutiliser cette source d'énergie en alimentation animale est une perspective de valorisation très intéressante. Cette stratégie vise à réduire la pression sur la productivité agricole en utilisant efficacement toutes les matières premières disponibles, ce qui limite considérablement leur accumulation sous forme de déchets. En plus de l'aspect environnemental et sanitaire, ces sous-produits peuvent représenter une biomasse précieuse si des technologies d'enrichissement en protéine sont mises en œuvre pour répondre et traiter les problèmes réels liés à la nutrition animale.

Toutefois une très petite quantité de ces sous-produits des industries agroalimentaires peut être utilisée en alimentation animale en raison de leur faible digestibilité et teneur en nutriments (protéines et acide aminés essentiels).

Aussi, il existe un réel besoin de fournir des sous-produits agroalimentaires qui soient réutilisables pour la nutrition animale mais qui présentent des propriétés nutritionnelles améliorées.

Une solution à ces problèmes a été proposée par le développement de procédés biotechnologiques, avec l'utilisation de microorganismes dans le but d'améliorer la qualité nutritionnelle de ces résidus représentent une belle opportunité pour une valorisation en alimentation animale.

Les microorganismes sont capables de dégrader les composants récalcitrants à la digestion, tels que les fibres et les composés néfastes comme les facteurs antinutritionnels tout en améliorant la qualité nutritive des déchets par un enrichissement en protéines et vitamines.

En particulier, les tourteaux ont déjà été largement utilisés en biotechnologie pour la production industrielle d'enzymes, antibiotiques, biopesticides, vitamines et autres composés biochimiques. Quelques-uns de ces produits, essentiellement les enzymes, sont d'ailleurs communément utilisés en tant qu'additif alimentaire dans les rations destinés aux animaux d'élevage.

Le contenu en carbohydrates, minéraux ainsi que la structure physique des tourteaux en font de bonnes sources de nutriment et/ou de support pour le développement de microorganismes. Mais ces nutriments ne sont pas facilement assimilables par la majorité des bactéries et levures industrielles (Wang et al., 2010, Enzyme and Microbial Technology, 47 (3), pp. 77-83). De ce fait, la production microbienne d'enzymes dans les tourteaux est beaucoup plus efficace par les moisissures que par les bactéries en raison de leur morphologie et de leur physiologie (présence de nombreuses polymérases) leur permettant de coloniser plus aisément ce type de substrat.

Les souches du genre Aspergillus, Pénicillium et Rhizopus sont les plus réputées pour la production d'enzymes sur tourteau [Sivaramakrishnan and Gangadharan, 2009 Edible OU Cakes (Biotechnology for Agro-lndustrial Residues Utilisation). Springer. 47 Op]

Bien que de te tels procédés permettent d'obtenir une production de protéines, et notamment d'enzymes, la digestibilité des tourteaux n'en est toutefois pas accrue.

Aussi, le besoin d'améliorer les procédés de préparation de produits alimentaires pour la nourriture animale demeure, et notamment en ce qui concerne la nutrition animale.

Un des buts de l'invention est d'obvier aux inconvénients susmentionnés.

Un second but de l'invention est de fournir un produit alimentaire issu de sous- produits végétaux qui soit à la fois facile à digérer, et qui fournisse un apport nutritionnel suffisant.

Encore un autre objet de l'invention est de fournir une composition alimentaire qui apporte un bénéfice nutritionnel et d'autres avantages à l'animal qui le consomme.

L'invention concerne l'utilisation d'au moins une souche de micromycètes pour la préparation d'un produit alimentaire comestible solide fermenté et destiné à l'alimentation animale ou humaine à partir d'un sous-produit issu de végétaux, notamment comestible, ledit produit comestible comprenant ledit micromycètes.

L'invention repose sur la constatation inattendue faite par les inventeurs que les moisissures permettaient d'obtenir un produit alimentaire comestible à partir d'un sous- produit issu de végétaux, ledit produit comestible étant enrichi en nutriments bio disponibles, notamment des protéines, et présentant une bonne digestibilité pour les animaux.

Dans l'invention, il est fait mention de moisissures ou micromycètes ou encore champignons filamenteux microscopiques de manière uniforme. Ces microorganismes pluricellulaires possèdent un appareil végétatif appelé thalle constitué de filaments, les hyphes, qui forment le mycélium visible à l'œil nu. La multiplication par reproduction aséxuée est la plus répandue avec une production de conidies. Chez certains mycètes la multiplication se fait également via une production massive de spores issues de la reproduction sexuée. Ces organismes hétérotrophes sont des parasites (plantes ou animaux) ou vivent en symbiose avec les plantes, ils sont également saprophytes et participent à la décomposition de déchets organiques avec des propriétés lytiques importantes. Les champignons microscopiques sont très répandus, ils jouent un rôle important car ils interviennent dans les grands cycles biologiques comme celui du carbone et de l'azote et sont présents dans de nombreux biotopes essentiellement terrestres. En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une souche de champignon inférieur ou filamenteux pour la préparation d'un produit comestible solide fermenté destiné à l'alimentation animale ou humaine à partir d'un sous-produit issu de végétaux, ledit produit comestible comprenant ladite souche de champignon inférieur ou filamenteux, ladite souche de champignon inférieur ou filamenteux est une souche d'Aspergillus sojae, de Rhizopus oligosporus, de Rhizopus oryzae ou dAspergillus oryzae, notamment une souche choisie parmi Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae.

Notamment, l'invention concerne avantageusement l'utilisation d'au moins une souche de champignon filamenteux pour la préparation par fermentation d'un produit comestible solide fermenté destiné à l'alimentation animale ou humaine à partir d'un sous-produit issu de végétaux,

ledit sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses, ledit produit comestible comprenant ladite souche de micromycètes, ladite souche de de micromycètes est une souche dAspergillus sojae, ou dAspergillus oryzae.

Dans cet aspect avantageux de l'invention, on entend par « oléagineux strict riche en matières grasses » une plante capable de produire des lipides, mais qui n'est généralement pas utilisée pour sa production de protéine. Aussi, de fait, le soja qui est une plante protéo-oléagineuse est exclu des végétaux utilisés dans la cadre de de ce mode de réalisation. De même, le blé ou la betterave sont exclus de ce mode de réalisation.

Dans l'invention, les micromycètes sont les suivants :

- Aspergillus sojae, pour lequel on peut citer notamment les souches suivantes :

ATCC® MYA4878™, ATCC® 9362™, ATCC® 20387™ ; une souche avantageuse est la souche CBS 100934.

- Rhizopus oligosporus, pour lequel on peut citer notamment les souches suivantes : ATCC ® 22959™, ATCC® 60826™, ATCC® 48010™, ou

- Aspergillus oryzae, pour lequel on peut citer notamment les souches suivantes :

ATCC ® 42149™, ATCC® 10124™, ATCC® 20719™, ATCC® 7252™ ; une souche avantageuse est la souche Aspergillus oryzae UMIP 1042.72.

Les inventeurs ont fait la constatation inattendue selon laquelle il était possible d'utiliser les souches de moisissure susmentionnées pour préparer une composition alimentaire fermentée solide comestible à partir de sous-produits de végétaux, ladite composition alimentaire présentant des propriétés nutritionnelles appropriées pour l'animal et une bonne digestibilité. En particulier, la composition alimentaire selon l'invention comprend des nutriments immunomodulateurs issus de la dégradation desdits sous-produits de végétaux fermentés.

Dans l'invention on parlera de nutriments, composés ou compositions immunomodulatrices de manière uniforme.

Dans l'invention, on définit par « composition alimentaire fermentée solide comestible », une substance utilisable pour la nutrition animale ou humaine qui présente les caractéristiques suivantes :

- elle est fermentée, c'est à dire qu'elle a subit une dégradation de sa composition du fait de la fermentation desdits champignons susmentionnés (dégradations en enzymatique des protéines, des sucres et des lipides),

- elle est solide, c'est-à-dire qu'elle présente une consistance relativement ferme par opposition aux liquides, et malgré les dégradations qu'elle a subi ou peut subir,

- elle est comestible, c'est-à-dire qu'elle est propre à être utilisée comme aliment par l'homme ou par l'animal, et qu'elle n'est pas susceptible, sous réserve d'absence de contamination par des pathogènes, de causer des troubles alimentaires ou d'engendrer de pathologies.

Dans l'invention, la composition est dite solide, ce qui signifie qu'elle est ferme et présente une certaine résistance, contrairement aux liquides. Bien que la composition puisse contenir plus de 50% d'humidité avant séchage, la composition sera majoritairement solide, présentera les propriétés susmentionnées, et sera donc dite « solide ». Après séchage, la composition pourra comprendre plus 5% d'humidité, et sera toujours considérée comme « solide ».

La fermentation en milieu solide (FMS) est caractérisée par une croissance microbienne sur des particules solides humides en absence d'eau libre. Elle est particulièrement bien adaptée aux microorganismes fongiques. Ces derniers se développent dans un système constitué de trois phases : une matrice solide, une phase liquide qui lui est liée et une phase gazeuse prise au piège entre et à l'intérieur de celles-ci (Rahardjo et al., 2006, Biotechnology Advances, 24 (2), pp. 161 -179). Le type de substrat généralement utilisé est une matière première naturelle peu onéreuse issue de résidus agricoles faisant à la fois office de support et de source de carbone et d'énergie pour les microorganismes (Rodriguez Couto and Sanroman, 2006, Journal of Food Engineering, 76, pp. 291 -302 ; Hôlker and Lenz, 2005, Current Opinion in Microbiology, 8, pp. 301 -306).

Avantageusement, la composition solide selon l'invention comprend un taux d'humidité d'environ 12%, ce qui correspond au taux d'humidité du sous-produit issu de végétaux à la sortie d'usine.

Dans l'invention, on définit également par « sous-produit issu de végétaux » les résidus ou déchets des industries agricoles et agroalimentaires.

Les aliments destinés aux animaux d'élevage utilisent notamment des sous-produits de l'agriculture, ou de sous-produits végétaux, auxquels il faut apporter des ingrédients pour améliorer les niveaux d'acides aminés essentiels, de vitamines et de minéraux.

Un des avantages de l'utilisation des micromycètes susmentionnés est qu'elle permet de palier à cet inconvénient d'apport d'ingrédient en permettant, par une dégradation de type fermentation, d'enrichir ledit sous-produit en éléments tels que des protéines, des vitamines, ou encore des dérivés de sucres, et apporter une valeur ajoutée à l'aliment de base.

Par un calcul, les inventeurs savent qu'une conversion de 50% de carbohydrates en biomasse du sous-produit issu de végétaux est obtenue par l'utilisation des champignons selon l'invention. Il y a environ 45% de carbohydrates dans le tourteau de colza, si on considère une consommation uniquement de 20% de ces carbohydrates par les champignons cela signifie que pour 100 g de tourteau 9 g de carbohydrates sont convertis en biomasse, donc 9% de biomasse produite au maximum.

Avantageusement, la description concerne l'utilisation susmentionnée, où ledit sous- produit issu de végétaux est choisi parmi : les graines d'oléagineuses et de proteagineuses, les coques et pellicules d'oléagineux et de proteagineux les tourteaux de plantes oléagineuses, les céréales, les coproduits de céréales (notamment les produits d'amidonnerie, de distillerie, de brasserie ...), les produits de la fabrication du sucre et des jus de fruits (betterave, agrumes, raisins, canne à sucre), ou le maïs.

De manière avantageuse, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ledit sous-produit issu de végétaux est issu de végétaux appartenant à la famille des Brassicaceae ou des Asteraceae.

Plus généralement, l'ensemble des sous-produits de végétaux comprenant au moins 1 ,5% de matière grasse par rapport à sa masse totale est avantageux. Des exemples de ces sous-produits sont donnés à l'exemple 6.

Les tourteaux sont les résidus solides obtenus après extraction de l'huile des graines ou des fruits oléagineux. Ce sont les coproduits de la trituration, c'est-à-dire l'industrie de fabrication de l'huile. Ils représentent généralement de 50 à 75 % de la masse des graines. Les tourteaux avantageux de l'invention sont des tourteaux d'amande, d'arachide, de carthame, de chanvre, de colza, de coprah (noix de coco), de coton, de lin cultivé, de maïs (tourteaux de germe de maïs), de navette, de noix, d'olive (tourteaux appelés « grignons » d'olives), de palmiste (tourteaux de noyaux de palmier à huile), de pavot (tourteaux d'œillette ou pavot), de sésame, de soja ou de tournesol.

La pulpe de betterave est un sous-produit de l'industrie sucrière dans les régions tempérées. Lors de l'extraction du sucre, les racines tubérisées sont râpées grossièrement et le jus sucré est récupéré par osmose. Le résidu riche en cellulose digestible prend le nom de pulpe de betterave et peut être utilisé en alimentation animale chez les animaux capables de le digérer (ruminants, cheval, lapins,...) pour les ruminants (seuls capables grâce aux bactéries de leur panse de digérer la cellulose). Il peut être utilisé sous forme de pulpes fraîches riches en eau (15 à 20 % de matière sèche) et doit être en général ensilé ou sous forme de pulpes déshydratées conditionnées en « bouchons » qui peuvent ainsi être incorporées à des aliments composés. Afin d'augmenter la digestibilité de cette pulpe, il est avantageux d'utiliser les champignons filamenteux tels que définis dans l'invention.

Le son, notamment de blé, est constitué par l'enveloppe du caryopse, séparée de l'amande des céréales. Lors de la mouture des céréales, le son fait partie des issues, c'est-à-dire des résidus obtenus après séparation de la farine par tamisage ou blutage. Le son contient notamment des constituants cellulosiques (fibres alimentaires), des protéines, des sels minéraux de l'acide phytique et des vitamines. Afin d'augmenter la digestibilité du son, il est avantageux d'utiliser les champignons tels que définis dans l'invention.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation définie précédemment, où ledit sous-produit issu de végétaux est un tourteau de colza.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation définie précédemment, où lesdits végétaux sont le colza ou le tournesol, notamment le colza.

Avec plus de 25 millions de tonnes par an, la production de tourteau de colza occupe la seconde place après le soja dans la fabrication mondiale de tourteaux. Le tourteau de colza issu de la plante Brassica napus est le principal sous-produit de la production de biodiesel en Europe.

Le tourteau de colza a été traditionnellement utilisé en tant que fertilisant organique. Son utilisation, au niveau mondial, en tant qu'aliment pour animaux monogastriques reste limitée. Généralement, les tourteaux constituent une source de protéine de prédilection pour les animaux d'élevage. Bien que des nouvelles variétés pauvres en glucosinolate et en acide érucique aient été développées, le tourteau de colza en tant qu'aliment et source de protéine pour les animaux reste défavorable par rapport au soja.

En effet, le tourteau de colza présente un taux de protéine totale de 35% contre 45% pour le tourteau de soja.

La concentration en lysine totale du tourteau de colza (1 ,8%) est inférieure de 36% à celle du tourteau de soja (2.8%) et la digestibilité de la lysine (75%) est aussi inférieure à celle du tourteau de soja (91 %) chez le porc. Le tourteau de colza présente des valeurs de méthionine totales plus avantageuses que celles du tourteau de soja (0.70% vs 0.64%) pour une digestibilité légèrement plus faible (87% vs 92%) L'utilisation du tourteau de colza apparaît donc nettement moins avantageuse que celle du tourteau de soja.

Grâce à l'invention, l'utilisation des micromycètes susmentionnés permet de valoriser les tourteaux de colza et notamment de permettre leur enrichissement en protéines bio-disponibles ou protéines solubles, en acides aminés (notamment en lysine, méthionine et arginine), et en substances immunomodulatrices.

Dans encore un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ledit sous-produit issu de végétaux est choisi parmi : les tourteaux, les graines, les coques et pellicules desdits oléagineux strict riche en matières grasses. Le sous-produit peut être utilisé seul, ou éventuellement en mélange avec au moins un autre sous-produit de végétaux, ou tout autre composé ou substance comestible.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une souche de champignon filamenteux pour la préparation par fermentation d'un produit comestible solide fermenté destiné à l'alimentation animale ou humaine à partir d'un tourteau de colza ou de tournesol,

ledit produit comestible comprenant ladite souche de micromycètes, ladite souche de de micromycètes est une souche d'Aspergillus sojae, ou d'Aspergillus oryzae.

Dans encore un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation selon la définition précédente, dans laquelle la préparation dudit produit alimentaire comestible solide fermenté est obtenue par fermentation en milieu solide.

Le procédé de fermentation en milieu solide est défini comme étant une culture de microorganismes (bactéries, champignons et autres) dans un substrat solide sans écoulement d'eau. Il s'agit d'exploiter le métabolisme et le mécanisme de croissance de ces microorganismes et leur métabolisme sur des substrats pour dégrader la matière solide afin d'en produire des substances à forte valeur ajoutée. Le développement microbien se fait, en surface et à l'intérieur de la matrice solide, en absence de tout écoulement liquide. La matrice poreuse peut être constituée d'un substrat naturel ou d'un support inerte capable d'absorber les nutriments qui se trouvent à l'état dissout dans une solution.

Un procédé avantageux de fermentation en milieu solide est décrit ci-après dans la partie Exemples.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite fermentation en milieu solide est réalisée dans les conditions où au moins 1 .10 ⁷ spores de champignon inférieur ou micro mycètes par gramme de matières sèche sont inoculées audit sous-produit de végétaux, notamment environ au moins 1 .10 ⁸ spores de champignon inférieur ou micromycètes par gramme de matières sèche sont inoculées audit sous-produit de végétaux.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite fermentation en milieu solide est réalisée dans les conditions où au moins 1 .10 ⁶ spores de micromycètes ou champignons filamenteux, notamment de 10 ⁶ à 10 ⁸ spores de micromycètes ou champignon filamenteux, en particulier environ 10 ⁷ spores de micromycètes ou champignons filamenteux, par gramme de matières sèche sont inoculées audit sous-produit de végétaux.

Dans un de ses aspects, l'invention concerne une méthode de production d'une produit fermenté solide comprenant un micromycète choisi parmi Aspergillus oryzae et Aspergillus soja, ledit procédé comprenant une étape de fermentation à l'aide dudit micromycète, d'un sous-produit de végétaux, tel que défini précédemment, et notamment, un sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses, avantageusement un sous-produit issu de végétaux appartenant à la famille des Brassicaceae ou des Asteraceae, en particulier un sous-produit de colza ou de tournesol, et plus particulièrement un tourteau de colza.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'un produit alimentaire solide fermenté destiné à la nutrition animale ou humaine comprenant :

- une étape de mise en contact d'au moins une souche de champignon, ladite souche de champignon est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae ou Aspergillus oryzae, en particulier Aspergillus sojae, avec un sous- produit issu de végétaux, et

- une étape de fermentation en milieu solide dudit sous-produit issu de végétaux. Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, ledit procédé comprenant:

- une étape de mise en contact d'au moins une souche de micromycètes, ladite souche de micromycètes, ou de champignon filamenteux, est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, avec un sous-produit issu de végétaux sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses, et

- une étape de fermentation en milieu solide dudit sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses.

Avantageusement, la description concerne un procédé défini ci-dessus, où ledit sous-produit issu de végétaux est choisi parmi : les graines d'oléagineuses et de proteagineuses, les coques et pellicules d'oléagineux et de proteagineux les tourteaux de plantes oléagineuses, les céréales, les coproduits de céréales (notamment les produits d'amidonnerie, de distillerie, de brasserie ...), les produits de la fabrication du sucre et des jus de fruits (betterave, agrumes, raisins, canne à sucre), ou le maïs.

Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, où ledit sous- produit issu de végétaux est issu de végétaux appartenant à la famille des Brassicaceae ou des Asteraceae.

Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, où ledit sous- produit issu de végétaux est choisi parmi : les tourteaux, les graines, les coques et pellicules desdits oléagineux strict riche en matières grasses. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, où ledit sous-produit issu de végétaux est un tourteau de colza.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, comprenant en outre une étape d'inactivation desdits moisissures. L'étape d'inactivation susmentionnée est avantageuse car elle permet d'empêcher la multiplication des moisissures et ainsi de stabiliser la composition alimentaire. L'inactivation des champignons peut se faire par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier tels que l'irradiation, notamment aux UV ou aux rayons β ionisants ou aux rayons gammas (à des doses allant jusqu'à 10 kilogray), ou encore un traitement thermique par chauffage, notamment de type thermisation (traitement à une température de 60 à 62 ^< C), pasteu risation (traitement à une température de 62 à 88Ό) à ou stérilisation (trait ement à une température de plus de ^' Ι ΟΟ'Ό), ou encore par cryogénisation par pulvérisât ion d'azote liquide.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé susmentionné qui comprend en outre une étape de séchage. Le séchage a pour effet de stabiliser les molécules d'intérêt produites ou libérées lors de la fermentation. Cette étape est réalisée par n'importe quelles techniques connues de l'homme du métier, notamment par séchage à l'air froid ou chaud, par pulvérisation sous vide ou par lyophilisation.

L'invention concerne par ailleurs un produit alimentaire solide destiné à l'alimentation animale, et comprenant au moins une souche de micromycète, ladite souche de micromycète est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae, en particulier Aspergillus sojae, et un sous-produit issu de végétaux, le produit alimentaire étant susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini précédemment.

Avantageusement, l'invention concerne un produit alimentaire solide destiné à l'alimentation animale, et comprenant au moins une souche de micromycètes, ladite souche de micromycètes, ou de champignon filamenteux, est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et un sous-produit issu de végétaux, ledit sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses, le produit alimentaire étant susceptible d'être obtenu par le procédé défini précédemment.

Avantageusement, l'invention concerne un produit alimentaire solide destiné à l'alimentation animale, et comprenant au moins une souche de champignon, ladite souche de champignon est une souche d'Aspergillus soja, dAspergillus oryzae, de Rhizopus oligosporus ou de Rhizopus oryzae, et un sous-produit issu de végétaux, le produit alimentaire étant susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini précédemment.

La composition susmentionnée est nouvelle. Elle est caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité variable de protéines bio disponibles, c'est-à-dire directement assimilables par l'animal, et notamment des β-glucanes également bio disponibles. Elle comprend par ailleurs des restes des champignons qui ont servi à la fermentation.

La composition comprend en outre pour 100g de sa masse de sous-produit de végétaux environ 9 grammes de carbohydrates convertis en biomasse, c'est-à-dire environ 9 % de biomasse, au maximum.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, la composition alimentaire susmentionnée comprend lesdits champignons sous une forme inactivée, c'est à dire sous une forme ne permettant plus leur croissance ou leur multiplication. Lesdits champignons sont notamment tués, de sortes que seules demeurent dans la composition les macromolécules composant les microorganismes, les différents mécanismes permettant la multiplication et la reproduction des micromycètes étant inhibés ou inactivés.

Un moyen d'inactiver les champignons du produit alimentaire est de le soumettre à un traitement connu de l'homme du métier, et notamment une étape d'irradiation et/ou de traitement thermique, ou les moyens mentionnés précédemment.

Une étape de séchage peut également être réalisée afin de stabiliser les molécules d'intérêt. Cette étape est réalisée par n'importe quelles techniques connues de l'homme du métier, notamment par séchage à l'air froid ou chaud, par pulvérisation sous vide ou par lyophilisation.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un produit alimentaire solide fermenté, notamment selon la définition précédente, destiné à l'alimentation animale comprenant du tourteau de colza et au moins une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae, en particulier Aspergillus sojae, ledit produit alimentaire solide fermenté présentant une activité immunomodulatrice au moins trois fois supérieure audit produit alimentaire non fermenté (test NBT sur neutrophiles sanguins).

Avantageusement, l'invention concerne un produit alimentaire solide fermenté, notamment la définition précédente, destiné à l'alimentation humaine ou animale comprenant

- du tourteau de colza et

- au moins une souche de micromycètes ou de champignons filamenteux choisie parmi les souches suivantes : Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, ledit produit alimentaire solide fermenté présentant une activité immunomodulatrice au moins deux fois supérieure à celle dudit produit alimentaire non fermenté.

Les autres tests in vitro sur les cellules monocytes du sang périphérique (PBMC) ou les macrophages différenciés de la moelle osseuse (BMDM) montrent également une activité immunomodulatrice supérieure au produit non fermenté. D'après la littérature cette activité immunomodulatrice peut être liée à la présence de β-glucanes qui font partie intégrante de la biomasse de certains microorganismes tels que les champignons.

Un β-glucane (bêta-glucane) est un polysaccharide entièrement constitué de D- glucose liés par des liaisons bêta. Les liaisons peuvent être β(1 -3), β(1 -4) ou β(1 -6), les chiffres indiquant les atomes de D-glucose concernés. Les β-glucanes forment un groupe diversifié de molécules. On les trouve essentiellement dans la cellulose des plantes, le son des céréales, les parois cellulaires de levures, notamment de levures de boulanger, et de certains champignons et bactéries.

Il a été démontré que les β-glucanes sont des facteurs d'amélioration de l'activité des macrophages et des neutrophiles. Ces composés augmentent la résistance aux infections liées aux bactéries gram négative, et sont des agents présentant des propriétés anticancéreuses, antibactériennes et antioxydantes. De plus, l'effet des β- glucanes peut être renforcé par les α-mannanes également liés à la paroi cellulaire des microorganismes, notamment des champignons. Les β-glucanes sont considérés comme d'intérêt en nutrition en tant que fibres solubles ou agents texturants, en particulier ceux provenant de l'avoine ou de l'orge. L'intérêt nutritionnel des β-glucanes est donc majeur.

La fermentation des sous-produits issus de végétaux opérée par les champignons susmentionnés permet un enrichissement en β-glucanes car ceux-ci font partie intégrante de la biomasse fongique, ils sont donc présents à une quantité supérieure à celle desdits produits non fermentés. Un moyen d'évaluer l'activité immunomodulatrice des produits est d'utiliser le test NBT décrit dans les exemples.

Avantageusement, l'invention concerne un produit alimentaire solide fermenté selon la définition précédente, où ledit produit immunomodulateur comprend au moins un β- glucane.

Les métabolites stimulant le système immunitaire sont avantageux pour le traitement et la prévention de certaines maladies en cas d'immunodéficience (allergies, cancers, maladies auto-immunes, et gastro-intestinales) ou en combinaison avec une thérapie à base d'antibiotique. Ces molécules bioactives ont essentiellement été isolées chez les champignons médicinaux couramment utilisés en Asie. La production en milieu liquide est plus efficace dans le cadre des macromycètes ou champignons supérieurs car la culture en milieu solide pour obtenir le carpophore est un processus long qui nécessite un à plusieurs mois. La croissance en milieu liquide accélère la croissance et permet de récolter du mycélium avec les substances bioactives en quelques jours. Ces substances (polysaccharides dont β-D-glucanes et α-mannanes, protéines ou peptides, triterpènes, lipides et phénols) induisent en majorité la mitogénicité et l'activation des cellules immunitaires telles que les cellules souches hématopoïétiques, lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques et cellules tueuses.

Par ailleurs, l'invention concerne également un produit alimentaire tel que défini précédemment, pour son utilisation en tant que médicament, notamment en tant que médicament vétérinaire ou pour une utilisation humaine, ou neutraceutique.

L'invention concerne de plus un procédé de préparation de produit immunomodulateur comprenant :

- une étape de mise en contact d'au moins une souche de champignon filamenteux, ladite souche de champignon filamenteux est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae et Aspergillus oryzae, en particulier Aspergillus sojae, avec un sous-produit issu de végétaux,

- une étape de fermentation en milieu solide dudit sous-produit issu de végétaux, et

- une étape d'extraction des produits immunomodulateurs issus de la fermentation à l'étape précédente.

Avantageusement, l'invention concerne un procédé de préparation de produits immunomodulateurs comprenant :

- une étape de mise en contact d'au moins une souche de micromycètes ou de champignons filamenteux, ladite souche de micromycètes étant une souche d'Aspergillus sojae ou d Aspergillus oryzae, avec un sous-produit issu de végétaux, ledit sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses

- une étape de fermentation en milieu solide dudit sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses, et

- une étape d'extraction des produits immunomodulateurs issus de la fermentation à l'étape précédente.

Avantageusement, les produits immunomodulateurs obtenus par le procédé décrit ci- dessus peuvent être des β-glucanes. .

L'extraction et le séchage des β-glucanes du produit de fermentation peuvent être réalisés par des techniques connues de l'homme du métier, notamment basées sur la technologie des membranes, sur l'extraction liquide-liquide, sur l'absorption, sous vide ou des techniques secondaires.

Ainsi cette étape peut être réalisée par

(i) pressage du liquide suivi d'un séchage par atomisation (ii) en milieu aqueux en présence ou non d'un tampon où l'eau représente 1 à 5 fois le poids du substrat suivi d'un séchage par lyophilisation.

Afin d'améliorer les rendements d'extraction, de concentrer et purifier les β-glucanes, le produit alimentaire (tourteau + champignon) peut être traité par des techniques connues de l'homme du métier notamment il peut être lavé, notamment deux fois, avec de l'eau distillée puis sécher à environ 50^ penda nt environ 8 heures puis repris dans quatre volumes d'éthanol à 95Ό et incubé pendant 8 heures à 4 ^< C.

Après une centrifugation à 11 000 g à 4 ^< C pendant e nviron 40 minutes, le précipité est suspendu dans un volume équivalent d'éthanol à 75% et centrifugé à nouveau. Le précipité est ensuite séché à 40^ afin d'éliminer l'éthanol résiduel (Shenbhagaraman et al., 2012, International Journal of Biological Macromolecules, 50, pp. 957-964).

Alternativement, le produit peut également être repris dans trois volumes d'éthanol à 95^. Après une centrifugation à 11 000 g à 4 ^< C pen dant 10 minutes, le précipité est dialysé sur membrane de cellulose contre de l'eau distillée pendant 48h. La fraction résultante est lyophilisée puis les protéines de la fraction sont éliminées par la méthode de Sevag (Matthaei et al., 1962, PNAS, 48, pp. 666-677). Les β-glucanes sont ensuite fractionnés par colonne Q sepharose Fast Flow (Sigma Aldricht) et élués avec du NaCI. La dernière étape de purification est réalisée sur colonne Sepharyl S-400 avec du NH ₄ C0 ₃ comme éluent avant une lyophilisation finale.

Un autre aspect de l'invention concerne par ailleurs des rations alimentaires constituées essentiellement, soit de 95% à 100%, du produit alimentaire tel que défini précédemment, ou en une composition alimentaire comprenant de 0,1 % à 95% du produit alimentaire tel que défini précédemment additionné à une nourriture classique selon l'animal, et notamment des minéraux, des suppléments nutritionnels, des aliments diététiques, des aliments complémentaires, des concentrés de production, ou des correcteurs azotés.

En d'autres termes, la composition susmentionnée peut être utilisée :

- soit directement comme produit comestible pour les animaux,

- soit comme complément ou additif alimentaire à ajouter dans les rations alimentaires classiques de l'animal concerné.

Dans le cadre de la nutrition humaine, il est possible d'utiliser la composition alimentaire selon l'invention sous forme d'additif. Cet additif peut être sous forme de solution buvable ou injectable, de comprimés, de tablettes, de granulés, gélules, ou sous toutes autres formes galéniques que l'homme du métier est capable de produire dans ce domaine. Cet additif peut par ailleurs être fourni en association avec d'autres composés ou additifs, tels que des vitamines, des sucres, des acides aminés, ou tous autres additifs bien connus de l'homme du métier.

En tant qu'additif alimentaire pour la nutrition humaine ou animale, il est préconisé de fournir de 0,1 % à 5 % de la composition selon l'invention par rapport à la masse totale de la ration alimentaire.

Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour nourrir les animaux comprenant la mise à disposition dans leur alimentation d'un produit alimentaire fermenté solide tel que défini précédemment.

Cette méthode consiste en la mise à disposition d'animaux de rations alimentaires constituées essentiellement, soit de 95% à 100%, du produit alimentaire tel que défini précédemment, ou en une composition alimentaire comprenant de 0,1 % à 95% du produit alimentaire tel que défini précédemment additionné à une nourriture classique selon l'animal, et notamment des minéraux, des suppléments nutritionnels, des aliments diététiques, des aliments complémentaires, des concentrés de production, ou des correcteurs azotés.

Par exemple, pour un ruminant ou un cheval, la méthode consistera à fournir à l'animal en complément de fourrages, soit du produit alimentaire tel que défini précédemment, soit dans un aliment minéral, soit dans un bolus, soit dans un supplément nutritionnel, distribué en l'état, soit dans un aiment de production, soit dans un correcteur azoté additionné de 0,1 % à 95% du produit alimentaire tel que défini précédemment. Par exemple l'aliment de production pour les vaches laitières pourra être constitué de céréales, issus de céréales, de protéagineux, de graines et de tourteaux d'oléagineux, de pulpes de betteraves, de mélasses, d'urée, de minéraux et de vitamines.

Pour les monogastriques, les chiens et les chats, la méthode consistera à fournir à l'animal soit du produit alimentaire tel que défini précédemment, soit un aliment complémentaire ou complet comprenant de 0,1 % à 95% du produit alimentaire tel que défini précédemment. Par exemple le produit pourra être incorporé dans un aliment porcelet constitué de céréales, issus de céréales, de graines et de tourteaux oléagineux, de produits laitiers, d'acides aminés de synthèse, de minéraux et de vitamines.

Ces exemples sont purement illustratifs et ne devraient pas être interprétés comme limitant la méthode de l'invention.

Dans encore un autre aspect, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteux est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le cadre de la prévention ou du traitement des désordres liés à une diminution de l'activité du système immunitaire, et notamment des désordres liés à la digestion animale ou humaine. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un micromycètes, ledit micromycètes étant Aspergillus sojae ou d'Aspergillus oryzae, et

- un sous-produit issu de végétaux étant issu d'un oléagineux strict riche en matières grasses,

pour son utilisation pour son utilisation en tant que médicament ou neutraceutique, notamment dans le cadre de la prévention ou du traitement des désordres liés à une diminution de l'activité du système immunitaire, notamment pour le traitement et la prévention de certaines maladies en cas d'immunodéficience telles que les allergies, les cancers, les maladies auto-immunes, et les maladies gastro-intestinales ou liée à la digestion.

Comme il est mentionné ci-dessus, les métabolites stimulant le système immunitaire, et notamment les β-glucanes, sont avantageux pour le traitement et la prévention de certaines maladies en cas d'immunodéficience telles que les allergies, les cancers, les maladies auto-immunes, et les maladies gastro-intestinales.

Une composition alimentaire comprenant un produit fermenté solide tel que défini ci- dessus, du fait de la présence, entre autres, de β-glucanes bio disponibles permet donc de traiter et surtout de prévenir les problèmes gastro-intestinaux rencontrés par les animaux lors de l'apport de rations alimentaires à partir de sous-produits issus de végétaux.

Aussi, dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteux est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le but de moduler le statut immunitaire des animaux, permettant ainsi d'augmenter la résistance des animaux aux maladies, notamment les maladies infectieuses bactériennes ou virales.

Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteux est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le cadre de la stimulation de l'immunité des jeunes animaux, notamment via la nutrition des reproducteurs. Dans cet aspect de l'invention, les adultes reproducteurs consommant la composition selon l'invention, définie ci-dessus, sont capable de transmettre, notamment par le biais du lait maternel, les composés issus de l'activation du système immunitaire par les composés immunomodulateurs, notamment par les β-glucanes, issus de la fermentation selon le procédé susmentionné, et ainsi stimuler le système immunitaire des jeunes animaux.

Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteuxest une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le cadre de la stimulation la viabilité, de l'état sanitaire et des performances de croissance de jeunes animaux par la stimulation de l'immunité.

Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteux est une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le but de moduler le statut immunitaire humain, permettant ainsi d'augmenter la résistance aux maladies ou de traiter des désordres immunitaires.

Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit fermenté solide comprenant

- un champignon filamenteux, ledit champignon filamenteuxest une souche choisie parmi les souches suivantes Aspergillus sojae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae, notamment Aspergillus sojae, et

- un sous-produit issu de végétaux,

pour son utilisation dans le but de moduler le statut digestif humain, permettant ainsi de diminuer les désordres digestifs.

Avantageusement, l'invention concerne un produit fermenté solide susmentionné pour son utilisation susmentionnée, où ledit sous-produit issu de végétaux est issu de végétaux appartenant à la famille des Brassicaceae ou des Asteraceae.

Avantageusement, l'invention concerne un produit fermenté pour son utilisation susmentionnée, où ledit sous-produit issu de végétaux est choisi parmi : les tourteaux, les graines, les coques et pellicules desdits oléagineux stricts riches en matières grasses.

Avantageusement, l'invention concerne un produit fermenté solide pour son utilisation la définition précédente, où ledit sous-produit issu de végétaux est choisi parmi : les graines d'oléagineuses et de protéagineuses, les coques et pellicules d'oléagineux et de protéagineux les tourteaux de plantes oléagineuses, les céréales, les coproduits de céréales (notamment les produits d'amidonnerie, de distillerie, de brasserie ...), les produits de la fabrication du sucre et des jus de fruits (betterave, agrumes, raisins, canne à sucre), ou le maïs.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un produit fermenté solide pour son utilisation susmentionnée, où ledit sous-produit issu de végétaux est un tourteau de colza.

Dans l'invention qui est décrite ci-dessus, l'homme est inclus dans la notion d' « animaux ».

L'invention concerne donc des compositions et des utilisations qui sont transposables à l'homme. L'invention sera mieux comprise à l'aide des figures et des exemples suivants :

Légende des figures :

La figure 1 représente un graphique montrant l'évolution du pourcentage de C0 ₂ des cultures de champignons sur tourteau de colza au cours du temps. L'axe des abscisses représente le temps en jours et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de C0 ₂ produit. Les souches testées sont les suivantes : 1 = Aspergillus niger ; 2 à 7 = Aspergillus sp. ; 8 = Aspergillus oryzae ; 9 Aspergillus sojae ; 10 = Rhizopus oryzae ; 11 = Rhizopus oligosporus ; 12 = Pénicillium brasilianum ; 28 = Trichoderma harzianum ; 42 = Rhizopus sp. ; T = tourteau seul (témoin).

La figure 2 représente un graphique montrant l'évolution de la perte de masse sèche des cultures de champignons sur tourteau de colza. L'axe des abscisses représente le temps en jours et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de perte de masse sèche du tourteau de colza. Les souches testées sont les suivantes : 1 = Aspergillus niger ; 2 à 7 = Aspergillus sp. ; 8 = Aspergillus oryzae ; 9 Aspergillus sojae ; 10 = Rhizopus oryzae ; 11 = Rhizopus oligosporus ; 12 = Pénicillium brasilianum ; 28 = Trichoderma harzianum ; 42 = Rhizopus sp.

La figure 3 est un histogramme montrant le pourcentage de neutrophiles activés dans A = le sang seul , B = le sang avec des bactéries issues du kit, C = le sang avec le tourteau seul, D = le sang avec un échantillon de tourteau fermenté avec Aspergillus oryzae, E = le sang avec un échantillon de tourteau fermenté avec Aspergillus sojae, F = le sang avec un échantillon de tourteau fermenté avec Rhizopus oryzae et G = le sang avec un échantillon de tourteau fermenté avec Rhizopus oligosporus,

La figure 4 représente un graphique montrant le pourcentage de β-glucane dans le tourteau de colza seul (A), ou du mycélium de Rhizopus oryzae (B), mycélium d'Aspergillus sojae (C), mycélium d'Aspergillus oryzae (D) ou mycélium de Rhizopus oligosporus (E). En contrôle est montrée l'utilisation de β-glucane de levure (F).

Les figures 5A à 5L représentent des photographies de culots cellulaires de cellules sanguines (PBMC).

La figure 5A représente un culot cellulaire de cellules traitées avec le milieu seul.

La figure 5B représente un culot cellulaire de cellules traitées avec le milieu additionné de 10ng/ML de LPS.

La figure 5C représente un culot cellulaire de cellules traitées avec le milieu additionné de 5μΜ de ZVAD.

La figure 5D représente un culot cellulaire de cellules traitées avec le milieu additionné de 100 μΜ de prednisolone.

La figure 5E représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A1 (fraction soluble du mycélium d'Aspergillus sojae) à une concentration de 0,125 mg/mL. La figure 5F représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A1 (fraction soluble du mycélium d'Aspergillus sojae) à une concentration de 0,25 mg/mL. La figure 5G représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A1 (fraction soluble de mycélium d'Aspergillus sojae) à une concentration de 0,5 mg/mL.

La figure 5H représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A1 (fraction soluble de mycélium d'Aspergillus sojae) à une concentration de 1 mg/mL. La figure 51 représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A2 (fraction soluble d'une culture sur tourteau avec Aspergillus sojae) à une concentration de 0,125 mg/mL.

La figure 5J représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A2 (fraction soluble d'une culture sur tourteau avec Aspergillus sojae) à une concentration de 0,25 mg/mL.

La figure 5K représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A2 (fraction soluble d'une culture sur tourteau avec Aspergillus sojae) à une concentration de 0,5 mg/mL.

La figure 5L représente un culot cellulaire de cellules traitées avec l'échantillon A2 (fraction soluble d'une culture sur tourteau avec Aspergillus sojae) à une concentration de 1 mg/mL.

La figure 6 représente un histogramme montrant le pourcentage de viabilité cellulaire des cellules sanguines (PBMC) traitées avec A = le milieu de culture, B = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS, C = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et 5μΜ de ZVAD, et D = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et 100μΜ de prednisolone.

La figure 7 est une courbe représentant la viabilité cellulaire des cellules sanguines en fonction des doses d'échantillon A1 ou A2 additionné de 10ng/mL de LPS. L'axe des abscisses représente la concentration en extrait exprimé en mg/mL. Les courbes avec des triangles blancs ou noirs représentent respectivement les résultats de viabilité obtenus avec les échantillons A2 et A1 . La courbe avec un rond blanc représente la viabilité des cellules sanguines traitées avec un extrait de tourteau ayant fermenté avec un macromycète ( Trametes versicolor).

La figure 8 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine IL-1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par A = le milieu de culture seul, B = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS, C = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et 5μΜ de ZVAD, et D = le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et 100μΜ de prednisolone. L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL. ^*** : différence significative déterminée par le test statistique de l'analyse de la variance (ANOVA)

La figure 9 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine IL-1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les PBMC dans le milieu de culture seul et le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS (A) ou additionné de 10 ng/mL de LPS et différentes concentrations de l'échantillon tourteau seul (T) : (B) : 7 μg/mL, (C) : 15 μg/mL, (D) : 31 ,2 μg/mL, (E) : 62,5 μg/mL, (F) : 125 μg/mL et (G) : 250 μg/mL L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL.

Les figures 10 A et B sont des histogrammes montrant la concentration de l'interleukine I L- 1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les PBMC dans le milieu de culture seul et par le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et différentes concentrations des produits A1 et A2.

La figure 10A est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine IL-1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les PBMC dans le milieu de culture seul (A) et par le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et différentes concentrations ((B) : 0,125 mg/mL, (C) : 0,25 mg/mL, (D) : 0.5 mg/mL et (E) : 1 mg/mL) de produit A1 . L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en mg/mL.

La figure 10B est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine I L- 1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les PBMC dans le milieu de culture seul (A) et par le milieu de culture additionné de 10 ng/mL de LPS et différentes concentrations ((B) : 0,125 mg/mL, (C) : 0,25 mg/mL, (D) : 0.5 mg/mL et (E) : 1 mg/mL) de produit A2. L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en mg/mL.

La figure 11 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine IL-1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les BMDM dans :

A = le milieu de culture seul,

B = le milieu de culture additionné de 1 μg/mL de LPS,

C = le milieu de culture additionné de 1 μg/mL de LPS et 5 μΜ de ZVAD,

D = le milieu de culture additionné de 1 μg/mL de LPS et 70 μΜ de prednisolone et E = le milieu de culture additionné de 1 LPS et 1 μΜ de DEXA.

L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL.

La figure 12 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine I L- 1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les BMDM dans :

A = le milieu de culture additionné de de LPS,

B = le milieu de culture additionné de LPS et de 1 μg/mL de produit PC (produit commercial riche en β-glucane de levure),

C = le milieu de culture additionné de LPS et de 10 μg/mL de produit PC,

D = le milieu de culture additionné de LPS et de 100 μg/mL de produit PC.

L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL.

La figure 13 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine I L- 1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les BMDM dans :

A = le milieu de culture additionné de de LPS,

B = le milieu de culture additionné de LPS et de 1 μg/mL de tourteau seul,

C = le milieu de culture additionné de LPS et de 10 μg/mL de tourteau seul,

D = le milieu de culture additionné de LPS et de 100 μg/mL de tourteau seul.

L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL.

La figure 14 est un histogramme montrant la concentration de l'interleukine I L- 1 β sécrétée dans le milieu cellulaire par les BMDM dans :

A = le milieu de culture additionné de LPS,

B = le milieu de culture additionné de LPS et de 1 μg/mL de culture sur tourteau (48h) avec Aspergillus sojae produit en cuve,

C = le milieu de culture additionné de LPS et de 10 μg/mL de culture sur tourteau (48h) avec Aspergillus sojae produit en cuve,

D = le milieu de culture additionné de LPS et de 100 μg/mL de culture sur tourteau (48h) avec Aspergillus sojae produit en cuve.

L'axe des ordonnées représente la concentration en IL-1 β exprimé en pg/mL.

EXEMPLES

Exemple 1 - Procédés de culture en milieu solide

I. Constitution d'une banque de travail pour micromvcète

Les tubes de gélose inclinée (comprenant du milieu PDA ; gélose dextrosée à la pomme de terre) servent au maintien des souches pures et sont entretenues régulièrement par repiquage.

Pour les souches sporulantes, les spores des champignons sont récoltées par grattage de la surface de la gélose avec de l'eau stérile. Les spores récoltées sont ensuite conservées dans du glycérol à - 80^.

Le milieu PDA est préparé comme suit :

L'infusion de pomme de terre se prépare en faisant bouillir dans l'eau 300 g de pommes de terre tranchées (lavées mais non pelées) pendant 30 minutes puis en laissant décanter le bouillon obtenu ou en le filtrant à travers un coton à fromage. On dilue ensuite en ajoutant de l'eau distillée pour un volume final d'un litre. Puis on ajoute 20 g de dextrose et autant d'agar-agar en poudre avant une stérilisation par autoclave à 100 kPa pendant 15 minutes.

II. Culture en condition non aérée : fiole Erlenmever

Inoculation et préparation du substrat

Afin de pouvoir disposer de suffisamment de spores pour les expérimentations, les souches sont repiquées en fiole de Roux contenant également du milieu gélosé. Celles- ci sont ensuite incubées pendant 4 jours à 30^.

Les cultures sont effectuées dans des fioles Erlenmeyer à col large de 500 mL. Avant inoculation avec le champignon, le milieu solide est autoclavé 20 min à 121 ^< C. Le milieu est ajusté entre 40 et 50% de matière sèche avec de l'eau stérile contenant des sporespour obtenir un taux d'inoculation de 1 x10 ⁷ spores/g sec. La diffusion d'air est très limitée à travers le bouchon en coton

Suivi de la culture

Pendant toute la durée des cultures, des mesures de C0 ₂ sont effectuées afin de suivre la croissance mycélienne. Des observations macroscopiques et microscopiques sont réalisées régulièrement pour visualiser l'apparition de la biomasse. En fin de croissance, l'ensemble du contenu d'une fiole est homogénéisé et récupéré pour un séchage à l'étuve et pour la mesure du pourcentage de matière sèche et pH. Le produit, une fois séché, est stocké à température ambiante en attente des tests de détermination de l'activité immunomodulatrice.

III. Culture en condition aérée : Cuves

Inoculation et préparation du substrat

Les cultures sont menées dans des cuves de capacité maximale 50L. Elles sont alimentées en parallèle avec de l'air dont on peut régler la température, l'humidité relative et le débit. Cet air traverse de bas en haut la couche de culture. Les réacteurs sont stérilisés à la vapeur vive pendant 3h. Le substrat oléagineux est stérilisé à l'autoclave (1 h à 121 ^< C). Le substrat oléagineux es t ensuite ensemencé avec une suspension de spores pour obtrenir un taux d'ensemencement de 1 x10 ⁷ spores/g sec et son pourcentage de matière sèche final est ajusté entre 40 et 50%. Les consignes de départ sont les suivantes : température 28^, humid ité 95% et débit d'air entre 7 et 12m/s.

Suivi de la culture

A des intervalles de temps réguliers des mesures de température sont effectuées dans l'air en sortie et en différents points dans la masse de culture. Des prélèvements réguliers sont réalisés pour le séchage d'échantillons de culture et le dosage de l'activité immunomodulatrice.

Exemple 2 - Culture de champignons sur tourteau de colza

Quatorze souches de moisissures ont été cultivées sur tourteau de colza. L'évolution du pourcentage de C0 ₂ et de la perte de masse sèche a été déterminée pour toutes les souches afin de pouvoir comparer leur croissance.

Souches

Les 14 souches sont les suivantes : Aspergillus niger (isolé de céréales), Aspergillus sp. (6 souches isolées du sol), Aspergillus sojae CBS 100934 et Aspergillus oryzae UMIP 1042.72, Rhizopus oryzae CBS 131512, Rhizopus oligosporus CBS 338.62, Pénicillium brasilianum (isolé du sol), Trichoderma harzianum (isolé du sol) et Rhizopus sp. (isolé d'un aliment). Les souches sont conservées en banque de travail sous forme de tube de gélose inclinée avec du milieu PDA à 25°C ainsi qu'en banque congelé sous forme d'une suspension de spores dans du glycérol à -80Ό.

Procédure d'inoculation

L'inoculum, sous forme d'une suspension de spores, a été obtenu à partir de précultures en fiole de Roux contenant du milieu gélosé PDA. Celles-ci sont incubées pendant 4 jours à 30^. Une suspension de l'ordre d e 1 ^* 10 ⁸ spores/mL selon la souche est obtenue suite au grattage de la surface de la gélose.

Conditions de culture

Les souches sont cultivées sur tourteau de colza en condition non aérée (fiole Erlenmeyer). La quantité de tourteau de colza est adaptée pour obtenir une hauteur de couche humide d'environ 2 cm. Le pourcentage de matière sèche est ajusté entre 40% et 50% avec de l'eau stérile contenant les spores. Quatre fioles par souche sont ainsi réalisées afin d'effectuer des mesures en cinétique nécessitant le sacrifice entier de la culture (1 prélèvement par jour). Toutes les fioles sont mises à incubées à 25^.

Méthodes analytiques

L'évolution du pourcentage de C0 ₂ est mesurée à l'aide d'un analyseur de gaz et le pourcentage de matière sèche en utilisant la méthode de dessiccation à l'étuve pendant 24h à ^" l OS . Cette dernière permet d'évaluer la per te de masse au cours du temps en prenant en compte le poids sec de la culture à l'instant initial. Une fois séchés ces échantillons de culture sont utilisés pour la détermination de l'activité immunomodulatrice avec le kit NBT (Sigma). Les échantillons de culture ainsi que le témoin tourteau seul sont broyés en fine poudre (< 0,5 mm) à l'aide d'un mortier et stockés à température ambiante à l'obscurité. Ces poudres sont ensuite incorporées dans le sang humain pour obtenir une concentration finale de l'ordre du 8 mg/mL. Un total de 100 neutrophiles est compté trois fois par frottis sanguin pour davantage de précision.

Résultats Détermination des paramètres liés à la croissance : CO?

Le pourcentage de C0 ₂ augmente après ensemencement pour l'ensemble des souches étudiées. Il y a donc germination des spores, croissance des microorganismes et consommation du substrat (Figure 1 ).

La souche numéro 8 (Aspergillus sp.) avec un pic à 9% de C0 ₂ après un jour de culture est en avance par rapport à toutes les autres souches. L'évolution est globalement comparable entre les autres souches de champignons. Il se produit vers le 3e jour de culture un ralentissement de la croissance lié à l'épuisement des nutriments disponibles. L'absence de production de C0 ₂ pour le témoin « tourteau seul » (T) confirme l'absence de contaminants.

Détermination des paramètres liés à la croissance : perte de masse sèche

La perte de masse sèche représente la perte de masse du substrat sous forme de C0 ₂ et/ou d'autres composés volatils. La perte de masse du tourteau cultivé avec les 14 souches se situe en moyenne entre 15 et 25% en fin de culture (Figure 2). Celle-ci est en accord avec l'évolution du pourcentage de C0 ₂ , en effet la souche la moins performante (n°11 ) a la perte de masse sèche la plu s faible au cours du temps. Les autres souches restent assez proches comme pour l'évolution du C0 ₂ .

L'ensemble de ces résultats montre que les 14 souches de moisissures sont capables de se développer sur le substrat tourteau de colza.

Exemple 3 - Etude in vitro de l'effet immunomodulateur des produits fermentés solide selon l'invention (test NBT)

Pour étudier la réponse immunitaire avec les cultures sur tourteau de colza les inventeurs ont sélectionné, parmi les souches restantes, uniquement celles qui sont utilisées en alimentation humaine à savoir les champignons utilisés pour l'élaboration de produits fermentés asiatiques. Toutes les autres souches de champignons sont ainsi éliminées du crible car elles pourraient présenter un risque potentiel pour la santé animale (présence d'éventuelles mycotoxines). Il nous reste donc un total de 4 souches de champignons à savoir Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizopus oryzae et Rhizopus oligosporus.

L'activité immunomodulatrice est évaluée avec un kit au NBT (NitroBlue de Tetrazolium ; Sigma). La méthode a été détournée de son utilisation première, c'est-à- dire le diagnostic in vitro pour l'identification d'un dysfonctionnement des neutrophiles ou une infection pyrogène chez l'homme. Le NBT est un sel de tétrazolium, une petite molécule qui pénètre facilement à l'intérieur des globules blancs. En présence d'un agent stimulant (bactéries, toxines, particules de latex et verre, protéine membranaire de levure etc.) les globules blancs s'activent et génèrent des dérivés réactifs de l'oxygène entraînant la réduction du NBT qui précipite alors dans la cellule sous forme de formazan (grains bleu-noir). Un examen microscopique permet ensuite de déterminer le pourcentage de globule blanc activé, c'est à dire les cellules présentant les dépôts intra cytoplasmiques insolubles de formazan.

Un échantillon de sang hépariné est incubé avec une solution tamponnée de NBT en présence d'échantillons de culture, tourteau seul ou de stimulants (bactéries désactivées) fourni dans le kit NBT Sigma.

Préparation d'un extrait de culture pour une incorporation dans le sang

Uniquement 5 μΙ_ d'extrait de culture peuvent être incorporés dans le sang pour la condition stimulée du test au NBT. Afin d'obtenir une stimulation des globules blancs, l'extrait doit être assez concentré comme le stimulant bactérien fourni avec le kit. Pour ce faire, 4 g humides d'un échantillon issu d'une culture sur tourteau de colza sont broyés à l'ultraturax avec un minimum d'eau osmosée (15 ml_). Un volume de 5 μΙ_, de consistance pâteuse, est ensuite prélevé à l'aide d'un cône dont l'extrémité a été coupée pour permettre le passage de quelques fragments de culture dans le sang. Afin de disposer d'un maximum de biomasse et donc de molécules immunomodulatrices, le choix des moments de prélèvement des échantillons pour l'analyse est établi en prenant en compte l'évolution du pourcentage de C0 ₂ au cours du temps ainsi que la sporulation, pour les souches produisant les spores. En ce qui concerne les micromycètes le 2e ou 3e jour de culture est choisi suivant la souche. Lors de ces temps de cinétique, les 4 souches n'ont donc pas encore commencé à sporuler mais ont toutefois produit beaucoup de biomasse puisque le pic de C0 ₂ est passé.

Résultats

L'évolution du pourcentage de C0 ₂ et de la perte de masse sèche permet de discriminer ces quatre souches en termes de croissance. A. sojae et A. oryzae sont les souches les plus performantes sur tourteau de colza. Le pourcentage de C0 ₂ est plus élevé et se maintient sur une plus longue durée par rapport aux deux souches de Rhizopus. Ceci met en évidence un métabolisme mieux adapté au milieu de culture avec notamment la synthèse d'enzymes permettant de dégrader davantage le substrat pour maintenir la croissance après épuisement des nutriments disponibles.

Les neutrophiles sont comptés au microscope.

Le choix du temps de cinétique pour la réponse immunitaire est le 3e jour car les microorganismes n'ont pas encore commencé à sporuler mais ils ont produit un maximum de biomasse puisque les pics de C0 ₂ sont passés. Les résultats de la figure 3 montrent que seules les cultures avec A. oryzae et A. sojae présentent un potentiel immunostimulant concernant l'activation des neutrophiles sanguins. La réponse avec les deux souches de Rhizopus est équivalente au tourteau seul qui induit une stimulation de 5,67%.

Parmi ces 4 souches, A. sojae et A. oryzae ont un potentiel immunomodulateur plus important puisque le contenu en β-glucane de leur biomasse ou mycélium seul est plus élevé par rapport aux Rhizopus. La réponse immunitaire dosée par le test NBT (Figure 3) est corrélée à la quantité de β-glucane présente dans la biomasse ou mycélium des champignons filamenteux (Figure 4).

Exemple 4 - Etudes in vitro de plusieurs produits sur cellules mononuclées sanguines humaines (PBMC) : Recherche d'effets cvtotoxiques et immunomodulateur

L'effet de trois produits Aspergillus (T : tourteau seul, A1 : mycélium seul d'A sojae et A2 : culture sur tourteau avec A. sojae a été évalué sur la toxicité cellulaire et la production d'IL-1 β par les cellules mononucléées sanguines d'origine humaine (PBMC) stimulées par une endotoxine (lipopolysaccharide ; LPS).

Le LPS, utilisé à une concentration non cytotoxique de 10 ng/mL pendant une nuit est inducteur de la production d'IL-1 β par les PBMC.

Les tests de recherche d'inhibition de la production d'IL-1 β réalisés dans cette étude ont été validés par l'utilisation de 2 références internes anti-inflammatoires : l'inhibiteur de caspase et inhibiteur de l'inflammasome NLRP3 (ZVAD) et un corticostéroïde (PRED, prednisolone). Ajouté aux cultures cellulaires en même temps que le LPS, ces 2 molécules inhibent significativement de plus de 50% la production d'IL-1 β.

Protocole :

A partir d'une poche de buffy coat humaine (fournie par l'Etablissement français du sang), la séparation des cellules mononucléées sanguines (lymphocytes + monocytes ou PBMC) de donneurs sains est obtenue par centrifugation sur Ficoll de densité égale à 1 ,077 g/mL. L'anneau opalescent contenant les cellules mononucléées est récupéré soigneusement. Les cellules sont lavées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) par centrifugation à +4 ^< C. Après numération d es cellules viables, 1 x 10 ⁵ cellules sont ensemencées dans chaque puits de plaques 96 puits à fond rond dans du milieu RPMI +10% de sérum de veau fœtal (SVF) +1 % de glutamine +1 % PSA.

Le traitement des cellules par les produits T, A1 et A2 ou par les références internes anti-inflammatoires a été réalisé à l'ensemencement ainsi que la stimulation par une endotoxine (Lipopolysaccharides extrait de Escherichia coli ; LPS 0128:B12). La fraction soluble des produits fournis (A1 , A2) a été testés à 4 concentrations 1 - 0.5 - 0.25 - 0.125 mg/mL (solutions mères préparées extemporanément en milieu de culture à la concentration initiale de 17 mg/mL). Le produit T a été testé aux concentrations suivantes : 7 - 15 - 31 .2 - 62.5 - 125 - 250 μg/mL.

Deux références internes anti-inflammatoires ont été testées : ZVAD (inhibiteur de caspase et inhibiteur de l'inflammasome NLRP3) à la concentration de 5μΜ et PRED (Prednisolone, corticostéroïde) à la concentration de 100μΜ. Le LPS a été utilisé à la concentration de 10 ng/mL. Les surnageants cellulaires ont été récupérés le lendemain (17h30 post-LPS) puis congelés à -20^ afin de réaliser ultérieurement le dosage I L- 1 β . Un test de viabilité cellulaire utilisant le XTT a été réalisé sur le tapis cellulaire. Un reportage photographique a été réalisé après 17h30 de traitement à l'aide d'un microscope optique inversé à contraste de phase muni d'une caméra (Nikon TMS).

Principe du test de viabilité cellulaire : Le XTT, dérivé du tétrazolium, permet de mesurer l'activité métabolique de cellules vivantes en culture. Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales ou extra-mitochondriales des cellules vivantes actives en un composé orangé hautement soluble dans l'eau. La quantité de composé réduit formé est proportionnelle à la quantité de cellules actives métaboliquement et peut être quantifiée en mesurant l'absorbance à une longueur d'onde comprise entre 450-500 nm (490nm) et une contre lecture entre 630 - 690 nm (660 nm). L'appareillage utilisé pour cette mesure est l'Infinité 200M® Pro (société Tecan). Le pourcentage de viabilité cellulaire est déterminé par le rapport au contrôle solvant considéré comme représentant 100% de viabilité cellulaire. Les résultats sont exprimés en % de viabilité cellulaire par rapport au contrôle correspondant (milieu de culture) et exprimés en moyenne ± écart-standard à la moyenne.

Principe du test de dosage de l'IL-W : L'IL-Ι β est dosée par méthode immuno- enzymatique ELISA en sandwich. Les puits d'une plaque 96 puits sont recouverts d'un anticorps de capture. Après ajout du surnageant de culture cellulaire, l'antigène (IL-1 β) va se lier à l'anticorps de capture. Un anticorps de détection est ajouté et se lie à l'antigène. Un anticorps secondaire lié à une enzyme avidine-HRP est ajouté et se lie à l'anticorps de détection. Le substrat est ajouté et est converti par l'enzyme en une forme quantifiable en mesurant l'absorbance à 450 nm. L'appareillage utilisé pour cette mesure est l'Infinité 200M® Pro (société Tecan).

Résultats

1 - Aspects des culots cellulaires après 17h30 de contact des PBMC stimulées au LPS avec les produits A1 et A2:

Les PBMC, composées de monocytes et de lymphocytes, sont des cellules en suspension. Les cellules sont visualisées sous forme d'un culot cellulaire puisque des plaques à fond rond ont été utilisées dans le but de faciliter le regroupement des cellules et préserver ainsi leurs capacités de prolifération. Le traitement des cellules peut modifier l'aspect du culot cellulaire (Figures 5). L'augmentation ou la diminution de la taille du culot indique des effets inducteurs de prolifération ou cytotoxique, la dissociation complète du culot cellulaire peut aussi être observée, comme cela est le cas notamment avec le produit A1 , indiquant une modification des interactions cellulaires.

2- Viabilité cellulaire : Après 17h30 d'incubation, le LPS 0128 :B12, utilisé à la concentration de 10 ng/mL n'induit aucune cytotoxicité en comparaison au contrôle (milieu de culture). L'ajout de 5μΜ de ZVAD ou de 100 μΜ de PRED ne modifie pas statistiquement la viabilité des PBMC. Les résultats ont représentés à la figure 6.

Comme indiqué dans la figure 7, le produit A1 testé à une concentration maximale de 1 mg/mL, ne présentent aucune cytotoxicité majeure, tout comme un témoin négatif. Le produit A2 induit une cytotoxicité d'environ 40% dès la plus faible concentration testée soit 0.125 mg/mL. Il est toutefois noté que cette cytotoxicité n'augmente pas avec la concentration. Une interaction avec le test XTT peut être envisagée.

3- Dosage IL-1 β :

Après 17h30 d'incubation, la stimulation par le LPS, utilisé à la concentration de 10 ng/mL, a induit une production d'IL-1 β par les PBMC (1357 ± 152 pg/mL) en comparaison au niveau basai en présence du contrôle Milieu de culture (4 ± 2 pg/mL).

En présence de LPS, ZVAD (5 μΜ) ou PRED (100 μΜ) induit une diminution significative de 56% de la production d'IL-1 β par les PBMC stimulées.

Ces résultats sont présentés à la figure 8.

En présence de LPS, les deux produits A1 et A2 sont capables de diminuer de façon importante la production d'IL-1 β par les PBMC stimulées par rapport au tourteau seul. Ces résultats sont présentés figures 9 et 10.

Ces résultats démontrent qu'en présence de LPS, les deux produits utilisés à différentes concentrations sont capables d'inhiber significativement la production d'IL- 1 β par les PBMC stimulées par le LPS et de manière doses-dépendantes. Pour le tourteau seul les valeurs restent au même niveau que le milieu cellulaire seul, il n'y a donc aucun effet immunomodulateur avec le produit non fermenté.

Exemple 5 - Etudes in vitro de plusieurs produits sur cellules de moelle osseuse de souris différenciées en macrophages matures (BMDM) : Recherche d'effets cvtotoxiques et immunomodulateur

L'effet de trois produits (PC : produit commercial riche en β-glucane de levure (40%) utilisé en alimentation animale, T : tourteau seul et C48 : culture produite en cuve sur tourteau avec A. sojaé) a été évalué sur la toxicité cellulaire et la production d'IL-1 β par les macrophages matures de souris stimulées par une endotoxine (lipopolysaccharide ; LPS). L'approche initiale avait pour but de vérifier la présence d'une activité pharmacologique dans la partie soluble des produits testés sans toxicité pour le modèle de culture cellulaire le plus adapté : les PBMC. Cependant, le principe actif étant considéré comme insoluble (β-glucane), la présence d'une activité pharmacologique a été réalisée sur le produit complet incluant les particules insolubles. Pour ce faire un autre modèle cellulaire a été testé, à savoir les macrophages, puisqu'il est plus adapté à la présence de particules insolubles, les cellules présentent notamment la capacité de phagocyter les particules.

Le LPS, utilisé à une concentration non cytotoxique de 1 μg mL pendant 24h est inducteur de la prolifération des macrophages et de la production d'IL-1 β.

Protocole :

Les cellules de moelle osseuse de souris sont isolées et prélevées sur des souris saines avant d'être mises en culture pendant 5 jours pour la différenciation en macrophage en présence d'une cytokine mMCSF à 50 ng/mL. Une nuit après l'ensemencement des BMDM en plaque 96 puits, les cellules sont traitées avec les produits complets ou les références internes anti-inflammatoires. La stimulation des BMDM par une endotoxine (Lipopolysaccharides extrait de Escherichia coli ; LPS 0128:B12, ^g/mL) a été réalisée 24h après le traitement. Après une nuit de stimulation, les surnageants cellulaires ont été récupérés puis congelés à -20^ afin de réaliser ultérieurement le dosage IL-Ι β. Un test de viabilité cellulaire utilisant le XTT a été réalisé sur le tapis cellulaire. Les principes du test XTT et du dosage des IL-1 β sont identiques à ceux présentés à l'exemple 4 pour les PBMC.

Les produits complets ont été testés à différentes concentrations : 1 - 10 - 100 μg/mL. Les solutions mères des produits ont été préparées extemporanément en milieu de culture. Trois références internes anti-inflammatoires ont été testées : ZVAD (inhibiteur de caspase et inhibiteur de l'inflammasome NLRP3) à la concentration de 5 μΜ ; PRED (Prednisolone, corticostéroïde) à la concentration de 7 ΟμΜ et DEXA (Dexamethasone, corticostéroïde) à la concentration de 1 μΜ. Le LPS a été utilisé à la concentration de 1 μg/mL.

Résultats

1 - Viabilité cellulaire :

Les produits complets, utilisés seuls, ne présentent aucune toxicité sur les BMDM à 1000 μg/mL, hormis PC (responsable d'une diminution de la viabilité cellulaire de 60%). En présence de LPS, les 3 produits induisent bien une prolifération cellulaire d'environ 70% comme pour le LPS seul par rapport au milieu contrôle.

L'ajout de 5μΜ de ZVAD, de 70 μΜ de PRED ou de 1 μΜ de DEXA en présence de LPS ne modifie pas statistiquement la viabilité des BMDM et induisent bien une prolifération des cellules.

2 - Dosage IL-1 β :

Le LPS, utilisé à une concentration non cytotoxique de 1 μg/mL pendant une nuit est inducteur de la production d'IL-1 β par les BMDM. En présence LPS, les produits de références internes anti-inflammatoires (ZVAD, PRED et DEXA) diminuent la production d'IL-1 β induite par les BMDM stimulés. Une diminution de plus de 75% est d'ailleurs obtenue avec PRED et DEXA. L'ensemble de ces données valident l'expérimentation. Ces résultats sont présentés à la figure 11 .

En présence de LPS, contrairement au produit T, inactif, les produits PC et C48 augmentent significativement la production d'IL-1 β par les BMDM stimulées et de manière dose-dépendante. L'activité immunomodulatrice avec l'échantillon de culture (C48) semble plus importante que celle observée avec le produit commercial (PC), avec une différence de 10 pg/mL pour la production d'IL-1 β à une même concentration testée de 100 μg/mL en présence des BMDM. La réponse immunitaire est plus que doublée avec ce modèle cellulaire pour le produit fermenté (C48) par rapport au produit non fermenté (tourteau seul : T) ou au milieu cellulaire seul additionné uniquement de LPS.

Ces résultats sont présentés figures 12, 13 et 14.

Exemple 6 - Sous-produits de végétaux comprenant au moins 1 ,5% de matière grasse.

Le tableau suivant donne des exemples de végétaux, et de leurs sous-produits, utilisables dans le cadre de l'invention.

Matières premières Taux de MG

WHEATFEED 2

SOLUBLES D AMIDONNERIE 3,5

TOURTEAUX ARACHIDE DESHUILE NON DETOXIFIE 2

GRAINE D ARACHIDE 48,5

AVOINE NUE 8,3

CORNFEED BNA MP COEF 3,1

COSSE D AVOINE 2,1

COQUE DE CACAO 5

COQUE DE LIN 5

TOURTEAUX COLZA DESH. HP 2,05

TOURTEAU DE COPRAH DESHUILE 2

COQUE DE TOURNESOL 3,6

PAT 50-55% MAT DEGRAISSE (MG<15) 6,8

DRECHE DE BLE 3,7

DRECHE de MAIS 9,5

DRECHE D ORGE 7

POUDRE D OS ET DE VIANDE 10,81

FARINE de BLE TENDRE 1 ,5

FARINE BASSE de BLE DUR 2,7

BOULGOUR de BLE DUR 4

FEVEROLE TANINS+ (>0.3%) 1 ,6

FARINE PREMIERE DE MAIS 2

FARINE SECONDE DE MAIS 5,5

FARINE DE CREVETTE 4,96

FARINE DE THON 9

FARINE DE POISSON 18

PAT VOLAILLE 13,5

GRAINE de COLZA GRANULE 43,5

GRAINE DE COLZA FARINE 43,5

GRAINE DE COTON 20 Matières premières Taux de MG

GRAINE DE LIN CRUE BROYEE 30,9

GLUTEN DE BLE 1 ,6

GLUTEN DE MAIS 60 2,5

GERME MAIS SEMOULERIE 20% MG 22

GRAINE de SOJA EXTRUDEE 19,7

GRAINE DE TOURNESOL 40,4

HUILE DE POISSON 99

HUILE DE PALME ACIDE 97

HUILE DE SON DE RIZ 97,5

HUILE DE TOURNESOL ACIDE 98

HUILE DE LIN 98,4

HUILE DE PALME 99

HUILE DE COPRAH 99

ACIDES GRAS LIBRES 99

HUILE DE TOURNESOL 99,1

HUILE D ARACHIDE 99,1

HUILE DE SOJA 99,5

HUILE DE COLZA 99,5

HUILE DE MAIS 99,5

ISSUES DE CEREALES CELULLOSE 1 ,5

LACTO DOUX 1 ,5

LACTOSERUM ACIDE 2,5

CASEINE 1 ,5

CONCENTRE PROTEIQUE DE LACTOSERUM 2

LAIT ENTIER - PRODUITS LAITIERS 26

LEVURE TORULA 2

TOURTEAUX LIN DESHUILE 5

LUPIN BLEU TOASTE 5,3

LUPIN BLEU 5,3

LUPIN BLANC 7,5

LUZERNE LAPIN CHEVAL MAT 17% 1 ,9

MAIS 3,5

MARC DE POIRE AVEC PECTINE 1 ,5

MARC DE POMME DEPECTINISE 4

MELASSE DE SOJA 3,2

MILLET 4,3

SON de MOUTARDE 19,4

ORGE 1 ,7

PAILLE 1 ,71

TOURTEAU PALMISTE DESHUILE 2

FARINE DE PLUME DEGRAISSE 7

PULPE DE RAISIN 5

COCENTRE PROTEIQUE DE LUZERNE (PX) 9,3

REMOULAGE BLANC BLE TENDRE 2,8

REMOULAGE BLE DUR 3,4

PLASMA DE PORC 2,5

SON de BLE DUR Granulé 2,555

TOURTEAUX SOJA 48 BRESIL 1 ,7

SON de BLE TENDRE Farine 3,1

SORGHO TANNINS= 0.4 2,8 Matières premières Taux de MG

SON DE RIZ DESHUILE 3,1

SON DE RIZ GRAS 19

TOURTEAU DE COTON 7

TOURTEAUX GERME MAIS DESHUILE 5

TOURNESOL LP OLEIQUE (MG<5 MAT<29) 1 ,5

PEPINS DE RAISIN 12

TOURTEAUX ARGAN EXPELLER 10,9

GRAINE DE LIN EXTRUDEE 38,5 : matière grasse