| 1. | Trägerfreies Elektrophoreseverfahren zum Trennen einer Probensubstanz in ihre Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß in einer ersten Stufe eine Grobfraktionierung der Probensub stanz und in wenigstens einer zweiten Stufe eine Feinfraktio nierung der grobfraktionierten Probensubstanz erfolgt. |
| 2. | Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der ersten Stufe mit einer hohen linearen Flußgeschwindig keit und einer kurzer Wanderungsstrecke der zu trennenden Ana lyten gearbeitet wird. |
| 3. | Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß in der ersten Stufe eine kleinere Anzahl von Fraktio nierstellen als in der zweiten Stufe verwandt wird. |
| 4. | Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß alle Stufen parallel simultan ausge führt werden. |
| 5. | Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Ausführung von Stufen in einem paralle len simultanen Verfahren mit einer seriellen Ausführung wenig stens einer Stufe kombiniert wird. |
| 6. | Elektrophoresevorrichtung zur Durchführung des Verfah rens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer Trennkammer, Elektroden, Fraktionierungen und Probeaufgaben, dadurch ge kennzeichnet, daß die Trennkammer in eine Vielzahl von separa ten Trennräumen mit separaten Elektroden, separaten Fraktio nierungen und separaten Probenaufgaben jeweils aufgeteilt ist. |
| 7. | Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß für benachbarte Trennräume gemeinsame Elektroden vorgese hen sind. |
| 8. | Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn zeichnet, daß die separaten Fraktionierungen verschiedene An zahlen von Fraktionierstellen haben. |
| 9. | Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwei separate Förderkanäle einer Dosierpumpe mit dem Trennraum im Bereich der elektrodennahen Fraktionierauslässe verbunden sind, um Medium zuzugeben und im selben Volumen abzuführen. |
| 10. | Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennkammer aus einem Vorder teil und einem Rückteil aufgebaut ist, die aus mehreren sepa raten Kammerbauelementen jeweils bestehen. |
| 11. | Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Rückteil aus einem massiven Metallblock besteht. |
| 12. | Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Metallblock Kühlrohre vorgesehen sind. |
Bekannte trägerfreie Elektrophoreseverfahren FFE arbeiten üblicherweise mit Elektrophoresevorrichtungen, deren Trennkam- mer nur zwei getrennte Elektrodenräume und nur einen Trennraum zwischen diesen Elektrodenräume aufweist.
Wenn jedoch die FFE im Bereich der Proteomics-Forschung eingesetzt werden soll, muß es möglich sein, eine Vielzahl von unterschiedlichen Probesubstanzen in kurzer Zeit, mit größt- möglicher Trennleistung und bei größtmöglichem Durchsatz an Probenmenge zu trennen.
Wie bei den meisten Trennverfahren ist jedoch auch bei der FFE eine gleichzeitige Optimierung der Elektrophoresevor- richtung hinsichtlich der Trennleistung und des Probendurch- satzes nur in sehr engen Grenzen möglich, da eine Erhöhung der Menge der Probesubstanz eine Minderung der Trennleistung zur Folge hat.
Die Optimierung der Trennleistung erfordert weiterhin ei- nen Trennraum mit einem möglichst engen und präzisen Trenn- kammerspalt sowie besondere Randbedingungen der Trennung wie z. B. eine relativ geringe lineare Flußgeschwindigkeit, eine möglichst lange Trennzeit und möglichst viele Fraktionier- stellen über die gesamte Breite des Trennraumes bzw. über den Bereich des Trennraumes, in dem die interessierende Probesub- stanz fraktioniert werden soll. Da aber die lineare Flußge- schwindigkeit nicht beliebig reduziert werden kann, erfordert eine Verlängerung der Trennzeit eine entsprechende Vergröße- rung der Länge der Elektroden. Das wiederum bedeutet eine gleichzeitige Erhöhung der Außendimensionen der Trennkam-mer, was es schwierig bis unmöglich macht, den Trennkammer-spalt mit der geforderten Präzision zu fertigen.
Aus der DE 2215761 AI ist eine Elektrophoresevorrichtung bekannt, die nach dem Elektrofiltrationsverfahren arbeitet.
Die bekannte Elektrophoresevorrichtung weist eine Trennkammer, auf beiden Seiten der Trennkammer angeordnete Elektroden, Fraktionierstellen und Probeaufgabestellen auf, wobei in der Trennkammer mehrere Membrane vorgesehen sind, die die Trenn- kammer in eine Vielzahl von miteinander in Verbindung stehende Trennräume unterteilt. Die Membranen dienen als Filter und sind für die jeweils abzutrennenden Spezies permeabel.
Aus der EP 0203713 A2 ist es weiterhin bekannt, bei einer derartigen Elektrophoresevorrichtung für jeden der von den Membranen begrenzten Trennräume ein eigenes Elektrodenpaar vorzusehen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht daher darin, eine trägerfreies Elektrophoreseverfahren und eine Elektrophoresevorrichtung zur Durchführung dieses Verfahren zu schaffen, die eine höhere Trennleistung, eine kürzere Trenn- zeit und einen größeren Durchsatz erlauben.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch das träger- freie Elektrophoreseverfahren gelöst, das im Anspruch 1 ange- geben ist.
Besonders bevorzugte Weiterbildungen und Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 5.
Die erfinderungsgemäße Elektrophoresevorrichtung ist Ge- genstand des Anspruchs 6.
Besonders bevorzugte Weiterbildungen und Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung sind Gegen- stand der Ansprüche 7 bis 12.
Gemäß der Erfindung wird somit statt eines einstufigen Trennverfahrens bei gleichzeitiger Optimierung der Trennlei- stung und des Probendurchsatzes ein zweistufiges Trennverfah- ren angewandt, das in einer ersten Stufe eine sehr schnelle Vortrennung oder Grobfraktionierung mit dem Ziel des größtmög- lichen Probendurchsatzes und nachfolgend in wenigstens einer zweiten Stufe eine gezielte Feinfraktionierung des grobfrak- tionierten Teilstromes der Probensubstanz durchführt.
Eine Erhöhung des Probendurchsatzes in der ersten Stufe der Grobfraktionierung kann insbesondere dadurch erzielt wer- den, daß der Trennvorgang mittels der FFE bei erhöhter linea- rer Flußgeschwindigkeit und gleichzeitig verkürzter Wander- ungsstrecke für die zu trennenden Analyten durchgeführt wird.
Dabei kann die Zahl der Fraktionierstellen für die Grobfrak- tionierung deutlich reduziert werden und kann für den Fall, daß nur an einer Fraktion Interesse besteht, eine einzige Fraktionierstelle vorgesehen werden. Eine weitere Erhöhung des Probendurchsatzes ist dann möglich, wenn dieses zweistufige Verfahren in Form eines parallelen simultanen Mehrfachverfah- rens durchgeführt wird.
Im Folgenden werden anhand der zugehörigen Zeichnungen be- sonders bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung näher beschrieben. Es zeigen -Figur 1, Figur 2 und Figur 3 schematische Ansichten der Ausbildung der Trennkammer bei drei Ausführungsbeispie- len der Erfindung, Figur 4 und Figur 5 schematische Schnittansichten der Trennkammer bei einem Ausführungsbeispiel der Erfin- dung, - Figur 6 und Figur 7 den Aufbau des Trennkammervorder- teils und des Trennkammerrückteils im Bereich der Medi- enzuführungen und Fraktionierung jeweils, - Figur 8, Figur 9 und Figur 10 die relative räumliche Anordnung der verschiedenen Fraktionierstellen und der Zuleitungen der Querströmungen und Figur 11,12 und 13 die Beeinflussung des Strömungspro- fils mittels der Querströmung.
In den Figuren 1, 2 und 3 sind schematisch drei Beispiele der Trennkammer bei verschiedenen Ausführungsbeispielen der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung dargestellt. Damit die Trennkammer eine Außenabmessung hat, die eine Fertigung des Trennkammerspaltes mit der notwendigen Präzision erlaubt, sind in der Trennkammer mehrere separate Trennräume vorgese- hen. Gemäß Figur 1 sind vier separate Trennräume mit vier se- paraten Medienzuführungen und vier separaten Fraktionierungen mit jeweils n Fraktionierstellen vorgesehen, wobei n kleiner 15 ist. Figur 2 zeigt eine Trennkammer mit zwei separaten Trennräumen und zwei separaten Medieneinlässen bei zwei sepa- raten Fraktionierungen mit jeweils n Fraktionierstellen, wobei n größer 50 ist. Figur 3 zeigt schließlich eine Trennkammer mit drei separaten Trennräumen, drei separaten Medieneinläs- sen, zwei separaten Fraktionierungen mit nl und n3 Fraktio- nierstellen, wobei ni kleiner 15 und n3 größer 50 ist, und ei- ner weiteren separaten Fraktionierung mit n2 Fraktionierstel- len, wobei n2 größer 15 ist.
Die in den Figuren 1 bis 3 dargestellten Trennräume haben je nach Ausführungsform separate Elektroden oder gemeinsame Elektroden mit den benachbarten Trennräumen, wenn identische Medien in den jeweiligen Elektrodenräumen verwendet werden können.
Mit den in den Figuren 1 bis 3 dargestellten Trennkammern, erfolgt eine trägerfreie Elektrophorese FFE zum Trennen von Probesubstanzen in ihre Analyten in Form eines wenigsten zwei- stufigen Verfahrens, wobei in der ersten Stufe eine Grobfrak- tionierung der Probensubstanz und in wenigstens einer zweiten Stufe eine Feinfraktionierung der grobfraktionierten Probesub- stanz erfolgt.
Dieses Verfahren kann im parallelen Simultanbetrieb oder im seriellen Betrieb durchgeführt werden, wobei die in den Fi- guren 1 und 2 dargestellten Trennräume im parallelen Simultan- betrieb als Trennraum für die Grobfraktionierung (Figur 1) und als Trennraum für die Feinfraktionierung (Figur 2) verwandt werden können. Figur 3 zeigt den Trennraum für den seriellen Betrieb in Form eines dreistufigen Verfahrens, bei dem die Grobfraktionierung in Serie mit einer zweistufigen Feinfrak- tionierung kombiniert ist.
Bei der parallelen Arbeitsweise kann entweder eine ein- zelne Probesubstanz gleichzeitig mehreren Trennräumen zudo- siert werden oder es können verschiedene Probesubstanzen in die separaten Trennräume appliziert werden. Die Trennung der Probesubstanzen im parallelen Simultanverfahren ermöglicht ei- ne Erhöhung des Durchsatzes der Probesubstanzen oder eine Er- höhung der Anzahl der Probesubstanzen.
Durch eine Verkürzung der Breite der separaten Trennräume lassen sich die Wanderungsstrecken der Analyten verkürzen und können die Trennprozesse mit höherer Flußgeschwindigkeit der Trennmedien und der Probesubstanzen durchgeführt werden. Mit zunehmender Zahl der Trennräume wird die Breite der Trennräume wesentlich kleiner, was allerdings zur Folge hat, daß zwar nur eine Grobfraktionierung aber mit wesentlich höherem Pro- bendurchsatz möglich ist.
Wenn die Trennräume mit völlig getrennten Elektrodenräumen in Serie geschaltet sind, werden die Fraktionen der Trennung aus einem Trennraum in den nachfolgenden Trennräumen unter identischen Trennbedingungen weiter getrennt und läßt sich da- durch eine höhere Trennleistung erzielen. In den in Serie ge- schalteten Trennräumen können die Trennungen aber auch unter verschiedenen Bedingungen hinsichtlich der verwendeten Trenn- techniken, der Trennmedien und/oder der allgemeinen eletropho- retischen Trennparameter durchgeführt werden.
Die Trennräume und die technischen Ausführungen der ein- zelnen Trennräume lassen sich mittels des oben beschriebenen Aufbaus fast beliebig kombinieren, wie es im Folgendem be- schrieben wird.
Wie es in den Figuren 4 und 5 dargestellt ist, besteht ei- ne Trennkammer üblicherweise aus zwei Baugruppen, nämlich dem Trennkammervorderteil und dem Trennkammerrückteil. Bei der er- findungsgemäßen Ausbildung bestehen die einzelnen Baugruppen jedoch aus mehreren separaten Bauelementen, die schematisch in Figur 4 und Figur 5 dargestellt sind.
Das heißt im Einzelnen, daß in der in Figur 4 dargestell- ten Weise ein Trennkammervorderteil aus einem Kunststoffblock 1 mit einer Hartplastikfolie 2 und eine Weichplastikfolie 3 sowie ein Trennkammerrückteil aus einem Metallblock 8 mit ei- ner Glasfolie 10 und einer Weichplastikfolie 11 über Abstand- halter 5 aneinander angeordnet sind. Im Kunststoffblock 1 sind mehrere, bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel vier, Elek- trodenräume 4 vorgesehen. Im Metallblock 8 befinden sich Kühl- rohre 9. Es sind weiterhin Medieneinlässe 7 und eine Vielzahl von Fraktionierungsstellen 6 vorgesehen. Figur 5 zeigt die Übertragung 12 der vorfraktionierten Probe.
Die Baugruppe des Trennkammervorderteils in Figur 4 be- steht somit aus einem Basisbaustein, nämlich einem massiven Plexiglasblock 1, in dem bis zu acht Elektrodenräume 4 und die Öffnungen für spezifische Methodenmodule der Medienzu- führungen und der Fraktionierungen untergebracht sind. Auf diesen Basisbaustein 1 ist eine dünne Folie 2 aus einem harten Kunststoffmaterial aufgebracht, wobei diese im Bereich der für die jeweiligen Anwendung benötigten Elektrodenräume des Kunst- stoffblockes 1 Öffnungen für den Stromtransport aufweist und die benötigten Elektrodenräume des Kunststoffblockes 1 nicht verschließt. Das gleiche gilt für die Ausführung der Hartpla- stikfolie 2 im Bereich der Medienzuführungen 7 und der Frak- tionierungen 6. Die dem Trennraum zugewandte Fläche der Hart- plastikfolie 2 kann entweder direkt chemisch modifiziert sein oder in der dargestellten Weise durch eine Kunststoffolie 3 abgedeckt sein, deren Oberfläche, die den Trennraum direkt be- grenzt, soweit chemisch modifiziert ist, daß die Effekte der Elektroosmose und der Sorption der Probenspezies minimiert sind.
Durch die beschriebene Kombination des Basisbausteines, nämlich des Kunststoffblockes 1, mit den beiden Kunststoffoli- en 2,3, die anwendungsspezifisch modifiziert sind, können al- le beschriebenen Anforderungen hinsichtlich der Anzahl der notwendigen Trennstufen, der Geometrie des Trennraumes und der speziellen elektrophoretischen Randbedingungen in der jeweili- gen Stufe des Trennprozesses erfüllt werden.
In den Figuren 6 und 7 ist der Aufbau des Trennkammervor- derteils und Trennkammerrückteils jeweils im Einzelnen darge- stellt. Wie es in Figur 7 dargestellt ist, besteht der Trenn- kammerrückteil aus mehreren Schichten, nämlich dem Metallblock 8, der Glasfolie 10 und der Weichplastikfolie 11. Diese Schichten können in verschiedener Weise kombiniert werden, um die Trennvorrichtung für die jeweilige Anwendung zu optimie- ren.
Der Basisbaustein des Trennkammerrückteils ist somit ein massiver Metallblock 8, der in Verbindung mit einer externen Kühlung eine effektive Abführung der während der elektropho- retischen Trennung entwickelten Wärme ermöglicht. Die dem Trennraum zugewandte Oberfläche des Metallblockes 8 ist durch die elektrisch isolierende dünne Folie 10 aus Glas oder eine Keramikfolie abgedeckt, wobei diese elektrisch isolierte Folie durch die Kunststoffolie 11 abgedeckt ist, deren Oberfläche, die den Trennraum direkt begrenzt, chemisch so modifiziert ist, daß eine Optimierung des Trennvorganges erzielt ist. In der Regel können die dem Trennraum zugewandten Kunststoffo- lien, das heißt die Folien 3 und 11 hinsichtlich ihres Materi- als und der Art der chemischen Modifizierung identisch oder ähnlich sein, sie können bei bestimmten Verfahrenskombinatio- nen aber auch unterschiedlich sein.
In den Figuren 8,9 und 10 sind verschiedene Fraktionier- module dargestellte, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwandt werden können. Der Fraktionierungsmodul in Figur 8 enthält in der Standardausführung drei Auslässe für die Frak- tionierung, wobei bei besonderen Anwendungen fünf oder sieben Fraktionsauslässe vorgesehen sind, wie es in Figur 9 und Figur 10 jeweils dargestellt ist. Dabei ist die Flußrichtung des Trennmediums durch einen Pfeil 13 wiedergegeben und sind die Zuführungsstellen 14 für die Querströmung, die n Fraktionier- stellen 15 für die Probensubstanz, und n+1 Auslässe 16 für das restliche Medium dargestellt.
Im Betrieb werden zwei separate Förderkanäle mit identi- scher Förderrate einer Dosierpumpe werden mit dem Trennraum jeweils im Bereich der elektrodennahen Fraktionierungsauslässe verbunden, wobei je nach Drehrichtung der Förderpumpe über ei- ne Verbindung zu dem elektrodennahen Trennraum ein Medium zu- gegeben wird und gleichzeitig über eine zweite Verbindung ein Medium aus dem Trennraum mit derselben Volumenrate abgeführt wird. Durch die gleichzeitige Zugabe und Abführung des Mediums im elektrodennahen Trennraum wird das Strömungsprofil im Be- reich der Fraktionierstelle der Probe verändert, wie es in den Figuren 11,12 und 13 dargestellt ist.
Figur 11 zeigt zwei Analyten 17,18, eine Pumpe 21 für die Querströmung, die Zuleitung 20 für die Querströmung und die Maske 19 für das Strömungsprofil. In Figur 11 ist ein Strö- mungsprofil ohne Querströmung dargestellt, Figur 12 zeigt das Profil bei angeschalteter Querströmung und Figur 13 zeigt das Strömungsprofil bei angeschalteter Querströmung aber mit umge- kehrter Drehrichtung der Pumpe 21.
Im Folgendem wird ein präparativer Langzeitversuch, das heißt der Betrieb des Fraktionsmoduls bei zwei typischen al- ternativen Anwendungen, beschrieben : Bei der präparativen Isolierung einer beliebigen getrenn- ten Substanz wird die Förderrate der zweikanaligen Pumpe so gewählt, daß die zu isolierende Substanz über einen der dafür vorgesehenen Probenauslässe gesammelt werden kann. Die Förder- rate der Zweikanalpumpe bleibt während der Dauer der präpara- tiven Isolierung unverändert. Kann der im Probenfraktionier- schlauch abfließende Analyt nur mit geringer Zeitverzögerung quantitativ detektiert werden, kann das Signal der Detektion für die Steuerung des Trennverfahrens dahingehend genutzt wer- den, daß der Analyt mit bester Ausbeute und Reinheit isoliert werden kann.
Wird während der elektrophoretischen Trennung die Förder- rate der Pumpe jedoch kontinuierlich verändert, werden nach- einander getrennte Substanzen über die Probenfraktionierstelle gesammelt. Durch die Änderung der Förderrate und durch die Än- derung der Drehrichtung der Zweikanalpumpe können alle ge- trennten Spezies nacheinander über die Fraktionierstelle elu- iert werden und nachfolgend einem Detektionssystem und einem Fraktionssammler mit zeitgesteuertem oder peakgesteuertem Wechsel der Sammelgefäße zugeführt werden.
Wenn eine örtliche Verschiebung der Probenbande um mehr als 20 mm in Richtung der Probenfraktionierstelle erzielt wer- den muß, empfiehlt sich eine Erhöhung der Anzahl der Proben- fraktionierauslässe, wobei diese Anzahl bei höheren Werten der Breite des Trennraumes beliebig erhöht werden kann, um eine optimale Qualität der Elution der Proben zu ermöglichen.