本发明涉及医药领域， 具体地涉及一株抗呼吸道合胞病毒的全人广谱 中和抗体 4F1 及其应用。 背景技术

RSV 导致急性上呼吸道和下呼吸道感染， 是世界范围内婴幼儿呼吸道感染重要的病 原之一， 同时 RSV还被公认为是某些高风险成年人， 诸如老年个体、 患有慢性肺部疾病 的成年个体以及免疫功能低下的成人（例如骨 髓移植病人）的重要病原体。全球每年有 3000 万的新增感染病例， 因 RSV感染而死亡的人数约为 20万人。在中国 2岁以下儿童肺炎症 候群中， RSV是最常见的病毒性病原（17.0%）。全世界都� ��切需要对于 RSV病毒感染的安 全、 有效、 价格低廉的预防治疗方法。

在过去几十年里， 已研究预防和治疗 RSV感染的方法， 包括疫苗、抗病毒化合物（利 巴韦林）、反义药物、 RNA干扰技术以及抗体产品例如免疫球蛋白或静 脉注射单克隆抗体。 帕利珠单抗是唯一被批准用于高风险儿童中的 RSV预防的抗体药物。 然而， 在中国尚没 有 RSV 的疫苗或可商购的治疗药物， 仅利巴韦林被批准用于治疗 RSV感染，但存在严 重的副作用。 帕利珠单抗靶向 F 蛋白保守的区域， 其作用广谱， 但目前每次给药所需帕 利珠单抗的剂量为 15mg/kg（体重）， 一年被动免疫 5次， 存在剂量高， 需多次给药， 价格 昂贵的缺点， 而且帕利珠单抗属于人源化的抗体， 仍然保留着部分鼠源序列， 可能存在着 一定的免疫原性， 在安全性上有一定的顾虑。 随着免疫学和分子生物学的发展， 基因工程 抗体迅速发展， 嵌合抗体、 人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展， 将 HAMA反应降 至最低乃至消除， 尤其以全人抗体成为抗体药物未来的发展方向 。

因此， 本领域仍然需要开发能够预防及控制 RSV感染的更有效的全人单克隆抗体。 发明内容

本发明目的是提供了一种能够预防及控制 RSV感染的全人单克隆抗体。 本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可 变区，所述的重链可变区包括以下三个 互补决定区 CDR：

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种 氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺 失、 修饰和 /或取代至少一个（如 1-3个， 较佳地 1-2个， 更佳地 1个）氨基酸并能够保留呼 吸道合胞病毒融合蛋白（较佳地融合前 F蛋白）结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中， 所述重链可变区还包括人源的 FR区或鼠源的 FR区。

在另一优选例中， 所述重链可变区具有 SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。 本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链， 所述的重链具有如本发明第一方面所述 的重链可变区。

在另一优选例中， 所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中， 所述的重链恒定区为人源、 鼠源或兔源的。 本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可 变区，所述的轻链可变区包括以下三个 互补决定区 CDR：

SEQ ID NO.: 6所示的 CDR1’，

氨基酸序列为 LGS的 CDR2’， 和

SEQ ID NO.: 7所示的 CDR3’。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种 氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺 失、 修饰和 /或取代至少一个（如 1-3个， 较佳地 1-2个， 更佳地 1个）氨基酸并能够保留呼 吸道合胞病毒融合蛋白（较佳地融合前 F蛋白）结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中， 所述轻链可变区还包括人源的 FR区或鼠源的 FR区。

在另一优选例中， 所述轻链可变区具有 SEQ ID NO.: 2所示的氨基酸序列。 本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链， 所述的轻链具有如本发明第三方面所述 的轻链可变区。

在另一优选例中， 所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中， 所述的轻链恒定区为人源、 鼠源或兔源的。 本发明的第五方面， 提供了一种抗体， 所述抗体具有：

（1） 如本发明第一方面所述的重链可变区； 和 /或

（2） 如本发明第三方面所述的轻链可变区；

或者， 所述抗体具有： 如本发明第二方面所述的重链； 和 /或如本发明第四方面所述 的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗呼吸 道合胞病毒的抗体，较佳地为特异性抗 呼吸道合胞病毒融合蛋白（较佳地融合前 F蛋白）的抗体。

在另一优选例中， 所述抗体选自： 动物源抗体、 嵌合抗体、 人源化抗体、 或其组合。 在另一优选例中， 所述的抗体为双链抗体、 或单链抗体。 在另一优选例中， 所述的抗体为单克隆抗体、 或多克隆抗体。

在另一优选例中， 所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中， 所述的抗体为药物偶联物形式。

在另一优选例中， 所述抗体的重链可变区序列如 SEQ ID NO. : 1所示； 并且所述的抗 体的轻链可变区序列如 SEQ ID NO. : 2所示。 本发明的第六方面， 提供了一种重组蛋白， 所述的重组蛋白具有：

（i） 如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本发明第二方面所述的重链、 如本发明 第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方 面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗 体； 以及

（ii） 任选的协助表达和 /或纯化的标签序列。

在另一优选例中， 所述的标签序列包括 6His标签、 GGGS序列、 FLAG标签。

在另一优选例中， 所述的重组蛋白（或多肽）包括融合蛋白。

在另一优选例中， 所述的重组蛋白为单体、 二聚体、 或多聚体。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合 呼吸道合胞病毒融合蛋白，较佳地结合 融合前 F蛋白。 本发明的第七方面， 提供了一种 CAR构建物， 所述的 CAR构建物的抗原结合区域 的 scFv段为特异性结合于 RSV融合蛋白（较佳地融合前 F蛋白）的结合区， 并且所述 scFv 具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如 本发明第三方面所述的轻链可变区。 本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细 胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发 明第七方面所述的 CAR构建物。

在另一优选例中， 所述的免疫细胞选自下组： NK细胞、 T细胞。

在另一优选例中， 所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物（如鼠 ）。 本发明的第九方面， 提供了一种抗体药物偶联物， 所述的抗体药物偶联物含有：

（a）抗体部分， 所述抗体部分选自下组： 如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本 发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面 所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述 的轻链、 或如本发明第五方面所述的抗体、 或其组合； 和

（b） 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部 分选自下组： 可检测标记物、药物、 毒素、 细胞因子、 放射性核素、 酶、 或其组合。

在另一优选例中， 所述偶联物选自： 荧光或发光标记物、 放射性标记物、 MRI（磁共 振成像）或 CT（电子计算机 X射线断层扫描技术）造影剂、 或能够产生可检测产物的酶、 放 射性核素、 生物毒素、 细胞因子（如 IL-2等）、 抗体、 抗体 Fc片段、 抗体 scFv片段、 金纳 米颗粒 /纳米棒、 病毒颗粒、 脂质体、 纳米磁粒、 前药激活酶 (例如， DT-心肌黄酶 (DTD) 或联苯基水解酶-样蛋白质 (BPHL))、 化疗剂 (例如， 顺铂 )或任何形式的纳米颗粒等。

在另一优选例中， 所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键 或接头进行偶联。 本发明的第十方面， 提供了一种活性成分的用途， 所述活性成分选自下组： 如本发明 第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方 面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻 链可变区、 如本发明第四方面所述的轻链、 或本发明第五方面所述的抗体、 如本发明第六 方面所述的重组蛋白、 或其组合， 所述活性成分用于制备药剂、 试剂、 检测板或试剂盒。

在另一优选例中， 所述试剂、 检测板或试剂盒用于检测呼吸道合胞病毒。

在另一优选例中， 所述药剂用于治疗或预防呼吸道合胞病毒感染 。

在另一优选例中， 所述的试剂包括芯片、 包被抗体的免疫微粒。 本发明的第十一方面， 提供了一种药物组合物， 所述的药物组合物含有：

(i) 活性成分， 所述活性成分选自下组： 如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本 发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面 所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述 的轻链、 或本发明第五方面所述的抗体、 如本发明第六方面所述的重组蛋白、 如本发明第 八方面所述的免疫细胞、 如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、 或其组合； 以及

(ii) 药学上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中， 所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中， 所述的药物组合物用于预防和 /或治疗呼吸道合胞病毒感染。 本发明的第十二方面， 提供了一种多核苷酸， 所述的多核苷酸编码选自下组的多肽:

(1) 如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本发明第二方面所述的重链、 如本发明 第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方 面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗 体； 或

(2) 如本发明第六方面所述的重组蛋白；

(3) 如本发明第七方面所述的 CAR构建物。

在另一优选例中， 所述的多核苷酸具有 SEQ ID NO. : 8和 /或 SEQ ID NO. : 9所示的序 列。 本发明的第十三方面， 提供了一种载体， 所述的载体含有如本发明第十二方面所述的 多核苷酸。

在另一优选例中， 所述的载体包括： 细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒、 或其他载体。 本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化 的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本 发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有 如本发明第十二方面所述的多核苷酸。 本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中 呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括 步骤：

(1) 将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；

P) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复� �物就表示样品中存在呼吸道合胞病 毒。

在另一优选例中， 所述检测为非治疗非诊断目的。

本发明还提供了一种检测样品中呼吸道合胞病 毒融合蛋白的方法， 所述方法包括步 骤：

(1) 将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；

P) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复� �物就表示样品中存在呼吸道合胞病 毒融合蛋白。

在另一优选例中， 所述呼吸道合胞病毒融合蛋白为呼吸道合胞病 毒融合前 F蛋白。 在另一优选例中， 所述检测为非治疗非诊断目的。 本发明的第十六方面， 提供了一种检测板， 所述的检测板包括： 基片 (支撑板)和测试 条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述 的抗体或如本发明第九方面所述的免疫偶联 物。 本发明的第十七方面， 提供了一种试剂盒， 所述试剂盒中包括：

(1) 第一容器， 所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的 抗体； 和 /或

(2) 第二容器， 所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述 的抗体的二抗； 或者， 所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检 测板。 本发明的第十八方面， 提供了一种重组多肽的制备方法， 所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下， 培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出重组多肽， 所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗 体或 如本发明第六方面所述的重组蛋白。 本发明的第十九方面， 提供了一种治疗呼吸道合胞病毒感染的方法， 所述方法包括: 给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗 体、 所述抗体的抗体-药物偶联物、 或表达 所述抗体的 CAR-T细胞、 或其组合。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例)中具体描 述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此 不再—累述。 附图说明

图 1显示了流式分选 RSV F蛋白特异性结合的记忆 B细胞。

图 2显示了匹配抗体轻重链基因琼脂糖凝胶电泳� �谱。

图 3显示了 4F1抗体对 RSV A2 pre-fusion F蛋白 (A)、 B9320 pre-fusion F蛋白 (B)及 A2 post-fusion F蛋白 (C)的结合活性。其中， 4F1抗体可以结合 RSV A型和 B型的 pre-fusion

F 蛋白。

图 4显示了 4F1抗体对 RSV A2 (A)和 B9320 (B)的抗体中和活性剂量拟合曲线；和帕 利珠单抗 (Palivizumab)对 RSV A2 (；C)和 B9320 CD)的抗体中和活性剂量拟合曲线。

图 5显示了小鼠预防实验中 4F1和帕利珠单抗对降低肺部病毒载量能力的比 较。 图 6显示了小鼠预防实验中 4F1和帕利珠单抗被动免疫后肺部病理损伤比较 。 具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究， 意外地获得一株针对呼吸道合胞病毒融合蛋白 (F 蛋白)及融合前 F蛋白 (preF蛋白)的全人单克隆抗体 4F1。 该抗体能够可以广谱性的结合 RSV A型和 B型病毒的 pre-fusion F蛋白，并对呼吸道合胞病毒具有很高的结合� �和活性， 具有识别广谱性和广谱中和性，能够抑制或阻 止呼吸道合胞病毒侵染易感细胞。体内外实 验证实 4F1抗体能有效地预防及控制 RSV的感染。 在此基础上， 完成了本发明。

本发明从一个健康的志愿者 PBMC中， 通过单细胞 RT-PCR技术筛选到一株抗 RSV 病毒全人广谱性中和抗体 4F1。 ELISA结合实验和细胞水平微中和实验证实 4F1抗体对 RSV A型和 B型蛋白具有广谱结合活性和广谱微中和活性� � 比较了 4F1和现在市售的帕 利珠单抗 (Palivizumab)抗体， 发现 4F1无论在细胞水平微中和实验还是小鼠预防实 验， 均 显著优于帕利珠单抗抗体， 且 4F1 抗体属于全人源抗体， 不含有鼠源成分， 意味着其有 更低的免疫原性和更高的安全性， 这预示该抗体潜在的抗 RSV感染的临床应用价值， 为 临床上提供新型抗 RSV病毒感染的候选药物。本发明的抗体结合 RSV F蛋白融合前形式， 大量研究证实针对 F蛋白的中和抗体识别位点主要在 pre-fusion F 蛋白上， 4F1抗体表位 的发掘也为 RSV疫苗的设计提供一些新的思路和参考。 术语

为了更容易理解本发明， 以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在 本文中另有明 确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语 都具有本发明所属领域的一般技术人员通常 理解的含义。在描述本发明之前， 应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验 条件， 因 为这类方法和条件可以变动。 还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述 具体实施方 案， 并且不意图是限制性的， 本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与 科学术语均具有如本发明所属领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用 ，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约 ” 意指该值可以从列举的值变动不多于 1%。例如，如本文所用，表述“约 100”包括 99和 101 和之间的全部值（例如， 99.1、 99.2、 99.3、 99.4等）。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如 J.biol.chem,243,p3558（1968）中所述。 如本文所用， 术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂， 包含本发明的针对呼吸道合 胞病毒融合蛋白（较佳地融合前 F蛋白）的单克隆抗体及其组合物，所述患者� �有一种或多 种疾病症状， 而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。 通常， 以有效缓解一种或多种 疾病症状的治疗剂的量（治疗有效量）给予患 者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味 着随后所描述的事件或情况可以发生但不是 必须发生。例如， “任选包含 1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重 链可变区可以 有但不是必须有， 可以是 1个、 2个或 3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当 的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳 比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之 间的同一性程度。本发明中所述的序列和其 具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少 为 85%、 90%或 95%， 优选至少为 95%。 非限制性实施例包括 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%。 呼吸道合胞病毒（RSV）

RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属，是由 15222个核苷酸组成的负链 RNA病毒。 RSV 为囊膜病毒， 基因组共编码 11种蛋白， 包括融合蛋白 F、 吸附蛋白 G、 小疏水蛋白 SH、 基质蛋白 M、 核蛋白 N、 憐蛋白 P、 大聚合酶蛋白 L、 小基质蛋白 M2 以及非结构蛋白 NS1和 NS2， 其中融合蛋白 F、 吸附蛋白 G和小疏水蛋白 SH蛋白位于病毒表面。 RSV 具有两种主要表面糖蛋白， G和 F。 G蛋白介导病毒结合到该细胞表面， 同时可模拟趋化 因子 CX ₃ C趋化因子的作用， 与其受体相互作用， 增强 RSV感染后的炎症反应； F蛋白 介导病毒和细胞膜的融合并且还促进感染的细 胞的膜与周围细胞融合以形成合胞体。根据 血清学， RSV存在两种不同抗原群或亚型， 即 A和 B， 主要通过 G蛋白的差异进行区 别。 大多数 RSV蛋白在两种亚群间是 度保守的， 其中 fusion F蛋白显不了 91%的氨基 酸相似性， G蛋白在 A和 B之间仅具有 53%的同源性。 F蛋白高度保守， 其诱导的中和 抗体可以同时抑制 A和 B两个亚型的病毒感染，在抗 RSV单克隆抗体药物及疫苗研制方 面均具有重要意义。 F蛋白属于 I型跨膜蛋白， F蛋白首先合成前体蛋白 F0。 F0在内质 网中三聚化并且在两个保守位点被细胞弗林样 蛋白酶处理， 产生 Fl、 F2和 Pep27多肽， 最后形成以二硫键相连接的 F1和 F2两个片段， F2-F1异二聚体形成三聚体组装成熟 F蛋 白。 F1亚单位包含七肽重复区 A(HRA)、功能域 1/11、七肽重复区 B (HRB)、跨膜蛋白 (TM)、 胞质区 (CP)， F2亚单位则由七肽重复区 C (HRC)组成。 F1 疏水性 N端 (137-155)在介导融 合中起重要的作用。 F蛋白介导的膜融合过程亦是其结构由融合前� �态到融合状态的变化 过程。 其采用亚稳态融合前构象。 当 G蛋白和靶细胞膜上的受体结合后， 融合前 F蛋白 (pre-fusion F蛋白)开始触发变构为稳定的融合后形式 (post-fusion)。 由于其在 RSV入侵中 的关键作用且高度保守， RSV F蛋白是中和抗体的靶标和疫苗开发的主要抗� �。大量研究 证实针对 F蛋白的中和抗体识别位点主要在 pre-fusion F 蛋白上， 基于 pre-fusion F设计 的重组蛋白免疫原性和保护效果要显著优于基 融合后 F蛋白 (post-fusion F蛋白)设计的疫 苗。

如本文所用， 术语“融合前 F蛋白” 、 "pre-fusion F蛋白” 、 “preF蛋白”可互换 使用， 均指呼吸道合胞病毒的融合蛋白 F的融合前形式。

为进一步获得疗效更好的、 全新的 RSV抗体药物及寻找新的抗体识别表位， 本发明 利用单细胞 RT-PCR技术从人的外周血 PBMC中分离到一株广谱性中和抗体 4F1。 新的 抗体的发现一方面为广谱中和抗体治疗应用提 供了新的选择，另一方面新的表位的发现为 广谱疫苗的开发提供了新的思路。 抗体

如本文所用， 术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构 特征的约 150000道尔顿的异 四聚糖蛋白， 其由两个相同的轻链 (L)和两个相同的重链 (H)组成。 每条轻链通过一个共价 二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型 的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻 链也有规则间隔的链内二硫键。 每条重链的一端有可变区 (VH)， 其后是多个恒定区。 每 条轻链的一端有可变区 (VL)，另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的� ��一个恒定区相对， 轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨 基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界 面。

如本文所用， 术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在 序列上有所不同， 它形成了 各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。 然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可 变区中。 它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区 (CDR)或超变区中的三个片段中。 可变区中较保守的部分称为构架区 (FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四� � FR区， 它们大致上呈 P-折叠构型， 由形成连接环的三个 CDR相连， 在某些情况下可形成部分 折叠结构。每条链中的 CDR通过 FR区紧密地靠在一起并与另一链的 CDR一起形成了抗 体的抗原结合部位 (参见 Kabat等， NIH Publ. No. 91-3242, 卷 I， 647-669页 (1991))。 恒定 区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表 现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖 于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体 (免疫球蛋白 )的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归� �明显不同的 两类（称为 K和人）中的一类。根据其重链恒定区的氨基� �序列， 免疫球蛋白可以分为不同的 种类。 主要有 5类免疫球蛋白： IgA, IgD, IgE, IgG和 IgM， 其中一些还可进一步分成亚类 （同种型）， 如 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA和 IgA2。 对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定 区分别称为 a、 5、 _S 、 丫、 和 1^。 不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是 本领域人员 所熟知的。

如本文所用， 术语“单克隆抗体（单抗）”指从一类基本均 一的群体获得的抗体， 即该群 体中包含的单个抗体是相同的， 除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆 抗体高特异 性地针对单个抗原位点。 而且， 与常规多克隆抗体制剂（通常是具有针对不同 决定簇的不 同抗体）不同， 各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。 除了它们的特异性外， 单克隆 抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合 成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语 “单克隆”表示了抗体的特性， 是从基本均一的抗体群中获得的， 这不应被解释成需要用任 何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗呼吸道合胞病毒融 合蛋白（较佳地 pre-fusion F蛋白）单克 隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、 具有所述的抗呼吸道合胞病毒融合蛋白（较佳 地 pre-fusion F蛋白）单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，� �及具有这些链的其他蛋白质或蛋 白质偶联物及融合表达产物。 具体地， 本发明包括具有含超变区（互补决定区， CDR）的轻 链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合 表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物）， 只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区 相同或至少 90%同源性， 较佳地至少 95% 同源性。

如本领域技术人员所知， 免疫偶联物及融合表达产物包括： 药物、 毒素、 细胞因子 （cytokine）, 放射性核素、 酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗呼吸道合 胞病毒融合蛋白 单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。 本发明还包括与所述的抗呼吸道合胞病毒融 合蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标 记物或抗原。

术语“抗体的抗原结合片段”（或简称“抗体 片段”）是指抗体的保持特异性结合抗原的能 力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体 的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗 体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例 包括（i）Fab片段， 由 VL、 VH、 CL和 CH1 结构域组成的单价片段； （ii）F（ab’） ₂ 片段， 包含通过较链区上的二硫桥连接的两个 Fab片 段的二价片段； （iii）由 VH和 CH1结构域组成的 Fd片段； （iv）由抗体的单臂的 VH和 VL 结构域组成的 Fv片段。 Fv抗体含有抗体重链可变区、 轻链可变区， 但没有恒定区， 并具 有全部抗原结合位点的最小抗体片段。 一般的， Fv抗体还包含 VH和 VL结构域之间的 多肽接头， 且能够形成抗原结合所需的结构。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体， 还包括具有免疫活性的抗体片段， 如 Fab 或 （Fab’） ₂ 片段； 抗体重链； 抗体轻链。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免 疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通 常以独特的空间构象包括至少 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14或 15个连续或非连续的氨 基酸。

术语“特异性结合”、 “选择性结合”、 “选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗 体对预 先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以 大约小于 IO_ ⁷ M，例如大约小于 10_ ⁸ M、 10 ⁹ M 或 10 ^'10 M或更小的亲和力 (KD)结合。

如本文所用， 术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的， 由本发明抗体或抗原结合片段识 别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫 活性的抗体的片段或抗体与其他序列形 成的融合蛋白。 因此， 本发明还包括所述抗体的片段、 衍生物和类似物。

在本发明中， 抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的 鼠的、嵌合的、人源化的 或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人 源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分， 可以采用本领域熟知的 DNA重组技术制备。 术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知 识和技能制备的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白 的单克隆抗体。 术语“嵌合抗体 (chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的 恒定区融合而成的抗体， 可以减轻鼠源性 抗体诱发的免疫应答反应。 术语“人源化抗体 (humanized antibody)”， 也称为 CDR移植抗 体 (CDR-grafted antibody)， 是指将鼠的 CDR序列移植到人的抗体可变区框架， 即不同类 型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源 化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋 白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序 列可以从包括种系抗体基因序列的公共 DNA 数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原 性下降的同时， 引起的活性下降， 可对所述 的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或 回复突变， 以保持活性。

在本发明中， 抗体可以是单特异性、 双特异性、 三特异性、 或者更多的多重特异性。 如本文所用， 术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用， 术语“可变区”与“互补决定区 (complementarity determining region, CDR)” 可互换使用。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成 抗原结合的 6 个高变区之一。 所述 6 个 CDR 的最常用的定义之一由 Kabat E.A 等人， (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication ⁹ 1- ³²⁴² )提供。

在本发明的一个优选的实施方式中， 所述抗体的重链可变区包括以下三个互补 决定区 CDR：

CDR1 : GFSFYSYS (SEQ ID NO : 3)，

CDR2： WYDGNHQ (SEQ ID NO. : 4)， 和

CDR3： TARSLVITLAGAGRDDY (SEQ ID NO. : 5)。

在另一优选例中， 所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO. : 1所示， 其中下 划线标注的依次为重链可变区 CDR1， CDR2， CDR3的氨基酸序列。

EVOLVOSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFSFYSYSVHWVROAPGKGLEWVADV AGRDDYWGOGTRVTVS S (SEQ ID NO : 1)

在另一优选例中， 所述重链可变区的核酸编码序列如 SEQ ID NO. : 8所示， 其中 下划线标注的依次为重链可变区 CDR1， CDR2， CDR3的核酸编码序列。

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCTATTCCTATTCTGTGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGATGTTGTATAT GATGGAAATCATCAACATTACACGGAGTCCGTGAGGGGCCGATTCTCCATCTCC AGAGACACCTCCACCAATACGGTGTATCTGCAAATGGGCAGCCTGAGGCCTGA AGACACGGCTCTTTATTACTGTACGGCCCGCAGTTTGGTCATAACGCTCGCGGG GGCGGGTCGAGATGACTATTGGGGCCAGGGAACTCGGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO : 8)

在本发明的一个优选的实施方式中， 所述抗体的重链包括上述重链可变区和重 链恒定区， 所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

如本文所用， 术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中， 根据本发明的抗体的轻链可变区， 具有选 自下组的互补决定区 CDR：

CDR1，： QSLLHSNGYTY (SEQ ID NO : 6)，

CDR2，： LGS， 和

CDR3’： VQDLQTSLT (SEQ ID NO : 7)。

在另一优选例中， 所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.: 2所示， 其中双 下划线标注的依次为轻链可变区 CDR1’， CDR2’， CDR3’的氨基酸序列。

DIVMTOSPLSLSVTPGEPASISCKSSOSLLHSNGYTYLDWYLOKPGKSPOLLIFL GSSRASGVPARFSGSGSGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCVODLOTSLTFGGGTKVDIK

(SEQ ID NO : 2)

在另一优选例中， 所述轻链可变区的核酸编码序列如 SEQ ID NO. : 9所示， 其中 双下划线标注的依次为轻链可变区 CDR1’， CDR2’， CDR3’的核酸编码序列。

GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGAGAGC CGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTCCATAGTAATGGATACA CTTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGAAGTCTCCACAACTCCTGATCT TTTTGGGTTCTAGTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGGAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGG GTTTACTACTGCGTGCAAGATCTACAAACTTCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACC AAAGTGGATATCAAA (SEQ ID NO : 9)

在本发明的一个优选的实施方式中， 所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻 链恒定区， 所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。 本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变 区基因特异性基因序列决定，可以广谱 性的结合 RSV A型和 B型病毒的 pre-fusion F蛋白，能够阻止呼吸道合胞病毒侵染易感细 胞。利用此抗体可变区基因或互补决定区（CDR ）基因， 可在利用原核和真核细胞的任何表 达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体 。

在本发明中， 术语“本发明抗体”、 “本发明蛋白”、 或“本发明多肽”可互换使用， 都指特异性结合抗呼吸道合胞病毒融合蛋白（ 较佳地 pre-fusi on F蛋白）的抗体，例如具 有重链可变区（如 SEQ ID NO. : 8所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列）和 /或轻链可变 区（如 SEQ ID NO. : 9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列）的蛋� �或多肽。 它们可含 有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中， 所述的抗体为抗呼吸道合胞病毒融合蛋白（较 佳地 pre-fusion F 蛋白）的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体， 它的重链恒定区和 /或轻链恒定区可以是人源化的 重链恒定区或轻链恒定区。 更优选地， 所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人 IgGl、 IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

一般， 抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变 区的 3 个特定的区域来描 述， 称为可变区域（CDR）， 将该段间隔成 4个框架区域（FR）， 4个 FR的氨基酸序列相 对比较保守， 不直接参与结合反应。 这些 CDR形成环状结构， 通过其间的 FR形成 的 P折叠在空间结构上相互靠近，重链上的 CDR和相应轻链上的 CDR构成了抗体的 抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的 氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了 FR或 CDR区域。

本发明抗体的重链和 /或轻链的可变区特别令人感兴趣， 因为它们中至少部分涉 及结合抗原。 因此， 本发明包括那些具有带 CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的 分子， 只要其 CDR与此处鉴定的 CDR具有 90%以上（:较佳地 95%以上， 最佳地 98% 以上）的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体， 还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体 与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还 包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。 例如在本发明抗体的基础上进行的 Fc片段的改造， 为了延长抗体半衰期， 在 CH2区 域引入三个突变点 M252Y /S254T /T256E。

如本文所用， 术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发 明抗体相同 的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是（i）有一个或 多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性 氨基酸残基）被取代的多肽， 而这样的取 代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码 编码的， 或（ii）在一个或多个氨基酸残 基中具有取代基团的多肽， 或（iii）成熟多肽与另一个化合物（比如延长 多肽半衰期的化 合物， 例如聚乙二醇）融合所形成的多肽， 或（iv）附加的氨基酸序列融合到此多肽序列 而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来 纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或与 6His标签形成的融合蛋白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领 域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有抗呼吸道合胞病毒融合蛋白 （较佳地 pre-fusion F蛋白）结合活 性的、 包括上述 CDR区的多肽。 该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、 包含 上述 CDR区的多肽的变异形式。 这些变异形式包括（但并不限于）： 一个或多个（通常 为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个）氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个（通常为 20个以内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内）氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基 酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加一 个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能 。该术语还包括本发明抗体的活性片段 和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编 码 DNA杂交的 DNA所 编码的蛋白、 以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或 蛋白。

本发明还提供了其他多肽， 如包含人抗体或其片段的融合蛋白。 除了几乎全长 的多肽外， 本发明还包括了本发明抗体的片段。 通常， 该片段具有本发明抗体的至少 约 50个连续氨基酸， 较佳地至少约 60个连续氨基酸， 更佳地至少约 80个连续氨基 酸， 最佳地至少约 100个连续氨基酸。

在本发明中， “本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗 体的氨基酸序列相比， 有至多 10个， 较佳地至多 8个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3个氨基酸被性质相 似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表 A进行氨基 酸替换而产生。

表 A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融 合蛋白的多核苷酸分子。 本发明 的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、基因组 DNA或人 工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码链。编 码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO. : 8或 9所示的编码区序列相同或者是简 并的变异体。 如本文所用， “简并的变异体”在本发明中是指编码具有与 本发明的多肽 相同的氨基酸序列， 但与 SEQ ID NO. : 8或 9所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括： 只编码成熟多肽的编码序列； 成熟多 肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列 ）以 及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码 此多肽的多核苷酸，也可以是还包括 附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之 间具有至少 50%， 较佳地至少 70%， 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件下与本发明所 述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中， “严格条件”是指： G）在较低离子强度 和较高温度下的杂交和洗脱，如 0.2xSSC, 0.1%SDS, 60 ^° C ;或⑺杂交时加有变性剂， 如 50%（v/v）甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0.1% Ficoll， 42 ^° C等； 或（3）仅在两条序列之间的相同 性至少在 90%以上,更好是 95%以上时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸编码的 多肽与 SEQ ID NO. : 1和 /或 SEQ ID NO. : 2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活 性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常 可以用 PCR扩增法、 重组法或人 工合成的方法获得。 一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有 关序列， 尤其是片 段长度较短时。 通常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片 段。 此外， 还可将重链的编码序列和表达标签（如 6His）融合在一起， 形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是 将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有 关序列。本发明所涉及的生物分子（核酸、蛋 白等）包括以分离的形式存在的生物分子。

目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 蛋白（或其片段， 或其衍生 物）的 DNA序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子（或 如载体）和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列 中。

本发明还涉及包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。 这些载体可以用于转化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞； 或 是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属； 鼠伤寒沙 门氏菌的细菌细胞； 真菌细胞如酵母； 果蝇 S2或 Sf9的昆虫细胞； CHO、 COS7、 293 细胞的动物细胞等。

用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。 当宿主为 原核生物如大肠杆菌时，能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCh 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCh。 如果需要， 转化 也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA转染方法： 磷酸 共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。 根据所 用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞生长的 条件下进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法（如温度转换 或化学诱导）诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的 蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于： 常规 的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分 子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析（HPLC）和其它各种液 相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标 记物（为诊断目的）、治疗剂、 PK（蛋 白激酶）修饰部分或任何以上这些物质的组合 结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于： 荧光或发光标记物、 放射性标记 物、 MRI（磁共振成像）或 CT（电子计算机 X射线断层扫描技术）造影剂、 或能够产生可 检测产物的酶。

可偶联的治疗剂包括但不限于： 胰岛素、 IL-2、 干扰素、 降钙素、 GHRH肽、 肠 肽类似物、 白蛋白、 抗体片段、 细胞因子、 和激素。

此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包 括但不限于： 1. 放射性核素； 2 生物毒； 3. 细胞因子如 IL-2等； 4. 金纳米颗粒 /纳米棒； 5. 病毒颗粒； 6. 脂质体; 7. 纳米磁粒； 8.前药激活酶； 10.化疗剂（例如， 顺铂）或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。 在优选例中， 所述的组合物是药物组合物， 它含 有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白， 以及药学上可接受的载体。 通常， 可将这 些物质配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳地 pH约为 6-8， 尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症� ��有 所变化。 配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给 药， 其中包括（但并不限于）： 口服、 呼吸道、 瘤内、 腹膜内、 静脉内、 或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合呼吸道合 胞病毒的融合蛋白（较佳地 pre-fusion F蛋白）分子， 因而可用于延长药物的半衰期， 此外， 还可同时使用其他治 疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量（如 0.001-99wt%,较佳地 0.01-90wt%， 更佳 地 0.1 -80wt%）的本发明上述的单克隆抗体（或其偶联 物）以及药学上可接受的载体或赋 形剂。 这类载体包括（但并不限于）： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其 组合。 药物制剂应与给药方式相匹配。 本发明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例 如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶 液通过常规方法进行制备。药物组合物 如针剂、 溶液宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 1 微克 /千克体重-约 10毫克 /千克体重。 此外， 本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使 用。

使用药物组合物时， 是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物 ， 其中该安 全有效量通常至少约 10微克 /千克体重，而且在大多数情况下不超过约 8毫克 /千克体 重， 较佳地该剂量是约 10微克 /千克体重-约 1毫克 /千克体重。 当然， 具体剂量还应 考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 检测用途和试剂盒

本发明的抗体可用于检测应用， 例如用于检测样本， 从而提供诊断信息。

本发明中， 所采用的样本（样品）包括细胞、 组织样本和活检标本。 本发明使用的术语 “活检”应包括本领域技术人员已知的所有种 类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括 例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检 制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞 或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体（或 其片段）的试剂盒， 在本发明的一个优选 例中， 所述的试剂盒还包括容器、 使用说明书、 缓冲剂等。 在优选例中， 本发明的抗体可 以固定于检测板。 本发明的主要优点

（1）本发明全人单克隆抗体能够特异性识别� �结合呼吸道合胞病毒的 pre-fusion F 蛋 白， 对呼吸道合胞病毒具有很高的中和活性， 并且可以结合中和 RSV A型和 B型病毒， 有效抑制或阻止呼吸道合胞病毒侵染易感细胞 。

（2）本发明全人单克隆抗体对 RSV A型和 B型病毒具有广谱结合活性和广谱中和活 性，能有效中和多种呼吸道合胞病毒，并且无 论在细胞水平微中和实验还是小鼠预防实验， 均显著优于现在市售的抗体 (如 Palivizumab抗体)。

(3)本发明是全人单克隆抗体 4F1，不含鼠源部分，对人体来说具有更低的免 疫原性和 更高的安全性， 可以避免人抗鼠等其它物种来源的抗体介导免 疫排斥反应。

(4) 本发明全人单克隆抗体 4F1结合 RSV F蛋白融合前形式， 大量研究证实针对 F 蛋白的中和抗体识别位点主要在 pre-fusion F 蛋白上， 4F1抗体表位的发掘也为 RSV疫苗 的设计提供一些新的思路和参考。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和 份数是重量百分比和重量份数。

本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实 验，通常按常规条件进行，或按照原料 /商品制造商建议的条件； 未注明具体来源的试剂， 为市场购买的常规试剂。

以下说明本发明能够中和呼吸道合胞病毒融合 蛋白的中和性全人单克隆抗体制备以 及抗体特性分析过程。 实施例 1 单细胞 RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达

1、 外周血单核细胞 (PBMC)的获得

从健康的志愿者体内抽取外周血， 采用常规 Ficoll-Paque (厂家为 Lympholyte®-H (CEDARLANE)公司)密度梯度离心， 得到 10 ⁷ 以上个外周血单核细胞 (PBMC)。

Ficoll分离方法:

(1)收集血液， 于 50ml 离心管 (预含 4%梓檬酸钠 1ml)， 收集全血 20ml， 颠倒混勾 8-10次。 (即使柠檬酸钠终浓度为 0.4%)；

(2)加等体积 RPMI1640(含柠檬酸钠)， 混匀；

(3)用 15ml透明离心管， 铺 3ml淋巴细胞分离液， 在其上小心加 6ml血样。 形成分 离界面 (或 4ml分离液加 8ml血样)；

(4)室温离心 800g， 20min(2000rpm， 20min)；

(5)小心吸取界面层细胞， 转移至新管；

(6)加 RPMI1640(含柠檬酸钠)， 稀释减小液体密度。 离心， 800g/2000rpm， 10min。 去上清；

(7)RPMI 1640洗细胞 2-3次， 备用

2、 RSV 融合蛋白 F特异性记忆 B细胞的获得

使用 FITC-CD19/APC-IgG/BV421 和 PE -RSV F 蛋白为标志物， BD Horizonä Fixable Viability Stain 780 去掉死细胞， 经流式细胞仪获得特异性 B 细胞至 96 孔 RT-PCR板， 每孔一个细胞， 获得 F蛋白特异性记忆 B细胞。

（1） RSV A2 pre-fusion F 蛋白由哺乳动物细胞 CHO表达系统表达； 参考 Invitrogen ExpiCHO-Sä Expression System 手册； A ² F 蛋白序列参考 UniProtKB/Swiss-Prot: P03420.1， RSV pre-fusion F蛋白的设计根据 Jason S. McLellan. Science 2013采用的策略进 行设计， 在上海捷瑞公司进行全基因合成， 构建到 invitrogen pcDNA3.1的表达载体上。

（2） RSV A2 pre-fusion F蛋白进行生物素（Biotin）标记： No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin （购自 PIERCE, 参考 PIERCE公司 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素标记 Protocol） 10mM试剂； 另两个标志物 FITC-CD19 和 APC-IgG均购自 BD Bioscience 公司； SA Streptavidin PE和 streptavidin BV 421（贝勾自 BD公司） 用来检测生物素标记的 F蛋白；

（3）分选细胞的标记： PBMC细胞分组， 实验组 +对照组， 按细胞数加入标志物， 避光 染色， 进行标记， 用 PBS重悬后， 使用 40 |im BD falcon滤膜过滤；

（4）特异性 B细胞的分选 :使用 BD FACS Influx筛选，根据前向角和侧向角从 PBMC 中筛选到淋巴细胞， 然后通过不同对照组的调节补偿， 获得 RSV F蛋白的特异性记忆 B 细胞，将其分选到 96孔板中进行 RT-PCR（反转录 PCR）,每孔一个细胞，板置于干冰上。

3、 抗体基因获得及载体构建

将获得的单个记忆 B细胞通过 RT-PCR获得 cDNA,然后通过 nested-PCR获得抗 体基因可变区， 跑琼脂糖核酸凝胶， 将重轻链可以配对的胶块回收并测序。 通过 IgBLAST网站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/igblast/）检索获得抗体基因序� ��。 接下来通过 Agel及 Sail酶切位点， Agel及 BsiwI酶切位点， Agel及 Xhol酶切位点 将抗体基因分别连接到相应的 IgH， Ig _K 和 IgX表达载体上。 全人抗体表达载体 IgH， IgK和 Ig 分别表达抗体 heavy链、 kappa链、 lambda链）由 Patrick Wilson实验室馈 赠， 载体序列见 NCBI GenBank:FJ475055、 FJ475056和 FJ517647。

4、 抗体表达和纯化

瞬时转染 CHO 细胞， 进行全人抗体表达。 转染前一天 （第 -1 天）， 分种 ExpiCHO-Sä 细胞， 最终密度为 3 x io ⁶ -4 x 10 ⁶ 个活细胞 /mL， 使细胞过夜生长。 次 日 （第 0 天）， 测定活细胞密度和存活率百分比。 细胞密度应达到约 7 x io ⁶ -10 x io ⁶ 个活细胞 /mL。 存活率应为 95-99%， 方可继续转染。 将细胞稀释至最终密度为 6 x lO ⁶ 个活细胞 /mL。 使用预冷的试剂 （4°C） 配制 Expi Fectamineä CHO/质粒 DNA 复合物。 室温孵育 Expi Fectamineä CHO/质粒 DNA 复合物 1-5 分钟， 然后将溶液 慢慢转移至 CHO细胞培养瓶中， 在添加过程中轻轻晃动培养瓶。 将细胞置于轨道摇 床上 （37°C 培养箱含 8% C0 ₂ 的湿化空气条件下） 培养。 培养 7-1 1天， 待细胞死亡 一半时即可收上清， 开始纯化抗体。

使用 Protein G Agarose 4FF填料 （购自 GE）纯化抗体。 首先将收集的 CHO细胞 悬液 4000rpm,4°C离心 30min， 将收集的上清再用 0.45um filter过滤， 待纯化。 取重 力型离心柱，加入 Protein G Agarose 4FF填料，使用 3倍柱体积的 20%乙醇稳定填料， 之后用 5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子， 然后上样品， 再用 10倍柱体积的结合缓 冲液平衡柱子， 最后用 3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱子， 向洗脱下来的抗体溶液中 加入中和 buffer使洗脱下来的样品 pH达 7.5左右。 将抗体溶液在 5L 1 *PBS中透析 3 次， 即可将抗体浓缩保存至 -80°C。 实验结果：

结果如图 1所示， 使用 FITC-CD19/APC-IgG/BV421和 PE双阳性标记为特异性 标志物，获得了若干个 RSV-F蛋白的特异性 B细胞，约占总记忆 B细胞数量的 0.3% _o 单细胞 RT-PCR和 Nested-PCR法获得匹配抗体重轻链可变区基因， 分子量为 400bp 左右， 电泳图谱见图 2。 琼脂糖割胶回收并进行测序。 将测序结果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast 及 http://www.imgt.org/ 进行比对,获得抗体胚系 基因信息和抗体重轻链基因高可变区信息， 并进行表达载体构建及后续表达纯化。 最 后， 通过该技术， 成功获得一株广谱性中和 RSV A型和 B型病毒的全人单克隆抗体， 命名为 4F1。

全人抗体 4F1重链可变区基因序列如下， 其中使用下划线标注的为重链基因可变区 中的高变区序列， 依次为重链基因 CDR1， CDR2和 CDR3序列。

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCTATTCCTATTCTGTGCACTGGG TCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGATGTTGTATATGATGG AAATCATCAACATTACACGGAGTCCGTGAGGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACA CCTCCACCAATACGGTGTATCTGCAAATGGGCAGCCTGAGGCCTGAAGACACGGCT CTTTATTACTGTACGGCCCGCAGTTTGGTCATAACGCTCGCGGGGGCGGGTCGAGA TGACTATTGGGGCCAGGGAACTCGGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO : 8)

全人抗体 4F1重链可变区氨基酸序列如下， 其中使用下划线标注的依次为重链氨基 酸 CDR1， CDR2， CDR3序列。

EVOLVOSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFSFYSYSVHWVROAPGKGLEWVADVVY DGNHOHYTESVRGRFSISRDTSTNTVYLOMGSLRPEDTALYYCTARSLVITLAGAGRD DYWGOGTRVTVSS (SEQ ID NO : 1)

全人抗体 4F1轻链可变区基因序列如下， 其中下划线标注的为轻链基因可变区中的 高变区序列， 依次为 CDR1'， CDR2'和 CDR3'序列。

GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGAGAGCC

GGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTCCATAGTAATGGATACACTTA

TTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGAAGTCTCCACAACTCCTGATCTTTTTGG

GTTCTAGTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACA GATTTTACACTGGAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTACTACTG CGTGCAAGATCTACAAACTTCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCA AA (SEQ ID NO : 9)

全人抗体 4F1轻链可变区氨基酸序列如下， 其中使用下划线标注的依次为轻链氨基 酸 CDR1'， CDR2'和 CDR3'序列。

DIVMTOSPLSLSVTPGEPASISCKSSOSLLHSNGYTYLDWYLOKPGKSPOLLIFLGS SRASGVPARFSGSGSGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCVODLOTSLTFGGGTKVDIK (SEQ ID NO.: 2) 实施例 2抗体特性分析

1、 ELISA检测抗体结合抗原的活性

为了研究 4F1 抗体结合 RSV A型和 B型病毒 F蛋白的能力， 使用 ELISA检测表达 的抗体是否识别 RSV A2和 B9320 pre-fusion F蛋白及 A2 post-fusion F蛋白。 A2 F蛋白序 列参考 UniProtKB/Swiss-Prot: P03420.1,B9320序列参考 UniProtKB/Swiss-Prot: Q6V2E7, RSV pre-fusion F蛋白的设计根据 Jason S. McLellan. Science 2013采用的策略进行设计， RSV post-fusion F蛋白的设计根据 Davide Corti. Nature 2013 采用的策略进行设计， 在上 海捷瑞公司进行全基因合成， 构建到 invitrogen pcDNA3.1的表达载体上。 由哺乳动物细 胞 CHO表达系统表达； 参考 Invitrogen ExpiCHO-S™ Expression System手册。 帕利珠单 抗 (Palivizumab， SYNAGIS®)为阳性对照抗体， 购自雅培公司。 包被 F蛋白 ELISA板， 0. 5 /mL，每孔 100 pL， 4。(:过夜。次日 PBST洗板 3 次。 2% BSA封闭，每孔 200 pL， 37 ^° C, 2 h _o 再次 PBST洗板 3 次。 4F1及对照抗体测试 12个浓度， 3倍梯度稀释， 2复 孔， 起始测试浓度为 30 /ml。 上样， 每孔 100 ， 37 ^° C， 2 h。 PBST洗板 3 次。 羊 抗人 IgG (Goat Anti-Human IgG) (Fc specific)- Peroxidase antibody (sigma)， 1 :5000 稀释， 每孔 100 ， 37 ^° C， 1 h _o PBST 洗板 3 次。 加底物 TMB 100 ^L /孔显色， 若颜色较浅 可 37 ^° C避光反应 15 min。 加入 2M H ₂ S0 ₄ 终止反应， 每孔 50 。 测定 OD ₄₅ o, 并进行 数据处理。 帕利珠单抗 (Palivizumab)简称 PVZ 用来作为阳性对照抗体， 抗无关病毒的全 人抗体作为阴性同型对照抗体 (NC)。

结果如图 3所示， 4F1抗体可以广谱性的结合 RSV A型和 B型病毒的 pre-fusion F蛋 白， 与阳性对照抗体结合能力相当。 4F1不结合 A型 post-fusion F 蛋白， 帕利珠单抗被 报道能结合两种形式的 F蛋白。结果表明， 4F1抗体能广谱结合 RSV A型和 B型 pre-fusion F 形式， 并且 4F1抗体和帕利珠单抗结合 F蛋白上两种不同的表位。

2、 病毒 TCID _5Q 测定

使用 TCID ₅ o实验核实 RSV微中和实验中稀释病毒液的滴度。将 200 _|i l稀释病毒 液加入 96孔细胞板 B2-D2孔内， 其它孔内加入 100 _|i l细胞培养液。从 B2-D2孔内吸 取 100 _|i l病毒液加入 B3-D3孔内， 混匀后并依次做 2倍梯度稀释， 病毒共稀释 18个 浓度点， 3复孔。 随后测试板于 37 °C、 5% C0 ₂ 培养箱中孵育 2个小时。 HEp2细胞 以每孔 25,000个细胞的密度接种到测试板中并于 37 °C、 5% C0 ₂ 培养箱中培养 5天。

培养 5天后， 弃去上清， 用 80%丙酮固定测试板中细胞。 使用 ELISA检测细胞 内的病毒含量。 原始数据用于病毒 TCID _5Q 计算（Karber法）。 计算公式如下：

TCID ₅ o/fL= Antilog 10 U阳性孔数量 / 3） - 0.5} x 0.3 ]/2

阳性孔判定标准: 测试孔读值 ＞（培养液对照平均值 + 3 培养液对照 SD值）

QC标准： 稀释病毒液的滴度应为 50 - 2000 TCIDW孔。

3、 病毒微中和实验

为了研究 4F1抗体中和 RSV 病毒的能力及广谱性， 将梯度稀释的 4F1抗体与不 同的病毒孵育， 通过微中和实验检测 4F1 抗体中和病毒的能力。 测试病毒株 A2 和 B9320（购自 ATCC）分别用细胞培养液稀释到 4000 TCIDWml。倍比稀释的抗体和 200 TCIDW孔的病毒以等体积比加入 96孔细胞培养板内， 混匀后于 37 °C、 5% C0 ₂ 培养 箱中孵育 2个小时。随后 HEp2细胞以每孔 25,000个细胞的密度接种到测试板中并于 37 °C、 5% C0 ₂ 培养箱中培养 5天。 抗体均测试 9个浓度， 3倍梯度稀释， 3复孔， 起始测试浓度为 4000 ng/ml _o

培养 5天后， 弃去上清， 用 80%丙酮固定测试板中细胞。 使用 ELISA检测细胞 内的病毒含量。 原始数据用于抗体在不同浓度下的中和活性计 算。 计算公式如下： 活性百分比（％） =（测试孔读值 - 病毒对照平均值）/（细胞对照平均值 - 病毒对照 平均值）乂 100

EC5 _Q 值通过 Prism软件计算， 中和活性曲线拟合方法为 sigmoidal dose-response （variable slope）。

结果如图 4和表 1所示。 4F 1抗体和对照抗体帕利珠单抗 Palivizumab对 RSV病 毒株的抗体中和活性剂量拟合曲线见图 4。 帕利珠单抗对 RSV A2和 B9320均显示出 中和活性， 其 IC _5Q 值分别为 384.3 ng/ml和 367.2 ng/ml。 4F 1对 RSV A2和 B9320的 ICso值分别为 4.368 ng/ml和 23.51 ng/ml。 4F 1抗体对 RSV A2和 B9320的中和活性 均优于帕利珠单抗， IC _5Q 低近 80-100倍。 阴性抗体 NC在测试浓度内没有显示出对测 试病毒株的中和活性， 其 ICso值大于最高检测浓度 4000 ng/ml（见表 1）。

_ 表 1 抗体 ICso值 _

抗体 ECso值（ng/ml） RSV A2 RSV B9320

帕利珠单抗 Palivizumab 384.3 367.2

4F1抗体 4.368 23.51 NC抗体 >4000 >4000 4、 4F1抗体在动物预防效果检测

本实施例检测了本发明的抗体 4F1和 Palivizumab预防小鼠感染 RSV的能力。 6-8 周龄的 BalB/c雌鼠提前放置到生物安全二级实验室动物 实验房。 dayO天小鼠分别腹 腔注射 15mg/kg， 3 mg/kg, 0.6mg/kg， 0.12mg/kg的 4F1抗体、 Palivizumab及 PBS。 24h后， 用乙醚麻醉小鼠， 对小鼠经鼻腔攻击 RSV A2 病毒（10 ⁷ PFU/50ul/小鼠）。 五 天后处死动物采集肺。 从每只小鼠去除左肺并且用 4%的多聚甲醛固定， 用石蜡包埋 并用常规苏木素 -伊红（HE）染色， 光镜观察肺部病理损伤和炎性细胞浸润情况。 取每 只小鼠右边肺组织进行组织匀浆，用 EZ-press RNA Purification Kit 进行总 RNA抽提， 然后反转成 cDNA, 用实时定量 RT-PCR的方法对 RSV的基因组进行相对定量，比对 编码 RSV的 NP蛋白的基因序列， 选取保守片段进行引物设计， 小鼠的 P actin作为 内参基因 （见表 2）。 参考 Toyobo KOD SYBR ^® qPCR Mix 使用手册。

表 2 实时定量 RT-PCR 引物

结果如图 5所示， 与 PBS组相比， 不同剂量的 4F1和帕利珠单抗均能有效地降 低肺部病毒的 RNA水平。 相比帕利珠单抗， 4F1抗体对肺部病毒载量的降低更为明 显。 0.12mg/kg 给药剂量的 4F1 比 15mg/kg给药剂量的帕利珠单抗对 RSV病毒的抑 制效果明显。

结果如图 6所示。 相对于 PBS对照组， 肺组织病理学的结果显示 4F1抗体在高 剂量和低剂量组能显著地降低小鼠肺部的病理 损伤情况，包括减少肺间质和支气管周 围炎性细胞浸润情况， 维持肺泡的正常形态结构， 减少出血点等指标。 而帕利珠单抗 只有在高剂量组 15mg/kg起到较明显的保护作用。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式 同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。