COMPLEMENT ALIMENTAIRE DESTINE A L'ANIMAL, EN PARTICULIER LA VOLAILLE L'invention concerne un complément alimentaire destiné a t'animai, en particulier la volaille et le gibier à plumes. Elle se rapporte également à l'utilisation dudit complément pour la fabrication d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des pathologies animales, au cours desquelles une présence surnuméraire de parasites flagellés et en particulier du genre Trichomonas et Histomonas est observée.

L. es flagellés unicellulaires sont des parasites connus pour leur implication dans les troubles digestifs chez l'animal. Ces parasites se manifestent dans de multiples pathologies.

Parmi les animaux susceptibles d'être infectés, on distingue tout d'abord les volailles et en particulier les dindes, le gibier à plumes (perdrix et faisans) et plus anecdotiquement le poulet sans pour autant que cette liste soit limitative. Ces animaux développent des pathologies en liaison avec la présence de Trichomonas (Tetratrichomorlas gallinal um) ou d'Histomonas (H. meleagridis).

Chez la dinde, H. meleagridis est l'agent de la pathologie entérohépatique, communément appelée Histomonose. H melagridis possède un hôte intermédiaire, Heterakis gallinarum et probablement Ascaris galli. Cette pathologie est caractérisée par des diarrhées importantes, une inflammation et une ulcération des caecums et par des lésions hépatiques sur les animaux infectés. Sous sa forme clinique, l'llistomonose se traduit par des mortalités importantes et une baisse des performances zootechniques. Sous sa forme subcliniquc, la présence du parasite modifie l'équilibre de la flore intestinale et entraîne des dysbactérioses, qui se manifestent par des troubles digestifs, en raison d'une quantité anormale de germes

pathogènes (Clostridium pewfringens, E. coli).

Chez le gibier à plumes, la présence de Trichomonas est associée à une pathologie des caecums, la trichomonose.

La prévention des pathologies liées à la présence de flagellés chez] la volaille est notamment effectuée par administration de Nitro-imidazole et Dimetridazole (DMZ). Cependant le Dimitridazole a été identifié comme potentiellement carcinogonc pour le consommateur. de sorte que sa commercialisation est aujourd'hui interdite. Le produit commercialisé sous la marque NIFURSOL"restait seul autorisé comme additif antiflagellé mais est interdit depuis le 01/04/2003.

Le document WO 00/47069 décrit une composition destinée au traitement des diarrhées sécrétrices de l'humain ou de l'animal contenant un extrait de latex riche en proanthocyanidine avec un extrait de plante en particulier de cannelle. L'association de proanthocyanidinc et de cannelle est plus précisément utilisée dans les pathologies dans lesquelles le Clostridium perfringens est impliqué.

Le document JP 05176689 décrit une composition destinée aux animaux non terrestres, en particulier aux poissons, contenant du cinnamaldéhyde.

Le document DE 3508875 décrit l'utilisation de différentes huiles essentielles, en particulier de cannelle pour stimuler la réponse immune chez l'animal.

Le document FR-A-2 502 906 décrit un additif alimentaire utilisé pour l'engraissement intensif des volailles associant notamment cannelle et citron.

Le document GB-A-2 321783 décrit un complément alimentaire destiné à l'animal en particulier le cheval, associant molasse, oxyde de calcium et extrait de plantes, en particulier de l'ail.

Le document JP 2 207758 décrit un complément alimentaire destiné à traiter les maladies infectieuses du poisson à base d'huiles essentielles. La nature de ces huiles n'est pas mentionnée.

Le document GB-A-2 118 420 décrit un additif alimentaire pour améliorer la qualité de la viande des petits animaux (poules, lapins) à base d'huiles essentielles, notamment de cannelle et de sulfure de diallyl en présence d'autres huiles, et par exemple l'huile de citron.

Le document EP-A-0 819 386 décrit également un complément alimentaire en vue d'améliorer la qualité de la viande, notamment du porc, à base d'épices choisies dans le groupe comprenant la cannelle et l'ail.

Le document US-A-5 882 701 décrit les compositions alimentaires à base de cannelle destinées aux poules pour améliorer le goût des oeufs.

Le document EP-A-1 053 686 décrit un complément alimentaire associant formaline, émulsifiant, amylacétate et au moins une huile essentielle parmi lesquelles l'huile essentielle d'ail et l'huile essentielle de cannelle.

Le documcnt EP-A-0 843 965 décrit une composition pour la protection dos plantes contre les insectes à base de cannelle et d'un extrait d'ail.

Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer une nouvelle composition susceptible d'inhiber le développement des flagellés, leur propagation (activité sur Heterakis) et de limiter leur incidence sur la flore. Un autre objectif de l'invention est de proposer un produit qui soit efficace dans des quantités les plus faibles possibles.

Or, le Demandeur a constaté que de manière tout à fait inattendue, l'association de cinnamaldéhyde encore dénommé trans-cinnamaldéhyde et de thiosulfinates en présence éventuellement de limonène inhibaient le développement, chez l'animal, des parasites du genre trichomonas et histomonas.

L'invention a donc pour objet un complément alimentaire destiné à l'animal, qui se caractérise en ce qu'il contient du cinnamaldéhyde et des thiosuliinates.

De manière connue, les thiosulfinatcs répondent å la formule RS20R'. On utilise avantageusement mais de manière non limitative les thiosulfinates choisis dans le groupe comprenant le diallyl sulfide, le dially ! disulfide, le diallyl trisullide le 5-alkyl-cystéine, le 5 alkyl-mercapto-cystéine, l'alliine, seuls ou en mélange.

Dans un mode de réalisation avantageux, le complément alimentaire de l'invention contient en outre du limonène.

Bien entendu, le cinnamaldéhyde le limonène et les thiosulfinate peuvent être obtenus par synthèse, mais également à partir d'un extrait végétal.

Ainsi le cinnamaldéhyde peut être utilisé sous la forme d'un extrait de feuilles de cannelle de Chine, connue sous la dénomination latine Cinnamomum aromaticeun Nees ou de la cannelle connue sous la dénomination cinnamomum

ceylani.

De même, les Lhiosulfinates peuvent Être utilisés sous la forme d'un extrait, notamment de bulbe d'ail (Allium sativunt) ou de bulbe d'oignon. L'extrait peut résulter du broyage du bulbe et se présenter sous forme solide, en poudre après séchage ou, sous forme liquide après dissolution en milieu aqueux de ladite poudre.

Lorsqu'on utilise directement l'extrait d'ai ! sous forme de poudre, en tant que source de thiosulfinate, l'extrait représente de 20 à 50 % en poids de la composition lorsque celle-ci se présente sous forme solide. Lorsque l'extrait se présente sous forme d'une solution aqueuse, ledit extrait représente entre 0, 1 et 5 % de la composition lorsqu'elle se présente elle même sous forme liquide.

Enfin, le limonène peut être utilisé sous la forme d'un extrait de péricarpe de citron (Citrus limon).

Pour obtenir un extrait le plus concentré possible en cinnamaldéhyde. limonène ou thiosulfinates, tes extraits peuvent se présenter sous la forme d'huile essentielle.

En effet, l'huile essentielle de cannelle contient entre 50 et 90 % en poids de cinnamaldéhyde avantageusement entre 70 et 85 % en poids. Ladite huile essentielle contient en outre du méthoxycinnamaldéhyde, en pratique à raison de 20% en poids.

L'huile essentielle d'ail contient quant a elle entre 60 eL 90 % de dérivés thiosulfinates. Elle est en pratique utilisée dans ta composition de l'invention lorsque cette dernière se présente sous la forme solide, éventuellement en présence d'un extrait de bulbe, sous forme de poudre.

L'huile essentielle de Citron contient entre 60 et 75 % en poids de limonène.

Ladite huile essentielle contient en outre du P pinène, en pratique à raison de 10% en poids.

Bien entendu, les huiles essentielles citées peuvent être obtenues par toutes les techniques connues de l'homme du métier, en particulier par entraînement à la vapeur ou ébullition.

Pour rendre les huiles essentielles administrabics par voie orale, la préparation de l'invention se présente, selon un premier mode de réalisation, sous forme d'une émulsion stabilisée, dans laquelle les huiles essentielles sont dispersées dans une phase aqueuse en présence d'un agent dispersant. Préférentiellement l'agent dispersant est un dispersant alimentaire, notamment choisi parmi les saponines ou les Lweens.

Dans ce mode de réalisation, l'huile essentielle de cannelle représente entre 5 et 15 %, avantageusement 10 % en poids de la composition. Avantageusement, l'extrait d'ail se présente sous forme d'une solution aqueuse et représente entre 0, 1 et 5 % avantageusement 1 % en poids de la composition. L'huile essentielle de citron représente entre 0, 5 et 5 %, avantageusement 1, 7 % en poids de la composition.

En pratique, les tweens, quand ils sont utilisés, représentent entre 20 et 40 % en poids de la composition, avantageusement 30 % en poids. S'agissant des saponines, celles-ci représentent en pratique entre 0, 5 et 5 %, avantageusement 1, 5 % en poids de la composition.

Dans un autre mode de réalisation, la préparation se présente sous forme d'une

poudre sur laquelle sont adsorbées les huiles essentielles. En pratique, la poudre est constituée de silice ou issue de remoulage, en particulier de blé. S'agissant du bulbe d'ail, celui-ci peut être avantageusement utilisé directement sous forme de poudre bien que l'huile essentielle reste une solution alternative, seule ou en combinaison avec l'extrait de bulbe.

Dans ce mode de réalisation, l'huile essentielle de cannelle représente entre 3 et 15 °lo, avantageusement 7 % en poids de la composition. L'extrait de bulbe d'ail, sous forme de poudre représente entre 30 et 50 %, avantageusement. 40 % en poids de la composition. L'huile essentielle de citron représente entre 0, 1 et 5 %, avantageusement 1 % en poids de la composition. Dans une alternative. la composition contient un extrait de bulbe d'ail sous forme de poudre et d'huile essentielle.

Dans un troisième mode de réalisation les huiles essentielles peuvent être mieroencapsulées, en particulier par des p 3-cyclodextrines, procédé conduisant cependant à augmenter de manière importante le coût de la préparation.

La préparation est administrée comme déjà dit par voie orale. Elle peut être incorporée soit dans l'alimentation soit dans l'eau de boisson. Dès lors, l'invention a également pour objet un aliment ou une eau de boisson destinés à l'animal incorporant le complément alimentaire ci-avant décrit.

Lorsqu'il s'agit d'une eau de boisson, la préparation sous forme d'émulsion est incorporée a raison de 0, 1 a 3 m !, avantageusement de 0, 35 à 2 ml par litre d'eau de boisson.

Comme déjà dit, la préparation peut être utilisée dans toutes les pathologies animales dans lesquelles les parasites flagellés, en particulier H. meleagridis et T. gallinarum, sont impliqués.

Dès lors l'invention concerne également l'utilisation du complément alimentaire pour la fabrication d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des pathologies animales au cours desquelles une présence surnuméraire des parasites flagellés, en particulier H. meleagridis et T. gallinarum est observée.

En pratique, les pathologies et animaux concernés par la préparation de l'invention comprennent les histomonoscs et trichomonoscs se développant chez les volailles (en particulier, les dindes, poulets, pintades) et chez le gibier à plumes.

Lorsque la source de cinnamaldéliyde, limonène et thiosulfinatc est constituée d'huiles essentielles et que la préparation est utilisée dans le cadre d'un traitement préventif, la quantité d'huile essentielle totale administrée est comprise entre 30-100 ppm dans l'aliment et 50-200 ppm dans l'eau de boisson.

En revanche, lorsqu'il s'agit d'un traitement curatif, la quantité d'huile essentielle totale administrée est comprise entre 100 et 300 ppm dans l'aliment et 100 à 300 ppm dans l'eau de boisson.

Le Demandeur a par ailleurs constaté que le cinnamaldéhyde, le limonène ou les thiosulfinates pris séparément avaient, à eux seuls, une action sur les parasites flagellés.

En d'autres termes, l'invention concerne également l'utilisation de cinnamaldéhyde, limonène ou thiosulfinates pris séparément, pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des pathologies

animales au cours desquelles une présence surnuméraire de parasites flagellés, en particulier du germe Trichomonas et Histomonas est observée.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortent bien des exemples de réalisation suivants.

Fisure 1 : Effets de diverses concentrations d'huile essentielle de cannelle (C. aromaticum), de citron (C. limon) et d'ail (A sativum) sur la viabilité du T. gallinarum. Les données exprimées comme la moyenne +/-a.

Les correspondances des séries de dilutions aux concentrations sont les suivantes : 1 = 2 µ/ml, 2 = 1 µ/ml, 3 = 0,5 µ/ml, 4 = 0, 25 µ/ml, 5 = 0, 125 µ/ml, 6=0, 0625 µ/ml, 7 = 0,030 µ/ml, 8 = 0,016 µ/ml, 9 = 0, 008 i/m), 10 = 0, 004 t/ml, 11 = 0, 002 µ/ml et 12 = 0, 001 y/ml.

Figure 2 : Effets de diverses concentrations en mélange de 50 : 50 de 2 huiles différentes choisies parmi la Cannelle, le citron et l'ail, sur la viabilité du T gallinarum. Les données exprimées comme la moyenne +/-o. Les correspondances des séries de dilutions aux concentrations sont les suivantes : 1 = 2 µ/ml, 2 = 1 µ/ml, 3 = 0, 5 µ/ml, 4 = 0,25 µ/ml, 5 = 0,125 µ/ml, 6 = 0,0625 µ/ml, 7 = 0, 030 /ml, 8 = 0,016 µ/ml, 9 = 0,008 µ/ml, 10 = 0, 004 µ/ml, 11 = 0, 002 µ/ml et 12 = 0. 001 11/mol.

Fisure 3 : Effets de diverses concentrations d'huiles essentielles de cannelle, de citron et d'ail sur la viabilité des H. meleagridis. Les données exprimées comme la moyenne +/- #. (Do = jour 0, Di =jour 1 et D = day2).

EXEMPLE 1 Dans cet exemple, on étudie l'activité inhibitrice de 3 huiles essentielles sur Tetratrichomonas gallinarum et Histomonas meleagridis. Le Demandeur a testé l'activité in vitro de trois huiles essentielles obtenues à partir de feuilles de cannelle (Cinnamomum aromaticum) (A) (fig 1), de péricarpe de Citron (Citrcss liston) (B) (fig 1) et de bulbes d'ail (Allium sativum) (C) (fig 1), contre les deux parasites de volailles cités précédemment. On également été testés les mélanges A/B (fig 2 + 3), A/C (uniquement sur Tetratrichomonas gallinarum) fig 2, B/C (fig 2) (uniquement sur Tetratricftomonas gaélinarum el) el A/B/C (uniquement sur-Histomonas meleagHdis.) (fig 3).

Matériel et méthode Les huiles essentielles ont été obtenues par hydrodistillation à partir des feuilles de cannelle, du bulbe d'ail et du pressage à froid de péricarpe de Citron. Les huiles essentielles de cannelle et de citron ont été analysées à l'aide d'un appareil de Chromatographie en Phase Gazeuse (HP-INNOWax, Hewlett Packard) équipé d'une colonne de 60.0 m, 320 µm de diamètre et d'un film nominal de 0.50 Am d'épaisseur, et d'un détecteur à ionisation de flamme. La température du four varie de 100°C à 220°C a raison de 1. 5 °C/mn et avec un split ratio de 1 : 100. Le temps d'élution est de 95 mn. L'huile essentielle d'ail a été analysée avec un appareil HP-INNOWax instrument (Hewlett Packard) équipé d'une colonne silice capillaire (25 m, 0.32 mm i. d., 0. 33t d'épaisseur).

L'identification des composants a été déterminée à partir de standards et en fonction des temps de rétention respectif. La composition des huiles utilisées est décrite dans le tableau 1. Huile de Cinnamomum aromaticum Huile de Citrus limon Huile de Allium sativum Composés Composition Composés Composition Composés Composition (% du poids total) (% du poids total) (% du poids total) Trans-cinnanaldehyde 79, 40 Limonène 71,10 Diallyl trisulfide 49, 8 Eugenol 1,40 Pinène 9,50 Diallyl disulfide 29, 8 Linilol 1,20 Terpinène 8, 10 DiallylsulGJe 1, 3 Coumarilc 0, 40 P-cymcne 1, 40 Limonrnc 1, 2 Terpinéol Traces Allyl-méthyl disulfide 0,9 Tableau 1: composition chimique des constituants principaux d'huiles essentielles de cannelle (Cinnamomum aromaticum), de citron (Citrus limon) et d'ail (Allium sativum) Souches de parasites La souche T. gallinarum a été isolée en Tchécoslovaquie à partir des caecums d'un canard et cultivée en milieu axénique, Tripticase-Yeast-Maltose (TYM, pH 7. 2).

10 % serum de cheval à 37°C inactivé à la chaleur.

La souche de H. meleagridis HmBR-a a été isolée à partir des fèces d'un poulet infecté oralement par Heterakis gallinarum, qui avait développé des signes d'histomonose. Le parasite et sa flore d'accompagnement ont été cultivés en milieu anaérobique à 39 °C sur un milieu Stepkowski (20).

Culture de T. gallinarum 2 ml d'aliquots de culture de T. gallinarum (5. 104 parasites/ml) ont été incubés en conditions anaérobies pendant 24 h à 37°C. Pendant ce temps, 12 dilutions des compositions A. B, C ont été préparées dans des plaques en U à 96 puits (Prolabo, Lyon, France), hydrodispersécs avec du Tween 80 (Sigma, L'Isle d'Abcau, France).

La dilution initiale était 4 % ; puis 100 WI de chaque ont été ajoutés au tube de culture, de sorte que les dilutions de chacune des compositions se soient étendues de 2 µ/ml à 0, 001 µ/ml. Après 24 h d'incubation, la plus basse dilution de composition dans laquelle on a observé aucun parasite actif'a été définie comme concentration léthalc minimum (CLM). Puis, le nombre de parasites dans chaque tube de culture a été estimé à l'aide d'une cellule de Malasse/. (Polylabo, Strasbourg, France).

Le témoin négatif contient une dilution de 0, 2% de Tween 80 (2 ptl/ml) (sigma) et le témoin positif contient du dimetridazole à 400 ll/ml. L'activité des mélanges A/B, A/C, B/C a été évaluée en utilisant la même méthode avec une première dilution de 2 µl/ml d'un mélange de 50 : 50 de 2 huiles différentes.

Culture de H. meleagridis L'activité in vitro de chaque huile A, B, C contre des meleagridis de H. a été évaluée en utilisant une technique semblable. Brièvement, 2 aliquots d'un millilitre de ce parasite ont été incubées en conditions anaérobies avec une concentration de 10° parasitcs/ml.

4 dilutions de chaque huile ont été préparées comme décrit ci-dessus et supplémentaires à la culture de parasite afin d'obtenir des dilutions finales s'étendant de 2 µ/ml à 0,25 jil/ml. Après incubation pendant 24 et 48 h, le nombre de parasites actifs dans chaque culture a été estimé par coloration au bleu de trypan à 0, 4 % (technique Gibco BRL, Cergy Pontoise. France). La plus basse dilution d'huile dans laquelle on a observé aucun parasite actif a été définie comme la concentration léthale minimum (CLM). Les mélanges de 2 huiles (C. Aromaticum et C. Limon) aux proportions d'un 50 : 50 et de 3 huiles (C. Aromaticum, C. Limom et A. Sativum) aux proportions d'un 50 : 30 : 2 () ont été également examinés contre les histomonas.

Résultats des essais Comme le montrent les figures, l'ensemble des huiles essentielles utilisées prises seules ou en combinaison inhibent le développement de T. gallinarum et H. meleagridis, avec une efficacité supérieure lorsque les trois huiles essentielle de cannelle, ail et citron sont utilisées ensemble (figure3).