Sector de la técnica

La invención se refiere a una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento. La invención se refiere asimismo a un método de preparación de dicha formulación.

Estado de la técnica

En el estado de la técnica se conoce la preparación de composiciones a partir de la sangre humana o animal, donde la sangre es procesada de manera que se obtiene un plasma rico en plaquetas (PRP) y/o un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) que presentan útiles propiedades biológicas y médicas. Dichos PRP o PRGF vienen siendo utilizados con éxito en aplicaciones ex vivo, por ejemplo como medio de cultivo celular, e in vivo, por ejemplo para realizar un proceso de regeneración ósea en un paciente o para tratar a un paciente de una dolencia articular mediante infiltraciones. En el caso de que dichas composiciones vayan a ser utilizadas en aplicaciones in vivo para tratar a un paciente, la tecnología de preparación de formulaciones PRP y PRGF ha ido evolucionando hacia la preparación de composiciones autólogas, es decir, obtenidas de la sangre del propio paciente. Ejemplos de este tipo de composiciones y métodos de preparación pueden encontrarse en las patentes US6569204 y ES2221770.

En los últimos años la tecnología también está evolucionando con el objetivo de conseguir que las composiciones ricas en plaquetas y/o en factores de crecimiento puedan obtenerse en forma de composiciones galénicas o formas farmacéuticas. Se entiende como composición galénica o forma farmacéutica a la disposición individualizada a que se adaptan los fármacos o principios activos, ya sean de origen químico o de origen biológico (como es el caso de las proteínas del PRP o PRGF), para facilitar su administración. La composición galénica o forma farmacéutica de un medicamento es clave porque determina la eficacia y seguridad del medicamento, ya que controla la dosis y la cesión de las moléculas del medicamento ai tejido. Además, la composición galénica o forma farmacéutica del medicamento es determinante para que la preparación del medicamento, su dosificación y su administración sean conocidas, estén controladas y sean ejecutables con relativa facilidad y de manera repetibie. En resumidas palabras, una composición galénica o forma farmacéutica pretende facilitar la manipulación, conservación, transporte, administración y en conjunto las propiedades de cualquier fármaco o sustancia con actividad terapéutica. Una de las formulaciones de mayor aplicación médica del PRP o

PRGF es la conocida como gel de fibrina o malla de fibrina, que es una formulación cuya consistencia semisólida resulta muy conveniente para ciertas aplicaciones. El procedimiento de preparación del gel o malla de fibrina generalmente comienza con una primera fase en la cual se obtiene el PRP o PRGF por un método aplicable, por ejemplo centrifugando sangre extraída de un paciente hasta que la sangre se separa en varias fracciones, y extrayendo la fracción superior, es decir la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP) o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF). Posteriormente, se realiza la activación de las plaquetas contenidas en el PRP o PRGF (entendiéndose por activación la acción de provocar que las plaquetas liberen ciertos factores de crecimiento contenidos en su interior) por ejemplo mediante la adición de cloruro cáicico. Como consecuencia de la activación, y si se espera un tiempo suficiente, se produce la eventual polimerización de fibrina a partir del fibrinógeno contenido en el plasma, obteniéndose un compuesto final que es un coágulo de fibrina (también denominado gel o malla de fibrina por su consistencia semisólida, como una especie de esponja biológica). Este procedimiento es el que suele realizarse para obtener un gel de fibrina a partir de una sangre modificada con un anticoaguiante, como por ejemplo con citrato sódico. Pero también se puede procesar la sangre sin mezclar ésta previamente con anticoagulante; en este caso, ai centrifugar la sangre se consigue tanto separar el plasma de los glóbulos rojos como, al mismo tiempo, obtenerse el gel de fibrina sin necesidad de añadir cloruro cáicico u otro activador de las plaquetas. Algunos ejemplos de aplicación del gel o malla de fibrina son: formar un andamiaje biológico para rellenar defectos óseos; ser aplicado sobre heridas o lesiones para la liberación progresiva de los factores de crecimiento: ser empleado como matriz para el cultivo de células madre; ser empleado como una membrana para poder cerrar defectos o úlceras; ser empleado en la fabricación de tejidos, lo que se conoce como ingeniería de tejidos, donde además de células y factores de crecimiento es de especial importancia contar con una matriz o andamiaje donde las células puedan crecer.

El gel o malla de fibrina presenta algunas limitaciones importantes. La principal limitación del gel o malla de fibrina es que es inestable y tiende a retraerse; por ello, el gel o malla de fibrina no es capaz de mantener un volumen estable a lo largo del tiempo ni de proporcionar un soporte tisular estable a lo largo del tiempo. Si bien esta tendencia a retraerse puede ser positiva en algunas aplicaciones, resulta negativa en otras. Por ejemplo, en una técnica de cirugía dental conocida como elevación del seno maxilar, el biomateriai que se emplea para regenerar el defecto óseo debe tener propiedades osteoconductoras pero además debe ser capaz de mantener el espacio físico durante un largo periodo de tiempo hasta que la matriz ósea se conforme, ya que en caso contrario habría un colapso del espacio que afectaría a la regeneración vertical del hueso alveolar. Otro ejemplo es el caso de una extirpación mamaria (mastectomía), durante la cual el biomateriai o gel que se emplee para rellenar el espacio mamario debe tener una resistencia mecánica adecuada y proporcionar un espacio y volumen a largo plazo de forma que no se coiapse dicho espacio. Otro ejemplo aún es el caso de los fiiiers o agentes de relleno estético (por ejemplo el ácido hiaiurónico), que son materiales de relleno (por lo tanto dan y mantienen volumen) ampliamente usados en el campo de la estética para aumentar el volumen en las comisuras y arrugas y corregir dichos defectos, dando un aspecto rejuvenecido; cualquier agente que esté dirigido a funcionar como filler o agente de relleno debe ser mecánicamente estable y resistente a la compresión de forma que mantenga el volumen del tejido. Por otra parte, la tendencia del gel o malla de fibrina a retraerse dificulta e incluso impide el empleo del gel o malla como agente de liberación de agentes externos, fármacos, proteínas, etc. Otro aspecto limitado del gel o malla de fibrina es su imposibilidad de poder ser infiltrado o canuiado en su estado normal, semisóiido, lo que impide su administración como relleno en la piel, en dermocosmética, en traumatología y en otros campos de la biología o medicina. La presente invención tiene como objetivo conseguir una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, que no tienda a retraerse y por tanto permita mantener un volumen estable a lo largo del tiempo. Entre otras aplicaciones, se desea que la formulación sirva como alternativa al gel o malla de fibrina en determinadas aplicaciones donde se requiere una composición estable.

Descripción breve de ta Invención Es objeto de la invención una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial (de origen humano o animal; autóloga, homologa u heterologa), rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y que comprende proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicial, con la particularidad de que dichas proteínas se encuentran en estado geiificado por un tratamiento térmico de calentamiento y enfriamiento. En particular, las proteínas gelificadas son preferentemente albúmina, glicoproteínas, globulinas y/o fibrinógeno. La formulación de acuerdo con la invención podría calificarse como un "gel de proteínas" (usando una terminología análoga a la utilizada para referirse ai gel de fibrina) debido a que presenta una consistencia gelificada que viene dada por las proteínas en estado geiificado. Además, la formulación es deformable. La composición presenta una configuración morfológica y biomecánica nueva en comparación con el resto de geies de relleno, composiciones sanguíneas ricas en plaquetas y/o factores de crecimiento, y similares conocidos en el estado de la técnica. Se propone también un método de preparación de la formulación anterior, que comprende los pasos de: disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento cuya formulación de base puede variar; calentar la composición sanguínea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto; enfriar la composición sanguínea inicial durante ai menos 1 minuto. Este método de la invención, que puede considerarse como una secuencia térmica, permite dar volumen y rigidez a una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento en general, obteniendo un gei proteico o formulación de consistencia de gei gracias ai estado geiificado de ciertas proteínas comprendidas en la composición sanguínea inicial.

La formulación de acuerdo con la invención es biocompatible, biodegradabie y presenta las propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, a la vez que tiene una consistencia densa o viscosa debido al estado geiificado de ciertas proteínas contenidas en la composición sanguínea inicial, con la importante ventaja de que dicha consistencia densa o viscosa es estable a lo largo del tiempo. La formulación según la invención es por tanto una alternativa ventajosa al gei o malla de fibrina, debido al hecho de que la formulación no se retrae y permite por ello mantener relleno un espacio físico. Además, la formulación presenta una buena resistencia a la compresión, similar o mejor que la del ácido hialurónico (utilizado habitualmente como fiiier o agente de relleno), y soporta adecuadamente la resistencia que le puede ejercer un tejido; por tanto, la formulación resulta muy apta para ser utilizada como filler o agente de relleno. Además, aun cuando tanto la malla de fibrina como la formulación según la invención tienen carácter semisóiido, solamente la segunda puede infiltrarse o inyectarse debido a que es deformable. Una ventaja adicional de la formulación es que puede ser desecada para posteriormente re-hidratarse.

Descripción breve de ¡as figuras

Los detalles de la invención se aprecian en las figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del alcance de la invención:

- La Figura 1 muestra dos imágenes de microscopía electrónica de un ejemplo de formulación según la invención.

- La Figura 2 muestra dos imágenes de microscopía electrónica de otro ejemplo de formulación según la invención.

- La Figura 3 muestra el factor de hinchamiento de varias formulaciones según la invención preparadas a partir de coagulo de fibrina tratado a diferentes temperaturas y tiempos.

- La Figura 4 muestra el factor de hinchamiento de varias formulaciones según la invención preparadas a partir de sobrenadante tratado a diferentes temperaturas y tiempos.

- La Figura 5 muestra unos resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones según la invención, ensayada con la línea celular osteoblástica MG 63.

- La Figura 6 muestra otros resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones según la invención, ensayada con la línea celular osteoblástica MG 63.

- Las Figuras 7 y 8 muestran respectivamente el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) en doce formulaciones de acuerdo con la invención.

- La Figura 9 muestra la cinética de liberación del factor de crecimiento PDGF-AB en cuatro formulaciones de acuerdo con la invención incubadas durante diferentes periodos de tiempo.

- La Figura 10 muestra la cinética de liberación del factor de crecimiento TGF-β en cuatro formulaciones de acuerdo con la invención incubadas durante 2 días.

- La Figura 1 1 muestra una fotografía de la espalda de una rata de laboratorio en la cual se han inyectado muestras de cuatro formulaciones según la invención.

- La Figura 12 muestra una gráfica relacionada con el ensayo de la figura anterior, ilustrando el volumen de la hemieiipsis tras inyectar las formulaciones a nivel intradérmico y transcurridas dos semanas tras la inyección. Descripción detailada de ia invención

Con e! fin de superar problemas aún existentes en el estado de la técnica relacionados con la falta de estabilidad de los geles o mallas de fibrina, se propone una formulación alternativa con propiedades biológicas o médicas deseables y con una estabilidad mejorada a lo largo del tiempo. Dicha formulación comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial. Dicha composición sanguínea es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y además comprende diversas proteínas. Por tanto, ia formulación igualmente es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y comprende diversas proteínas. De entre dichas proteínas, determinadas proteínas se encuentran en estado gelificado, es decir, desnaturalizadas y formando una red proteica ordenada, preferentemente debido a un tratamiento térmico de calentamiento y enfriamiento. Las proteínas en estado gelificado son preferentemente albúmina, glicoproteínas, globulinas y/o fibrinógeno. Se ha comprobado que el gei proteico de acuerdo con ia invención no se retrae, puede canuiarse o infiltrarse fácilmente y mantiene el volumen y espacio a diferencia de sus homónimos basados sólo en la red de fibrina.

La composición sanguínea inicial puede ser, por ejemplo, un plasma sanguíneo rico en plaquetas, es decir, un plasma con una concentración elevada de plaquetas. Dicho plasma se ha obtenido generalmente mediante la técnica de centrifugar sangre (para separarla en una fracción de fracción de glóbulos rojos, una fracción de glóbulos blancos y una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP)) y separar toda o parte de la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP).

La composición sanguínea inicial puede también ser un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en plaquetas (PRP), El sobrenadante es una sustancial líquida que aparece sobre el coágulo cuando se causa la coagulación de un plasma rico en plaquetas (PRP) y su posterior retracción.

La composición sanguínea inicial puede ser un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un plasma sanguíneo rico en plaquetas que ha sido activado (por ejemplo mediante la aportación de cloruro de calcio, de trombina, de una combinación de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sódico, de colágeno, o de cualquier otro agente que actúe activando las plaquetas e induciendo la formación de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.

Análogamente, la composición sanguínea inicial puede ser un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un sobrenadante obtenido tras la coagulación y posterior retracción de un plasma rico en plaquetas que ha sido previamente activado (por ejemplo mediante la aportación de cloruro de calcio, de trombina, de la combinación de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sódico, de colágeno, o de cualquier otro agente que actúe activando las plaquetas e induciendo la formación de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.

La composición sanguínea inicial puede contener o no leucocitos.

La composición inicial también puede ser un gel de fibrina obtenido directamente del procesado de sangre que no haya sido modificada con un anticoagulante.

Se propone asimismo un método de preparación de una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, donde dicho método comprende los pasos de: a) disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, la cual es preferentemente un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, o un gel de fibrina obtenido a partir de sangre no modificada con anticoagulante; en caso de contar la composición sanguínea con plaquetas, activar opcionalmente las plaquetas con algún agente activador como cloruro cálcico, trombina, gluconato cálcico, colágeno o cualquier otro, o una combinación de ellos., y esperar hasta que se forme una fibrina provisional; c) calentar la composición sanguínea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto; d) enfriar o atemperar la composición sanguínea inicial durante al menos 1 minuto.

El método anterior desarrolla un choque térmico sobre la composición sanguínea inicial de forma que se induce una geiificación proteica de varias proteínas existentes en el plasma humano, entre ellas la albúmina, las glicoproteínas, las globulinas y/o el fibrinógeno. A ios efectos de la presente invención, se denomina "geiificación" ai proceso sufrido por las moléculas en el cual se polimerizan o agregan para formar una red proteica ordenada. En resumen, como consecuencia del proceso de choque térmico se logran nuevas formulaciones biocompatibies y biodegradabies, dependiendo de cuál sea la composición sanguínea inicial, cuyo denominador común es la geiificación o polimerización proteica.

Ademas, se ha comprobado que la formulación según la invención, provista de proteínas gelificadas, mantiene sustanciaimente los niveles de factores de crecimiento de la composición sanguínea inicial. Es decir, el choque térmico no provoca una destrucción masiva de factores de crecimiento de dicha composición sanguínea inicial.

Preferentemente, la composición sanguínea inicial se calienta a una temperatura de entre 70 y 85°C.

La composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento es de origen humano o animal. Además, puede ser autóloga (perteneciente a un paciente ai cual se desea tratar posteriormente con la formulación final), homologa (perteneciente a un miembro de la misma especie que el paciente, los pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final) o heteróloga (perteneciente a un miembro de diferente especie que el paciente, ios pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final).

La invención contempla que la composición sanguínea inicial puede incorporar opcionaimente una o más sustancias adicionales, añadidas de forma previa ai tratamiento térmico reivindicado. Dichas sustancias adicionales pueden ser:

- uno o más agentes bioactivos seleccionados entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, poiisacáridos, lípidos, sustancias orgánicas no proteicas y sustancias inorgánicas;

- uno o más polímeros biodegradables seleccionados entre: ácido hiaiurónico, sales de hiaiuronato, chondroitín 4 sulfato, chondroitín 6 sulfato, dextrán, gel de sílice, algínato, hidroxipropiímetilceluiosa, derivados de chitín, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietiieno glicóiicos (PEG), polihidroxietilenometacriiato (HEMA), proteínas sintéticas o naturales, colágenos;

- uno o más polímeros orgánicos seleccionados del grupo de policarpoiactona, poiiglicólico, poiiláctico, y sus co-polímeros;

- uno o más de entre los siguientes agentes: antibióticos, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos, factores de crecimiento, hormonas;

- uno o más componentes inorgánicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.

La invención contempla también que cualquiera de las sustancias anteriores puedan ser añadidas a la formulación después de realizado el tratamiento térmico. La formulación según la invención contempla modos de realización diversos en los que la formulación pueda comprender, además de ¡os aspectos técnicos reivindicados, otros compuestos, componentes, moléculas, etc. que resulten convenientes para ¡a aplicación concreta a ¡a que vaya a estar destinada ¡a formulación. En otras palabras, la invención se plantea como una familia de nuevas formulaciones basadas en geies de proteínas, estando formada dicha familia por diferentes formulaciones que tienen en común ¡a presencia de proteínas gelificadas y que pueden diferir en su composición adicional.

Además, es posible realizar pasos adicionales sobre la formulación con proteínas gelificadas que incluyen desecados de ¡as matrices para aumentar su versatilidad. Es decir, ¡as formulaciones de proteínas gelificadas de acuerdo con la invención pueden ser desecadas (calor seco) o liofilizadas para formar una membrana. Esta membrana puede ser posteriormente rehidrata mediante diferentes alternativas tales como añadir una solución salina, un plasma rico en plaquetas, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas, un plasma rico en factores de crecimiento, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento, o cualquier otra solución que permita hidratar ¡a membrana.

Ejemplos Ejemplo 1

Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo con cierre hermético y que no contiene anticoagulante citrato. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ¡a centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ¡a fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), incluyendo también los glóbulos blancos, a una jeringa de 5 mi. Debido a que el tubo inicial no se encontraba citratado, el PRP ha comenzado a coagular. Se calienta el contenido de ¡a jeringa a una temperatura de 70°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfría el segundo contenedor a una temperatura de 4°C durante 2 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisóiida, con consistencia de gel. Por tanto, se obtiene una formulación activada, con consistencia de gel tanto por la fibrina generada como consecuencia de la coagulación como por ia geiificación de las proteínas producida por el tratamiento térmico, y libre de citrato y calcio. La presencia de fibrina otorga a ia formulación una consistencia mayor firmeza y resistencia, mientras que las proteínas gelificadas aportan estabilidad y volumen constante. Gracias a sus propiedades y resistencia mecánica, una sustancia de este tipo puede ser útil por ejemplo para corregir defectos verticales en ios tejidos faciales.

Ejemplo 2 Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene anticoaguiante citrato al 3,8% en una cantidad de 0, 1 mi. Se centrifuga ia sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ia centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ia fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a una jeringa de 5 m i. Se calienta ia jeringa a una temperatura de 80°C durante 3 minutos. Posteriormente, se enfría ia jeringa a una temperatura de 20°C durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior del segundo contenedor una sustancia semisóiida, con consistencia de gel, cuyas plaquetas se encuentran pendientes de activar, y que no comprende fibrina por no haber sido previamente coagulada. Una sustancia de este tipo puede ser útil para su aplicación por ejemplo como relleno en ia cirugía estética y conseguir un rejuvenecimiento eliminando o minimizando la presencia de arrugas gracias a ia inyectabilidad del bio-gel a través de aguja (menor o igual de 25 G) y su consistencia capaz de elevar la piel. Este bio-gel es estable en el tiempo y además libera factores de crecimiento que estimulan el crecimiento y la proliferación celular, resultando por tanto muy ventajoso en comparación con sustancias convencionales tales como el ácido hialuronico. El acido hialuronico, que es el material de relleno mas utilizado en la actualidad, precisamente carece de bioactividad y por lo tanto no promueve la formación de tejidos ni consigue ia persistencia de mejoras a lo largo del tiempo, lo cual hace necesario que deba ser administrado periódicamente, generalmente cada 3-4 meses.

Ejemplo 3

Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene anticoaguiante citrato al 3,8% en una cantidad de 0, 1 mi. Se centrifuga ia sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ia centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ia fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a una jeringa de 5 mi. Se añade cloruro de calcio al 10% en una relación de 50 μ! por cada 1 mi de plasma, causando la activación de las plaquetas, es decir, la liberación de factores de crecimiento, y ia coagulación del plasma. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 75°C durante 5 minutos. Posteriormente, se enfría la jeringa a una temperatura ambiente durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de ia jeringa una sustancia semisóiida, con consistencia de gei tanto por la fibrina generada como consecuencia de ia coagulación como por la geiificación de las proteínas producida por el tratamiento térmico, provista de citrato, calcio y factores de crecimiento liberados. Una sustancia de este tipo puede ser útil para rellenar un defecto óseo, como por ejemplo el alveolo que queda tras extraer una pieza dental, para fomentar la regeneración del alveolo. Gracias a la liberación de factores de crecimiento y ia capacidad del gei para actuar como soporte del crecimiento celular, el gei favorece el que se produzca el relleno del alveolo con tejido óseo, acortando así ios tiempos de espera para colocar, por ejemplo, un implante dental en el alveolo que sustituya al diente extraído. Ejemplo 4

Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene 0, 1 mi de una solución de citrato sódico con una concentración de 3,8% (peso/volumen) que actúa como anticoagulante. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a un tubo de fraccionamiento de 9 mi. Se añade una solución de cloruro de calcio (con una concentración de 10% en peso/volumen) en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma y se introduce el tubo en un horno a 37°C. El cloruro de calcio causa la activación de las plaquetas, es decir, la liberación de factores de crecimiento, la coagulación del plasma y la formación de fibrina (viéndose dicha formación acelerada por encontrarse el tubo en las condiciones de temperatura proporcionadas por el horno). Seguidamente, por la retracción del coágulo se obtienen dos fases: una fase sólida, que es una estructura tridimensional de fibrina, y una fase líquida sobrenadante, que contiene proteínas y factores de crecimiento piaquetaríos y plasmáticos. Se separa la fase líquida o sobrenadante a una jeringa de 3 mi. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 80°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfría la jeringa a una temperatura de 22°C durante 5 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisólida, aunque con una consistencia menos sólida que las formulaciones de acuerdo con la invención que sí comprenden fibrina. Debido a su consistencia menos sólida, una sustancia de este tipo puede ser útil por ejemplo para rellenar defectos periodontaies intra-óseos con el objetivo de promover la regeneración del tejido periodontai, o regenerar hueso infiltrándolo subperióstico o supraperióstíco.

Ejemplo 5

En otro ejemplo, se partió de un coágulo de fibrina (sustancia preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para obtener plasma rico en plaquetas, añadir cloruro cálcico en una proporción de 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi de plasma, y esperar 10-20 minutos hasta la polimerización de la fibrina) y se sometió al mismo a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20°C durante 10 minutos, obteniéndose un gel proteico. La Figura 1 muestra dos imágenes de microscopía electrónica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar la presencia de estructuras redondas que representan la albúmina desnaturalizada y otras estructuras lineales que son fibras de fibrina. En la imagen de la derecha se puede observar la superficie compacta (exterior) del gel.

Ejemplo 8

En otro ejemplo, se partió de un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) (sustancia preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para diversas fracciones, separar una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), añadir cloruro cálcico en una proporción de 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi de plasma, con el fin de provocar la liberación de factores de crecimiento e iniciar la coagulación del plasma. La retracción del coágulo permitió obtener un sobrenadante. Entonces, dicho sobrenadante se sometió a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20°C durante 10 minutos, obteniéndose un gel proteico. La Figura 2 muestra dos imágenes de microscopía electrónica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar el interior del gel y la presencia de estructuras redondas que representan la albúmina desnaturalizada. En la imagen de la derecha se puede observar la superficie compacta (exterior) del gel.

Ejemplo 7

En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo un coágulo de fibrina (preparado según lo descrito en el Ejemplo 5) a diferentes temperaturas y tiempos. Las condiciones de preparación fueron: calentar el coágulo a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el coágulo a 70°C durante 30 minutos (círculo), calentar el coágulo a 80°C durante 15 minutos (triangulo); y enfriar todos ellos a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geies fueron desecados a 37°C durante 24 horas y después fueron incubados en agua destilada. En intervalos de 24 horas los geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. La Figura 3 representa el grado o factor de hinchamiento de los geles proteicos preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede observarse, ios geles aumentan entre 2 y 3 veces su peso inicial debido a la absorción del agua y la retención de la misma dentro de su estructura. También se puede observar que los geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubación. Los geies preparados a 70°C durante, en cambio, 30 minutos (círculo) se hinchan aproximadamente 3 veces su peso inicial tras 24 horas pero al incrementarse el tiempo de incubación se observa un descenso ligero del factor de hinchamiento. Mientras, los geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triángulo) tardan más que los dos anteriores, concretamente 48 h, en alcanzar un hinchamiento máximo. En cualquier caso, la capacidad de hinchamiento de los geies permite que ios geles puedan ser utilizados, por ejemplo, corno matrices para la liberación local de sustancias bioactivas (proteínas o principios activos). Este uso se llevaría a cabo normalmente aplicando una solución que contenga dichas sustancias bioactivas sobre ios geies deshidratados, produciéndose la consiguiente hidratación de los geies, los cuales entonces incorporarían las sustancias bioactivas en su interior.

Ejemplo 8

En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo un sobrenadante (preparado según el Ejemplo 6) a diferentes temperaturas y tiempos. Las condiciones de preparación fueron: calentar el sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el sobrenadante a 70°C durante 30 minutos (círculo), calentar el sobrenadante a 80°C durante 15 minutos (triángulo); y enfriar todos ellos a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geles fueron desecados a 37°C durante 24 horas y después fueron incubados en agua destilada. En intervalos de 24 horas ¡os geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. El peso inicial es el peso del gel seco antes de su incubación en agua. La Figura 4 representa el grado de hinchamiento de ¡os geles de proteínas preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede observarse, los geles han aumentado aproximadamente 3 veces su peso inicial debido a ¡a absorción de¡ agua y ¡a retención de la misma dentro de su estructura. También se puede observar que ¡os geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubación. En cambio, los geles preparados a 70°C durante 30 minutos (círculo) se hinchan 3 veces su peso inicial tras 48 horas pero a mayor tiempo de incubación se observa un descenso ligero de¡ factor de hinchamiento. Mientras, ¡os geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triángulo) alcanzan dicho factor de hinchamiento aproximadamente igual a 3 tras 24 horas de incubación. En cualquier caso, ¡a capacidad de hinchamiento de ios geles permite que ¡os geles puedan ser utilizados, por ejemplo, como matrices para la ¡iberación local de sustancias bioactivas (proteínas o principios activos). Este uso se ¡levaría a cabo norma¡mente apücando una solución que contenga dichas sustancias bioactivas sobre ¡os geles deshidratados, produciéndose ¡a consiguiente hidratación de ios geles, los cuales entonces incorporarían ¡as sustancias bioactivas en su interior.

Eiempio 9

En otro ejempto, prepararon cuatro ge¡es proteicos o formulaciones de acuerdo con ¡a invención a partir de un sobrenadante (indicado como "SN" en la gráfica a la que se hará referencia al final de este ejemplo), un coágulo de fibrina ("Fibrina"), un plasma rico en plaquetas sin activar ("Sin activar") y un piasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular ("activ~sin coaguiar"), realizando un tratamiento térmico consistente en calentar las sustancias inicíales anteriores a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos. Los métodos de preparación de estas sustancias iniciales están explicados en ios Ejemplos 2, 3 y 6. Cada una de estas cuatro formulaciones obtenidas tras el tratamiento térmico se incubó en medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagie's Médium (DMEM) sin suero bovino fetal durante 48 horas. Por otra parte, se partió asimismo de una quinta sustancia o sustancia de control, consistente en el propio DMEM sin suero bovino fetal. Los cinco medios de cultivo fueron empleados para cultivar células MG 63, renovándose a los 2 (cuadrado), 4 (círculo) y 7 días (triángulo). Después de cada uno de estos periodos de tiempo se evaluó la proliferación celular utilizando el reactivo colorimétrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferación se calculó con la siguiente función: % proliferación = (absorbancia del WST-1 para los geles / absorbancia del WST-1 para control) ^* 100. La Figura 5 muestra ios resultados de citocompatabilidad de los geles proteicos ensayados con la línea celular osteoblástica MG 63. Como puede observarse, los geles no son tóxicos como muestra el aumento en la proliferación celular con respecto a la muestra de control. A los 2 días de proliferación (cuadrado) el gel preparado a partir del plasma rico en plaquetas sin activar resultó en mayor proliferación celular. Sin embargo, estas diferencias son ausentes a mayores tiempos de proliferación (círculo, triángulo). Por tanto, este ejemplo sirve para demostrar que las formulaciones según la invención presentan un comportamiento adecuado para estimular el crecimiento celular y también son biocompatibles, lo que permite su desarrollo dirigido hacia su uso clínico.

Ejemplo 10

Ai igual que en el ejemplo anterior, se prepararon cuatro geles proteicos o formulaciones de acuerdo con la invención a partir de un sobrenadante (cuadro), un coágulo de fibrina (círculo), un plasma rico en plaquetas sin activar (triángulo con vértice central hacia arriba) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular (triángulo con vértice central hacia abajo), realizando un tratamiento térmico consistente en calentar las sustancias iniciales anteriores a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos. Los métodos de preparación de estas sustancias iniciales están explicados en ios Ejemplos 2, 3 y 6, Las cuatro formulaciones obtenidas fueron incubadas en medio de cultivo durante 2, 4, 7 y 9 días. Después de cada tiempo, ios medios fueron recogidos y se añadió nuevo medio a los geies. Los medios recogidos se guardaron para usarlos para cultivar las células MG 63. Las células se dejaron crecer con este medio durante 48 horas, tras las cuales fue evaluada la proliferación celular utilizando el reactivo coiorimétrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferación fue calculada con la siguiente función: % proliferación = (absorbancia del WST-1 para los geies / absorbancia del WST-1 para control) ^* 100, donde como sustancia de control se utilizó un DMEM sin suero. La Figura 8 muestra la proliferación celular en cada medio de cultivo y en cada intervalo de tiempo de incubación. Como puede observarse, la mayor proliferación celular fue conseguida tras 2 días de incubación. A mayores tiempos de incubación, ios medios de cultivo promovieron una menor proliferación celular, lo que podría indicar que la liberación de los factores de crecimiento fue mayor tras 2 días de incubación y este contenido en factores de crecimiento fue menor en ios medios de mayor tiempo de incubación (4, 7 y 9 días). Así, estos resultados muestran que la liberación en los geies de sustancias bioactivas que estimulan la proliferación celular va disminuyendo en función del tiempo siguiendo un perfil de liberación parecido a otros tipos de geies que se caracterizan por liberar grandes cantidades de sustancias bioactivas durante las primeras horas de incubación (efecto "burst"), y que con el paso de tiempo se disminuye notablemente la cantidad liberada.

Ejemplo 1 1

En otro ejemplo, se partió de dos sustancias iniciales. La primera sustancia era un gei de fibrina obtenido tras activar un plasma rico en plaquetas con cloruro cálcico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma (como en el Ejemplo 6). La segunda sustancia era un sobrenadante obtenido tras la retracción de un gei de fibrina (como en el Ejemplo 6). Ambas sustancias fueron sometidas a tres tratamientos térmicos diferentes: un calentamiento a 70°C durante 15 minutos, un calentamiento a 70°C durante 30 minutos y un calentamiento a 80°C durante 15 minutos. En todos los casos, ios calentamientos fueron seguidos de un enfriamiento a temperatura de 4°C o a una temperatura de 20°C, durante 10 minutos. Se obtuvieron doce geies proteicos. Seguidamente, se centrifugaron ios doce geies a 14800 rpm durante 20 minutos y se midió el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β). Los resultados de estas medidas se muestran en las Figuras 7 y 8, donde se visualizan ios doce geies en seis grupos de dos, indicándose los grupos como "1 " (gei de fibrina a 70°c, 15 minutos), "2" (gel de fibrina a 70°c, 30 minutos), "3" (gei de fibrina a 80°c, 15 min), "4" (gel de sobrenadante a 70°C, 15 min), "5" (gel de sobrenadante a 70°C, 30 min) y "8" (gel de sobrenadante a 80°C, 15 min), y donde dentro de cada grupo se indica con una barra negra el gei enfriado a 4°C y con una barra blanca el gei enfriado a 20°C, La Figura 7 muestra los contenidos del factor de crecimiento PDGF-AB observados. Puede concluirse que el contenido de este factor de crecimiento fue en general mayor en ios geies enfriados a 20°C (barras blancas) que los geies enfriados a 4°C (barras negras), exceptuando ios geies de sobrenadante preparado a 70°C durante 30 minutos ("5") y a 80°C ("6"), donde no se observaron apenas diferencias en el contenido de PDGF-AB en función de la temperatura de enfriamiento. La Figura 8 muestra ios contenidos del factor de crecimiento TGF-β observados. Puede concluirse que, en lo que respecta a ios geies preparados a partir de fibrina (grupos "1 ", "2", "3"), en el caso de realizarse el enfriamiento a 20°C (barras blancas) el contenido del factor TGF-β fue similar en los tres grupos, es decir, para diferentes tratamientos térmicos de preparación de ios geies, mientras que en el caso de realizarse el enfriamiento a 4°C (barras negras) el contenido del factor TGF-β fue mayor en el gel preparado a 70°C durante 15 minutos (grupo "1 "). En cambio, en lo que respecta a los geies preparados a partir de sobrenadante (grupos "4", "5", "6"), puede observarse que solamente el gel proteico preparado a partir del sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (grupo "1 ") liberó el TGF-β, no siendo detectado dicho factor en ios demás geies preparados a partir del sobrenadante. Así, es posible concluir que el gel de fibrina mantiene más contenido de factores de crecimiento que el sobrenadante a temperaturas superiores a 70°C y que tanto la temperatura de calentamiento como la temperatura de enfriamiento afectan a este contenido de factores de crecimiento, siendo mayor el contenido a temperaturas de calentamiento más bajas y a una temperatura de enfriamiento de 21 °C. También puede concluirse que el PDGF-AB es más estable que el TGF-β a temperaturas altas y que el gel proteico basado en fibrina contiene más cantidad de TGF-β que el gel proteico basado en el sobrenadante.

Ejemplo 12

En otro ejemplo, se prepararon cuatro geies proteicos o formulaciones de acuerdo con la invención, aplicando un tratamiento térmico consistente en calentar a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos las siguientes sustancias iniciales: un sobrenadante (SN), un coagulo de fibrina (fibrina), un plasma rico en plaquetas sin activar (sin activar) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaC sin coagular (activado sin coagular). La preparación de estas sustancias iniciales está explicada en los Ejemplos 2, 3 y 6. Los cuatro geles proteicos fueron incubados en D EM durante distintos periodos de tiempo (2, 4 y 7días). Los medios de cada tiempo de incubación fueron extraídos para determinar el contenido del PDGF-AB y el TGF-β con el objetivo de determinar la cinética de liberación de estos factores de crecimiento de los cuatro geles proteicos. La Figura 9 muestra la cinética de liberación del PDGF-AB en medio de DMEM, indicándose con barras negras, blancas y rayadas las medidas correspondientes a los periodos de tiempo de incubación de 2, 4 y 7 días. Puede observarse que la liberación del PDGF-AB fue mayor durante 2 y 4 días de incubación para el gel proteico preparado desde el sobrenadante. Los demás geles no muestran diferencias significativas entre los tres tiempos de incubación. Por su parte, la Figura 10 muestra la cinética de liberación del TGF-β en medio de DMEM después de 2 días de incubación. Puede observarse que este factor fue presente solo en ios geles proteicos preparados a partir del sobrenadante y la fibrina, siendo mayor la liberación del TGF-β del gel proteico a partir del sobrenadante. Así, se puede concluir que la liberación de los factores de crecimiento es más rápida desde los geies proteicos basados en el sobrenadante. Ejemplo 13

En otro ejemplo, se ensayó el efecto de relleno de los geles de proteínas o formulaciones de acuerdo con la invención en ratas de laboratorio. Para ello se prepararon cuatro formulaciones según la invención. La preparación de las cuatro formulaciones comenzó con la realización de los pasos siguientes. En primer lugar, se extrajo sangre de unos pacientes a tubos de 9 mi sin anti-coaguiante; se centrifugaron ios tubos a 850 g durante 8 minutos para separar el plasma de los glóbulos rojos. Entonces, se extrajo a tubos nuevos de 9 mi toda la columna de plasma situada encima de la fracción de glóbulos rojos, excluyendo ios leucocitos. Este plasma fue empleado para preparar: por una parte, el propio plasma líquido (B); por otra parte, un coágulo de fibrina (C), para lo cual se añadió 10% cloruro cáicico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma, produciéndose la activación del plasma y la formación del coágulo; y por otra parte, un sobrenadante (A), para lo cual se preparó un coágulo de fibrina igual que el anterior, y se esperó 60 minutos a 37°C para permitir la retracción de la fibrina y la obtención del sobrenadante. También se extrajo la sangre de ios pacientes en tubos de extracción de 9 mi con 0.1 mi de 3.8% de citrato sódico como anti-coaguiante. La sangre fue centrifugada a 850g durante 8 minutos, seguidamente los 2 mi de plasma justo encima de la capa leuco-plaquetaria fue obtenida y activada con 10% cloruro cáicico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma para obtener el coágulo de fibrina (D). Estas cuatro sustancias iniciales (A, B, C, D) fueron tratadas a 70°C durante 10 minutos y enfriadas a 20°C durante 10 minutos para obtener ios geles. Se administró una dosis de 0,6 mi de cada una de las formulaciones de los geles a cada rafa. La fotografía visible en la Figura 1 1 muestra la formación de aumento en volumen sostenido por ios geles proteicos indicando una mejora en sus propiedades mecánicos.

Además, se preparó un plasma rico en factores de crecimiento (ai que se hará referencia corno "PRGF-Endoret") siguiendo ios pasos de extraer sangre en tubos de 9 mi con 0, 1 mi de 3.8% de citrato sódico, centrifugar la sangre a 850 g durante 8 minutos, separar la fracción de plasma rica en plaquetas (los 2 mi de la columna de plasma justo encima de ¡a fracción de glóbulos rojos, sin incluir los leucocitos) y, en el momento antes de inyectarlo en la rata, activar el plasma (causar la liberación de factores de crecimiento de las plaquetas) añadiendo 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi.

La Figura 12 muestra ios cambios en volumen tras 2 semanas de inyectar los geies proteicos en ratas y empleando como controles ácido hialurónico y el plasma rico en factores de crecimiento "PRGF-Endoret" descrito anteriormente. Se puede concluir que los geles proteicos son tan eficaces en mantener el volumen de la hem ¡elipsis como el ácido hialurónico, mientras que el plasma rico en factores de crecimiento "PRGF-Endoret" no fue útil para mantener el volumen de la hemielipsis.

Es interesante añadir que, durante ¡a realización de este ensayo, se intentó asimismo inyectar gel (coágulo) de fibrina convencional, con el fin de comparar la estabilidad de ¡os geies proteicos según la invención con la estabiüdad del gel de fibrina. El resultado fue que no resultó posible inyectar dicho gel de fibrina porque se producía una separación de fase (se separaba la fibrina del sobrenadante), impidiendo ¡a administración del gel de f¡br¡na como tal.

Ejemplo 14

Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el Ejemplo 2. A continuación se le añade un colágeno tipo I. Seguidamente, se callenta la mezcla a una temperatura de 75°C durante 10 minutos y se enfría posteriormente hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El resultado de esta preparación es un gel de proteínas que muestra mayor consistencia. Este tipo de gel se puede emplear como "filler" (relleno) para el tratamiento de arrugas ya que muestra mayor estabilidad y una tasa de degradación más lenta que sin el colágeno. Asi, esta modificación contribuye a ralentizar en mayor medida aún ¡a degradación de ¡a formulación. Clínicamente, esta mejora en ¡a estabilidad aumenta el periodo entre una primera y una segunda administración del gel. Esto supone una solución a la desventaja del tratamiento de arrugas con el ácido hialurónico, que requiere repetir su administración cada 3-4 meses, es decir, en un corto periodo de tiempo. Ejemplo 15 Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el

Ejemplo 2. A continuación se le añade un fosfato cálcico, por ejemplo granulado. Seguidamente, se calienta la mezcla a una temperatura de 80°C durante 10 minutos y se enfría hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El material híbrido resultado de esta preparación muestra mejores propiedades mecánicas que el gel sin modificar con fosfato cálcico. Así, la modificación de gel con fosfato cálcico aumenta la resistencia del gel a fuerzas de compresión y de tensión. Este tipo de material se puede emplear para la regeneración de defectos óseos que requieran una mayor estabilidad mecánica del material de relleno a causa de la falta de una o más paredes en el defecto.

Ejemplo 18

Se prepara el gel de proteínas según la invención, según el método de preparación descrito en cualquiera de ios ejemplos anteriores. Entonces, el gel se combina con ácido hiaiurónico para producir un material híbrido. Este material muestra mejores propiedades visco- elásticas, lo que aumenta su estabilidad en la zona de administración evitando así su migración. Este material híbrido es útil para su aplicación en superficies como puede ser la pared vestibular del proceso alveolar estrecho para provocar un crecimiento óseo horizontal y así aumentar el grosor del proceso alveolar para permitir la inserción de implantes dentales con suficiente cobertura ósea. Ejemplo 17

Después de preparar el gel y desecarlo como se ha descrito en el Ejemplo 8 (cualquiera de ios ejemplos de gel de proteínas descrito en el mismo es válido), el material seco se incuba, durante 24 horas y en oscuridad, en un líquido que contiene un antibiótico de doxiciclina hyclata en una concentración de 15 mg/ml. El resultado es el hinchamiento del gel incluyendo en su estructura el antibiótico para su posterior liberación en la zona de aplicación. Así, este gei sirve ahora para la liberación controlada del antibiótico para el tratamiento de una infección en zona dónde hay menor suministro sanguíneo como por ejemplo el hueso y evita la administración sistémica del antibiótico. Este procedimiento puede repetirse con otros antibióticos y otros fármacos para garantizar la liberación local de ios mismos.