本发明属生物制药技术领域， 具体涉及葛根素的新衍生物、 生物转化方 法及其药物应用。 背景技术

葛根素 （puerarin )是从豆科植物野葛 （ puerarialobata ( Willd. ) Ohwi ) 及葛根藤（Rthomaonii Benth ) 中提取， 分离得到的异黄酮葡萄糖碳苷， 化 学名为 7,4， -二羟基 -8- β -D-葡萄糖基异黄酮， 呈白色针状结晶， 能溶于水， 但溶解度小（6.24g/L), 其水溶液为无色或微黄色， 分子量为 416.37。 葛根素 是中药葛根中主要活性成分之一，是一种天然 的低毒有效的心脑血管系统疾 病治疗药物， 药理作用广泛， 临床上已用于降低血压、 减慢心率、 降低心肌 耗氧量； 扩张冠状血管， 改善正常和缺血心肌的代谢； 对脑循环、 周围血管 及微循环有影响； 除此以外， 葛根素还有降血糖降血脂、 抗氧化、 抗肿瘤等 作用 (姚丹，丁选胜.中国临床药理学与治疗学， 2008, 13, 468-474. )。

目前葛根素制剂有葛根素注射液、 滴眼剂、 冻干粉针剂， 实际使用中主 要以注射给药应用于临床（吴燕红， 苏子仁， 赖小平等.中药新药与临床药 理, 2004, 15(4):259-261. )。 由于葛根素在水中的溶解度较低， 临床应用时需加 入助溶剂， 以提高溶解度。 目前临床应用的葛根素注射液大多需加入高浓 度 丙二醇做助溶剂， 不仅增加成本， 也因为药液粘度过大， 给生产造成过滤上 的麻烦， 同时不溶性杂质增加， 对人体产生一定的毒副作用， 致使用药安全 性降低。 为方便应用， 需要改善葛根素溶解性和生物利用度。 据相关文献报 道， 目前的方法主要通过对葛根素进行糖基化结构 修饰或采用特殊剂型有效 改善葛根素溶解性。迄今，国内外关于葛根素 的糖基化结构修饰的报道如下： 2004年， Li等人 ( Li D, Park S H, Shim J H, et al. Carbohyd Res, 2004, 339, 2789-2797. )首次报道了体外酶法糖基化葛根素， 由来源于嗜热芽孢杆菌的 麦芽糖淀粉酶催化合成得到了 C-6" 醇羟基上糖基代的葡萄糖基 - α -(1,6)-葛 根素 ( CASRN : 824959-75-3 ) 及麦芽糖基 - α -(1,6)-葛根素 ( CASRN : 824959-76-4 )。 催化反应在 1% ( w/v ) 葛根素， 3% ( w/v )可溶性淀粉为糖 基供体的条件下， 55 °C反应 45min, 产物转化率达 70%。 两转化产物经制备 液相色谱分离纯化后， 经测定其水溶性较葛根素分别提高了 14倍和 168倍。 蒋洁蓉等（ Jiang J R, Yuan S, Ding J F, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2008,81 _: 647-657. ) 利用氧化微杆菌糖基化葛根素， 获得 7-0-葡萄糖苷葛根素 ( CASRN： 1163249-06-6 ) 与 7-0-异麦芽糖苷葛根素 （ CASRN： 1163249-07-7 )。 催化反应在 4g/L葛根素， 50g/L蔗糖为糖基供体条件下， 30 °C反应 48h, 7-0-葡萄糖苷葛根素摩尔转化率为 40%, 7-0-异麦芽糖苷葛根 素摩尔转化率为 5%。 两转化产物经制备液相色谱分离纯化后， 其水溶性较 葛根素分别提高了 18倍和 100倍。 Huang等（ Huang W, Ochiai H, Zhang X Y, et al. Carbohyd Res, 2008, 343, 2903-2913. ) 利用一种乙酰基半乳糖苷酶， 以 三甘露糖乙酰氨基葡萄糖恶唑啉为糖基供体， 在 20% DMSO中对葛根素进 行糖基化转化， 得到相应的糖苷化合物 Puerarin-GlcNAcMan3 ( CASRN: 1093135-90-0 )。 催化反应在 4.16g/L葛根素， 13g/L三甘露糖乙酰氨基葡萄 糖恶唑啉为糖基供体条件下， 23 °C反应 2h, Puerarin-GlcNAcMan3摩尔转化 率为 60%, 该糖基化产物的制备及相关性质未见报道。 Choi等 (Choi C H, Kim S H, Jang J H, et al. J Sci Food Agric, 2010,90: 1179-1184.)利用来源于脂肪 嗜热芽孢杆菌的麦芽淀粉酶（BSMA )糖基化葛根素， 分别获得葡萄糖基- α -(1 ,6)-葛根素、 麦芽糖基 - α -(1 ,6)-葛根素和葡萄糖基 - α -(1 ,3)-葛根素 ( CASRN: 1219937-73-1 ), 在 10g/L 葛根素时， 产物总转化率为 56.7%。 Yu 等 (Yu C G, Xu H D, Huang G D, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010,86:863-870.) 以 40%乙醇处理氧化微杆菌后， 改变了细胞通透性， 氧化 微杆菌可使 7-0-葡萄糖苷葛根素转变为 7-0-果糖苷葛根素 （CASRN : 1223091-93-7 )。 张连文等（中国发明专利申请号： 200910068855.7; 公开号： CN 101575631A ) 以半乳糖转移酶糖基化葛根素， 催化反应在 9.12g/L葛根 素， 4g/L UDP-半乳糖为糖基供体条件下， 得到半乳糖基 - α -(1,4)-葛根素 ( CASRN: 1196677-60-7 ), 其溶解度是葛根素的 12倍。

葛根素糖苷化后， 水溶性得到显著提高， 糖苷化修饰后分子结构的变化 不影响葛根素的药效， 但提供了一种高浓度给药的葛根素糖苷化合物 。 相关 报道如下： Chung等（ Chung M J, Sung N J, Park C S, et al. Eur J Pharmacol, 2008, 578,159 - 170. ) 以等摩尔的葡萄糖基 - o -(1,6)-葛根素 ( CASRN : 824959-75-3 )和麦芽糖基 - α -(1,6)-葛根素 （CASRN: 824959-76-4 ) 的混合 物为水溶性葛根素糖苷化产物，在 HepG2细胞与 C57 BL/6J小鼠中的药理实 验表明： 水溶性葛根素糖苷化产物保持了与葛根素相同 的抗氧化活性及降低 低密度脂蛋白氧化作用的药效。 蒋洁蓉等（ Jiang J R, Yuan S, Ding J F, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2008,81 , 647-657. ) 以 7-0-葡萄糖苷葛根素 ( CASRN: 1163249-06-6 )进行的体外药物代谢动力学实验表明： 7-0-葡萄 糖苷葛根素与葛根素相比表现了更好的药物代 谢动力学性能， 7-0-葡萄糖苷 葛根素的血浆半衰期 （tl/2 )和平均滞留时间 （MRT )分别是葛根素的 2倍 和 2.8倍，该性能有可能增加 7-0-葡萄糖苷葛根素的生物利用度。袁生等（� � 国发明专利申请号： 200710021700.9 ) 以 7-0-葡萄糖苷葛根素或 7-0-异麦芽 糖苷葛根素及其药物组合物制成用于治疗和预 防心脑血管疾病的药物。 张连 文等（中国发明专利申请号： 200910068855.7; 公开号： CN 101575631A ) 以主动脉血管平滑肌为生理模型， 将葛根素和半乳糖基- α -(1 ,4)-葛根素对血 管平滑肌的舒张作用进行比较， 发现半乳糖基 - α -(1,4)-葛根素的舒张作用好 于葛根素。

由于葛根素较差的水溶性， 利用生物转化方法进行葛根素糖基化修饰 时， 转化前葛根素浓度普遍较低（均不超过 10g/L ), 产物摩尔转化率也较低 (均不超过 70% ), 这些局限性给获得足够产物进行心脑血管及肿 瘤相关疾 病的药理实验及后期的工业化生产都带来了相 当的难度。 发明内容

为了解决上述技术问题， 本发明的一个目的是提供一种新型的果糖基化 葛根素。

本发明的另一个目的是所述果糖基化葛根素的 制备方法， 具体地， 该方 法以烟草节杆菌 (拉丁文学名： Arthrobacter nicotianae XM6, 分类命名： 烟 草节杆菌 XM6, 于 2010年 6月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地 址： 中国 武汉 武汉大学，邮编： 430072 ,保藏编号： CCTCC NO: M2010164) 在水相或非水相生物转化果糖基化葛根素。

本发明又一个目的是提供所述果糖基化葛根素 在治疗心脑血管相关疾 病的药物制备中的用途。

本发明再一个目的是提供所述果糖基化葛根素 在治疗肿瘤相关疾病的 药物制备中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

一方面， 本发明提供一种果糖基化葛根素， 所述果糖基化葛根素具有下 式（I )所示的结构：

( I )

其中， 1^和 分别独立地选自氢、 曱基、 乙基、 曱酰基、 乙酰基、 曱氨 基和硫酸基； R为果糖单糖基或 2至 5个果糖连接的寡糖基，其结构如式（ II ) 所示：

( II )

其中 n=0~4。

另一方面， 本发明提供用于制备上述果糖基化葛根素的方 法， 所述方法 包括采用具有果糖基化酶活力的发酵液或发酵 液上清或纯化的果糖基化酶 或其重组表达蛋白， 对含有葛根素的转化液进行生物转化反应， 使葛根素转 化为果糖基化葛根素。

优选地， 所述方法还包括转化结束后， 去除转化液中的菌体细胞或菌体 蛋白等杂质， 然后将经树脂纯化得到的目标馏分旋转蒸发或 冷冻干燥后得到 果糖基化葛根素粉末或晶体。

优选地， 所述发酵液或发酵液上清由具有果糖基化葛根 素活力的微生物 发酵获得； 进一步优选地， 所述微生物为烟草节杆菌 (Ar irakzcter 'c a聽 e XM6) (CCTCC NO: M2010164)。

优选地， 用于微生物发酵的发酵培养基包含： 蔗糖 5-80g/L, 蛋白胨 5-50g/L, KH ₂ P0 ₄ 0.4-4g/L, CaCl ₂ 0.5-5g/L, MnS0 ₄ 0.1-2g/L, pH6-8; 发酵 条件优选为： 25~40°C , 10~400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌通气， 转速通气量 为 l~6wm, 10~400rpm, 发酵 6-48小时； 进一步优选地， 发酵培养基包含 蔗糖 15g/L,蛋白胨 25g/L, KH ₂ P0 ₄ 2g/L, CaCl ₂ 2g/L, MnS0 ₄ 0.2g/L, pH7.5; 发酵条件进一步优选为： 30°C , 240rpm摇瓶振荡 16小时或发酵罐搅拌通气， 转速通气量为 4wm, 300rpm, 发酵 6小时。

优选地， 所述生物转化反应在水相或非水相中进行；

其中，所述水相转化条件包括：采用 10~400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌， 葛根素浓度大于 0.1g/L至饱和， 糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物， 葛根 素与糖基供体摩尔比为 1 : 1~1： 200, 加入占反应体系 10%-50%的发酵液或 发酵液上清（含果糖基化酶 10-100U/mL), 在任意一种 pH 4-8的緩沖溶液 中进行，转化温度为 25~40°C ,反应时间为 6~96小时；优选条件为： 以 10g/L 葛根素， 100g/L蔗糖为糖基供体， 加入 20%的发酵液上清（含果糖基化酶 30U/mL),于 l/15mol/L磷酸盐緩沖液 (pH6.86)的 5L发酵罐中， 30°C , 300rpm 搅拌转化 12小时。

所述非水相转化条件包括： 采用 10~400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌，

5~50%选自二曱基亚砜（DMSO )、 二曱基曱酰胺（DMF )、 乙腈、 曱醇、 丙 酮或乙醇的一种或几种的亲水性有机溶剂， 葛根素浓度为 5~200g/L,优选葛 根素浓度 5~120g/L,糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物， 葛根素与糖基供 体摩尔比为 1 : 1-1 : 200, 加入 10%-50%的发酵液或发酵液上清（含果糖基 化酶 10-100U/mL),在任意一种 pH4~8的緩沖溶液中，转化温度为 25-40 °C , 反应时间为 6~96小时； 优选条件为： 采用 20%的 DMSO, 107.5g/L葛根素， 350g/L蔗糖为糖基供体， 加入 20%的发酵液上清（含果糖基化酶 30U/mL), 于 l/15mol/L磷酸盐緩沖液 (pH6.86)的 5L发酵罐中， 30°C , 300rpm搅拌转 化 72小时。

优选地， 所述树脂纯化为将含有果糖基化葛根素的转化 液通过 AB-8大 孔树脂的吸附， 可选地， 如为非水相转化， 该吸附在将转化液中的有机溶剂 低温蒸发去除或将有机溶剂稀释至低于 2%体积比的条件下进行； 吸附后先 采用洗脱液洗去残余的糖基供体， 然后采用洗脱液梯度洗脱或阶段洗脱分别 得到果糖基化葛根素； 进一步优选地， 采用 10倍柱床体积 pH 4~4.5的蒸馏 水洗去残余的糖基供体，然后采用 5~30%的曱醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段 洗脱分别得到果糖基化葛根素。

优选地， 所述方法还包括采用洗脱液洗脱回收残余葛根 素； 进一步优选 地， 采用 100%曱醇或乙醇洗脱回收残余葛根素。

优选地，所述果糖基化酶或其重组表达蛋白为 β -D-呋喃果糖苷酶或其重 组表达蛋白。

更优选地，所述 β -D-呋喃果糖苷酶是来源于节杆菌属细菌，其分 子量约 60 kDa , Ν端前 5个氨基酸序列分别为 ATEP V。

又一方面， 本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗 心脑血管相关 疾病的药物中的用途。

再一方面， 本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗 肿瘤相关疾病 的药物中的用途。

优选地， 所述药物为注射剂或口服制剂。 以下是本发明的详细描述：

为了完成本发明之目的， 本申请采取如下技术方案：

根据本发明的一个实施方式， 本发明提供一种如式（I )所示新型的果糖 基化葛根素：

( I )

其中， 和 分别选自的取代基是氢基， 曱基， 乙基， 曱酰基， 乙酰基, 曱氨基和 酸基中的一种。

式（I ) 中， R为式（II )所示：

( II )

其中 n=0~4。 R为果糖单糖基或 2至 5个果糖连接的寡糖基。

该化合物由酶法制备， 可以用各种通常的方法如色谱分离、 液相萃取、 重结晶方法进行纯化。 该化合物的结构可以通过元素分析， 红外光谱， 可见 紫外光谱， 核磁共振谱， 单晶 X-Ray衍射手段进行表征。

根据本发明的另一个实施方式， 本发明提供一种生物转化果糖基化葛根 素的方法。

本发明采用具有葛根素果糖基化酶活力的发酵 液、 或发酵液上清（胞外 酶）、 或该酶的重组表达蛋白， 加入到含有葛根素的水相或非水相转化液中， 使葛根素转化为果糖基化葛根素； 转化结束后， 转化液中的菌体细胞或菌体 酶蛋白经加热沉淀、 离心去除； 然后转化液经 AB-8大孔树脂进行分离， 目 标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛 根素粉末或晶体。

上述具有葛根素果糖基化活力的微生物菌种可 以是任何果糖基化葛根 素的微生物或糖苷酶， 特别是烟草节杆菌 (Ar irakzcter nicotianae XM6) (CCTCC NO: M2010164)。

上述具有葛根素果糖基化活力的胞外酶、或该 酶的重组表达蛋白为 β -D- 呋喃果糖苷酶或 β -D-呋喃果糖苷酶重组表达蛋白。

上述 β -D-呋喃果糖苷酶由节杆菌属细菌所产生。

所述培养基的营养物质没有特别的限制， 可以是任何一种合适于微生物 生长的营养介质， 如任何以淀粉、 葡萄糖、 玉米粉、蔗糖为碳源， 以玉米浆、 黄豆饼粉、 花生饼粉等为氮源的培养基。 上述用于发酵培养的培养基是： 蔗 糖 5-80g/L , 蛋白胨 5-50g/L , KH ₂ P0 ₄ 0.4-4g/L , CaCl ₂ 0.5-5g/L , MnS0 ₄ 0.1-2g/L, pH 6-8

上述用于发酵培养的条件是： 25~40 °C , 10~400rpm摇瓶振荡或 5L发酵 罐搅拌通气， 转速通气量为 l~6vvm, 10~400rpm, 发酵 6-48小时。

上述生物转化方法， 转化反应可在水相或非水相中进行， 转化温度范围 在 25~40 °C , 10~400rpm摇瓶振荡或 5L发酵罐搅拌， 反应时间 6~96h。 （ 1 ) 水相转化条件为： 葛根素浓度大于 0.1g/L至饱和，糖基供体为果糖或蔗糖或 两者混合物， 葛根素与糖基供体摩尔比为 1 : 1-1 : 200 , 在任意一种 pH4~8 的緩沖溶液中； （2 )非水相转化条件为： 采用 5~50%的亲水性有机溶剂二曱 基亚砜（DMSO )、 二曱基曱酰胺（DMF )、 乙腈、 曱醇、 丙酮、 乙醇， 葛根 素浓度 5~200g/L, 优选葛根素浓度 5~120g/L , 糖基供体为果糖、 蔗糖或两 者混合物， 葛根素与糖基供体摩尔比为 1 : 1-1 : 200, 在任意一种 114~8的 緩沖溶液中；

上述含有果糖基化葛根素的转化液通过 AB-8大孔树脂的吸附， 是将转 化液中的有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶剂 稀释至低于 2%体积比的条件 下进行吸附； 第一步洗脱液为 10倍柱床体积 pH4~4.5的蒸馏水（乙酸调节 pH ) 洗去残余的糖基供体， 第二步洗脱液为 5~30%的曱醇或乙醇溶液梯度 洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素， 第三步洗脱液为 100%曱醇或乙 醇洗脱回收残留葛根素。

上述经树脂纯化得到的果糖基化葛根素溶液旋 转蒸发或冷冻干燥后得 到果糖基化葛根素粉末或晶体。

根据本发明的又一种实施方式， 本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生 物在制备治疗心脑血管相关疾病的药物中的用 途。

用本发明的单果糖基- β (2,6)-葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂 型的药物； 在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。

利用本发明的化合物单果糖基- β (2,6)-葛根素对大鼠心肌缺血 Τ波幅度 变化的试验表明： 受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根素的剂量分别为 12.5mg/kg,25mg/kg和 50mg/kg均能显著减少由垂体后叶素引发的 T波振幅， 并且对于 T波的减少幅度小于葛根素， 说明受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根 素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血作用。 利用本发明的化合物单果糖基- β (2,6)-葛根素对心肌缺血大鼠心率的实验结果表 明， 注射垂体后叶素后 2 min内各组大鼠均出现心率明显下降， 2~10min各组心率开始恢复。 与对照 组相比， 受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根素的不同剂量组均能加快心肌缺血 大鼠心率的恢复， 并且单果糖基- β (2,6)-葛根素低剂量组的恢复时间快于葛 根素组。 说明受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根素对心肌缺血导致的心率失常 具有一定的治疗作用。本发明所述果糖基化葛 根素可制备成治疗心脑血管疾 病的药物。

根据本发明的再一种实施方式， 本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生 物在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。

用本发明的单果糖基- β (2,6)-葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂 型的药物； 在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。

利用本发明的化合物单果糖基- β (2,6)-葛根素对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231和人慢粒白血病细胞株 Κ562体外增殖抑制的试验表明： 单果 糖基- β (2,6)-葛根素作用 48小时后均可减少 MDA-MB-231细胞的细胞数目。 与相同时间内的对照组比较，当单果糖基 - β (2,6)-葛根素剂量达到 50 mol/L 时有差异（P<0.05 ), 剂量在 ΙΟΟ μ ηιοΙ/L时有显著性差异（PO.01 ), 当剂量 达到 150和 200 μ mol/L时该差异具有极显著性（ P<0.001 ),对 MDA-MB-231 细胞的抑制率分别达到 44.04%和 59.42%,说明单果糖基- β (2,6)-葛根素能明 显抑制人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231的增殖，且抑制率随剂量增加而增加� � 单果糖基- β (2,6)-葛根素作用 48小时后均可减少 Κ562细胞的细胞数目。 与 相同时间内的对照组比较， 当单果糖基- β (2,6)-葛根素在低剂量 1 μ mol/L其 结果就有显著性差异（PO.05 ), 剂量在 100、 150和 200 μ mol/L时该差异 具有极显著性（PO.001 ), 对 K562细胞的抑制率分别达到 16.41%、 29.84% 和 46.41%, 说明单果糖基 - β (2,6)-葛根素能明显抑制人慢粒白血病细胞株 Κ562的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。 说明受试样品单果糖基 - β (2,6)- 葛根素在体外对肿瘤细胞具有一定的抑制作用 。本发明所述果糖基化葛根素 可制备成治疗肿瘤疾病的药物。 与现有技术相比， 本发明具有的有益效果在于：

首先， 本发明人发明了一种新的果糖基化葛根素， 实验证明这种新型葛 根素衍生物对于心肌缺血导致的心律失常具有 一定的治疗作用，可以有效用 于治疗心脑血管疾病， 并且实验同时证明这种新型葛根素衍生物在体 外对人 乳腺癌细胞株 MDA-MB-231和人慢粒白血病细胞株 K562有显著的抑制作 用， 可以用于治疗肿瘤疾病， 这都丰富了葛根素糖基化衍生物作为药物的来 源， 而现有的葛根素糖苷化衍生物未见这方面的报 道；

其次， 相比葛根素， 这种新型果糖基化葛根素的溶解度更好， 药理活性 高， 弥补了葛根素产品的缺陷， 使用药的安全性提高， 疗效增加， 是一种具 有较好发展前景的新药产品；

再次， 本发明人还提供了该新型果糖基化葛根素的生 物转化方法。 在现 有利用生物转化方法进行葛根素糖基化修饰时 ， 由于葛根素较差的水溶性， 葛根素浓度普遍较低 (均不超过 10g/L ) , 产物摩尔转化率也较低（均不超过 70% ) , 而采用本发明的生物转化方法， 所获得的单果糖基- β (2,6)-葛根素浓 度达 111.7g/L, 底物转化率达 90%以上， 解决了现有技术中所存在的技术难 题，有利于利用该产物进行心脑血管及肿瘤相 关疾病的药理试验及后期的工 业化生产。 附图的简要说明

以下， 结合附图来详细说明本发明的实施例， 其中：

图 1 显示水相生物转化葛根素的 HPLC 图谱， 该图中： 保留时间 14.910min的峰为葛根素， 保留时间 10.131min的峰为单果糖基- β (2,6)-葛根 素， 保留时间 6.130min的峰为双果糖基 - β (2,6)-葛根素， 保留时间 5.409min 的峰为三果糖基- β (2,6)-葛根素，保留时间 5.144min的峰为四果糖基- β (2,6)- 葛根素， 保留时间 4.968min的峰为五果糖基- β (2,6)-葛根素；

图 2 显示非水相生物转化葛根素的 HPLC 图谱， 该图中： 保留时间 13.735min的峰为葛根素； 保留时间 7.450min的峰为单果糖基 - β (2,6)-葛根 素， 保留时间 4.603min的峰为双果糖基 - β (2,6)-葛根素； 保留时间 4.192min 的峰为三果糖基- β (2,6)-葛根素；

图 3显示单果糖基- β (2,6)-葛根素的 ¹ HNMR语图；

图 4显示单果糖基- β (2,6)-葛根素的 ¹³ CNMR语图；

图 5显示单果糖基- β (2,6)-葛根素的 Η-Η COSY谱图；

图 6显示单果糖基- β (2,6)-葛根素的 C-H HSQC谱图；

图 7显示单果糖基- β (2,6)-葛根素的高分辨质谱图；

图 8显示葛根素的 ¹ HNMR谱图；

图 9显示葛根素的 ¹³ CNMR语图；

图 10显示双果糖基- β (2,6)-葛根素的 ¹ HNMR语图；

图 11显示双果糖基- β (2,6)-葛根素的 ¹³ CNMR谱图；

图 12显示双果糖基- β (2,6)-葛根素的 Η-Η COSY谱图；

图 13显示双果糖基- β (2,6)-葛根素的 C-H HSQC谱图；

图 14显示双果糖基- β (2,6)-葛根素的高分辨质谱图；

图 15显示三果糖基- β (2,6)-葛根素的质谱图；

图 16显示四果糖基 - β (2,6)-葛根素的质谱图；

图 17显示五果糖基 - β (2,6)-葛根素的质谱图。 生物材料的保藏信息

拉丁文学名： Arthrobacter nicotianae XM6 ,分类命名：烟草节杆菌 XM6 , 于 2010年 6月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址： 中国 武汉 武 汉大学， 邮编： 430072 , 保藏编号： CCTCC NO: M2010164。 实施发明的最佳方式

可以理解的是， 在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表 示， 其并 不作为对本发明的限制。 在不偏离于本发明范围的情况下， 本发明的主要特 征可以用于各种实施方式。 本领域的技术人员将会意识到或能够确认， 仅仅 使用常规实验， 许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤 中。 这些等同 物被认为处在本发明的范围之内， 并且被权利要求所覆盖。

在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知 的常 规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次 出现时标明， 其后所用相同试剂如无特殊说明， 均以首次标明的内容相同。 实施例 1: 采用水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素

将 40mL发酵培养的培养基 2 (培养基组成见表 1 )放入 250mL三角瓶， 121 °C高压蒸汽灭菌 20min后，接入烟草节杆菌 (Ar rakzcter nicotianae XM6) (CCTCC NO: M2010164) , 于 30 °C , 180rpm振荡发酵培养 16小时作为种子 液接种至 5L发酵罐中， 接种量 5体积％, 发酵罐装液量 3L, 发酵罐灭菌方 式与摇瓶相同。 在 30 °C , 300rpm发酵培养， 通气量 3wm, 发酵培养 6小时 ( OD约 10左右 )后 8000rpm离心 20min, 收集上清酶液， 测定上清酶液中 含果糖基化酶 30U/mL。 其中， 酶活力的测定采用以下方法：

底物溶液的配制： 0.4g葛根素， 10g蔗糖充分溶解在 lOOmL l/15mol/L 磷酸盐緩沖液 (pH6.86)中。反应体系：取 2mL l/15mol/L磷酸盐緩沖液 (pH6.86) 加入 18mL底物溶液中， 置于 30 °C中反应 lOmin, 后立即取出 ΙΟΟμΙ^加入 90(^L的曱醇中终止反应，作为空白对照。 同时另取 2mL酶液加入 18mL底 物溶液中， 置于 30 °C中反应 lOmin, 后立即取出 ΙΟΟμΙ^加入 900μΙ^的曱醇 中终止反应， 作为样品。 之后用 HPLC 进行测定。 酶活力单位定义为： 在 30 °C条件下， 每分钟转化 Ι μηιοΐ葛根素所需酶的量为一个活力单位（ 1U即 Ι μηιοΐ/ηιΐη )。比活力定义（ U/mL ):单位体积（ mL )酶液中具有的酶活力（ U ) 数。

将 600mL上清酶液加入至总体积 3000mL含有 10g/L葛根素（购自南京 泽朗医药科技有限责任公司 ）， 100g/L 蔗糖， l/15mol/L 磷酸盐緩沖液 ( ρΗ6·86 )的 5L发酵罐中， 30 °C , 300rpm进行葛根素糖基化反应， 12小时 后， 45 °C加热 2小时终止转化反应。 转化液经 HPLC检测， 果糖基化葛根素 转化率达 95%。 结果参考图 1。

将上述含有果糖基化葛根素的转化液经 AB-8大孔树脂的吸附 （层析柱 40 600mm, 流速 lOmL/min ),然后用 10倍柱床体积 pH4~4.5的蒸馏水（冰 乙酸调节 pH ) 洗去残余的糖基供体， 接着用 5%-30%的曱醇溶液梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 （纯度 >97% ) , 最后用 100%曱醇洗脱去除色素与 葛根素。

纯度 >97%的果糖基化葛根素分别于 45 °C旋转蒸发或冷冻干燥后得到单 果糖基- β (2,6)-葛根素粉末或晶体 7.9g,双果糖基- β (2,6)-葛根素粉末或晶体 16.8g, 三果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶体 3.3g, 四果糖基 - β (2,6)-葛根素 粉末或晶体 3.2g, 五果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶体 2.2g。

经测定， 在 25°C时， 单果糖基 - β (2,6)-葛根素溶解度为 26.0g/L, 双果糖 基 - β (2,6)-葛根素溶解度为 280.8g/L , 分别是相同条件下葛根素溶解度 ( 5.2g/L ) 的 5倍和 54倍。

上述单果糖基 - β (2,6)-葛根素： HR-MS: m/z 577.1563[M-H]", 元素组成 为 C ₂₇ H ₂₉ 0 ₁₄ (图 7 ), M-H计算值 577.1557; 在 DMSO的 ¹ H-NMR和 ¹³ C-NMR 化学位移的特征分别如下：

^-NMR OOMHz, DMSO-d ₆ ) δ: 8.29(1H, s, Η-2), 7.93(1Η, d, J=8.7Hz, Η-5), 6.98(1Η, d, J=8.7 Hz, H-6), 7.40(2H, d, J=8.5 Hz, H-2VH-6'), 6.80(2H, d, J=8.7 Hz, H-3VH-5'), 9.48(1H, s, 4'-0H), 4.81(1H, d, J=9.1 Hz, H-l"), 3.93-3.96(2H, m, H-2"/H-4 ^m ), 3.79-3.89 (2H, m, H-5 H-6'"), 3.48-3.61 (3H, m, H-6", H-5"', H-6 ^m ), 3.29-3.42 (6H, m, H-3", H-4", H-6", 2Η-Γ", H-3'") (图 3、 图 5、 图 6 )

¹³ C-NMR(500MHz, DMSO-d ₆ ) δ： 174.9, 160.9, 157.1, 152.6, 130.0, 126.2 _: 123.0, 122.5, 114.9, 112.5, 116.8, 104.1(C-2 ^m ), 82.1(C-5'"), 79.7, 78.4, 76.7, 75.1(C-5"), 73.4, 70.7, 70.3, 62.3(C-6"), 61.5(C-6 ^m ), 61.1 (图 4 )。

葛根素 ifi-NMR和 ¹³ C-NMR化学位移的特征分别如下：

iH-NMR OOMHz, DMSO-d ₆ ) δ: 8.33(1H, s, Η-2), 7.97(1Η, d, J=8.8Hz, H-5), 7.01(1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.41(2H, d, J=8.8 Hz, H-2VH-6'), 6.83(2H, d, J=8.8 Hz, H-3VH-5'), 9.52(1H, s, 4'-0H), 4.85(1H, d, J=9.0 Hz, H-l"), 4.05(1H, s, H-2"), 3.52, 3.75 (2H, m, 2H-6"), 3.26-3.36 (3H, m, H-3", H-4", H-5") (图 8 )

¹³ C-NMR(500MHz, DMSO-d ₆ ) δ： 175.1, 161.2, 157.2, 152.7, 130.1, 126.4 _: 123.2, 122.6, 117.0, 115.19, 112.7, 81.8(C-5"), 78.8, 73.6, 71.0, 70.6, 61.5(C-6") (图 9 )。

双果糖基 - β (2,6)-葛根素： HR-MS : m/z 739.2080[M-H]" , 元素组成为 C ₃₃ H ₃₉ 0 ₁₉ (图 14 ), M-H计算值 739.2086; 在 DMSO的 ¹ H-NMR和 ¹³ C-NMR 化学位移的特征分别如下：

^-NMR OOMHz, DMSO-d ₆ ) δ： 8.29 (1Η, s, H-2), 7.95 (1H, d, J=8.7Hz,

H-5), 6.97 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.40 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2VH-6'), 6.80 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3VH-5'), 9.48 (1H, s, 4'-OH), 4.81(1H, d, J=9.2 Hz, H-l"), 3.92-3.99(3H, m, H-2", H-4"', H-4""), 3.69-3.87 (4H, m, H-6" , H-5", H-5'", H-6""), 3.48-3.58 (5H, m, H-6", H-3'", H-6'" , H-5"", H-6"") , 3.25-3.42 (8H, m, H-3", H-4", 2H-1'", H-6'" , 2Η- ", H-3"") (图 10、 图 12、 图 13 )。

¹³ C-NMR(500MHz, DMSO-d ₆ ) δ： 174.7, 160.7, 156.9, 152.4, 129.8, 126.0 _: 122.9, 122.4, 116.6, 114.8, 112.3, 104.2, 104.0, 81.9(C-5 ^,m ), 80.1, 79.6, 78.3, 163, 76.0, 75.5(C-5'"), 75.1 (C-5"), 73.3, 70.6, 70.4, 62.7(C-6"), 62.4(C-6 ^m ), 62.0(C-6"")， 61.1, 60.8, (图 11 )。

三果糖基 - β (2,6)-葛根素： ESI-MS : m/z 925.3 [M+Na] ⁺ , 元素组成为

C ₃₉ H ₅ 。0 ₂₄ Na (图 15 ); 四果糖基 - β (2,6)-葛根素： ESI-MS: m/z 1064.3 [M-H]", 元素组成为 C ₄₅ H ₅₉ 0 ₂₉ (图 16 ); 五果糖基 - β (2,6)-葛根素： ESI-MS : m/z 1226.5[M-H]", 元素组成为 C ₅₁ H ₆₉ 0 ₃₄ (图 17 )。 实施例 2: 采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根 素

将 40mL发酵培养的培养基 2 (培养基组成见表 1 )放入 250mL三角瓶， 121 °C高压蒸汽灭菌 20min后，接入烟草节杆菌 (Ar rakzcter nicotianae XM6) (CCTCC NO: M2010164), 于 30°C , 180rpm振荡发酵培养 16小时作为种子 液接种至 5L发酵罐中， 接种量 5%, 发酵罐装液量 3L, 发酵罐灭菌方式与 摇瓶相同， 30°C , 300rpm发酵培养， 通气量 3wm, 发酵培养 6小时 （OD 约 10左右）后 8000rpm离心 20min, 收集上清酶液， 测定上清酶液中含果 糖基化酶 30U/mL。

将 600mL上清酶液加入至总体积 3000mL含有 107.5g/L葛根素，350g/L 蔗糖， 20% DMSO的 l/15mol/L磷酸盐緩沖液 (pH6.86)的 5L发酵罐中， 30 °C , 3 OOrpm振荡转化， 72小时后， 45 °C加热 2小时终止转化反应。 转化液 经 HPLC检测： 单果糖基- β (2,6)-葛根素达 111.7g/L, 双果糖基- β (2,6)-葛根 素达 28.3g/L, 三果糖基 - β (2,6)-葛根素达 2.3g/L, 果糖基化葛根素衍生物转 化率达 90%。 结果参考图 2。

上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释 10倍后经 AB-8大孔树脂的吸附 (层析柱 40 600mm, 流速 l OmL/min ), 然后用 10倍柱床体积 pH4~4.5的 蒸馏水（冰乙酸调节 pH )洗去残余的糖基供体， 接着用 5%-30%的曱醇溶液 梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 （纯度 >97% ), 最后用 100%曱醇洗脱 去除色素与葛根素。

纯度 >97%的果糖基化葛根素分别于 45 °C旋转蒸发或冷冻干燥后得到单 果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶体 270g , 双果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶 体 68g, 三果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶体 5g。 实施例 3: 采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根 素

将 40 mL发酵培养的培养基 2 (培养基组成见表 1 )放入 250 mL三角 瓶， 121 °C高压蒸汽灭菌 20min后， 接入烟草节杆菌 {Arthrobacter nicotianae XM6) (CCTCC NO: M2010164) , 于 30 °C , 180rpm振荡发酵培养 16小时后 ( OD约 10左右）， 8000rpm离心 20min, 收集上清酶液， 上清酶液中含果 糖基化酶 30U/mL。

将 4mL上清酶液至总体积 20mL含有 107.5g/L葛根素， 350g/L蔗糖， 20% DMSO的磷酸盐緩沖液 (pH6.86)的 250mL具塞三角瓶中， 30 °C , 180rpm 振荡转化， 72小时后， 45 °C加热 1小时终止转化反应。 转化液经 HPLC检 测：单果糖基- β (2,6)-葛根素达 111.7g/L ,双果糖基- β (2,6)-葛根素达 28.3g/L, 三果糖基- β (2,6)-葛根素达 2.3g/L , 果糖基化葛根素转化率达 90%。

上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释 10倍后经 AB-8大孔树脂的吸附 (层析柱 20 600mm, 流速 l OmL/min ), 然后用 10倍柱床体积 pH4~4.5的 蒸馏水（冰乙酸调节 pH )洗去残余的糖基供体， 接着用 5%-30%的曱醇溶液 梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 （纯度 >97% ), 最后用 100%曱醇洗脱 去除色素与葛根素。 纯度 >97%的果糖基化葛根素分别于 45 °C旋转蒸发或冷 冻干燥后得到单果糖基 - β (2,6)-葛根素粉末或晶体 1.8g, 双果糖基 - β (2,6)- 葛根素粉末或晶体 0.5g, 三果糖基- β (2,6)-葛根素粉末或晶体 0.03g。 实施例 4: 不同发酵和转化条件对产物形成的影响

将 40mL发酵培养的培养基 (培养基组成见表 1 )放入 250mL三角瓶， 121 °C高压蒸汽灭菌 20min后，接入烟草节杆菌 (Ar rakzcter nicotianae XM6) (CCTCC NO: M2010164), 在不同的发酵条件下 （发酵条件见表 2)振荡发 酵培养后， 8000rpm离心 20min, 收集上清酶液， 上清酶液中含果糖基化酶 10-100U/mL。 以 20%上清酶液加入至转化体系中， 在不同转化条件下 （转 化条件见表 2 ),振荡转化后 45°C加热 2小时终止转化反应，转化液经 HPLC 检测。

不同菌种发酵条件以及转化条件， 对葛根素糖基化产物的形成均产生不 同影响，表 1和表 2列出了在不同条件下进行葛根素糖基化反应� �主要产物 单果糖基化葛根素与双果糖基化葛根素的摩尔 转化率的变化。

表 1培养基成分的不同配比组成

培养基 蔗糖 蛋白胨 KH ₂ P0 ₄ CaCl ₂ MnS0 ₄

pH 组成 (g/D (g/D (g/D (g/D (g/D

1 5 5 0.4 0.5 0.1 6

2 35 25 2 2 0.5 7

3 80 50 4 5 2 8

4 5 25 2 2 0.5 7

5 35 50 0.4 0.5 0.1 6

6 80 5 4 5 2 8 表 2 不同糾下单果糖基 -卩(2，6)-葛根素（ PI )与双果糖基 -卩(2，6)-葛根素（ P2 ) 的摩尔转化率

底物

发酵 发酵 培养 转化 转化 转化 底物 溶剂

与蔗 P1 P2 时间 温度 基组 时间 温度 规模 浓度 溶剂 比例

糖摩 (%) (%)

(h) (°C) 成 (h) (°C) (mL) (g/L) (%)

尔比

6 25 1 6 25 20 2 1: 1 DMF 10 65 10

12 30 2 48 30 300 20 1: 5 曱醇 20 73 17

18 40 3 96 35 3000 120 1: 10 DMSO 40 42 0

6 30 4 6 25 20 2 1: 1 丙酮 50 0 0

12 25 5 96 30 3000 100 1: 10 DMSO 20 72 18

48 40 6 48 40 500 20 1: 5 乙腈 20 20 0

6 30 6 36 25 500 20 1: 5 乙醇 20 30 0

12 40 2 72 30 3000 120 1: 10 DMSO 30 65 16

48 25 3 96 40 20 2 1: 1 乙醇 30 10 0 6 40 1 48 25 500 60 1 : 5 DMSO 30 67 17

12 30 5 18 30 20 2 1 : 1 丙酮 10 68 13

48 25 1 6 40 3000 20 1 : 10 乙腈 40 0 0

6 40 3 96 25 3000 20 1 : 10 曱醇 40 10 0

12 25 2 24 30 500 120 1 : 5 DMSO 50 5 0

48 30 1 48 40 20 2 1 : 1 DMF 40 0 0 从表 2中结果可以看出， 非水相转化优点在于转化体系中葛根素浓度可 增加至 120g/L, 在优选的非水相转化条件下， 非水相转化率可达 90% , 转化 产物浓度显著提高 （在 107.5g/L葛根素时， 转化总产物可达 140g/L以上 ), 且可通过溶剂的选择与比例调控转化产物， 非水相转化的这些优势将有利于 工业化生产。 实施例 5: 单果糖基- β (2,6)-葛根素在血液中的代谢动力学实验

1. 仪器和色谱条件

HPLC分析采用 DIONEX,色谱柱为 Discovery HS C18柱（ 250 x 4.6 um,5 urn ), 进样体积为 20 L , 柱温为 30 °C , 检测器为 UVD170U, 检测波长 254 nm, 流动相： A, 水， B , 色谱级曱醇， A:B=80:20,流速 lmL/min。

2. 实验动物

Sprague-Dawley大鼠（ SD大鼠）， 体重 180-220g, 雌雄各半， 由南通大 学医学实验中心提供， 生产许可证号： SCXK (苏） 20080010。

3. 实验方法

3.1 样品采集

SD大鼠随机分成 2组， 每组 5只， 实验前禁食 12小时。 葛根素及单果 糖基 - β (2,6)-葛根素分别溶解于 20%的 1 ,2-丙二醇生理盐水中， 按 50mg/kg 的剂量给予大鼠尾静脉注射葛根素和单果糖基 - β (2,6)-葛根素。 服用后经 t=0min、 4min、 7min、 17min、 40min、 60min、 120min、 180min后, 目艮目匡采 集 0.5 mL血液置于肝素钠处理过的离心管中， 立即以 3000rpm的条件下离 心分离 15min, 分离血浆以备分析。

3.2样品处理

精密取血浆 100 置试管中，再加入 400 曱醇沉淀蛋白， 于漩涡混 合器上混合 5min, 然后 lOOOOrpm离心 lOmin, 上清液用于 HPLC分析。

3.3 数据分析 按照 3.2 制备的葛根素及单果糖基 - β (2,6)-葛根素样品的血浆浓度用外 标法计算得到。 得到的数据用药代动力学统计软件进行分析。

4.结果

从葛根素及单果糖基 - β (2,6)-葛根素的主要代谢动力学参数（表 3 )可 见， 单果糖基 - β ( ² , ⁶ )-葛根素的 tl/ ² , MRT (0-t)和 MRT (0-∞)的值明显高于 葛根素， 表明葛根素衍生物在血液中的滞留时间与葛根 素相比得到延长， 因 而有利于其在体内有较长的作用时间。同时葛 根素衍生物的 AUC(O-t)和 ACU (0-∞)值显著高于葛根素， 表明葛根素衍生物与葛根素相比具有更高的生 物 利用度。

表 3 葛根素及单果糖基 -P(2，6)-葛根素在大鼠中的代谢动力学

( n=5 )

参数 葛根素 单果糖基 -β(2,6)- 葛根素

tl/2 min 17.029士 3.086 19.741士 2.34

CL L/min/kg 0·013±0·003 0.009士 0.001

Y L/kg 0.303士 0.045 0.256士 0.032

AUC(O-t) 4096.192士 973.839 5523.446士 688· 104 mg/Lxmin

ACU (O-oo) 4131.694士 1018.104 5605.211士 723.966 mg/Lxmin

MRT (0-t) min 19.681士 5.075 25.707士 2.324

MRT (0-oo) min 20.576士 5.979 27.453士 2.976 tl/2=清除的半衰期

CL=全身清除率

AUC=浓度-时间曲线下的面积

MRT=平均滞留时间 实施例 6: 单果糖基 - β (2,6)-葛根素对大鼠急性心肌缺血的保护作用实

1. 实验材料

垂体后叶素注射液购自南京新百药业有限公司 ， 生理盐水注射液购自南 京小营药业有限公司， 二曱基亚砜、 丙二醇、 无水乙醇均采用色谱级。 葛根 素购自南京泽朗医药科技有限责任公司 , 单果糖基- β (2,6)-葛根素由本发明 方法制备， 经高效液相色语检测纯度在 99%以上。

2. 实验动物

Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）， 体重 180-220g, 雌雄各半， 由南通大 学医学实验中心提供， 生产许可证号： SCXK (苏） 20080010。

3. 试验方法

取对垂体后叶素敏感的 SD大鼠 50只适应性饲养 3天后,随机分为溶剂 组、 葛根素组和单果糖基 - β (2,6)-葛根素低、 中、 高三组， 每组 SD大鼠 10 只。 所给药物均用 10%的丙二醇溶液助溶， 均给药 0.5mL, 溶剂组使用丙二 醇生理盐水溶液， 葛根素组使用葛根素丙二醇生理盐水溶液， 剂量为 50mg/kg, 单果糖基 - β (2,6)-葛根素组使用丙二醇生理盐水溶液， 剂量分别为 12.5mg/kg , 25mg/kg , 50mg/kg。 给药后 5min,各组大鼠静脉緩慢注射 Pit 0.5U/kg复制急性心肌缺血模型，观察注射 Pit后 15s、 30s、 lmin、 5min、 lOmin 时各组大鼠的心电图变化， 计算以上各时间点的心率和 T波的幅度变化。

4. 统计方法

数据采用 表示， 采用 t检验。 PO.05 , 表示差异有显著性； 若 PO.01 , 表示差异非常显著； 若 PO.001 , 表示差异极端显著。

5. 结果

5.1 葛根素衍生物对大鼠心肌缺血 T波幅度变化的影响

表 4 单果糖基 -卩(2，6)-葛根素 ( P1 )对心肌缺血大鼠 T波幅度变化的影响 剂 Τ波幅度变化 /mv

里

组别 正

/mg. ^ 15s 30s lmin 2min 5min lOmin 常

kg ¹

0.119±0. 0.150±0. 0.207±0.0 0.178±0. 0· 111±0· 0.055土 溶剂组 - 1

146 092 65 053 048 0.029

0.082±0. 0.114±0. 0.118±0.0 0.132±0. 0.118±0. 0.074土 葛根素 50 1

052 096 86 096 075 0.061

P1高 0.092±0. 0.118±0. 0.109±0.0 0.106±0. 0.080±0. 0.082土

50 1

剂量组 067 087 84 091 070 0.058

P1中 25 1 0.053±0. 0.105±0. 0.116±0.0 0.112±0. 0.067±0. 0.054土 剂量组 027 076 88 087 038 0.038

PI低 0.082士 0. 0.097士 0. 0.051±0.0 0.102士 0· 0.069士 0· 0.068士

12.

剂量组 060 084 34 071 040 0.038 注： 与溶剂组比较 *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001

实验结果表明， 受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根素的剂量分别为 12.5mg/kg, 25mg/kg和 50mg/kg均能显著减少由垂体后叶素引发的 T波振幅， 并且对于 T波的减少幅度小于葛根素， 说明受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根 素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血作用。

5.2葛根素衍生物对心肌缺血大鼠心率的影响

表 5单果糖基 -卩(2，6)-葛根素 ( P1 )对心肌缺血大鼠心率的影响 (Ν^Ο, ^ ) 剂量 心率 /次 .mill-

465士 474士 448士 443士 423士 384士 360士 345士 399士 模型组 一 ***

67 29 46 44 42 35" 32 35 43

484士 512士 469士 437士 411士 379士 379士 384士 434士 葛根素

33 36 32 63 69 85 72 53 51

P1高 483士 485士 423士 420士 378士 327士 339士 347士 435士

50

剂量组 91 95 84 76 34 89 45" 55" 72

P1中 474士 476士 442士 405士 428士 403士 386士 375士 420士

25

剂量组 68 65 81 88 65 54 41" 37 43

P1低 403士 433士 416士 411士 389士 347士 339士 349士 395士

12.

剂量组 54 63 79 75 72 71 57 50 45 实验结果表明， 注射垂体后叶素后 2min内各组大鼠均出现心率明显下 降， 2~10min各组心率开始恢复。与对照组相比， 受试样品单果糖基 - β (2,6)- 葛根素的不同剂量组均能加快心肌缺血大鼠心 率的恢复， 并且单果糖基- β (2,6)-葛根素低剂量组的恢复时间快于葛根素组 。 说明受试样品单果糖基- β (2,6)-葛根素对心肌缺血导致的心率失常具有一 定的治疗作用。 实施例 7: 单果糖基- β (2,6)-葛根素对肿瘤细胞增殖的抑制作用实验

1. 细 株与药品

人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 , 购自上海复蒙基因生物科技有限公司； 人慢粒白血病细胞株 K562, 购自中国科学院上海细胞研究所细胞库； 葛根 素， 购自南京泽朗医药科技有限责任公司； 单果糖基 - β (2,6)-葛根素由本发 明方法制备， 经高效液相色语检测纯度在 99%以上。

2. 实验药物及溶液配制

药液储液： 称取 8.32mg 葛根素粉末， 溶于 2mLDMSO 中， 配制成

10mmol/L的葛根素； 称取 11.56mg单果糖基- β (2,6)-葛根素粉末， 溶于 2mL DMSO中， 配制成 10mmol/L的单果糖基- β (2,6)-葛根素； 以 0.22 μ m滤器 过滤， 1000 μ L/doff 分装， -20°C存储， 同时 0.22 μ m滤器过滤高浓度 DMSO 以备对照组之用。

细胞培养液： 取 RPM 1-1640培养基 (粉剂） 1包，溶于 800mL三蒸水中， 磁力搅拌器搅拌至少半小时， 至完全溶解， 补加 NaHC0 ₃ 2g, 充分溶解后定 容至 1L。 用 0.22pm孔径的滤膜过滤除菌， 加入血清， 使血清终浓度为 10%,

4°C贮存。

PBS磷酸盐緩沖液： 在 800mL蒸馏水中溶解 8gNaCl、 0.2gKCl、 1.44g Na ₂ P0 ₄ 和 0.24g K¾PO ₄ , 用 HC1调节溶液 PH值至 7.4, 加水定容至 1L, 高压 蒸汽灭菌 20分钟， 低温保存。

MTT应用液： 称取 500mg MTT粉剂， 溶于 lOOmL PBS中， 搅拌溶解 后， 0.22pm孔径的滤膜过滤除菌， 分装后 4°C避光保存备用。

三联液： 取 SDS 25g, 异丙醇 12.5mL, 浓 HC1 2.5mL用三蒸水定容至 1L, 低温保存。

3. 主要试剂与仪器

高效液相色语仪（美国戴安 型号： P600 );酶标仪（Molecular Devices公 司 型号： spectra MAX 190/GEMINIXS ); C0 ₂ 培养箱 （Forma公司 型号： 3111 );低速离心机（ Thermostat型号： PICO- 17 );倒置显微镜 ( leica公司 型 号： DMIL ); 水平脱色摇床（南京大学仪器公司 型号： TY-80S ); 胎牛血清 ( Hyclone公司；)； 小牛血清（ GibacoBRL公司；)； RPMI1640 (美国 Gibco公 司 ；)； Penicillin G Sodium Salt ( AMRESCO公司 ); Streptomycin Sulfate ( AMRESCO公司；)； Trypsin ( AMRESCO公司；)； MTT ( AMRESCO公司）。

4. 细胞培养

MDA-MB-231细胞在含体积分数为 10%灭活胎牛血清、 100U青霉素和 链霉素的 RPMI-1640完全培养基， 于 37°C 5%C0 ₂ 饱和湿度孵箱内培养。

K-562细胞在含体积分数为 10%灭活小牛血清、 100 U青霉素和链霉素 的 RPMI-1640完全培养基， 于 37°C 5% C0 ₂ 饱和湿度孵箱内培养。

5. 实验方法

5.1 MDA-MB-231细胞毒性试验

取对数生长期的 MDA-MB-231细胞（一次性培养瓶），弃培养液。� � 10mL PBS洗一次，弃 PBS后，加入 3mL 0.25%胰蛋白 -0.04% EDTA, 37 °C消化 3min 后， 向其中加入 5mL完全培养基中和反应， 吹打后将细胞转入 15mL离心管 中， lOOOrpm离心 3分钟。 配细胞悬液， 用适量的完全培养基调整细胞浓度 为 3 X 10 ⁴ /mL。 将细胞加入 96孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180 μ L, 培 养板放入细胞培养箱中（ 37°C , 5% C0 ₂ )常规培养。待细胞生长至 50%-70% 加入各浓度药液。取 10mmol/L葛根素及单果糖基- β (2,6)-葛根素储液，用 PBS 梯度稀释药液至 1000、 500、 100、 50、 10、 5、 1和 Ο.ΐ μ ηιοΐ/L, 每孔加药 20 μ , 药物终浓度分别为 100、 50、 10、 5、 1、 0.5、 0.1和 0.01 μ mol/L。 DMSO溶剂对照组加入 20 μ L PBS中含有相应药物溶剂， 空白组加入 20 μ LPBS。 每个药物浓度设 6个复孔。 将培养板放回细胞培养箱， 48小时后加 入 20 μ L MTT ( 5mg/mL )溶液， 继续在培养箱中孵育 4小时后， 倒扣掉上 清， 吸水纸拍干， 每孔加 200 L DMSO, 摇床避光震摇 15分钟， 使结晶物 充分溶解。 用全自动酶标仪在 490nm测定吸光值， 计算平均抑制率， 抑制率 ( % ) = (对照组 A490-实验组 A490 ) /对照组 A490 ), 实验重复 3次。

5.2 K562细 毒性试马全

取对数生长期的 K-562细胞调整浓度至 1 X 10 ⁵ 个/11^ ,接种于 96孔培养 板， 每孔加入细胞悬液 90uL, 实验组以不同终浓度（1、 5、 10、 20、 50、 100、 150、 200 μ mol/L ) 葛根素及单果糖基 - β (2,6)-葛根素处理， 每孔加药 lOuL, DMSO溶剂对照组加入 20 L PBS中含有相应药物溶剂， 空白组加入 20 L PBS。 每个药物浓度设 6个复孔。 将培养板放回细胞培养箱， 48小时 后加入 20 μ L MTT ( 5mg/mL )溶液， 继续在培养箱中孵育 4小时后， 每孔 加入三联液 lOOuL, 过夜待结晶充分溶解。 振荡器震荡 20min用全自动酶标 仪在 490nm处测定吸光值， 计算平均抑制率， 抑制率 （％) = (对照组 A ₄₉₀ - 实验组 A ₄₉ 。 ) /对照组 A ₄₉ 。 ), 实验重复 3次。

6. 统计处理

采用 Microsoft Excel 2003 软件中的相关分析和 Student t检验,数据采用

7. 实验结果 7.1 葛根素衍生物对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231增殖的影响 表 6不同浓度葛根素和单果糖基 -卩(2，6)-葛根素作用 48h对 MDA-MB-231细 胞增殖的影响

组别 葛根素 单果糖基 -β(2,6)-葛根素

OD值 平均抑制 OD值 平均抑制 率（％ ) 率（％ ) 对照组 0.707士 0.036 0.701士 0.086

0.5μηιο1/Ε组 0.632士 0.056 10.68 0.676士 0.021 3.68

Ιμηιοΐ/L组 0.624士 0.053* 11.67 0.666士 0.069 5.02

5μηι ol/L组 0.619士 0.090* 12.43 0.677士 0.081 3.47

ΙΟμηιοΙ/L组 0.610士 0.039** 13.77 0.672士 0.085 4.20

5(^mol/L组 0.531士 0.066** 24.92 0.560士 0.062* 20.17

ΙΟΟμηιοΙ/L组 0.473±0.034*** 33.06 0.500士 0.068** 28.70

15(^mol/L组 0.372±0.037*** 47.47 0.392±0.041*** 44.04

200 mol/L组 0.619±0.042*** 61.91 0.285±0.067*** 59.42 注： 与对照组比较， *Ρ<0.05 , **Ρ<0.01 , ***Ρ<0.001 ο

ΜΤΤ 法分析后统计结果说明 （见表 6 ), 葛根素和单果糖基 - β (2,6)-葛 根素作用 48小时后均可减少 MDA-MB-231细胞的细胞数目。与相同时间内 的对照组比较， 当单果糖基 - β (2,6)-葛根素剂量达到 50 mol/L 时有差异 ( P<0.05 ), 剂量在 100 μ mol/L时有显著性差异（ PO.01 ), 当剂量达到 150 和 200 μ mol/L时该差异具有极显著性（ PO.001 ), 对 MDA-MB-231细胞的 抑制率分别达到 44.04%和 59.42%,说明单果糖基- β (2,6)-葛根素能明显抑制 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。

7.2 葛根素衍生物对人慢粒白血病细胞株 Κ562增殖的影响

表 7 不同浓度葛根素和单果糖基 -卩(2，6)-葛根素作用 48h对 K562细胞增殖

的影响

组别 葛根素 单果糖基 -β(2,6)-葛根素

OD值 平均抑制 OD值 平均抑制 率 （％ ) 率（％ ) 对照组 1.026士 0.032 1.027士 0.007

Ιμηιοΐ/L组 0.917士 0.031*** 10.65 0.950±0.041** 7.85

5 mol/L组 0.949±0.023*** 7.52 0.950士 0.018*** 7.53

ΙΟμηι οΙ/L组 0.929±0.030*** 9.46 0.958士 0.022*** 6.76

2(^mol/L组 0.916士 0.056** 10.68 0.963士 0.055* 6.16

5(^mol/L组 0.793士 0.083*** 22.73 0.913±0.048*** 11.14

ΙΟΟμηιοΙ/L组 0.709±0.038*** 30.89 0.858士 0.028*** 16.41

15(^mol/L组 0.650士 0.039*** 36.65 0.720士 0.055*** 29.84

200 mol/L组 0.470士 0.027*** 54.19 0.550士 0.086*** 46.41 注： 与对照组比较， *P<0.05 , **P<0.01 , ***P<0.001 o

MTT 法分析后统计结果说明 （见表 7 ), 葛根素和单果糖基 - β (2,6)-葛 根素作用 48小时后均可减少 Κ562细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组 比较， 当单果糖基- β (2,6)-葛根素在低剂量 1 μ mol/L其结果就有显著性差异

( P<0.05 ),剂量在 100、 150和 200 μ mol/L时该差异具有极显著性（ P<0.001 ), 对 K562细胞的抑制率分别达到 16.41%、 29.84%和 46.41%, 说明单果糖基- β (2,6)-葛根素能明显抑制人慢粒白血病细胞株 K562的增殖， 且抑制率随剂 量增力口而增力口。