本发明涉及对于环境中的重金属锰具有治理功 能的真菌菌种， 具体地说，是一种能够将廈水中的二价锰离子 氧化产生固体从而将 二价锰离子去除的真菌菌种 XS3-3-2( Leptosphaerulina chartarum ) 及其菌剂。 背景技术

廈水处理主要是利用物理、 化学和生物的方法对廈水进行净 化， 以实现廈水的回收、 复用并减少污染， 从而达到充分利用水资 源和保护环境的目 的。 由于冶炼、 电解、 电镀、 农药、 医药、 油漆、 颜料等企业排出的廈水中均含有大量的重金属 ，而重金属对于环境 的严重污染又是众所周知，因此除重金属成为 廈水处理中最为关键 的环节。 目前国内尚未见到关于真菌处理廈水的成熟技 术的报道， 而美国 US6923912B1 虽然公开了一种用白腐真菌和褐腐真菌处理 纸浆厂和造纸厂产生的廈水的方法，但该方法 只能去除廈水中的颜 色和 BOD、 COD，并不能去除廈水中的重金属离子。 发明内容

本发明 目 的之一在于提供一种真菌菌种 XS3-3-2, 该菌种可以 将液态的二价锰离子氧化成为更高价的锰氧化 物固体并从液体中 沉淀出来， 因而可以用于去除廈水中的二价锰离子。 本发明的目 的 之二在于提供该真菌菌种 XS3-3-2菌剂。 为实现本发明 目 的之一， 采用如下技术方案：

一种真菌菌种 XS3-3-2, 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心 （ CGMCC ), 保藏日期为 2012年 02月 09 日 ， 保藏号为 CGMCC No.5776。 所述真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776是从有色金属矿区的 污染土壤中分离得到的。 优选地， 所述真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776 是从含有大量二价锰金属离子的有色金属矿区 的污染土 壤中分离得到的。 进一步优选地， 所述真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776 是从含有大量二价锰金属离子和二价铅金属离 子的重庆 秀山某锰业有限公司所在地的污染土壤中分离 得到的。土壤环境中 所含二价锰离子的浓度越高，从中分离出对锰 具有高耐受力和氧化 能力的菌种就越容易。 具体的步骤如下：

( 1 ) 将 10克新鲜土样装入含有 90毫升无菌水的三角瓶中；

( 2) 用玻璃珠打散， 搅匀， 制成土壤悬液； II

( 3 ) 用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基 I 平板上， 所述 分离培养基 I 的组成为： 无水醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽提物 0.15g/L, 琼脂 15g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟；

所述酵母抽提物， 又称为酵母味素， 英文名称为 Yeast extract, 根据国际通用用法缩写为 YE。 根据中华药典之规定， 酵母抽提物 是采用以蛋白质含量丰富的食用酵母为原料， 采用 自溶、 酶解、 分 离、 浓缩等生物技术， 将酵母细胞内的蛋白质、 核酸等进行降解后 精制而成的一种棕黄色可溶性膏状或浅黄色粉 状物，主要成分为多 肽、 氨基酸、 呈味核苷酸、 B族维生素以及微量元素。 本发明所用 的酵母抽提物为 Sigma- Aldrich公司生产的 500g装试剂。

( 4)将所涂布的分离培养基 I 在 30°C的条件下培养 2〜4天， 获得单个菌落；

( 5 ) 将所述单个菌落分别接入新鲜的所述分离培养 基 I 中进 行分离培养， 获得多个纯化的菌落；

( 6 ) 对步骤 （ 5 ) 中得到的多个纯化的菌落重复步骤 （ 5 ) 的 操作 3〜5次， 得到进一步纯化的菌落；

( 7)从步骤（ 6) 中得到的菌落取等量的菌体分别接入液体培 养基 I 中， 所述液体培养 I基的组成为： 无水醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽提物 0.15g/L, 二价锰离子 350 mol/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟； 在 30°C且避光的条件下 培养 14天； 培养结束后将培养液离心分离， 分别取上清液， 采用 原子吸收分光光度法测定上清液中的二价锰离 子浓度，其中二价锰 离子浓度最低者所对应的菌种即为本发明薛选 出的具有二价锰离 子氧化能力的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776。 优选地， 所述步骤中进一步还包括步骤 （ 8):

将所述步骤 （ 7) 筛选出的菌种接种至等量的含有不同浓度的 二价锰离子的固体培养基 I 上， 所述固体培养基 I 的组成为： 无水 醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽提物 0.15g/L, 琼脂 15g/L, 二价锰离子 350 mol/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120 °C高温高压灭菌 30 分钟， 所述固体培养基 I 中二价锰离子浓度分别为 0、 250、 500、 750、 ΙΟΟθ mol/L; 在 30 °C条件下避光培养 7天后均可见菌体长满 固体培养基 I 平板， 且菌体周围出现肉眼可见的棕黄色颗粒；

利用 LBB指示剂法对所述棕黄色颗粒进行定性： 将 LBB 固体 粉末试剂溶解在醋酸中配成质量浓度为 0.04%的 LBB 溶液， 向固 体培养基 I 中均匀滴加 LBB溶液 2mL, 棕黄色颗粒变为深蓝色， 说明本发明的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776 对于浓度高达 ΙΟΟθ mol/L的二价锰离子仍具有很好的耐受能力。

所述 LBB 指示剂法之所以能够对所述棕黄色颗粒进行定 性， 原理在于 LBB溶液本身是无色的， 其在与锰氧化物（ Mn ( III , IV, VI ))相遇后即可呈现为深蓝色， 因此当无色的 LBB溶液变化为深 蓝色时可以断定其接触到了锰氧化物。 为实现本发明 目 的之二， 采用如下技术方案：

包含本发明所述的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776 的菌 剂， 按照如下方法制备而成：

( 1 ) Petri Dishes 培养： 将已经纯化的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776在无菌条件下接种于固体培养基 II上， 30°C的条 件下培养 3 天， 所述固体培养基 II的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡萄糖 20g/L, 琼脂 15g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟；

( 2 ) —级种子培养： 将步骤 （ 1 )培养的菌种在无菌条件下接 种于液体培养基 II , 所述液体培养基的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡萄糖 20g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120 °C高温高压灭菌 30分钟， 30 °C的条件下培养 4天， 制得一级种子；

( 3 ) 二级种子培养： 按与发酵培养基的体积比为 10%的接种 量， 将所述一级种子接种到含有总体积为 1.5 L 的发酵培养基的 2.5L 的发酵罐中， 适当曝气， 培养 4 天， 制得二级种子， 所述发 酵培养基的组成为：马铃薯浸粉 5g/L,葡萄糖 20g/L,氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟；

( 4 ) 混合发酵培养： 按与发酵培养基的体积比为 15%的接种 量， 将所述二级种子均接种到含有总体积为 7L 的发酵培养基的 10L 的发酵罐中进行高密度发酵培养， 获得包含所述真菌菌种 XS3-3-2的菌剂， 所述发酵培养基的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡 萄糖 20g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C 高温高压灭菌 30分钟。 本发明的真菌菌种 XS3-3-2 及其菌剂成本低廉， 大规模生产 方便，能够显著地将廈水中所含有的大量二价 锰离子氧化成为更高 价的锰氧化物并从水中沉淀出来，便于产业化 地实现廈水中金属锰 离子的去除以及其他各种下游应用。 附图说明

图 1为将实施例 1制成的真菌菌种 XS3-3-2接种至含有不同浓 度二价锰离子的固体培养基后其氧化二价锰离 子能力的变化效果 图。 具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明， 由技术常识可知， 本发明也可通过其它的不脱离本发明技术特征 的方案来描述，因此 所有在本发明范围内或等同本发明范围内的改 变均被本发明包含。 实施例 1:

按照如下方法制备真菌菌种 XS3-3-2:

( 1 )从重庆秀山某锰业有限公司所在地的污染土� �中选取 10 克新鲜土样装入含有 90毫升无菌水的三角瓶中；

( 2 ) 用玻璃珠打散， 搅匀， 制成土壤悬液；

( 3 ) 用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基平板上 ， 所述分 离培养基的组成为： 无水醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽提物 0.15g/L, 琼脂 15g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C 高温高压灭菌 30分钟；

( 4 ) 将所涂布的分离培养基在 30 °C的条件下培养 3天， 获得 单个菌落；

( 5 ) 将所述单个菌落分别接入新鲜的所述分离培养 基中进行 分离培养， 获得多个纯化的菌落；

( 6 ) 对步骤 （ 5 ) 中得到的多个纯化的菌落重复步骤 （ 5 ) 的 操作 4次， 得到进一步纯化的菌落；

( 7 ) 从步骤 （ 6 ) 中得到的菌落取等量的菌体 a、 b、 c、 d分 别接入液体培养基 I 中， 所述液体培养 I基的组成为： 无水醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽提物 0.15g/L, 二价锰离子 350 mol/L, 其余为 去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟； 在 30°C且避 光的条件下培养 14天； 培养结束后将培养液离心分离， 分别取上 清液， 采用原子吸收分光光度法测定上清液中的二价 锰离子浓度， 结果分别为 13.8、 11.9、 8.42、 0.36mg/L, 说明菌体 d对于二价锰 离子的清除能力最强，菌体 d即为本发明筛选出的具有二价锰离子 氧化能力的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776。

图 1为将本实施例制成的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776 接种至含有不同浓度二价锰离子的固体培养基 I 后其氧化二价锰 离子能力的变化效果图。

所述固体培养基 I 的组成为： 无水醋酸钠 0.2406g/L, 酵母抽 提物 0.15g/L,琼脂 15g/L,二价锰离子，其余为去离子水，且 pH=7.0, 120 °C高温高压灭菌 30分钟。固体培养基 I 中所含二价锰离子的浓 度，按照图中培养亚从上至下的顺序呈递增的 梯度变化，依次为 0、 250 mol/L、 500 mol/L、 750 mol/L、 1000 mol/L。

从图中可以看出， 从上至下培养亚呈现的棕黄色逐渐加深， 说 明其中生成的锰氧化物颗粒的质量是逐渐增多 的，即本发明的真菌 菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776氧化二价锰离子的能力是随着环境 中二价锰离子浓度的增加而提高的。 实施例 2:

按照如下方法制备真菌菌种 XS3-3-2菌剂：

( 1 ) Petri Dishes 培养： 将已经纯化的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776在无菌条件下接种于固体培养基 II上， 30°C的条 件下培养 3 天， 所述固体培养基 II的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡萄糖 20g/L, 琼脂 15g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟；

( 2 ) —级种子培养： 将步骤 （ 1 )培养的菌种在无菌条件下接 种于液体培养基 Π , 所述液体培养基的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡萄糖 20g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120 °C高温高压灭菌 30分钟， 30 °C的条件下培养 4天， 制得一级种子；

( 3 ) 二级种子培养： 按与发酵培养基的体积比为 10%的接种 量， 将所述一级种子接种到含有总体积为 1.5 L 的发酵培养基的 2.5L 的发酵罐中， 适当曝气， 培养 4 天， 制得二级种子， 所述发 酵培养基的组成为：马铃薯浸粉 5g/L,葡萄糖 20g/L,氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C高温高压灭菌 30分钟；

( 4 ) 混合发酵培养： 按与发酵培养基的体积比为 15%的接种 量， 将所述二级种子均接种到含有总体积为 7L 的发酵培养基的 10L 的发酵罐中进行高密度发酵培养， 获得包含所述真菌菌种 XS3-3-2的菌剂， 所述发酵培养基的组成为： 马铃薯浸粉 5g/L, 葡 萄糖 20g/L, 氯霉素 0.1g/L, 其余为去离子水， 且 pH=7.0, 120°C 高温高压灭菌 30分钟 实施例 3:

在 250mL 的锥形瓶中加入二价锰离子浓度为 19.23mg/L的溶 液， 加入 2g实施例 1获得的真菌菌种 XS3-3-2 CGMCC No.5776, 14 天后利用原子吸收分光光谱法测定溶液中残留 的二价锰离子浓 度， 结果为 0.36mg/L, 即对于二价锰离子的去除率为 98.13%, 单 位去除量为 75.42 mg/g。 实施例 4:

在 250mL 的锥形瓶中加入二价锰离子浓度为 19.23mg/L的溶 液， 加入 2g实施例 2获得的真菌菌种 XS3-3-2菌剂， 14天后利用 原子吸收分光光谱法测定溶液中残留的二价锰 离子浓度， 结果为 2.28mg/L, 即对于二价锰离子的去除率为 88.14%, 单位去除量为 7.06mg/g。 可以看出，真菌菌种 XS3-2-2及其菌剂对于二价锰离子均有很 好的去除效果，其通过将溶液中的二价锰离子 氧化生成锰氧化物颗 粒的过程使得游离的二价锰离子转化为固态而 从溶液中脱离出来， 从而达到了去除水体中锰离子的目 的。 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本 发明的详细工艺 流程， 但本发明并不局限于上述详细工艺流程， 即不意味着本发明 必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技 术领域的技术人员应 该明了， 对本发明的任何改进， 对本发明所用各原料的等效替换及 辅助成分的添加、 具体方式的选择等， 均落在本发明的保护范围和 公开范围之内。 打印件 (原件为电子形式)

1 下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

1-1 页码 1

1-2 行号： 18

1-3 保藏事项

1-3-1 保藏单位名称 CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心

1-3-2 保藏单位地址 Institute of Microbiology, Chinese Academy of

Sciences, No. 1， West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing 100101， China

1-3-3 保藏日期 2009年 2月 09日 （09.02.2009)

1-3-4 保藏号 CGMCC 5776

1-5 本说明是对下列指定国

所有指定国

1-6 单独提交的说明 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心存活性 报告书

这些说明将随后提交给国际局 由受理局填写

0-4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

0-4-1 受权官员 由国际局填写

0-5 国际局收到本表格日期：

0-5-1 受权官员