Glykoproteine weisen eine Vielfalt und Komplexität von Koh- lenhydrat-Einheiten auf, wobei die Zusammensetzung und Anordnung der Kohlenhydrate für unterschiedliche Organismen charakteri- stisch ist. Die Oligosaccharid-Einheiten der Glykoproteine haben eine Reihe von Aufgaben, so sind sie z. B. wichtig in der Stoff- wechselregulation, sie sind an der Vermittlung von Zell-Zell- Wechselwirkungen beteiligt, sie bestimmen die Zirkulationszeiten von Proteinen im Blutkreislauf und sie sind ausschlaggebend für die Erkennung von Epitopen in Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Die Glykosylierung von Glykoproteinen beginnt im endoplasma- tischen Retikulum (ER), wo die Oligosaccharide entweder durch N- glykosidische Bindungen an Asparagin-Seitenketten oder durch O- glykosidische Bindungen an Serin-oder Threonin-Seitenketten ge- bunden werden. Die N-gebundenen Oligosaccharide enthalten ein gemeinsames Core aus einer Pentasaccharid-Einheit, die aus drei Mannose-und zwei N-Acetylglucosaminresten besteht. Zur weiteren Modifikation der Kohlenhydrat-Einheiten werden die Proteine vom ER zum Golgi-Komplex transportiert. Die Struktur der N-gebunde- nen Oligosaccharideinheiten von Glykoproteinen wird von ihrer Konformation und der Zusammensetzung der Glykosyltransferasen der Golgi-Kompartimente bestimmt, in denen sie prozessiert werden.

Es wurde gezeigt, dass im Golgi-Komplex einiger Pflanzen- und Insektenzellen die Core-Pentasaccharideinheit durch Xylose und al, 3-gebundene Fucose substituiert wird (P. Lerouge et al.

1998 Plant Mol. Biol. 38,31-48 ; Rayon et al. 1998 L. Exp. Bot.

49,1463-1472). Das entstehende Heptasaccharid"MMXF3"stellt den Hauptoligosaccharid Typ in Pflanzen dar (Kurosaka et al.

1991 J. Biol. Chem., 266,4168-4172). So weisen z. B. die Meer- rettich Peroxidase, Karotten ß-Fructosidase und Erythrina cristagalli Lectin als auch die Honigbienengift Phospholipase A2 oder die neuronalen Membran Glykoproteine aus Insekten Embryonen a1,3-Fucosereste, die an das Glykancore gebunden sind, auf.

Diese Strukturen werden auch komplexe N-Glykane bzw. Mannose defiziente oder trunkierte N-Glykane genannt. Die a-Mannosyl- reste können weiters durch GlcNAc ersetzt werden, an die Galak- tose und Fucose gebunden sind, so dass eine Struktur hergestellt wird, die dem humanen Lewis a Epitop entspricht (Melo et al.

1997, FEBS Lett. 415,186-191 ; Fitchette-Laine et al. 1997 Plant J. 12,1411-1417).

Weder die Xylose noch die a1,3-gebundene Fucose kommen in Säugerglykoproteinen vor. Es stellte sich heraus, dass die Core- a1,3-Fucose eine wichtige Rolle in der Epitoperkennung von An- tikörpern spielt, die gegen pflanzliche und Insekten-N-gebundene Oligosaccharide gerichtet sind (I. B. H. Wilson et al., Glycobio- logy Vol. 8, Nr. 7, S. 651-661,1998) und dadurch Immunreaktio- nen im menschlichen oder tierischen Körper gegen diese Oligo- saccharide auslösen. Der a1,3-Fucoserest scheint weiters eine der Hauptursachen für die weit verbreitete allergische Kreuz- reaktivität zwischen verschiedenen pflanzlichen und Insekten- Allergenen zu sein (Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol.

1993 ; 102 : 259-266) und wird auch"kreuzreaktive Kohlenhydrat Determinante" (CCD) genannt. Bei einer Studie von Epitopen von Tomaten und Graspollen wurden ebenfalls a1,3-gebundene Fucose- resten als gemeinsame Determinante festgestellt, was der Grund für das häufige gemeinsame Auftreten von Tomaten-und Graspol- lenallergien in Patienten zu sein scheint (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol 98,4 ; 805-814). Die CCDs ver- schleiern weiters durch das häufige Auftreten von immunologi- schen Kreuzreaktionen Allergie-Diagnosen.

Diese immunologischen Reaktionen, die von pflanzlichen Pro- teinen im menschlichen Körper ausgelöst werden, sind das Haupt- problem bei der medizinischen Verwendung von in Pflanzen produ- zierten, rekombinanten menschlichen Proteinen. Um dieses Problem zu umgehen, müsste die a1,3 Core-Fucosylierung verhindert wer- den. Es konnte in einer Studien gezeigt werden, dass Oligo- saccharide, die anstelle einer L-Fucose (6-Deoxy-L-Galaktose) eine L-Galaktose aufweisen, dennoch voll biologisch aktiv sind (E. Zablackis et al. 1996, Science, Vol 272). Gemma$ einer ande- ren Studie wurde eine Mutante der Pflanze Arabidopsis thaliana isoliert, dem die N-Acetyl-Glucosaminyl-Transferase I fehlt, das erste Enzym in der Biosynthese von komplexen Glykanen. Die Bio- synthese der komplexen Glykoproteine in dieser Mutante ist damit gestört. Dennoch sind diese mutierten Pflanzen in der Lage, sich unter bestimmten Bedingungen normal zu entwickeln (A. Schaewen et al. 1993, Plant Physiol. 102 ; 1109-1118).

Um die Bindung der Core-a1,3 Fucose in einem Oligosaccharid gezielt zu unterbinden, ohne auch in andere Glykosylierungs- schritte einzugreifen, müsste nur das Enzym ausgeschalten wer- den, das direkt für diese spezifische Glykosylierung verantwort- lich ist, nämlich die Core-a1,3-Fucosyltransferase. Sie wurde erstmals aus Mungo Bohnen isoliert und charakterisiert, wobei festgestellt wurde, dass die Aktivität dieses Enzyms abhängig von der Gegenwart von nichtreduzierenden GlcNAc-Enden ist (Staudacher et al., 1995, Glycoconjugate J. 12,780-786). Diese Transferase, die nur in Pflanzen und Insekten, nicht aber im Menschen oder anderen Wirbeltieren vorkommt, müsste gezielt in- aktiviert oder unterdrückt werden, so dass menschliche Proteine, die in Pflanzen oder pflanzlichen Zellen bzw. auch Insekten oder -zellen hergestellt werden, dieses Immunreaktionen auslösende Epitop nicht mehr wie bisher aufweisen.

Die Schrift von John M. Burke"Clearing the way for ribozymes" (Nature Biotechnology 15 : 414-415 ; 1997) betrifft die generelle Funktionsweise von Ribozymen.

Die Schrift von Pooga et al"Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology 16 : 857-861 ; 1998) betrifft PNA-Mole- küle allgemein und spezifisch ein PNA-Molekül, das komplementär zur humanen Galaninrezeptortyp 1 mRNA ist.

Die US 5 272 066 A betrifft ein Verfahren zur Veränderung von eukaryotischen und prokaryotischen Proteinen, um ihre in vivo-Zirkulation zu verlängern. Dabei werden die gebundenen Oligosaccharide mit Hilfe von verschiedenen Enzymen, darunter auch die GlcNAc-a1e3 (4)-Fucosyltransferase verändert.

Die EP 0 643 132 A1 betrifft die Klonierung einer a1,3-Fuco- syltransferase, die aus humanen Zellen (THP-1) isoliert wird.

Die in dieser Schrift beschriebenen Kohlenwasserstoffketten entsprechen den menschlichen Sialyl Lewis x-und Sialyl Lewis a- Oligosacchariden. Die Spezifitat des Enzyms aus humanen Zellen ist eine ganz andere als die Fucosyltransferase aus pflanzlichen Zellen.

Es-ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das Gen, das für eine pflanzliche Fucosyltransferase codiert, zu klonieren und zu sequenzieren, Vektoren umfassend dieses Gen, DNA-Stücke davon oder geänderte oder davon abgeleitete DNA herzustellen, Pflanzen und Insekten sowie Zellen davon mit einem dieser Vektoren zu transfektieren, Glykoproteine herzustellen, die die normaler- weise vorkommende a1,3-Core Fucose nicht umfassen, sowie ent- sprechende Verfahren zur Verfügung zu stellen.

Die erfindungsgemaße Aufgabe wird gelöst durch ein DNA-Mole- kul, das eine Sequenz gemãß der SEQ ID No : 1 (in dieser Schrift wurde der IUPAC-Code verwendet, wobei"N"für Inosin steht) mit einem offenen Leserahmen von Basenpaar 211 bis Basenpaar 1740 umfasst oder zumindest 50% Homologie zur obengenannten Sequenz aufweist oder unter stringenten Bedingungen mit der oben genann- ten Sequenz hybridisiert oder eine Sequenz umfasst, die infolge des genetischen Codes zur oben genannten DNA-Sequenz degeneriert ist, wobei die Sequenz für ein pflanzliches Protein mit einer Fucosyltransferase-Aktivitat codiert oder dazu komplementär ist.

Diese Sequenz, die zuvor noch nie beschrieben wurde, eignet sich ausgezeichnet für jegliche Experimente, Analysen und Her- stellungsverfahren etc., die sich auf die pflanzliche Fucosyl- transferase-Aktivitãt beziehen. Dabei ist sowohl die DNA-Sequenz als auch das von dieser Sequenz codierte Protein von Interesse, wobei aber insbesondere die DNA-Sequenz für die Unterbindung der Fucosyltransferase-Aktivitat herangezogen wird.

Der offene Leserahmen der Sequenz mit der SEQ ID No : 1 codiert für ein Protein mit 510 Aminosäuren und mit einem theo- retischen Molekulargewicht von 56,8 kDa, wobei im Bereich zwischen Asn36 und Gly54 vermutlich ein transmembranes Stick vorliegt. Der errechnete pI-Wert des codierten Proteins der Se- quenz gemäß der SEQ ID No : 1 beträgt 7,51.

Die Aktivität der pflanzlichen Fucosyltransferase wird durch ein Verfahren nachgewiesen und gemessen, wobei die Fucosyltrans- ferase zu einer Probe umfassend markierte Fucose und einen an einen Rager, z. B. Sepharose, gebundenen Akzeptor (z. B. ein Glykoprotein) zugesetzt wird. Nach der Reaktionszeit wird die Probe gewaschen und der Gehalt an gebundener Fucose gemessen.

Die Aktivitat der Fucosyltransferase wird dabei als positiv angesehen, wenn die Aktivitatsmessung zumindest um 10 bis 20%, insbesondere zumindest um 30 bis 50% hoher liegt als die Aktivi- tatsmessung der Negativkontrolle. Die Struktur des Glykoproteins kann zusatzlich mittels HPLC verifiziert werden. Solche Proto- kolle sind Stand der Technik (Staudacher et al. 1998, Anal.

Biochem. 246,96-101 ; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem.

199,745-751).

Beispielsweise wird Fucosyltransferase zu einer Probe um- fassend radioaktiv markierter Fucose und einen Akzeptor, z. B. <BR> <BR> <P>GlcNAcßl-2Manal-3 (GlcNAcßl-2Manal-6) Manßl-4GlcNAcßl-4GlcNAcßl- Asn, zugesetzt. Nach Reaktionszeit wird die Probe durch Anio- nenaustauschchromatographie gereinigt und der Gehalt an gebunde- ner Fucose gemessen. Aus der Differenz der gemessenen Radioakti- vitat der Probe mit Akzeptor und der einer Negativkontrolle ohne Akzeptor kann die Aktivität errechnet werden. Die Aktivität der Fucosyltransferase wird bereits als positiv gewertet, wenn die gemessene Radioaktivitat zumindest um 30-40% höher liegt als die gemessene Radioaktivitat der Negativprobe.

Die Paarung von zwei DNA-Molekulen kann durch die Wahl der Temperatur und lonenstärke der Probe verändert werden. Unter stringenten Bedingungen, werden erfindungegmäß Bedingungen ver- standen, die eine exakte, stringente, Bindung ermöglichen. Z. B. werden die DNA-Molekule in 7% Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), 0,5M NaP04 pH 7,0 ; lmM EDTA bei 50°C hybridisiert und mit 1% SDS bei 42°C gewaschen.

Ob Sequenzen eine zumindest 50% Homologie zur SEQ ID No : 1 aufweisen, kann z. B. mit dem Programm FastDB der EMBL oder SWISSPROT Datenbank ermittelt werden.

Bevorzugterweise codiert die Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Molekuls fur ein Protein mit einer GlcNAc-a1,3-Fucosyltrans- ferase-Aktivitat, insbesondere mit einer Core-al, 3-Fucosyltrans- ferase-Aktivitat. Wie oben bereits beschrieben, kommt die Core- al, 3-Fucosyltranferase in Pflanzen und Insekten, nicht aber im menschlichen Organismus vor, so dass insbesondere diese DNA- Sequenz geeignet ist, in Fucosyltransferase-spezifischen Ana- lysen und Experimenten sowie Produktionsverfahren verwendet zu werden. Unter einer Core-a1,3-Fucosyltransferase wird insbeson- dere die GDP-L-Fuc : Asn-gebundene GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase verstanden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist mit der Bezeichnung al, 3-Fucosyl-transferase in der Regel insbesondere die Core-a1,3-Fucosyltransferase gemeint. Zur oben beschriebenen Aktivitätsmessung dienen dabei insbesondere Akzeptoren mit einem nicht reduzierenden GlcNAc-Ende. Solche Akzeptoren sind z. B. <BR> <BR> <P>GlcNAcßl-2Manal-3 (GlcNAcRl-2Mana1-6) Manßl-4GlcNAcal-4GlcNAcßl- Asn, GlcNAcßl-2Manal-3 (GlcNAcßl-2Mana1-6) Manßl-4GlcNAcßl- 4 (Fucal-6GlcNAcßl-Asn und GlcNAcßl-2Manal-3 [Manal-3 (Manal- 6) Manal-6] Manal-4GlcNAcl-4GlcNAcßl-Asn. Ob die Fucose gebunden ist, kann weiters durch Messen der Unempfindlichkeit gegenüber der N-Glykosidase F festgestellt werden, was mit Hilfe der Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann.

Bevorzugterweise weist das erfindungsgemäße DNA-Molekul zu- mindest 70-80%, besonders bevorzugt zumindest 95%, Homologie zur Sequenz gemãß der SEQ ID No : 1 auf. Diese Sequenz codiert fur eine besonders aktive GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase. Da die DNA-Sequenz je nach Pflanze bzw. Insekt mehr oder weniger ver- andert sein kann, weist eine Sequenz, die z. B. 70% Homologie zur Sequenz gemãß der SEQ ID No : 1 aufweist, ebenfalls eine Fucosyl- transferase-Aktivitat auf, die ausreicht, um fur Analysen, Expe- rimente oder Herstellungsverfahren wie oben beschrieben verwen- det zu werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst das DNA-Molekul 2150 bis 2250, insbesondere 2198, Basenpaare.

Dieses DNA-Molekhl weist 100 bis 300, vorzugsweise 210, Basen- paare stromaufwärts vor dem Startcodon auf sowie 350 bis 440, insbesondere 458, Basenpaare stromabwarts nach dem Stopcodon des offenen Leserahmens auf, wobei das Ende des DNA-Molekuls vor- zugsweise einen 3'-Poly (A)-Schwanz umfasst. Auf diese Weise ist eine einwandfreie Regulation auf dem Niveau der Translation gesichert, und es wird ein DNA-Molekul zur Verfügung gestellt, das besonders effizient und problemlos für eine aktive GlcNAc- a1,3-Fucosyltransferase codiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiters ein DNA-Molekul, das eine Sequenz gemãß der SEQ ID No : 3 umfasst oder eine Sequenz umfasst, die zumindest 85%, besonders bevorzugt zumin- dest 95%, insbesondere zumindest 99%, Homologie zur oben genann- ten Sequenz aufweist oder unter stringenten Bedingungen mit der oben genannten Sequenz hybridisiert oder die infolge des geneti- schen Codes zur oben genannten DNA Sequenz degeneriert ist. Die Homologie wird vorzugsweise mit einem Programm bestimmt, das Insertionen und Deletionen erkennt und diese nicht in der Homo- logie-Berechnung berucksichtigt. Diese Nukleotidsequenz codiert für ein konserviertes Peptid-Motiv, d. h. dass die Mehrheit der aktiven und funktionierenden GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferasen die dadurch codierte Aminosäurensequenz umfasst. Die Sequenz kann dabei sowohl die gleiche Grole wie die Sequenz gemäß der SEQ ID No : 3 aufweisen, oder aber selbstverständlich auch gruger sein.

Diese Sequenz weist eine geringere Lange auf als die Sequenz, die für das gesamte Protein codiert, und ist somit weniger an- fallig für Rekombinationen, Deletionen oder andere Mutationen.

Aufgrund des konservierten Motivs und ihrer erhöhten Stabilitat eignet sich diese Sequenz besonders gut für Sequenzerkennungs- Tests.

Die SEQ ID No : 3 weist folgende Sequenz auf : <BR> <BR> <BR> 5'-gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatgaggaag&l t;BR> <BR> <BR> attatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct-3' Gemãß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfin- dung ein DNA-Molekul, das eine Teilsequenz eines der oben ge- nannten DNA-Molekule umfasst und eine Grole von 20 bis 200, vor- zugsweise 30 bis 50, Basenpaaren aufweist. Das DNA-Molekul kann beispielsweise dazu eingesetzt werden, als Sonde an komplemen- tare Sequenzen von GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferasen zu binden, so dass diese aus einer Probe selektiert werden können. Auf diese Weise k6nnen weitere GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferasen aus den verschiedensten Pflanzen und Insekten selektiert, isoliert und charakterisiert werden. Es k6nnen jede beliebige oder auch meh- rere verschiedene Teilsequenzen verwendet werden, insbesondere ein Teil des oben schon beschriebenen konservierten Motivs.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn eines der oben ge- nannten DNA-Molekule kovalent mit einer nachweisbaren Markie- rungssubstanz assoziiert ist. Als Markierungssubstanz kommt jeder gebrauchliche Marker in Frage, so z. B. fluoreszierende, luminiszierende, radioaktive Marker, nicht-isotope Markierungen, wie Biotin, etc. Dadurch werden Reagenzien bereitgestellt, die fur den Nachweis, die Selektion und Quantifizierung von entspre- chenden DNA-Molekulen in festen Gewebeproben (z. B. von Pflanzen) oder auch in Flüssigkeitsproben durch Hybridisierungsverfahren nützlich sind.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der oben genannten DNA-Moleküle oder Teile unterschiedlicher Länge davon, mit mindestens 20 Basenpaaren umfasst. Zur Transfektion in Wirtszellen ist ein eigenständiger, vermehrungsfähiger Vektor notwendig, wobei je nach Wirtszelle, Transfektionsmechanismus, Aufgabe und Größe des DNA-Moleküls ein passender Vektor verwendet werden kann. Da eine große Zahl an verschiedenen Vektoren bekannt ist, würde eine Aufzählung den Rahmen der Anmeldung sprengen, so dass hier da- rauf verzichtet wird, insbesondere, da die Vektoren dem Fachmann bestens bekannt sind (bezüglich Vektoren sowie allen in dieser Schrift verwendeten Techniken und Begriffe, die dem Fachmann bekannt sind, siehe auch Sambrook Maniatis). Idealerweise weist der Vektor eine geringe Molekülmasse auf und sollte selektier- bare Gene aufweisen, um in einer Zelle zu einem leicht erkenn- baren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektorhältigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entsprechenden Genprodukten zu erhal- ten, sollte der Vektor einen starken Promotor, sowie einen Enhancer, Genamplifikationssignale und Regulatorsequenzen auf- weisen. Für eine autonome Replikation des Vektors ist weiters ein Replikationsursprung wichtig. Polyadenylierungsstellen sind für eine korrekte Prozessierung der mRNA und Spleißsignale für die von RNA-Transcripten verantwortlich. Werden Phagen, Viren oder Viruspartikel als Vektoren verwendet, steuern Verpackungs- signale die Verpackung der Vektor-DNA. Z. B. sind für die Tran- skription in Pflanzen Ti-Plasmide geeignet und für die Tran- skription in Insektenzellen Baculoviren, bzw. in Insekten Transposons, wie das P Element.

Wird der oben beschriebene erfindungsgemäße Vektor in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeschleust, so wird eine posttran- skriptionelle Unterdrückung der Genexpression des endogenen a1,3-Fucosyltransferase-Gens durch Transkription eines zu diesem homologen Transgens oder Teilen davon in Sense-Orientierung er- reicht. Für diese Sense-Technik wird weiters auf die Schriften Baulcombe 1996, Plant. Mol. Biol.. 9 : 373-382 und Brigneti et al.

1998, EMBO J. 17 : 6739-6746 verwiesen. Diese Strategie des"Gen- Silencing"stellt eine wirkungsvolle Möglichkeit dar, die Ex- pression des a1,3-Fucosyltransferase-Gens zu unterdrücken, s. auch Waterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 : 13959- 13964.- Weiters betrifft die Erfindung einen biologisch funktionel- len Vektor, der ein DNA-Molekül gemäß einem der oben beschrie- benen Ausführungsformen oder Teile unterschiedlicher Länge davon in inverser Orientierung zum Promotor umfasst. Wird dieser Vektor in eine Wirtszelle transfektiert, wird eine"Antisense- mRNA"abgelesen, die komplementär zur mRNA der GlcNAc a1,3-Fu- cosyltransferase ist und diese komplexiert. Diese Bindung be- hindert entweder die korrekte Prozessierung, den Transport, die Stabilität, oder durch Verhinderung der Ribosomenanlagerung die Translation und damit die normale Genexpression der GlcNAc a1,3- Fucosyltransferase.

Obwohl die gesamte Sequenz des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden könnte, können Teilsequenzen davon aufgrund der geringeren Größe für bestimmte Zwecke vorteilhafter sein. Wich- tig ist z. B. beim Antisense-Aspekt, dass das DNA-Molekül groß genug ist, um eine ausreichend große Antisense-mRNA zu bilden, die an die Transferase-mRNA bindet. Beispielsweise umfasst ein geeignetes Antisense-RNA-Molekül 50 bis 200 Nukleotide, da viele der bekannten natürlich vorkommenden Antisense-RNA-Molekülen etwa 100 Nukleotide umfassen.

Für eine besonders effektive Inhibierung der Expression einer aktiven a1,3-Fucosyltransferase ist eine Kombination der Sense-Technik und Antisense-Technik geeignet (Waterhouse et al.

1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 : 13959-13964).

Vorteilhafterweise werden schnell hybridisierende RNA-Mole- küle eingesetzt. Die Effizienz von Antisense-RNA-Molekülen, die eine Größe von aber 50 Nukleotiden aufweisen, hängt von der An- lagerungskinetik in vitro ab. So zeigen z. B. schnell anlagernde Antisense-RNA-Moleküle eine stärkere Inhibition der Proteinex- primierung als langsam hybridisierende RNA-Moleküle (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48 : 713-742 ; Rittner et al.

1993, Nucl. Acids Res, 21 : 1381-1387). Solche schnell hybridi- sierenden Antisense-RNA-Moleküle weisen insbesondere eine große Anzahl von externen Basen (freie Enden und Verbindungssequen- zen), eine große Anzahl von strukturellen Subdomänen (Komponen- ten), sowie einen geringen Grad an Schleifen (Patzel et al.

1998 ; Nature Biotechnology, 16 ; 64-68) auf. Die hypothetischen Sekundärstrukturen des Antisense-RNA-Moleküls können z. B. mit Hilfe eines Computerprogramms ermittelt werden, gemäß dem eine geeignete Antisense-RNA DNA-Sequenz ausgesucht wird.

Es können unterschiedliche Sequenzregionen des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, nur den Teil, der für die Ribosomenanlagerung verantwort- lich ist, in den Vektor einzubauen. Eine Blockierung in diesem Bereich der mRNA reicht aus, um die gesamte Translation zu stop- pen. Eine besonders hohe Effizienz der Antisense-Moleküle ergibt sich auch für die 5'-und 3'-untranslatierten Regionen des Gens.

Vorzugsweise weist das erfindungsgemäße DNA-Molekül eine Sequenz auf, die eine Deletions-, Insertions-und/oder Substitu- tionsmutation umfasst. Die Anzahl der mutierten Nukleotide ist dabei variabel und reicht von einem einzigen bis zu mehreren deletierten, inserierten oder substituierten Nukleotiden. Es ist auch möglich, dass durch die Mutation der Leserahmen verschoben ist. Wichtig bei einem derartigen"Knockout-Gen"ist lediglich, dass die Expression einer GlcNAc a1,3-Fucosyltransferase gestört ist und die Bildung eines aktiven, funktionellen Enzyms verhin- dert wird. Dabei ist die Stelle der Mutation variabel, solange die Exprimierung eines enzymatisch aktiven Proteins unterbunden ist. Vorzugsweise ist die Mutation im katalytischen Bereich des Enzyms, der sich im C-terminalen Bereich befindet. Die Verfahren zum Einführen von Mutationen in DNA-Sequenzen sind dem Fachmann bestens bekannt, so dass hier darauf verzichtet wird, näher auf die verschiedenen Möglichkeiten der Mutagenesen einzugehen. Es können sowohl zufällige Mutagenesen aber auch insbesondere ziel- gerichtete Mutagenesen, z. B. die site-directed-mutagenesis, die oligonukleotidgesteuerte Mutagenese oder Mutagenesen mit Hilfe von Restriktionsenzymen hier zur Anwendung kommen.

Die Erfindung stellt weiters ein DNA-Molekül zur Verfügung, das für ein Ribozym codiert, welches zwei Sequenzabschnitte von jeweils mindestens 10 bis 15 Basenpaaren aufweist, die Sequenz- abschnitten eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls wie oben be- schrieben komplementär sind, so dass das Ribozym die mRNA kom- plexiert und schneidet, die von einem natürlichen GlcNAc-a1,3 Fucosyltransferase DNA-Molekül transkribiert wird. Das Ribozym erkennt die mRNA der GlcNAc-al, 3 Fucosyltransferase durch komp- lementäre Basenpaarung mit der mRNA. Anschließend schneidet und zerstört das Ribozym die RNA in einer sequenzspezifischen Art, bevor das Enzym translatiert wird. Nach Dissoziation vom ge- schnittenen Substrat, hybridisiert das Ribozym wiederholt mit RNA-Molekülen und wirkt als spezifische Endonuklease. Generell können Ribozyme spezifisch zur Inaktivierung einer bestimmten mRNA hergestellt werden, selbst wenn nicht die gesamte DNA-Se- quenz, die für das Protein codiert, bekannt ist. Ribozyme sind besonders dann effizient, wenn die Ribosomen langsam an der-mRNA entlang gleiten. In diesem Fall ist es für das Ribozym leichter, eine Ribosomen-freie Stelle an der mRNA zu finden. Aus diesem Grund sind langsame Ribosomen-Mutante als System far Ribozyme ebenfalls geeignet (J. Burke, 1997, Nature Biotechnology ; 15, 414-415). Dieses DNA-Molekul eignet sich besonders gut für die Unterdruckung bzw. Unterbindung der Exprimierung einer pflanz- lichen GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase.

Eine Möglichkeit besteht auch darin, eine abgewandelte Form eines Ribozyms einzusetzen, namlich ein Minizym. Insbesondere für das Schneiden von größeren mRNA-Molekulen sind Minizyme ef- fizient. Ein Minizym ist ein Hammerkopf-Ribozym, das anstelle der Stem/Loop II einen kurzen Oligonukleotid-Linker aufweist.

Besonders effizient sind Dimer-Minizyme (Kuwabara et al. 1998, Nature Biotechnology, 16 ; 961-965).

Demnach betrifft die Erfindung ebenfalls einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der beiden zuletztgenannten DNA- Molekule (Mutations oder Ribozym-DNA-Molekul) umfasst. Hierbei gilt das oben bezüglich Vektoren bereits Beschriebene. Ein sol- cher Vektor kann z. B. in einen Mikroorganismus eingeschleust und für die Herstellung von hohen Konzentrationen der oben beschrie- benen DNA-Molekule verwendet werden. Weiters ist ein solcher Vektor besonders gut für die Einschleusung des spezifischen DNA- Moleküls in einen pflanzlichen oder Insekten-Organismus geeig- net, um die GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase-Produktion in diesem Organismus einzuschränken oder völlig zu unterbinden.

Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA umfassend das erfindungsgemäße DNA-Molekul zur Verfugung gestellt, wobei RNA aus Insekten-bzw. pflanzlichen Zellen, insbesondere aus Hypokotyl-Zellen, isoliert wird, mit der nach Zusetzen einer reversen Transkriptase und Primern eine reverse Transkription durchgeführt wird. Die einzelnen Schritte dieses Verfahrens werden nach Protokollen wie an sich bekannt durchge- führt."Für die reverse Transkription besteht einerseits die Mög- lichkeit, mit Hilfe von Oligo (dT)-Primern die cDNA der gesamten mRNA herzustellen und erst anschließend mit ausgewahlten Primern eine PCR durchzuführen, um DNA-Molekule umfassend das GlcNAc- al, 3-Fucosyltransferase-Gen herzustellen. Andererseits können die ausgewählten Primer direkt für die reverse Transkription eingesetzt werden, um eine kurze, spezifische cDNA zu erhalten.

Die geeigneten Primer können z. B. synthetisch nach Vorlage von cDNA-Sequenzen der Transferase hergestellt werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können sehr rasch und einfach, mit geringer Fehlerquote, große Mengen an erfindungsgemäßen cDNA-Molekulen hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zum Klonieren einer GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass das erfindungsgemäße DNA-Molekul in einen Vektor kloniert wird, der anschließend in eine Wirtszelle bzw. einen Wirt trans- fektiert wird, wobei durch Selektion und Amplifikation von transfektierten Wirtszellen Zellinien erhalten werden, die die aktive GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase exprimieren. Das DNA-Mole- kül wird beispielsweise mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen in den Vektor eingefugt. Für den Vektor gilt wiederum das oben bereits angefhhrte. Wichtig ist bei diesem Verfahren, dass ein effizientes Wirt-Vektor System gewahlt wird. Um ein aktives Enzym zu erhalten sind eukaryotische Wirtszellen besonders ge- eignet. Eine Möglichkeit besteht darin, den Vektor in Insekten- Zellen zu transfektieren. Dabei ware insbesondere ein Insekten- virus als Vektor zu verwenden, so z. B. Baculovirus.

Selbstverstandlich können menschliche oder ander Wirbeltier- Zellen ebenfalls transfektiert werden, wobei diese ein ihnen fremdes Enzym exprimieren wurden.

Bevorzugterweise wird ein Verfahren zur Herstellung von re- kombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzen-oder Insekten- zellen, bzw. Pflanzen oder Insekten mit einer unterdrückten bzw. vollstandig unterbundenen GlcNAc-al, 3-Fucosyltransferase-Produk- tion zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest einer der erfindungsgemäßen Vektoren, namlich der umfassend das erfindungsgemäße DNA-Molekül, das mutierte DNA- Molekül oder das DNA-Molekül, das für Ribozyme codiert oder der umfassend das DNA-Molekül in inverser Orientierung zum Promotor, in die-Wirtszelle bzw. Pflanze oder in das Insekt eingeschleust wird. Hier gilt ebenfalls das oben für die Transfektion bereits Beschriebene.

Als Wirtszellen können z. B. Pflanzenzellen verwendet werden, wobei hier beispielsweise das Ti-Plasmid mit dem Agrobacterium- System in Frage kommt. Es ist mit dem Agrobakterium-System mög- lich, direkt eine Pflanze zu transfektieren : Agrobakterien ver- ursachen bei Pflanzen Wurzelhalsgallen. Wenn Agrobakterien eine verletzte Pflanze infizieren, gelangen die Bakterien selbst nicht in die Pflanze, sondern sie schleusen den rekombinanten DNA-Abschnitt, die sogenannte T-DNA aus dem ringförmigen, ex- trachromosomalen, tumorinduzierenden Ti-Plasmid in die Pflanzen- zellen ein. Die T-DNA, und damit auch das darin eingefügte DNA- Molekül, wird stabil in die chromosomale DNA der Zelle einge- baut, so dass die Gene der T-DNA in der Pflanze exprimiert wer- den.

Es gibt zahlreiche bekannte, effiziente Transfektionsmecha- nismen für verschiedene Wirtssysteme. Einige Beispiele sind Elektroporation, die Calciumphosphatmethode, Mikroinjektion, Liposomenmethode.

Die transfektierten Zellen werden anschließend selektiert, z. B. aufgrund von Antibiotika-Resistenzen, für die der Vektor Gene aufweist, oder anderer Markergene. Danach werden die trans- fektierten Zellinien amplifiziert, entweder in kleineren Mengen, z. B. in Petrischalen, oder in großen Mengen, etwa in Fermento- ren. Weiters weisen Pflanzen eine besondere Eigenschaft auf, sie sind nämlich in der Lage sich aus einer (transfektierten) Zelle bzw. aus einem Protoplasten zu einer vollständigen Pflanze wieder zu entwickeln, die gezüchtet werden kann.

Je nach eingesetztem Vektor kommt es zu Vorgängen im Wirt, so dass die Enzym-Expression unterdrückt oder vollständig unter- bunden wird : Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül mit der Deletions- Insertions-oder Substitutionsmutation transfektiert, so kommt es zu einer homologen Rekombination : Das mutierte DNA-Molekül erkennt trotz Mutation die identische Sequenz im Genom der Wirtszelle und wird an genau der Stelle eingebaut, so dass ein "Knockout-Gen"entsteht. Auf diese Weise wird in das Gen für die GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase eine Mutation eingebracht, die die einwandfreie Expression der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase inhibieren kann. Wie oben schon dargelegt ist es bei dieser Technik wichtig, dass die Mutation ausreicht, um die Expression des aktiven Proteins zu unterbinden. Nach Selektion und Ampli- fikation kann als zusätzliche Überprüfung das Gen sequenziert werden, um den Erfolg der homologen Rekombination bzw. den Grad der Mutation festzustellen.

Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül, das für ein Ribo- zym codiert, transfektiert, so wird in der Wirtszelle das aktive Ribozym exprimiert. Das Ribozym komplexiert die komplementäre mRNA Sequenz der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase zumindest an einer bestimmten Stelle, schneidet diese Stelle und kann auf diese Weise die Translation des Enzyms inhibieren. In dieser Wirtszelle sowie in den von ihr abstammenden Zellinien bzw. ge- gebenenfalls Pflanze wird keine GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase exprimiert.

Im Falle des Vektors umfassend das erfindungsgemäße DNA- Molekül in Sense-oder inverser Richtung zum Promotor, wird in der transfektierten Zelle (bzw. Pflanze) eine Sense-oder Anti- sense-mRNA exprimiert. Die Antisense-mRNA ist komplementär zu zumindest einem Teil der mRNA-Sequenz der GlcNAc-a1,3-Fucosyl- transferase und kann ebenfalls die Translation des Enzyms inhi- bieren. Als Beispiel für ein Verfahren zur Unterdrückung der Expression eines Gens durch Antisense-Technik wird auf die Schrift Smith et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 224 : 477-481 verwiesen, wobei in dieser Schrift die Expression eines Gens, das im Rei- fungsprozess bei Tomaten involviert ist, inhibiert wird.

In allen Systemen wird die Expression der GlcNAc-a1,3-Fuco- syltransferase zumindest unterdrückt, vorzugsweise sogar voll- ständig unterbunden. Der Grad der Störung der Genexpression hängt vom Grad der Komplexierung, homologen Rekombination, von eventuellen anschließenden zufälligen Mutationen, und sonstigen Vorgängen im Bereich des Genoms ab. Die transfektierten Zellen werden auf GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase Aktivität überprüft und selektiert.

Es besteht weiters die Möglichkeit, die oben beschriebene Unterdrückung der Expression der a1,3-Fucosyltransferase noch weiter zu verstärken, indem zusätzlich zur Einschleusung eines oben beschriebenen Vektors, ein Vektor umfassend ein Gen, das für ein Säugetier-Protein, z. B. ßl, 4-Galaktosyltransferase, co- diert, in den Wirt eingeschleust wird. Die Fukosylierung kann durch die Wirkung anderer Säugetier-Enzyme vermindert werden, wobei die Kombination der Inhibierung der Exprimierung einer aktiven a1,3-Fucosyltransferase mit Hilfe eines erfindungsgemä- en Vektors und mit Hilfe eines Säugetier-Enzym-Vektors beson- ders effizient ist.

Für die Transfektion kann jegliche Pflanzensorte eingesetzt werden, beispielsweise die Mungo Bohne, Tabakpflanze, Tomaten- und/oder Kartoffelpflanze.

Ein anderes, vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzen-oder Insekten- zellen bzw. Pflanzen oder Insekten, besteht darin, dass das DNA- Molekül umfassend die Mutation in das Genom der Wirtszelle bzw.

Pflanze oder des Insekts an der Stelle der nichtmutierten, homo- logen Sequenz eingeschleust wird (Schaefer et al. 1997, Plant J. ; 11 (6) : 1195-1206). Dieses Verfahren funktioniert demnach nicht mit einem Vektor, sondern mit einem reinen DNA-Molekül.

Das DNA-Molekül wird z. B. durch Genbombardement, Mikroinjektion oder Elektroporation, um nur drei Beispiele zu nennen, in den Wirt eingeschleust. Wie oben bereits dargelegt, legt sich das DNA-Molekül an die homologe Sequenz im Genom des Wirten an, so dass es zu einer homologen Rekombination und damit zur Aufnahme der Deletions-, Insertions-bzw. Substitutionsmutation im Genom kommt : Die Exprimierung der GlcNAc-1,3-Fucosyltransferase kann unterdrückt bzw. vollständig unterbunden werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Pflanzen bzw.

Pflanzenzellen sowie Insekten bzw. Insektenzellen, wobei ihre GlcNAc-a1, 3-Fucosyltransferase-Aktivität unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der in natürlichen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen und Insekten bzw. Insektenzellen vorkommende GlcNAc-a1, 3-Fucosyltransferase-Aktivität beträgt. Der Vorteil dieser Pflanzen bzw. Pflanzenzellen liegt darin, dass die Glyko- proteine, die von ihnen produziert werden, keine bzw. kaum a1,3- gebundene Fucose aufweisen. Werden nun Produkte dieser Pflanzen bzw. Insekten vom menschlichen oder Wirbeltier-Körper aufgenom- men, kommt es zu keiner Immunreaktion gegen das a1,3-Fucose- Epitop.

Vorzugsweise werden rekombinante Pflanzen bzw. Pflanzenzel- len zur Verfügung gestellt, die nach einem der oben beschriebe- nen Verfahren hergestellt sind und dass ihre GlcNAc-a1,3-Fuco- syltransferaseproduktion unterdrückt bzw. vollständig unterbun- den ist.

Die Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante Insekten bzw.

Insektenzellen, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren hergestellt sind und dass ihre GlcNAc a1,3-Fucosyltransferase- produktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist. Auch hier werden keine Glykoproteine mit a1,3-gebundenen Fucoseresten produziert, so dass es ebenfalls zu keiner Immunreaktion gegen das a1,3-Fucose-Epitop kommt.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein PNA-Molekül, das eine Basensequenz umfasst, die komplementär zur Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls sowie Teilsequenzen davon ist.

PNA (Peptid Nukleinsäure) ist eine DNA ähnliche Sequenz, wobei die Nukleobasen an ein Pseudopeptidrückgrat gebunden sind. PNA hybridisiert im allgemeinen mit komplementären DNA-, RNA-oder PNA-Oligomeren durch Watson-Crick Basenpaarung und Helixforma- tion. Das Peptidrückgrat gewährleistet eine größere Resistenz gegenüber enzymatischer Degradation. Das PNA-Molekül stellt da- durch ein verbessertes Antisense-Agens dar. Weder Nukleasen noch Proteasen sind in der Lage, ein PNA-Molekül anzugreifen. Die Stabilität des PNA-Moleküls, wenn es an eine komplementäre Se- quenz gebunden ist, weist eine ausreichende sterische Blockie- rung von DNA und RNA Polymerasen, der reversen Transkriptase, Telomerase und der Ribosome.

Weist das PNA-Molekül die oben genannte Sequenz auf, so bin- det sie an die DNA bzw. an ein Stelle der DNA, die für GlcNAc- a1,3-Fucosyltransferase codiert, und kann auf diese Weise die Transkription dieses Enzyms inhibieren. Das PNA-Molekül, da es weder transkribiert noch translatiert wird, wird synthetisch hergestellt, z. B. mit Hilfe der t-Boc-Technik.

Vorteilhafterweise wird ein PNA-Molekül zur Verfügung ge- stellt, das eine Basensequenz umfasst, die der Sequenz des er- findungsgemäßen DNA-Moleküls sowie Teilsequenzen davon ent- spricht. Dieses PNA-Molekül komplexiert die mRNA bzw. eine Stelle der mRNA der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase, so dass die Translation des Enzyms inhibiert ist. Hier trifft ahnliches, wie für die Antisense-RNA zu. So ist z. B. ein besonders effizienter Komplexierungsbereich die Translationsstart-Region oder auch die 5'-nichttranslatierten Regionen der mRNA.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen oder Insekten bzw. Zel- len, insbesondere Pflanzen-oder Insektenzellen, die eine blok- kierte Expression der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase auf dem Niveau der Transkription bzw. Translation aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass erfindungsgemäße PNA-Molekule in die Zellen eingeschleust werden. Um das PNA-Molekul bzw. die PNA- Moleküle in die Zelle einzuschleusen, werden wiederum die her- kömmlichen Methoden, wie z. B. Elektroporation oder Mikroinjek- tion angewandt. Besonders effizient ist das Einschleusen, wenn die PNA-Oligomere an Zellen-Penetrationspeptide, z. B. Trans- portan oder pAntp, gebunden sind (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnology, 16 ; 857-861).

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von re- kombinanten Glykoproteinen zur Verfügung, das dadurch gekenn- zeichnet ist, dass die erfindungsgemäßen, rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen sowie rekombinante Insekten bzw. Insekten- zellen, deren GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase-Produktion unter- drückt bzw. vollständig unterbunden ist, oder Pflanzen oder Insekten bzw. Zellen, in die nach dem erfindungsgemaßen Verfah- ren PNA-Molekule eingeschleust sind, mit dem Gen, das für das Glykoprotein codiert, transfektiert sind, so dass die rekombi- nanten Glykoproteine exprimiert werden. Dabei werden wie oben schon beschriebene Vektoren umfassend Gene far die gewunschten Proteine in den Wirt bzw. Wirtszellen wie ebenfalls oben schon beschrieben transfektiert. Die transfektierten Pflanzen-oder Insektenzellen exprimieren die gewünschten Proteine, wobei sie keine oder kaum a1,3-gebundene Fucose aufweisen. Dadurch 16sen sie die oben bereits erwahnten Immunraktionen im menschlichen oder Wirbeltier-Körper nicht aus. Es können jegliche Proteine in diesen Systemen produziert werden.

Vorzugsweise wird ein Verfahren zur Herstellung von rekom- binanten humanen Glykoproteinen zur Verfügung gestellt, das da- durch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemãßen, rekombin- anten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen sowie rekombinante Insekten bzw. Insektenzellen, deren GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferasepro- duktion unterdrückt bzw. vollstandig unterbunden ist, oder Pflanzen oder Insekten bzw. Zellen, in die nach dem erfindungs- gemäßen Verfahren PNA-Molekule eingeschleust sind, mit dem Gen, das für das Glykoprotein codiert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Durch dieses Verfahren wird es möglich, menschliche Proteine in Pflanzen (zel- len) zu produzieren, die, wenn sie durch den menschlichen Körper aufgenommen sind, keine gegen a1,3-gebundene Fucosereste gerich- tete Immunreaktion auslösen. Dabei besteht die Möglichkeit, Pflanzensorten zur Produktion der rekombinanten Glykoproteine einzusetzen, die als Nahrungsmittel dienen, z. B. Banane, Kartof- fel und/oder Tomate. Die Gewebe dieser Pflanze umfassen das rekombinante Glykoprotein, so dass z. B. durch Extraktion des rekombinanten Glykoproteins aus dem Gewebe und anschließende Verabreichung bzw. direkt durch den Verzehr des pflanzlichen Gewebes das rekombinante Glykoprotein in den menschlichen Körper aufgenommen wird.

Bevorzugterweise ist dabei ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen zur medizinischen Verwen- dung, das die erfindungsgemäßen, rekombinanten Pflanzen bzw.

Pflanzenzellen sowie rekombinante Insekten bzw. Insektenzellen, deren GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase-Produktion unterdrückt bzw. vollstandig unterbunden ist, oder Pflanzen oder Insekten bzw.

Zellen, in die nach dem erfindungsgemaßen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust sind, mit dem Gen, das für das Glykoprotein co- diert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoprote- ine exprimiert werden. Hierbei kommt jegliches Protein in Frage, das medizinisch von Interesse ist.

Weiters betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante Gly- koproteine, wobei sie gemaß einem oben beschriebenen Verfahren in pflanzlichen oder Insekten-Systemen hergestellt wurden und wobei ihre Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der in den nicht Fucosyltransferase reduzierten pflanzlichen oder Insekten-Systemen exprimierten Proteinen vorkommenden a1,3-gebundenen Fucose-Reste aufweist.

Vorzuziehen sind natürlich Glykoproteine, die keine a1,3-gebun- denen Fucose-Reste aufweisen. Die Menge an a1,3-gebundener Fucose ist abhängig von dem Grad der oben beschriebenen Unter- drückung der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase.

Bevorzugterweise betrifft die Erfindung rekombinante humane Glykoproteine, die gemäß einem oben beschriebenen Verfahren in pflanzlichen oder Insekten-Systemen hergestellt wurden, und die in ihrer Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, beson- ders bevorzugt 0%, der in den nicht Fucosyltransferase reduzier- ten pflanzlichen oder Insekten-Systemen exprimierten Proteinen vorkommenden a1,3-gebundenen Fucose-Reste aufweisen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft rekombi- nante humane Glykoproteine zur medizinischen Verwendung, die gemäß einem oben beschriebenen Verfahren in pflanzlichen oder Insekten-Systemen hergestellt wurden, und die in ihrer Peptid- sequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der in den nicht Fucosyltransferase reduzierten pflanzlichen oder Insekten-Systemen exprimierten Proteinen vorkommenden a1,3- gebundenen Fucose-Reste aufweisen.

Diese erfindungsgemäßen Glykoproteine können andere gebunde- ne Oligosaccharid-Einheiten, die für Pflanzen bzw. Insekten spe- zifisch sind, aufweisen, wodurch sie sich-im Falle von humanen Glykoproteinen-von diesen natürlichen Glykoproteinen unter- scheiden. Nichtsdestotrotz werden durch die erfindundungsgemäßen Glykoproteine eine geringere bzw. gar keine Immunreaktion im menschlichen Körper ausgelöst, da, wie in der Beschreibungsein- leitung schon dargestellt, die a1,3-gebundenen Fucose-Reste die Hauptursache der Immunreaktionen bzw. Kreuz-Immunreaktionen gegen pflanzliche und Insekten-Glykoproteine sind.

Ein weiterer Aspekt umfasst eine pharmazeutische Zusammen- setzung, die die erfindungsgemäßen Glykoproteine umfasst. Zu- sätzlich zu den erfindungsgemäßen Glykoproteinen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung weitere, für solche Zusammen- setzungen übliche Zusätze. Dies sind z. B. geeignete Verdünnungs- mittel verschiedenen Puffergehalts (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phos- phat), pH und Ionenstärke, Additive, wie etwa Tenside und Lös- lichmacher (z. B. Tween 80, Polysorbate 80), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol), Adjuvantien, Antioxidations- mittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Emulgatoren, Füllstoffe (z. B. Lactose, Mannitol), kovalente Bindung von Poly- meren, wie etwa Polyethylenglykol, an das Protein, Einbau des Materials in teilchenförmige Zubereitungen von polymeren Verbin- dungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure, etc oder in Liposome, Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe, die bei der jewei- ligen-Behandlung nützlich sind. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo Aus- scheidung der erfindungsgemäßen Glykoproteine beeinflussen.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Selektieren von DNA-Molekülen zur Verfügung, die für eine GlcNAc-a1,3-Fucosyl- transferase codieren, in einer Probe, wobei die erfindungsgemä- ßen, markierten DNA-Moleküle zur Probe zugesetzt werden, die an die DNA-Moleküle, die für eine GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase codieren, binden. Die hybridisierten DNA-Moleküle können detek- tiert, quantifiziert und selektiert werden. Damit die Probe Ein- zelstrang-DNA aufweist, mit der die markierten DNA-Moleküle hy- bridisieren können, wird die Probe, z. B. durch Erwärmen, denatu- riert.

Eine Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende DNA, eventuell nach Zusetzen von Endonukleasen, durch Gelelektropho- rese auf einem Agarosegel zu trennen. Nach Überführen auf eine Membran aus Nitrozellulose werden die erfindungsgemäßen markier- ten DNA-Moleküle zugesetzt, die an das entsprechende homologe DNA-Molekül hybridisieren ("Southern Blotting").

Eine andere Möglichkeit besteht darin, homologe Gene aus anderen Spezien durch PCR-abhängige Verfahren unter Verwendung von spezifischen und/oder degenerierten Primern, abgeleitet aus der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls, aufzufinden.

Bevorzugt umfasst die Probe für das obengenannte erfinderi- sche Verfahren genomische DNA eines pflanzlichen bzw. Insekten- Organismus. Durch dieses Verfahren wird auf sehr schnelle und effiziente Weise eine große Anzahl von Pflanzen und Insekten auf das Vorhandensein des GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase-Gens unter- sucht. Auf diese Weise können Pflanzen und Insekten, die dieses Gen nicht aufweisen, selektiert werden bzw. können in solchen Pflanzen und Insekten, die dieses Gen aufweisen, durch ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Verfahren die Exprimierung der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase unterdrückt bzw. vollständig unterbunden werden, so dass sie anschließend zur Transfektion und Produktion von (humanen) Glykoproteinen eingesetzt werden können.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die DNA-Moleküle, die für eine GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase codieren, die nach den zwei zuletzt genannten Verfahren selektiert und anschließend aus der Probe isoliert wurden. Diese Moleküle können für weitere Unt- zersuchungen eingesetzt werden. Sie können sequenziert und ih- rerseits auch als DNA-Sonden zum Auffinden von GlcNAc-a1,3-Fu- cosyltransferasen verwendet werde. Diese-markierten-DNA- Moleküle werden für Organismen, die den Organismen, aus denen sie isoliert wurden, verwandt sind, effizienter als Sonden fun- gieren, als die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Präparation von erfindungsgemäß klonierter GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase, die Isoformen mit pI-Werten zwischen 6.0 und 9.0, insbesondere zwischen 6.8 und 8.2, aufweist. Der pI-Wert eines Proteins ist derjenige pH-Wert, bei dem seine Nettoladung Null beträgt und ist abhängig von der Aminosäuresequenz, dem Glykosylierungsmu- ster als auch von der räumlichen Struktur des Proteins. Die GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase umfasst zumindest 7 Isoformen, die einen pI-Wert in diesem Bereich aufweisen. Der Grund für die verschiedenen Isoformen der Transferase sind z. B. unterschied- liche Glykosylierungen sowie limitierte Proteolyse. Versuche zeigten, dass Mungobohnen-Sämlinge von verschiedenen Pflanzen unterschiedliche Verhältnisse der Isozyme aufweisen. Der pI-Wert eines Proteins kann durch isoelektrische Fokussierung, die dem Fachmann bekannt ist, festgestellt werden.

Die Haupt-Isoform des Enzyms weist ein apparentes Moleku- largewicht von 54 kDa auf.

Insbesondere weist die erfindungsgemäße Präparation Isofor- men mit pI-Werten von 6.8,7.1 und 7.6 auf.

Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung von"verpflanzlichten"Kohlenhydrat-Einheiten von menschlichen und anderen Wirbeltier-Glykoproteinen, wobei zu einer Probe, die eine Kohlenhydrat-Einheit bzw. ein Glykoprotein umfasst, Fucose- Einheiten sowie von einem oben beschriebenen DNA-Molekül codier- te GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase zugesetzt werden, so dass Fucose in a1,3-Stellung durch die GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase an die Kohlenhydrat-Einheit bzw. das Glykoprotein gebunden wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Klonierung von GlcNAc- a1,3-Fucosyltransferase ist es möglich, große Mengen gereinigtes Enzym herzustellen. Um eine voll aktive Transferase zu erhalten, werden geeignete Reaktionsbedingungen hergestellt. Es hat sich gezeigt, dass die Transferase eine besonders hohe Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 7 aufweist, wenn als Puffer 2- (N-Morpho- lino) Ethansulfonsäure-HC1 verwendet wird. In Gegenwart von biva- lenten Kationen, insbesondere Mn2+, wird die Aktivität der rekombinanten Transferase verstärkt. Die Kohlenhydrat-Einheit wird entweder in ungebundener Form oder an ein Protein gebunden zur Probe zugesetzt. Die rekombinante Transferase ist für beide Formen aktiv.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht ein- geschränkt ist, weiter erläutert werden. Im einzelnen zeigen in der Zeichnung die Fig. la und lb die gemessenen Mengen an Pro- tein und die gemessene Enzymaktivität in den einzelnen Fraktio- nen des Eluats als Kurven ; die Fig. 2 die Abbildung eines Elek- trophorese-Gels der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase ; die Fig. 3 das Ergebnis der isoelektrischen Fokussierung und die gemessene Transferase-Aktivität der einzelnen Isoformen ; die Fig. 4 die N- terminalen Sequenzen von 4 tryptischen Peptiden 1-4 sowie die DNA-Sequenz von drei Primern S1, A2 und A3 ; die Fig. 5a und 5b die cDNA-Sequenz der a1,3-Fucosyltransferase ; die Fig. 6a und 6b die daraus hergeleitete Aminosäuresequenz der a1,3-Fucosyltrans- ferase ; die Fig. 7 eine schematische Darstellung der a1,3-Fuco- syltransferase sowie die Hydrophobizität der Aminosäuren-Reste ; die Fig. 8 einen Vergleich der konservierten Motive verschiede- ner Fucosyltransferasen ; die Fig. 9 einen Vergleich der Fucosyl- transferase-Aktivität von mit dem al, 3-Fucosyltransferase-Gen transfektierten Insektenzellen mit einer Negativkontrolle ; die Fig. 10a und 10b Strukturen von verschiedenen Akzeptoren der a1,3-Fucosyltransferase ; die Fig. 11 und 12 Massenspektren ; und die Fig. 13 das Ergebnis einer HPLC.

Beispiel 1 : Isolieren der Core-a1,3-Fucosyltransferase Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Mungobohnen-Sämlinge wurden in einem Mixer homogenisiert, wobei 0.75 Volumen Extrak- tionspuffer pro kg Bohnen verwendet wurde. Das Homogenisat wurde anschließend durch zwei Lagen Baumwollstoff filtriert und das Filtrat wurde bei 30000xg 40 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit Lösungspuffer über Nacht bei ständigem Rühren extrahiert. Anschließende Zentrifu- gation bei 30000xg für 40 min ergab den Triton-Extrakt.

Der Triton-Extrakt wurde wie folgt gereinigt : Schritt 1 : Der Triton-Extrakt wurde auf einen mikrogranu- lären Diäthylaminoäthyl-Zellulose-Anionenaustauscher DE52 Zellu- lose-Säule (5x28 cm, Fa. Whatman), der zuvor mit Puffer A kali- briert wurde, aufgetragen. Die nicht gebundene Fraktion wurde in Schritt 2 weiterbehandelt.

Schritt 2 : Die Probe wurde auf eine mit Puffer A kalibrierte Affi-Gel Blue Säule (2.5x32) Säule aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit diesem Puffer wurde adsorbiertes Protein mit Puffer A umfassend 0.5 M NaCl eluiert.

Schritt 3 : Nach Dialyse des Eluats aus Schritt 2 gegen Puf- fer B wurde es auf eine, mit demselben Puffer kalibrierte, S- Sepharose-Säule aufgetragen. Gebundenes Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0.5 M NaCl in Puffer B eluiert.

Fraktionen mit GlcNAc-a1,3-Fucosyltranferase wurden gepoolt und gegen Puffer C dialysiert.

Schritt 4 : Die dialysierte Probe wurde auf eine mit Puffer C kalibrierte GnGn-Sepharose-Säule aufgetragen. Das gebundene Pro- tein wurde mit Puffer C umfassend 1 M NaCl anstelle von MnCl2 eluiert.

Schritt 5 : Das Enzym wurde anschließend gegen Puffer D dia- lysiert und auf eine GDP-Hexanolamin-Sepharose-Säule aufge- bracht. Nach Waschen der Säule mit Puffer D wurde die Trans- ferase durch Ersetzen von MgCl und NaCl mit 0.5 mM GDP eluiert.

Aktive Fraktionen wurden gepoolt, gegen 20 mM Tris-HC1 Puffer, pH 7.3, dialysiert und lyophilisiert.

Die enzymatische Aktivität der GlcNAc a1,3 Fucosyltransfe- rase wurde durch Verwendung von GnGn-Peptid und GDP-L- [U-"Cl Fucose bei Substratkonzentrationen von jeweils 0.5 und 0.25, in Gegenwart von 2- (N-Morpholin) Ethansulfonsäure-HC1 Puffer, Triton X-100, MnC12, GlcNAc und AMP bestimmt (gemäß Staudacher et al.

1998 Glycoconjugate J. 15,355-360 ; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199,745-751).

Proteinkonzentrationen wurden mit Hilfe der Bichinchonin- säure Methode (Pierce) oder, bei den letzten Schritten der Enzymreinigung, mittels Aminosäurenanalyse bestimmt (Altmann 1992 Anal. Biochem. 204,215-219).

In Fig la und lb sind die gemessenen Mengen an Protein und die gemessene Enzymaktivität in den einzelnen Fraktionen des Eluats als Kurven dargestellt. Fig. la zeigt die oben beschrie- bene Trennung auf der S-Sepharose Säule, Fig. 1 b die Trennung auf der GnGn-Sepharose-Säule, wobei der Kreis Protein, der schwarze, volle Kreis GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase und das Viereck N-Acetyl-ß-Glucosaminidase darstellt. Ein U ist defi- niert als die Menge Enzym, die lmol Fucose auf einen Akzeptor pro Minute tranferiert.

Tabelle 1 zeigt die einzelnen Schritte der Transferase- Reinigung.

Tabelle 1 Reinigungsschritt Ges. Ges. Spez. Reinigungs Ausbeute Prot. Aktiv. Aktiv. Faktor mg mU mU/mg-fach t Triton X-100 Extrakt 91500 4846 0.05 1 100 DE52 43700 4750 0.10 2 98.0 Affigel Blue 180.5 4134 23 460 85.3 S-Sepharose 8.4 3251 390 7800 67.1 GnGn-Sepharose 0.131 1044 8030 160000 21.5 GDP-Hexanolamin- Sepharose 0.021 867 43350 867000 17.9 wurde mittels Aminosäure-Analyse ermittelt Extraktionspuffer : 0.5 mM Dithiothreit 1 mM EDTA 0. % Polyvinylpolypyrrolidon 0.25 M Saccharose 50 mM Tris-HC1 Puffer, pH 7.3 Lösungspuffer : 0.5 mM Dithiothreit 1 mM EDTA 1.5oui5 Triton X-100 50 mM Tris-HC1, pH 7.3 Puffer A : 25mM Tris-HC1 Puffer, pH 7.3 mit : 0.1% Triton X-100 und 0.02% NaN3 Puffer B : 25 mM Na-Citrat Puffer, pH 5.3 mit : 0.1% Triton X-100 und 0.02% NaN3 Puffer C : 25 mM Tris-HC1 Puffer, pH 7.3 mit : 5 mM MnCl2 und 0.02% NaN3 Puffer D.

25 mM Tris-HC1, pH 7.3 mit : 10 mM MgC12, 0.1 M NaCl und 0.02% NaN3 Beispiel 2 : SDS-Paqe und isoelektrische Fokussierung Eine SDS-Page wurde in einer Biorad-Mini-Protean-Zelle auf Gelen mit 12.5t Acrylamid und li Bisacrylamid durchgeführt. Die Gele wurden entweder mit Coomassie Brilliant Blau R-250 oder Silber gefärbt. Isoelektrische Fokussierung der Fucosyltransfe- rase wurde auf vorgefertigten Gelen mit einem pI-Bereich zwi- schen 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva) durchgeführt. Die Gele wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Silber gefärbt.

Für die zweidimensionale Elektrophorese wurden Banden aus dem Fokussierungsgel ausgeschnitten, mit S-Alkylierungs-Reagentien und SDS behandelt und einer SDS-Page, wie oben beschrieben, un- terzogen.

Fig. 2 stellt die Abbildung eines Elektrophorese-Gels der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase dar, wobei links die zweidimen- sionale Elektrophorese und rechts die eindimensionale SDS-Page dargestellt sind. Dabei ist die mit A bezeichnete Bahn ein Standard, die mit B bezeichnete Bahn die GlcNAc a1,3-Fucosyl- transferase aus der GnGn-Sepharose-Säule und die mit C bezeich- nete Bahn"gereinigte"GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase, d. h. die Fraktion der GDP-Hexanolamin-Sepharose-Säule. Die zwei Banden bei 54 und 56 kDa stellen Isoformen der Transferase dar.

Fig. 3 zeigt das Ergebnis der isoelektrischen Fokussierung.

Bahn A wurde mit Silber gefärbt, auf Bahn B wurde Aktivität der Transferase Isoformen getestet. Die Aktivität ist dabei als W Fucose angegeben, die GDP-Fucose auf das Substrat transferiert wurde.

Beispiel 3 : Peptidsequenzierunq Für die Sequenzierung des Proteins wurden Banden aus dem mit Coomassie gefärbten SDS-Polyacrylamidgel geschnitten, carboxy- amidomethyliert und mit Trypsin gemäß Görg et al. 1988, Electro- phoresis, 9,681-692, gespalten. Die tryptischen Peptide wurden mit der reversen Phase HPLC auf einer 1.0x250 mm Vydac C18 bei 40°C mit einer Durchflussrate von 0.05 ml/min getrennt, wobei ein HP 1100 Apparat (Hewlett-Packard) verwendet wurde. Die iso- lierten Peptide wurden mit Hewlett-Packard G1005A Protein Sequenzierungs System gemäß dem Protokoll des Herstellers se- quenziert. Weiters wurde die Peptidmischung durch Ingel-Verdau- ung mit MALDI-TOF MS analysiert (siehe unten).

Fig. 4 zeigt die N-terminalen Sequenzen von 4 tryptischen Peptiden 1-4 (SEQ ID No : 5-8). Ausgehend von den ersten drei Peptiden wurden Primer S1, A2 und A3 hergestellt (Sequenz-Iden- tifikationsnummern 9-11).

Beispiel 4 : RT-PCRundcDNA Klonieren Die gesamte RNA wurde aus einem 3 Tage alten Mungo Bohnen Hypokotyl isoliert, wobei das SV Total RNA Isolierungs System von Promega verwendet wurde. Zur Herstellung der Erststrang-cDNA wurde die gesamte RNA 1 h bei 48°C mit AMV reverse Transkriptase und Oligo (dT) Primern inkubiert, wobei das Reverse Transkription System von Promega verwendet wurde.

Die Erststrang-cDNA wurde einer PCR unterzogen, wobei eine Kombination von Sense-und Antisense-Primern verwendet wurde : Zu 10 p1 der reversen Transkription Reaktion wurde folgendes zugesetzt : 50 y1 mit O. lmol eines jeden Primers, 0.1 mM dNTPs, 2 mM MgC12,10 mM Tris-HC1 Puffer, pH 9.0,50 mM KC1 und 0.1 k Triton X-100.

Nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 min, wurden 40 Zyklen von 1 min bei 95°C, 1 min bei 49°C und 2 min bei 72°C durchlaufen. Der letzte Extensionsschritt wurde bei 72°C für 8 min durchgeführt. PCR Produkte wurden in den pCR2.1 Vektor subkloniert, wobei das TA Cloning Kit von Invitrogen ver- wendet wurde, und sequenziert. Die Produkte dieser PCR waren zwei DNA-Fragmente mit der Länge von 744bp und 780bp, wobei beide DNA-Fragmente dasselbe 5'-Ende aufweisen (s. auch Fig. 7).

Ausgehend von diesen zwei DNA-Fragmenten wurden die fehlen- den 5'und 3'Regionen der cDNA durch 5'-und 3'-Rapid Amplifi- kation von cDNA-Enden (RACE) erhalten, wobei der RACE Kit von Gibco-BRL verwendet wurde. Als Antisense-Primer wurde der uni- verselle Amplifikations-Primer des Kits und als Sense-Primer entweder 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID No : 12) oder 5'- AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEQ ID No : 13) verwendet. Es wurde auch als Sense Primer der verkürzte Anker-Primer des Kits und als Antisense-Primer 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEQ ID No : 14) oder 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID No : 15) verwendet.

Die PCR wurde mit einer Annealing Temperatur von 55°C und den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die 5'und 3' RACE Produkte wurden in den pCR2.1 Vektor subkloniert und se- quenziert : Die Sequenzen der subklonierten Fragmente wurden mittels der Didesoxynukleotid-Methode sequenziert (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit und ABI PRISM 310 Genetiv analyser (Perkin Elmer)). T7 und M13 Vorwärts-Primer wurden für die Sequenzierung der in den pCR2.1 Vektor klonierten Produkte verwendet. Beide Stränge der Codierungsregion wurden vom Vienna VBC Genomics-Sequencing Service sequenziert, wobei infrarotmarkierte Primer (IRD700 und IRD800) und ein LI-COR Long Read IR 4200 Sequenzierer (Lincoln, NE) verwendet wurden.

Fig. 5a und 5b zeigen die gesamte cDNA, die eine Größe von 2198 bp und einen offenen Leserahmen von 1530 bp aufweist (SEQ ID No : 1). Der offene Leserahmen (Startcodon bei Basenpaaren 211-213, Stopcodon bei Basenpaar 1740-1743) codiert für ein Pro- tein von 510 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 56.8 kDA und einem theoretischen pI-Wert von 7.51.

Fig. 6a und 6b zeigen die von der cDNA hergeleitete Amino- säurensequenz der GlcNAc-a1,3 Fucosyltransferase (SEQ ID No : 2).

Stellen für die Asparagin gebundene Glykosylierung sind bei Asn346 und Asn429.

In Fig. 7 ist die schematische GlcNAc-a1,3-Fucosyltransfe- rase-cDNA (oben) und der hergeleitete Hydrophobizitätsindex des codierten Proteins (unten) dargestellt, wobei ein positiver Hydrophobizitätsindex eine erhöhte Hydrophobizität bedeutet. Da- zwischen sind die Größen der beiden oben genannten PCR-Produkte in Relation zur kompletten cDNA gezeigt. Der Codierungs-Bereich ist durch den Balken dargestellt, wobei"C"für den postulierten cytoplasmatischen Bereich, T für den postulierten transmembranen Bereich und G für den postulierten Golgi-Lumen katalytischen Bereich der Transferase codiert. Die Analyse der DNA-Sequenz durch"TMpred" (von EMBnet, Schweiz) ergab eine vermutliche Transmembran-Region zwischen Asn36 und Gly54. Der C-terminale Bereich des Enzyms umfasst vermutlich die katalytische Region und sollte folglich in das Lumen des Golgi-Apparats weisen. Dem- nach scheint diese Transferase ein Transmembranprotein des Typs II zu sein, wie alle bisher analysierten Glykosyltranferasen, die eine Rolle in der Glykoprotein-Biosynthese spielen (Joziasse, 1992 Glycobiology 2,271-277). Die grauen Bereiche stellen die vier tryptischen Peptide, die Sechsecke die potenti- ellen N-Glykosylierungs-Stellen dar. Eine via NCBI zugängliche BLASTP Suche aller Datenbanken zeigte eine Ähnlichkeit zwischen der GlcNAc-a1,3 Fucosyltransferase und anderen a1,3/4-Fucosyl- transferasen, z. B. der humanen Fucosyltransferase-VI. Mit 18-21% (untersucht von SIM-LALNVIEW, Expase, Schweiz) war die Gesamt- ähnlichkeit jenseits jeglicher Signifikanz. Dennoch weist ein Sequenzbereich von 35 Aminosäuren (SEQ ID No : 4) eine auffallend hohe Homologie zu anderen a1,3/4 Fucosyltransferasen auf (Fig.

8). Dieser Sequenzbereich befindet sich zwischen Glu267 und Pro301 der SEQ ID No : 2.

Beispiel 5 : Expression der rekombinanten GlcNAc-a1,3 Fucosyltransferase in Insektenzellen Die codierende Region der vermutlichen GlcNAc-a1,3 Fucosyl- transferase samt cytoplasmatischer und transmembraner Region wurde mit dem Vorwärts-Primer 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID NO : 16) und Rückwärts-Primer 5'- CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEQ ID No : 17) mit dem Expand High Fidelity PCR System von Boehringer Mannheim amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit PstI und BamHI doppelt verdaut und in Alkalin-Phosphatase behandeltem Baculovirus Transfer-Vektor pVL1393, der zuvor mit PstI und BamHI verdaut wurde, subklo- niert. Um eine homologe Rekombination zu gewährleisten, wurde der Transfervektor mit Baculo Gold viraler DNA (PharMingen, San Diego, CA) in Sf9 Insektenzellen in IPL-41 Medium mit Lipofectin cotransfektiert. Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei 27°C wurden verschiedene Volumina des Überstandes mit dem rekombinan- ten Virus zur Infektion der Sf21 Insektenzellen verwendet. Nach einer Inkubation von 4 Tagen bei 27°C in IPL-41 Medium mit 50 FCS wurden die Sfl Zellen geerntet und 2x mit Phosphat gepuffer- ter Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden in 25 mM Tris HCL Puffer, pH 7.4, mit 2% Triton X-100 resuspendiert und durch Sonifikation auf Eis aufgebrochen.

Beispiel 6 : Assay für die GlcNAc a1,3 Fucosyltransferase-Aktivität Das Homogenat und der Zellüberstand wurden auf GlcNAc a1,3 Fucosyltransferase getestet. Blindproben wurden mit rekombinatem Baculovirus, der für die Tabak-GlcNAc-Transferase I (Strasser et al. 1999, Glycobiology, im Druck) codiert, durchgeführt.

Fig. 9 zeigt die gemessene Enzymaktivität der rekombinanten GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase sowie der Negativkontrolle. Im besten Fall war die Enzymaktivität der cotransfektierten Zellen und deren Überstand 30x höher als die der Negativkontrollen.

Diese endogene Aktivität, die in Abwesenheit der rekombinanten Transferase messbar ist, kommt im wesentlichen von der Insekten- a1,6-Fucosyltransferase und nur zu einem geringen Prozentsatz von der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase. Demnach beträgt die Er- höhung der GlcNAc-a1,3-Fucosyltransferase, die von den rekombi- nanten Baculoviren stammt, weit aber das 100fache.

Das Enzym zeigte eine breite Maximal-Aktivität um einen pH- Wert von 7.0, wenn die Aktivität in 2- (N-Morpholin) Ethansulfon- saure-cl Puffer gemessen wurde. Wie in Tabelle 2 ersichtlich ist, födert der Zusatz von bivalenten Kationen, insbesondere Mn2+, die Aktivität der rekombinanten Transferase.

Tabelle 2 Zusatzmittel relative Aktivität (konz. lOmM) (Akzeptor : GnGn-Peptid) <BR> <BR> 0<BR> kein 21<BR> <BR> EDTA 18<BR> <BR> MnCl2 100<BR> <BR> CaCl2 82<BR> <BR> MgCl2 52 CdCl2 44 CoCl2 35 CuCl2 3<BR> <BR> NiCl2 24<BR> <BR> ZnCl2 0.6 Tabelle 3 zeigt, dass unter den eingesetzten Akzeptoren das GnGn-Peptid die höchsten Inkorporationsraten bei Standard Ver- suchsbedingungen zeigt, knapp gefolgt vom GnGnF6-Peptid und M5Gn-Asn. Kein Transfer konnte auf das MM-Peptid festgestellt werden, welches das reduzierende GlcNAc-Ende an der 3-gebundenen Mannose nicht aufweist. Diese Struktur scheint für die Core-Fu- cosyltransferase notwendig zu sein. Die rekombinante Transferase war weiters inaktiv hinsichtlich die gebräuchlichen Akzeptoren, die für die Bestimmung der Blutgruppen a1,3/4-Fucosyltransfera- sen, die die Fucose auf GlcNAc an den nicht reduzierenden Enden von Oligosacchariden transferieren. Die scheinbaren Km-Werte für die Akzeptor-Substrate GnGn-Peptid, GnGnF6-Peptid, M5Gn-Asn und für das Donor Substrat GDP-Fucose wurden auf 0.19,0.13,0.23 bzw. 0.11 geschätzt. Die Strukturen der Moleküle sind in Fig.

10a und 10b dargestellt.

Tabelle 3 Akzeptor-Substrat rel. Aktivität Km-Wert <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> % mu GnGn-Peptid 100 0.19 GnGnF6-Peptid 87 0.13 M5Gn-Asn 71 0.23 MM-Peptid 0 Galßl-4GlcNAc 0 Galßl-3GlcNAc 0 Galßl-3GlcNAcßl-3Galßl-4Glc 0 Beispiel 7 : Massenspektrometrie des Fucosvl-Transferase Produkts Dabsyliertes GnGn-Hexapeptid (2nmol) wurde mit dem Insekten- zellen-Homogenat umfassend die rekombinante GlcNAc-a1,3 Fucosyl- transferase (0.08 mU) in Gegenwart von nicht radioaktiver GDP-L- Fucose (10 nmol), 2-(N-Morpholin) Ethansulfonsäure-HCL Puffer, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc und AMP inkubiert. Eine Negativkon- trolle wurde mit einem Homogenat der für die Blindproben infi- zierten Insektenzellen durchgeführt. Die Proben wurden für 16 h bei 37°C inkubiert und mittels MALDI TOF Massenspektrometrie analysiert.

Massenspektrometrie wurde auf einem DYNAMO (Therrmo BioAna- lysis, Santa Fe, NM) durchgeführt, einem MALDI-TOF MS, das zur dynamischen Extraktion fähig ist (Synonym für verspätete Extrak- tion) wurden zwei Arten von Probenmatrix-Präparationen ein- gesetzt : Peptide und dabsylierte Glykopeptide wurden in 5k Amei- sensäure gelöst und Aliquote wurden auf das Ziel aufgetragen, Luft getrocknet und mit 1% a-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure bedeckt.

Pyridylaminierte Glykane, reduzierende Oligosaccharide und nicht derivatisierte Glykopeptide wurden mit Wasser verdünnt, auf das Ziel aufgetragen und Luft getrocknet. Nach Zusatz von 2t 2,5-Di- hydroxybenzoesäure wurden die Proben sofort durch Anlegen eines Vakuums getrocknet.

Fig. 11 zeigt das Massenspektrum dieser Proben, wobei A die Negativkontrolle darstellt : Der Hauptpeak (S) zeigt das Dabsyl- Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)(GlcNAc4Man3) Asn-Arg-Thr Substrat, wobei der errech- nete [M+H] + Wert 2262.3 beträgt. Dieses Substrat scheint auch als Natrium Additionsprodukt und als kleineres Ion, das durch Fragmentation der Azo-Funktion der Dabsyl-Gruppe entstanden ist, bei (S*) auf. Eine geringe Produktmenge (P, [M+H] + = 2408.4) ist auf die endogene a1,6-Fucosyltransferase zurückzuführen. Der Peak bei m/z = 2424.0 zeigt die unvollständige Degalactosylie- rung des Substrats. Das Massenspektrum B zeigt die Probe mit rekombinanter a1,3-Fucosyltransferase. Der Hauptpeak (P) stellt das fucosylierte Produkt dar, (P*) dessen fragmentiertes Ion.

Zusätzlich wurden Aliquote beider Proben miteinander ver- mischt, um ähnliche Konzentratinen von Substrat und Produkt zu erhalten (Probe A). Diese Mischung wurde mit 0.1 M Ammoniumace- tat, pH 4.0, umfassend 10yU N-Glykosidase A (Probe B) oder mit 50 mM Tris/HCl, pH 8.5, umfassend 100 AU (1 U hydrolysiert 1 ymol Substrat pro min) N-Glykosidase F (Probe C) verdünnt. Nach 2 und 20h wurden kleine Aliquote dieser Mischungen entnommen und mittels MALDI-TOF MS analysiert.

In Fig. 12 sind die drei Massenspektren der Proben A, B und C dargestellt. Die unverdaute Probe A zeigt zwei Hauptpeaks : Das Substrat bei 2261.4 m/z und das fucosylierte Produkt bei 2407.7 m/z. Die mittlere Kurve zeigt das Massenspektrum der Probe B, mit N-Glycosidase A behandelt, die beide Glykopeptide hydroly- siert. Der Peak bei 963.32 stellt das deglycosylierte Produkt dar. Die untere Kurve zeigt das Massenspektrum der Probe C. Die N-Glykosidase F ist nicht in der Lage, a1,3 fucosylierte Subs- trate zu hydrolysieren, so dass das Spektrum den Peak bei 2406.7 m/z des fucosylierten Produkts aufweist, während der Peak des hydrolysierten Substrats bei 963.08 m/z aufscheint.

Beispiel 8 : HPLC Analyse des pyridylaminierten Fucosyltransferase-Produkts Die beiden oben beschriebenen Proben (fucosyliertes Produkt und Negativkontrolle) wurden mit N-Glykosidase A verdaut. Die erhaltenen Oligosaccharide wurden pyridylaminiert und mittels reverse Phase HPLC analysiert (Wilson et al. 1998 Glycobiology 8,651-661 ; Kubelka et al. 1994 Arch. Biochem. Biophys. 308,148- 157 ; Hase et al. 1984 J. Biochem. 95,197-203).

In Fig. 13 stellt im oberen Diagramm B die Negativkontrolle dar, wobei zusätzlich zum Restsubstrat (GnGn-Peptid) a1,6 fuco- syliertes Produkt zu sehen ist. A weist einen Peak bei wesent- lich geringerer Retentionszeit auf, was für an den reduzierenden GlcNAc-a1,3-gebundene Fucose spezifisch ist.

Im unteren Diagramm wurde das isolierte Transferase-Produkt vor (Kurve A) und nach Verdauung durch N-Acetyl-ß-Glukosamini- dase (Kurve B) mit MMF3 aus Honigbiene Phospholipase A2 (Kurve C) verglichen.

SEQUENZPROTOKOLL <110> Altmann Dr., Friedrich <120> alpha 1,3-Fucosyltransferase R36247 <130> R 36247 <140> <141> <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210>1 <211> 2198 <212> DNA <213> Pflanze <400> 1 actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa 60 aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca 120 tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt 180 tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc 240 tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca 300 aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgccc ttgtggtcat cgcggagatc 360 gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac 420 ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct 480 tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc 540 acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg 600 aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca 660 tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa 720 tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca 780 accagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg 840 gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcatttc caattgtggt 900 gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat 960 tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag 1020 cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat tcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa 1080 ttcttccaat cccttgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag 1140 gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct 1200 gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg 1260 tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg tggatatggc agctgtgcat 1320 tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat 1380 ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440 tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500 actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt ttgaagttca catccctgaa tcttgtgcct 1560 gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620 atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680 gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740 tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800 gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860 tcttggcca-a ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920 tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980 agtcacagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040 cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100 gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160 gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198 <210> 2 <211> 510 <212> PRT <213> Pflanze <400> 2 Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Arg Gly Ser Arg Thr Asp Gly Ala 1 5 10 15 Gln Gln Asp Ser Leu Pro Val Leu Ala Pro Gly Gly Asn Pro Lys Arg 20 25 30 Lys Trp Ser Asn Leu Met Pro Leu Val Val Ala Leu Val Val Ile Ala 35 40 45 Glu Ile Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Met Ala Lys Asn Ala Ala Met 50 55 60 Val Asp Ser Leu Ala Asp Phe Phe Tyr Arg Ser Arg Ala Val Val Glu 65 70 75 80 Gly Asp Asp Leu Gly Leu Gly Leu Val Ala Ser Asp Arg Asn Ser Glu 85 90 95 Ser Tyr Ser Cys Glu Glu Trp Leu Glu Arg Glu Asp Ala Val Thr Tyr 100 105 110 Ser Arg Gly Phe Ser Lys Glu Pro Ile Phe Val Ser Gly Ala Asp Gln 115 120 125 Glu Trp Lys Ser Cys Ser Val Gly Cys Lys Phe Gly Phe Ser Gly Asp 130 135 140 Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly Leu Pro Gln Pro Ser Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ser Ile Leu Arg Ser Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn 165 170 175 Ile Ala Met Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Asn Ile Val Met Thr Thr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Asp Val Pro Val Gly Tyr Phe Ser Trp Ala Glu Tyr Asp 195 200 205 Met Met Ala Pro Val Gln Pro Lys Thr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ala 210 215 220 Phe Ile Ser Asn Cys Gly Ala Arg Asn Phe Arg Leu Gln Ala Leu Glu 225 230 235 240 Ala Leu Glu Lys Ser Asn Ile Lys Ile Asp Ser Tyr Gly Gly Cys His 245 250 255 Arg Asn Arg Asp Gly Arg Val Asn Lys Val Glu Ala Leu Lys His Tyr 260 265 270 Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn Glu Glu Asp Tyr Val Thr 275 280 285 Glu Lys Phe Phe Gln Ser Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Val 290 295 300 Gly Ala Pro Asn Ile Gln Asp Phe Ala Pro Ser Pro Gly Ser Ile Leu 305 310 315 320 His Ile Lys Glu Ile Glu Asp Val Glu Ser Val Ala Lys Thr Met Arg 325 330 335 Tyr Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ala Tyr Asn Gln Ser Leu Arg Trp Lys 340 345 350 Tyr Glu Gly Pro Ser Asp Ser Phe Lys Ala Leu Val Asp Met Ala Ala 355 360 365 Val His Ser Ser Cys Arg Leu Cys Ile His Leu Ala Thr Val Ser Arg 370 375 380 Glu Lys Glu Glu Asn Asn Pro Ser Leu Lys Arg Arg Pro Cys Lys Cys 385 390 395 400 Thr Arg Gly Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg Glu Arg Gly 405 410 415 Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu 420 425 430 Asn Ala Val Lys Ala Ala Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu 435 440 445 Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg Pro Glu Val Ile Arg Gly Gly Ser 450 455 460 Ala Leu Lys Leu Tyr Lys Ile Tyr Pro Ile Gly Leu Thr Gln Arg Gln 465 470 475 480 Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His 485 490 495 Leu Glu Asn Asn Pro Cys Ala Lys Phe Glu Val Ile Phe Val 500 505 510 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctta gcgtttgaaa attcgaatga ggaagattat 60 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Peptid <400> 4 Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn 1 5 10 15 Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gln Ser Leu Val Ala Gly 20 25 30 Thr Val Pro 35 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Peptid <400> 5 Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gln Pro Ser Thr Ala Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Peptid <400> 6 Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Peptid <400> 7 Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Peptid <400> 8 Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yaayathgc 29 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 13 agtgcactag agggccagaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25