Die D-Vitamine oder Calciferole entstehen aus ihren Provitaminen durch eine Sonnenlicht- katalysierte Spaltung des B-Rings im Sterangerüst. Ihre wichtigsten Vertreter sind Vitamin-D3 (Cholecalciferol) und Vitamin-D2 (Ergocalciferol), welche sich nur in den Seitenketten geringfügig unterscheiden, die aber-soweit bekannt-gleich metabolisiert werden und identische biologische Wirkungen besitzen. Während Provitamin-D2 mit der Nahrung aufgenommen werden muss, kann das Provitamin-D3 im menschlichen Organismus gebildet werden. Soweit durch Indizes nicht näher bezeichnet, umfasst die Bezeichnung Vitamin-D nachstehend allgemein alle Vitamin-D-Fonnen. In der Haut gebildetes oder mit der Nahrung aufgenommenes Vitamin-D wird im Plasma vom Vitamin-D-Bindungs-oder-Transportprotein (DBP) gebunden, zur Leber transportiert und dort zu 25-Hydroxyvitamin-D (25-OH-D) metabolisiert. Das Vitamin-D-bindende Protein DBP ist auch als Gc-Globulin oder group specific component bekannt (J. G. Haddad in J. Steroid Biochem. Molec.

Biol. (1995) 53,579-582). Über 95% des im Serum messbaren 25-Hydroxyvitamin-D ist in der Regel 25-Hydroxyvitamin-D3.25-Hydroxyvitamin-D2 wird nur in höheren Anteilen gefunden, wenn die Person unter einer Medikation mit Vitamine steht oder, wie in den Vereinigten Staaten häufig praktiziert, die Nahrung mit Vitamin-D2 angereichert wird.

25-Hydroxyvitamin-D ist der vorherrschende Vitamin-D-Metabolit im Blutkreislauf und seine Konzentration im Serum beschreibt allgemein den Vitamin-D-Status, d. h., inwieweit dem Organismus Vitamin-D zur Verfügung steht. 25-Hydroxyvitamin-D wird bei Bedarf in der Niere zu la, 25-Dihydroxyvitamin-D metabolisiert, einer honnonartigen Substanz mit hoher biologischer Wirkung. Die Bestimmung von la, 25-Dihydroxyvitamin-D gibt an, wieviel Vitamin-D sich in der aktivierten Form befinden.

Die Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin-D in einer Probe erfolgt bevorzugt nach dem Prinzip der kompetitive Proteinbindungsanalyse, wobei anhand der Verdrängung von radioaktivem 25-Hydroxyvitamin-D von den Bindungsstellen eines Vitamin-D-bindenden Proteins das in der Probe vorhandene 25-Hydroxyvitamin-D quantifiziert wird. Daneben haben sich seit einigen Jahren Radioimmunoassays mit 1'S1-markierten Vitamin-D-Derivaten und Antikörpern gegen Vitamin-D- Derivate in der Diagnostik etabliert. Die Angaben zum üblichen 25-Hydroxyvitamin-D-Spiegel im Serum schwanken je nach Labor. Es besteht aber Einigkeit dahin, dass die Konzentration von 25- Hydroxyvitamin-D im Serum in der Regel größer als 5 ng/ml und kleiner als 80 ng/ml ist. Die kompetitive Proteinbindungsanalyse verlangt den Einsatz eines radioaktiven Vitamin-D-Derivats, welches das gleiche Proteinbindungsverhalten besitzen muss wie 25-Hydroxyvitamin-D. Ähnliches gilt auch für die kompetitive Bindungsanalyse für das biologisch aktive la, 25-Dihydroxyvitamin-D oder andere Vitamin-D-Metaboliten.

Die europäischen Patentschriften 0 312 360 und 0 363 211 sowie Tanabe et al. in J. Chem.

Soc., Chem. Commun. 1989,1220-1221 und J. Nutri. Sci. Vitaminol., 1991,37,139-147 offenbaren verschiedene'lod-markierte Hydroxy-und Dihydroxyvitamin-D-Derivate und deren Verwendung in Bindungsanalysen. Nachteilig an diesen Derivaten ist, dass sie problematisch herzustellen und extrem labil sind. Licht, radioaktive Strahlung, Protonen. Wasserstoff, Enzyme, freie Radiale oder die Gegenwart von lod in freier oder gebundener Fonn haben großen Einfluss auf die Raumstruktur und die Bindeeigenschaften der Vitamin-D-Derivate an Vitamin-D-bindendes Protein DBP oder spezifischen Antikörpern. Sie können vor allem eine Drehung des A-Rings im Sterangerüst verur- <BR> <BR> <BR> sachen oder katalysieren. Die 3i-Hydroxygruppe des Vitamin-D-Moleküls wird dabei in die Pseudo-la-Position gedreht, so dass dann das 5,6-trans-Vitamin-D vorliegt. Die sogenannten Pseudo-la-Hydrox-AIlalogell des Vitamin-D werden zwar ähnlich wie Vitamin-D metabolisiert, sie haben aber eine in wesentlichen Punkten andere Struktur und werden von Vitamin-D-bindenden Proteinen wie bspw. DBP/Gc-Globulin oder Anti-Vitamin-D-Antikörper nicht oder deutlich schlechter gebunden.

Vitamin-D3 5,6-trans-Vitamin-D 3 pseudo-1a-Hydroxy-Analog Die vorstehend beschriebene Um) agerung ist als Beispiel zu verstehen. Es treten auch andere chemische Reaktionen und Umfaserungen auf. Gleiches gilt fiir'H-oder"C-markierte Vitamin-D- Derivate. Auch diese Vitamin-D-Derivate sind nicht so stabil, dass sie eine zuverlässige Bindungsanalyse eriauben. Die radioaktive Markierung steigert zudem die Kosten für Lagerung, Transport und Entsorgung und ist allgemein nachteilig für Gesundheit und Umwelt. Ferner ist die <BR> <BR> Halbwertszeit von''lod vergleichsweise kurz. Eine kompetitive Bindungsanalyse mit'H-und'qC- markierten Vitamin-D-Derivaten hingegen verlangt besondere Szintillationszähler und ist apparativ anspruchsvoller, bei weitgehend gleichen Problemen.

Ray et al. in Biochemistry, 1991,30,4809-4813 offenbaren die Kopplung von Vitamin-D3 mit verschiedenen farbgebenden Gruppen. Die Nachweisempfindlichkeit für die farbstoffinarkierten Vitamin-DR-Derivate ist aber zu gering, als dass man sie in einer kompetitiven Bindungsanalyse für natürliche Vitamin-D-Metabolite einsetzen könnte, abgesehen davon, dass die farbstoffmarkierten Derivate in Serum nicht stabil und zudem besonders lichtempfindlich sind Es ist Aufgabe der Erfindung, Vitamin-D-Derivate zur Verfügung zu stellen, die in einer kompetitiven Bindungsanatyse oder ganz generell in Immunoassays von Vitamin-D-Metaboliten wie 25-Hydroxy-und 1.25-Dihydroxy-Vitamin-D eingesetzt werden können. Dies setzt folgende Eigen-

schaften voraus, erstens. dass für die Vitamin-D-Derivate eine Nachweisempfindlichkeit besteht, welche höher ist. beziehungsweise h1 einem niedrigeren Konzentrationsbereicll liegt, als die Kon- zentration der gesuchten Vitamin-D-Metabolite in den Proben ; zweitens, dass die Derivate in Serum, Plasma oder Urin unter üblichen protischen Bedingungen und gegenüber Serumenzymen stabil sind ; und schließlich drittens, dass die Derivate über Wochen und Monate hinreichend licht-und laeerstabil sind. Diese Aufgabe wird gelost durch Vitamin-D-Derivate der Fonnel worin ist : O das Sauerstoffatom einer Ethersruppe ; X eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffstoffgruppe von 0,8 bis 4,2 nm Länge, bevorzugt ein C8-bis C12-Gruppe, die übliche Heteroatome wie S, O, N oder P aufweisen kann, ganz besonders bevorzugt eine Hexamido-, Octamido-oder Decamido- <BR> <BR> <BR> Amidopropylether-Linkergruppe ;<BR> <BR> <BR> <BR> Y Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe.

A eine funktionelle Gruppe, die von einem bindenden Protein wie einem Antikörper oder Vitamin-D-bindendes Protein DBP mit hoher Affinität gebunden wird ; R die Seitengruppe eines Vitamin-D-Metabolits, bevorzugt die Seitengruppe von Vitamin-D, oder D, besonders bevorzugt die 25-hydroxylierte Seitengruppe von Vitamin-D, oder D3.

Eine hohe Affinität liegt vor. wenn die Dissoziationskonstante (K) zwischen dem bindenden Protein, z. B. dem Antikörper oder DBP, und dem Antigen bzw. der funktionelle Gruppe A größer 108 ist. Eine Dissoziationskonstante größer 1016 ist finir viele Anwendungen vorteilhaft. In einer bevorzugten Ausführungsform ist A ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Tyrosin, substituiertem Tyrosin, substituierten Aminosäuren. charakteristischen Aminosäure-und Peptidsequenzen, FITC, Proteinen und Proteingruppen wie Protein A und Protein G oder einem weiteren Vitamin-D-Derivat, ganz besonders bevorzugt 25-Hydroxyvitamin-D.

Die Abstandsgruppe X ist bevorzugt ausgewählt aus substituierten und unsubstituierten C- Körpern mit 0,8 bis 4,2 nm, bevorzugt etwa 0,12 nm Länge. Besonders bevorzugt ist eine Aminocarbonsäure, insbesondere eine Aminoundecansäure, peptidische und Ketogruppe oder ein substituierter oder unsubstituierter Aminopolyetherrest mit einer Länge von 0,8 bis 4,2 nm, bevorzugt etwa 0,9 bis 1,5 nm. Dieser Abstand zwischen der Gruppe A und der Bindungs-bzw.

Erkennungsstelle für den Vitamin-D-Rest ist erforderlich, dass die bindenden Proteine an die

jeweiligen Bindungsstellen binden können und dabei sich nicht gegenseitig stören. Zu beachten ist, dass beispielsweise für das Vitamin-D-bindende Protein DBP (Gc-Globlin) die 19-Methylengruppe, gegebenenfalls die 1-Hydroxygruppe des A-Rings und die Vitamin-D-Seitenkette zur Erkennungs- stelle gehören und in einer Bindungstasche aufgenommen werden. Ähnliches gilt auch für spezifische Antikörper gegen die verschiedenen Vitamin-D-Derivate. Ist die Abstandsgruppe X zu kurz, kann neben dem Vitamin-D-bindenden Protein kein weiteres Bindungsprotein an der gewählten funktionellen Gruppe A binden. Für das bevorzugte Beispiel heißt das, wenn sich die funktionelle Biotin-Gruppe innerhalb der Bindungstasche des Vitamin-D-bindenden Proteins befindet, ist sie für das zweite Bindungsprotein, zum Beispiel das Streptavidin, nicht mehr zugänglich. Ist die Abstandsgruppe X hingegen zu lang, können Molekülfaltungen auftreten, welche gleichfalls die gleichzeitig Bindung zweier Bindungspartner behindern.

Daneben besitzt die erfindungsgemäl3e Abstandsgruppe überraschenderweise einen sterischen Effekt. als sie offenbar eine 180°-Drehung des A-Rings aktiv verhindern hilft. Es wird vermutet, ohne an diese Theorie gebunden zu sein, dass das 3ß-Sauerstoffatom der Ethergruppe am A-Rings entsprechend einer natürlichen Hydroxygruppe hydratisiert ist und so einen Angriff auf die 5,6-Doppelbinduna verhindert, abgesehen von anderen elektronischen und sterischen Effekten. Ein anderer wichtiger Aspekt ist, dass die erfindungsgemäße Ethergruppe von den im Serum oder Plasma stets vorhandenen Esterasen nicht gespalten werden kann.

Ganz besonders bevorzugt ist 25-Hydroxyvitamin-D3-3ß-3 [6-N-(biotinyl) hexamido] amido- propylether der Formel II und die la-Hydroxy-und Vitamin-D2-Analogen.

Weiterhin bevorzugt sind Derivate, die als zweite funktionelle Gruppe einen Vitamin-D- Rest enthalten. Der Vorteil dieser Derivate ist, dass sie keine systemfremden Gruppen und Verbin- dungen enthalten und so eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der kompetitiven Bindungsanalyse erlauben, auch weil sich eventuelle Bindungsbesonderheiten aus erster und zweiter Bindung des Vitamin-D-bindenden Proteins bei einer quantitativen Bestimmung kompensieren.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der nachstehenden Formel III :

worin R, Y und X wie in oben in Formel I definiert sind. Besonders günstig sind dabei symmetrische Vitamin-D-Derivate.

Die erfindullgsgemäßell 25-Hydroxy-und 1a, 25-Dihydroxy-Vitamin-D-Derivate sind über- raschend licht-. lager-und serumstabil und erlauben in allen kompetitiven immundiagnostischen Verfahren eine empfindliche, zuverlässige quantitative Bestimmung von Vitamin-D-Metaboliten wie 25-Hydroxy-und la. 25-Dihydroxy-Vitamin-D, beispielsweise für die Routinediagnostik im Human-und Veterinärmedizinbereich sowie in der Forschung.

Erfindunsssemäß wird die Verbindung der Formel I erhalten durch ein Verfahren, umfassend die Schritte : a) Cyanoethylierung der 3-Hydroxygruppe von Vitamin-D oder 25- Hydroxyvitamin-D mit Acrylnitril in einem geeigneten Lösungsmittel wie Acetonitril in Gegenwart von Kaliumhydrid und tert.-Butanol ; b) Reduktion der resultierenden Nitrilgruppe mit einem Gemisch aus Lithiumhydrid und Lithiumaluminiumhydrid zu einem Amin ; und c) Anhängen einer Abstandsgruppe. aegebenenfalls zusammen mit einer funktiooellen Gruppe A an das Amin, bspw.

Biotinylieren der Verbindung mit einem aktivierten Biotinylierungsreagenz wie LC-BHNS oder, zum Erhalt eines Vitamin-D-Derivats gemäß Formel 111, Kopplung von zwei Amino-Vitamin-D- Gruppen durch Kondensation mit einer Dicarbonsäure wie Sebacinsäure mittels Carbodiimid.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung funktioneller Vitamin-D-Derivate ergibt höhere Ausbeuten bei kürzeren Reaktionszeiten. Anders als in herkömmlichen Verfahren erfolgt nämtich in Schritt a) die Cyanoethylierung der 3-Hydroxygruppe in Gegenwart von Kaliumhydrid und tert.-Butanol. Dadurch wird erreicht, dass nur an der 3-Hydroxy-Gruppe von Vitamin-D eine Cyanoethylieruna erfolgt und die andere Hydroxygruppen des Vitamin-D vor einer Umsetzung geschützt sind. Die Umsetzung erfolgt bei 0 bis 20°C, bevorzugt bei 5 bis 8°C in einem neutralen Lösungsmittel wie Acetonitril.

Bei der nachfolgenden Reduktion wird die Nitrilgruppe des Cvanoethylethers quantitativ in das Amin überfuhrt. welches dann vergleichsweise einfach mit einer anderen funktionellen Gruppe verknüpft werden kann, zum Beispiel durch Umsetzung mit einem handelsiiblichen Biotinylie- rungsreagenz.

Die Erfindung umfasst zudem die Verwendung der erfindungsgemäßen funktionellen Vitamin-D-Derivate in Verfahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy-und la, 25-Dihydroxy- Vitamin-D in Serum, Plasma, Urin oder einer anderen Probe. Hierbei wird das erfmdungsgemäße funktionelle Vitamin-D-Konjugat entweder als Zwischenglied eingesetzt, wobei das Vitamin-D- bindende Protein und nativer Vitamin-D-Metabolit um die Bindestelle kompetitieren, oder selbst als kompetitive Bindungskomponente zu nativem Vitamin-D. Das quantitative Bestimmungsverfahren ist vorzugsweise ein EIA, ELISA, RIA, IRMA, LiA oder ILMA, FIA oder IFMA in manuell abzuarbeitenden Testsystemen oder auf Automaten angepasste Versionen in Flüssigphasen-wie Festphasentechnik.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy-und I a, 25- Dihydroxy-Vitamin-D-Derivaten umfasst die Schritte : a) Beschichten eines Trägers mit Strep-

tavidin, b) Zugabe ein oder mehrerer multifunktioneller Biotin-Vitamin-D-Derivate. c) Zugabe der Probe und einer definierten Menge Vitamin-D-bindendes Protein, d) Bestimmung des gebundenen Bindungsproteins mit markierten anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörpern. Die Markierung der anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörper kann direkt sein, bspw. eine radioaktive Markierung, oder auch indirekt, bspw. ein Enzym oder ein aktives Enzymfragment wie Peroxidase, das eine Farbreaktion zu katalysieren vennag.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy-und la, 25- Dihydroxy-Vitamin-D-Derivaten umfasst die Schritte : a) Beschichten eines Trägers mit anti- Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörpern. b) Zugabe des Vitamin-D-Bindungsproteins, c) Zugabe der Probe sowie eine definierte Menge Biotin-Vitamin-D-Derivat, d) Bestimmung der Menge gebundenes Derivat mit markiertem Streptavidin. Das Streptavidin ist bevorzugt indirekt mit Peroxidase markiert ; der Träger ist vorzugsweise eine Reaktionsgefäßwand, beispielsweise von einer Mikrotiterplatte, oder Teilchen aus polymerem oder magnetischem Material oder beidem, beispielsweise Kunststoff-oder Celluiose-Mikropartikel.

Diese Verfahren ermöglichen eine nicht-radioaktive quantitative Bestimmungen von 25- Hydroxy-und 1, 25-Dihydroxy-Vitamin-D, ohne dass aufwendige Sicherheitsvorkehrungen erforderlich sind. Die hier vorgeschlagenen kompetitiven Verfahren sind somit für Routineunter- suchungen im Rahmen einer Osteoporose-Prophylaxe, bei einer vermuteten D-Hypovitaminose oder D-Hypervitaminose, zur Diagnostik allgemeiner Art und in der Forschung.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zur Bestimmung von Vitamin-D-Metaboliten wie 25-Hydroxy-und 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D, der unter anderem das erfindungsgemäße funk- tionelle Vitamin-D-Derivat enthält. Der Kit umfasst wahlfrei Vitamin-D-Bindungsprotein (Gc- Globulin), anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörper, Streptavidin und vorbehandelte oder unvorbehandelte Mikrotiterplatten und/oder maanetische oder andere Mikropartikel und andere Reagenzien.

Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den beiliegenden Zeichnungen. Es zeigt : Fig. 1 den schematischen Syntheseweg fur das bifunktionelle Vitamin-D-Derivat 25-Hydroxy Vitamin-D3-3 ß-3' [6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropylether) gemäß der Erfindung ; Figs. 2,3 und 4 Schemadarstellullgell verschiedener ELISAs zur Bestimmung von 25-OH-Vitamin- D mit Hilfe des erfindungsgemäßen 25-OH-Vitamin-D-Konjugat ; Fig. 5A die Eichkurve eines kompetitiven ELISAs für 25-OH-Vitamin-D nach Fig. 2 ; Fig. 5B Eichkurven von ELISAs gemäß Fig. 5A mit 3,60 und 100 Tage altem 25-OH-Vitamin-D- Biotin-Tracer ; Fig. 5C die Eichkurve eines kompetitiven ELISAs für 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D analog Fig. 2 ; Figs. 6 und 7 Schemadarstellungen kompetitiver RIA für 25-OH-Vitamin-D mit Hilfe des erfindungsgemäßen 25-OH-Vitamin-D-Konjugats ;

Figs. 8,9 und 10 Schemadarstellungen kompetitiver, radioaktiver IRMAs für 25-OH-Vitamin-D mit Hilfe des erfindungsgema (3en 25-OH-Vitamin-D-Konjugats ; Figs. 11 und 12 Schemadarstellungen kompetitiver ELISAs unter Verwendung von Mikropartikein ; Fig. 13 Schemadarstellung eines kompetitiven Bindunasassays für 25-OH-Vitamin-D mit Hilfe eines 25-OH-Vitamin-D-Konjugats gemäß der Erfindung und einem direktmarkierten Vitamin-D-bindenden Protein.

Fig. 14 ein Blockdiagramm des Vergleichs der 1, 25-Dihydroxy-Vitamin-D-Gehalte in Seren von Dialyse-und Normalpatienten.

Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Syntheseweg zur Herstellung des bifunktionellen 25- OH-Vitamin-D-Konjugats. Zunächst wird 25-OH-Vitamin-D in einem Gemisch aus Acetonitril, Kaliumhydrid und tert.-Butanol mit Acryinitril cyanoethyliert. Durch die Gegenwart des als Base fungierenden Kaliumhydrids und durch die Anwesenheit von tert.-Butanol zur Abwendung unspezi- fischer Reaktionen an der 25-Hydroxygruppe wird erreicht, dass selektiv die 3-Hydroxy-Gruppe des Vitamin-D cyanoethyliert wird. Die Ausbeute an 25-OH-Vitamin-D-3ß-cyanoethylether betragt in der Regel etwa 74% bei einer Reaktionsdauer von 40 Minuten.

Nach üblicher Aufarbeitung wird der 25-OH-Vitamin-D-3ß-cyanoethylether mit Lithium- hydrid versetzt und die 25-Hydroxygruppe in das Lithiuma) kohotat überfuhrt. Es folgt eine Reduktion des Nitrils mit LiAIH4 zu 25-OH-Vitamin-D-3ß-3'-aminopropylether. Dieser Schritt ist quantitativ, ohne dass Nebenprodukte auftreten. Zuletzt erfolgt gegebenenfalls eine Biotinylierung mit einem aktivierten Biotinylierungsreagenz wie LC-BHNS (Biotinyl-N-e-aminocaproyl-hydroxy- succinimidester). Die resultierende Abstandsgruppe X hat entsprechend der Aminocaproylkette eine Länge von etwa 0.8 bis 0.9 nm.

25-OH-Vitamin-D-3, [6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropylether ist temperaturstabil und kann in einer wässrigen, leicht sauren Matrix über mehrere Monate gelagert werden. Da die <BR> <BR> <BR> Verbindung von Serumenzymen nicht gespalten wird, eignet sie sich bestens für diagnostische Routinetests in Serum, Plasma und Urin.

Fig. 2 zeigt eine Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA für 25-OH-Vitamin-D. Hier- bei wird das 25-OH-Vitamin-D-Konjugat (25-OH-Vitamin-D-3ß-3'[6-N-(biotinyl) hexamido] amido- propylether) über Streptavidin an eine feste Phase gebunden. Dann erfolgt in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von Vitamin-D-bindenden Protein und 25-OH-Vitamin-D aus Standard oder Probe an das 25-OH-Vitamin-D-Konjugat. Der Nachweis erfolgt durch Peroxidase-markierte Anti- körper gegen das Vitamin-D-bindende Protein. Der Fachmann weiß, dass auch andere Marker- enzyme verwendet werden können, zum Beispiel alkalische Phosphatase oder Galaktosidase, etc.

Fig. 3 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven, nicht-radioaktiven ELISA, wobei das Vitamin-D-bindende Protein zunächst über anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörper an die feste Phase gebunden wird. Danach erfolgt in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von 25-OH- Vitamin-D-Biotin und 25-OH-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe. Zur Bestimmung wird dann

Peroxidase-markiertes Streptavidin eingesetzt. Das gezeigte Prinzip lässt sich selbstverständlich auf andere Tracer-Gruppen statt Biotin und auf andere Markerenzyme, wie oben angegeben, übertragen.

Fig. 4 zeigt die Schemadarstellullg eines kompetitiven ELISA, wobei das Vitamin-D- bindende Protein direkt an die feste Phase gebunden ist. Die kompetitive Bindung von 25-OH- Vitamill-D3-Biotin und 25-OH-Vitamin-D3 aus Standard bzw. Probe erfolgt in flüssiger Phase und Peroxidase-markiertes Streptavidin wird zur quantitativen Bestimmung eingesetzt.

Fig. 5A-C zeigen die typische Eichkurven von kompetitiven ELISAs mit 25-OH-bzw 1,25- Dihydroxy-Vitamin-D3-Biotin gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Prinzip. Die Menge an gebundenem Vitamin-D-Bindungsprotein wurde bestimmt durch eine standardisierte Farbreaktion mit Peroxidase-gekoppelten anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörpern und Tetramethylbenzidin (TMB) ais Substrat. Alternative Substrate wären beispielsweise OPD (1. 2-Phenyldiamin x 2 HCI), ABTS und andere. Für die Eichkurve wurden Vitamin-D-Proben mit Konzentrationen von 0,8,20, 50,125 und 312 nMol/I eingesetzt. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm ; die Abszisse die Konzentration an 25-OH-bzw. 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D in nMol/l.

Fig. 6 zeigt die Schemadarstellun eines kompetitiven Protein-Bindungsversucl (CPBA), wobei 25-OH-Vitamin-D3-Biotin und 25-OH-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe in flüssiger Phase um die Bindungsstelle des Vitamin-D-Bindungsproteins kompetitieren. Es wird 1''-I-markiertes Streptavidin für die quantitative Bestimmung verwendet.

Fig. 7 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven Radioimmunoassays (RIA), wobei 25-OH-Vitamin-D-Biotin und 25-OH-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe in flüssiger Phase um die Bindullgsstelle eines anti-Vitamin-D-Antikörpers kompetitieren. Für die quantitative Bestimmung wird 125I-markiertes Streptavidin eingesetzt. Erfolgt die Bestimmung durch ein Streptavidin, das nicht radioaktiv, sondern mit einem Fluorophor oder Luminophor markiert ist, liegen sogenannte LIA-oder FIA-Assays vor.

Fig. 8 zeigt die Schemadarstellung eines 25-OH-Vitamin-D-IRMA. Es wird zunächst 25- OH-Vitamin-D-Biotin über Streptavidin an die feste Phase gebunden. Die kompetitive Bindung von Vitamin-D-Bindungsprotein an das Konjugat und 25-OH-Vitamin-D aus Standard oder Probe erfolgt dann in flüssiger Phase. Die Menge des Konjugat-gebundenen Bindungsproteins wird mit 51-markierten Antikörpern bestimmt.

Fig. 9 ist die Schemadarstellung einer IRMA-Sandwich-Technik (Immunoradiometrischer Assay). Hierzu werden anti-Vitamin-D3-Antikörper an die feste Phase gekoppelt. An diese binden dann Vitamin-D-Bindungsproteine. Die Kompetition erfolgt im nächsten Schritt zwischen dem 25- OH-Vitamin-D-Konjugat und 25-OH-Vitamin-D aus Standard oder Probe. Die Bestimmung der Menge gebundenes Konjugat erfolgt durch 1251-markiertes Streptavidin.

Fig. 10 zeigt die Schemadarstellung eines weiteren IRMA-Sandwich-Technik. Es wird zunächst Vitamin-D3-Bindungsprotein an die feste Phase gekoppelt. Dann erfolgt daran die kompetitive Bindung zwischen dem 25-OH-Vitamin-D3-Konjugat und 25-OH-Vitamin-D3 aus

Standard oder Probe. Die Menge gebundenes Konjugat xvird durch'251-markiertes Streptavidin bestimmt.

Fig. 11 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA unter Verwendung von Mikropartikeln. Hierbei wird 25-OH-Vitamin-D-Biotin über Streptavidin an Mikropartikel gebun- <BR> <BR> <BR> den. Dann wird 25-OH-Vitamin-D-Derivat daran gebunden. In flüssiger Phase wird Vitamin-D- Bindungsprotein und die jeweiiige Probe zugegeben. Bindunasproteine und 25-OH-Vitamin-D aus Standard oder Probe kompetitieren um die Bindungsstelle des Konjugats. Die gebundenen Bestand- teile werden dadurch abgetrennt, dass sie über die Mikropartikel von einem Magneten zurück- gehalten werden, während der Überstand mit den ungebundenen Substanzen entfernt wird. Die Menge gekoppeltes Bindungsprotein wird bestimmt in einem zweistufigen Verfahren mit einem primären Antikörper gegen Vitamin-D-Bindungsprotein und einem sekundären Peroxidase- markierten Antikörper.

Fig. 12 zeigt eine Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA unter Verwendung von Mikropartikein. Es wird 25-OH-Vitamin-D-Biotin über Streptavidin an Mikropartikel gebunden.

Dann wird die flüssige Probe mit 25-OH-Vitamin-D3 (aus Standard oder Probe) dazugegeben sowie eine nicht-sättigende Menge Antikörper. Das Konjugat und das native Vitamin-D3 kompetitieren um die Bindung des Antikörpers. Die Menge gebundener Antikörper erfolgt durch Agglutination der Mikropartikel. Diese kann beispielsweise direkt durch Nephelometrie bzw. Turbimetrie bestimmt werden.

Fig. 13 zeigt das Schema eines kompetitiven Bindungsassays, wobei das Vitamin-D- bindende Protein direkt markiert ist. beispielsweise radioaktiv mit'rSIod, oder für eine Elektro- chemolumineszenz mit Ruthenium (II) tris- (bipyridin)-NHS-ester. Die Markierung können auch Enzyme sein wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, SGalactosidase u. a., oder auch FITC.

Fig. 14 veranschaulicht in einem Blockdiagramm die unterschiedlichen 1.25-Dihydroxy- Vitamin-D-Gehalte im Serum von Dialyse-und Normalpatienten.

Die bekannten Bestimmungsverfahren für Proteine wie der kompetitive ELISA beruhen auf dem Prinzip, dass die nachzuweisende Verbindung mit einem Bindungsprotein oder Konjugat um eine Bindungsstelle kompetitiert. Es wird dann die Menge gebundenes Bindungsprotein oder Konjugat bestimmt und anhand einer Eichkurve die Konzentration der nachzuweisenden Verbindung ermittelt.

Die in den Figuren gezeigten Testprinzipien lassen sich einfach auf andere Vitamin-D- Derivate übertragen. Besonders erwähnt sei la. 25-Dihydroxy-Vitamin-D2/D3. In diesem Fall muss ein Bindungsprotein bzw. ein Rezeptor oder Antikörper gewählt werden, der das la, 25-Dihydroxy- Vitamin-D-Analoge spezifisch erkennt. Das zugehörige bifunktionelle la, 25-Dihydroxyderivat kann gewonnen werden enzymatisch durch Umsetzung von 25-OH-Vitamin-D-3ß-cyanoethylether mit 25-OH-Vitamin-D-la-Hydroxylase, Reduktion zum Amin und schließlich Addition der zweiten funktionellen Gruppe. Ferner werden hier Derivate von Vitamin-D2 und Vitamin-D3 vorgeschlagen.

Deren Synthese kann auf dem in Beispiel I vorgestellten Weg erfolgen

BEISPIELE Beispiel 1 : Synthese von 25-OH-Vit.-D3-3ß-3' [6-N-(biotinal) hexamido] amidopropylether (4) Alle Umsetzungen erfolgten im Dunkeln unter trockener Stickstoffatmosphäre. Zwischen- produkte wurden bei-20°C gelaQert. Es wurden HPLC-reine Lösungsmittel eingesetzt. Das 25-OH- Vitamin-D3 war von BIOMOL Feinchemikalien GmbH, Hamburg, der LC-BHNS (Lona-Chain-Bio- tinyl-N-e-aminocaproyl-hydroxysuccinimidester) von Sigma Chemie, alle weiteren Chemikalien von Fluka, Darmstadt. Die Massenspektroskopie (FAB) erfolgte mit einem Finigan-BIAT-90, die <BR> <BR> <BR> NMR-Messungen mit einem Bruker-ARX-400 (400 MHz) oder einem Bruker-ARC-250F (250 MHz).

(i) 25-OH-Vitamin-D3-3ßcyanoethylether (2) 5 mg 25-OH-Vitamin-D3 (12,5 µMol), gelöst in Methylenchlorid (CH2CI2), wurde in einen mit Stickstoff gefüllten Kolben überführt und das Lösungsmittel abgezogen. Der feste Rückstand wurde in 1 ml Acetonitril aufgenommen und versetzt mit 10 Tropfen einer Mischung von tert.- Butanol und Acetonitril (9 : 1 v/v) sowie 130 µMol Acrylnitril (10 eq.) in 100 µl Acetonitril [Stammlösung : 86 ut Acrvinitril (1.3 mMol) verdünnt mit Acetonitril auf 1 ml]. Die klare Lösung wurde 15 Minuten bei 6°C gerührt. Es wurde 6.25 IlMol Kaliumhydrid (0,5 eq.) in 25 1ll tert.- Butanol/Acetonitril (9 : 1 v/v) [Stammlösung : 10 mg KH (250 IlMol) in 1 ml tert.-ButanoUAcetonitril (9 : 1 v/v)] zugegeben. Die dabei entstehende Ausflockung löste sich sofort wieder. Die Mischung wurde bei 6°C gerührt. Die wiederhotte Dünnschichtchromatographie (DC) einzelner Proben mit 20% Petrolether in Methyl-tert.-butylether (MTBE) auf Kieselgel zeigte, dass nach 10 Minuten bereits 90% der Ausgangsverbindung umgesetzt waren. Nach 15 Minuten wurden wenige Tropfen Reaktionsgemisch mit etwa 5 Tropfen Wasser und 0. 5 m) MTBE aufgearbeitet. Die DC der organischen Phase zeigte kein Edukt mehr. Nach 40 Minuten wurde das gesamte Reaktionsgemisch mit Wasser/MTBE aufgearbeitet. Es wurde 4 mg öliges Produkt erhalten.

IR(NaCl/CH2Cl2) : 3422 OH 2941,2872 CH 2252 Nitril 1105 Ether Die HPLC-Analyse (3% MeOH/CH2Cl2) ergab 93% Produkt und 7% Edukt. 4 mg Produkt enthielten somit 3.7 mg (8,2 llMol) Zielverbindung, was einer Ausbeute von 74% entspricht.

(ii) 25-OH-Vitamin-D3-3ß-3'aminopropylether (3) 3.75 mg (8. 3 IlMol) Nitril aus (i) wurde in 2 ml Ether gelöst, mit 125 pmol Lithiumhydrid gelöst in I mi Ether (Stammlösung : 7 mg frisches feinpulvriges LiH in 7 ml Ether) versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Es wurde 169 µMol LiAlH4 als Auf- schlämmung in 1 ml Ether (Stamm : 18 mg frisches feinpulvriges LiAIH4 in 3 ml Ether) zugegeben.

Nach einer weiteren Stunde wurde das Gemisch mit I ml konzentriertem KOH, 5 ml H2O und 4 x 20 ml MTBE aufgearbeitet. Die Dünnschichtchromatographie einer Probe mit 1 : 1 MTBE/Petrolether

auf Kieselgel zeigte nur noch den Ausgangspunkt. Das Diol lag bei Ri 0.27 ; das Nitril bei R ; 0.4. Die gewonnene Substanz wurde ohne weitere Analyse und Aufreinigung weiterverarbeitet.

(ici) 2,5-Hydroxyvitamin-D3-3ß-3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopro pylether(4) Es wurde 3 mg (6.6 uMol) 25-OH-Vitamin-D3-3ß-aminopropyletller (3) aus (ii) in 1 ml Dimethylformamid (DMF) gelost. Dann wurde unter Stickstoff 3 mg (6.6 pMol) LC-BNHS und 1 111 (17.5 IlMol) Triethylamin zugegeben. Es wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt, das DMF abgezogen und der Rückstand mit 20% Methanol (MeOH) in CH, CI, vorgereinigt. 12 mg (> 100%) der so gewonnenen Substanz wurden mitteis HPLC gereinigt (Bedingungen : Knauer Kromasil-100, 5 µM, 250 x 4 mm, 10% MeOH in CH, Cl,, 1.5 ml/min, OD 265 nm, 7 Minuten). Die Ausbeute betrug 1,2 mg (1,5 µmol). Dies entspricht 12%, bezogen auf das 25-OH-Vitamin-D und 18% bezogen auf die Nitrilverbindung.

Tabelle I Biotin-25-OH-Vitamin-D3 H Mult cc Zuordnung [Hz] 6,42 1 Dd 5,7 NH (Biotin) 6,2 1 D 11 6 6,0 1 D 11 7 5,85 1 Dd 5,7 NH (Biotin) 5,55 2 M 3-O-CH, (28) 5.38t SNH oder OH 5,05 1 D 2 19 4,83 1 D 2 19 4.77 1 S NH oder OH 4,51 1 M HC-NH I Biotin 4,33 1 M HC-NH 11 Biotin 3,53 1 M 3 2,53 1 D 10 4 1.21 6 S 26, 27-CH3 0,93 3 D 6 21-CH, 0,543 S 18-CH3 MS (Finigan MAT 90) ; (FAB) : 797 (MH) vom 5.9.97 und 28.11. 97 ; H-NMR (Bruker ARX 400) in CDCl3/TMS bei 400 MHz. Die Analysedaten sind in Tabelle I gezeigt.

Beispiel 2 : Stabilität von 25-OH-Vit.-D3-3ß-3'l6-N-(biotinyl) hexamidolamidopropylether Es wurde jeweils 20 mg gereinigte 25-OH-D3-Biotin-Verbindung (25-OH-Vitamin-D3-3ß- 3'[6-N-(biotinyl)-hexamido]amidopropylether) aus Beispiel 1 in ein NMR-Röhrchen gegeben und mit 1 ml Lösungsmittel versetzt. Das Lösungsmittel war eine Mischung aus Deuteriochloroform- : Deuteroacetonitril : D2O im Verhältnis 3 : 2 : 1 mit einem pH-Wert zwischen 4 und 5. Die Proben

wurden 200 Tage unter nachstehenden Bedingungen gelagert und in regehnäßigen Abständen die NMR-Spektren untersucht.

Probe 1 : unter Lichtausschluss bei-20°C ; Probe 2 : unter Lichtausschluss bei +4-6°C; Probe 3 : unter Lichtausschluss bei Umgebungstemperatur ; Probe 4 : unter starker Lichteinwirkung (auf der Fensterbank) bei Umgebungstemperatur.

Die Proben 1 und 2 zeigten über die ganzen Zeit keine wesentlichen Veränderungen im NMR-Spektrum. Eine HPLC-Analyse bestätigte, dass die Proben I und 2 auch nach 200 Tagen pro- tisches Lösungsmittel intakt waren. Probe 3 zeigte eine minimale Veränderung im NMR-Spektrum nach 100 Tagen. Die HPLC-Analyse ergab, dass mehr als 78% der Verbindung noch intakt war.

Probe 4 war nach 2 Monaten abgebaut. Die Stabilitätsuntersuchuna zeigt, dass die Verbindung unter Ausschluss von Licht sehr beständig ist, selbst in protischen Lösungsmitteln und ohne Kühlung.

Beispiel 3 : 25-Hydroxyvitamin-D-ELISA mit 25-Hdroxv itamin-D3-3ß-3'&N-(biotinyl)- <BR> <BR> hexamidolamidopropylether<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Die Bestimmung erfolgte nach dem in Fig. 2 gezeigten Prinzip. Hierzu musste zunächst 25- OH-Vitamin-D-3ß-3' [6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropylether über Streptavidin an eine feste Phase gebunden werden.

(i) Beschichtung einer Mikrotirerplatte mit Streptavidin In die Vertiefunaen einer Mikrotiterplatte wurde jeweils 100 ng Streptavidin gegeben, gelost in 200 pl 60 mM NaHCO-"pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Streptavidin- Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfma) mit 200 Ill Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung 250 ut Assaypuffer <BR> <BR> <BR> gegeben. Für den Assaypuffer wurde 5 Casein in 00 ml 0. 1 N NaOH gelöst und mit PBS, pH 7,4 auf 1 L Volumes aufgefüllt. Die Lösung wurde eine Stunde gekocht, das Volumen mit destilliertem Wasser auf einen Liter ergänzt, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und 0,1 g Thimerosal zur Vermeidung von Mikrobenwachstum zugefügt. Die Vertiefungen in der Mikrotiterpiatte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Assaypuffer inkubiert, dann der Assaypuffer entfemt und jede Vertiefung funfinal mit je 200 u1 Waschpuffer gewaschen.

(ii) Bindung von 25-Hydroxyvitamin-D3-3ß-3'(6-N-(biotinyl)hexamido]amidoprop ylether Es wurde in eine jede Vertiefung 100 pi Biotin-Vitamin-D-Lösung gegeben (10 ng 25-OH- Vitamin-D-3ß-3'[6-N-(biotinyl) llexamido] amidopropylether[6-N-(biotinyl) llexamido] amidopropylether in 100 pl Wascllpuffer) und eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und unter Schütteln inkubiert. Dann wurde die Biotin-Vitamin-D- Lösung aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 pi Waschpuffer gewaschen. Es folgte in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von Vitamin-D-bindenden Protein in Gegenwart von 25-OH-Vitamin-D aus Standard oder Probe.

(iii) Proben orbereitung Es wurde 50 u ! Serum in einem !, 5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 200 Ill Ethanolabs (vorgekühlt auf-20°C) durch Vortexen gemischt und 20 Minuten bei-20°C ausgefallt. Die Proben wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehung zentrifugiert und die Über- stände abgenommen und im ELISA eingesetzt.

Man kann in der Regel davon ausgehen, dass Plasma oder Serumproben bei 4°C etwa 2 Wochen stabil sind. Bei längerer Lagerung müssen sie bis zur Bestimmung tiefgefroren werden.

Urinproben müssen vor einer Lagerung mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt werden. Sie können dann bei 4°C etwa 14 Tage aufbewahrt werden ; bei längerer Lagerung müssen auch sie bis zur Bestimmung tiefgefroren werden.

(iv) Kompetitine Bindung Es wurde jeweils 100 Ill Vitamh1-D-bindendes Protein, isoliert aus Ziegenserum (1 : 15000 in Assaypuffer mit 3% (w/v) PEG 6000), zusammen mit 10 pl Standard, Kontrolle oder Probe (10 ut Überstand aus der Probenvorbereitung) in die Vertiefungen gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln und unter Rütteln inkubiert. Dann wurden die Lösungen aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit je 200 pl Waschpuffer gewaschen.

(v) Bestimmung der kompetitiven Bindung Es wurde jeweils 100 ul Kaninchen-anti-Vitamin-D-Bindungsprotein (1 : 10000 verdünnt in Assaypuffer mit 3% (w/v) PEG 6000) in die Vertiefungen gegeben und eine Stunde im Dunkeln und unter Rütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 nt Waschpuffer gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 pi anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase (1 : 20 000 verdünnt in Waschpuffer). Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden Antikörper-Lösungen abgenommen und eine jede Vertiefung fünfinal mit je 200 ut Waschpuffer gewaschen. Für die Farbreaktion wurden 100 pI Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat-Lösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Farbentwickiung gestoppt durch Zugabe von 50 u) 2 M H, SO4 pro Vertiefung. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 450 nm. Die nachstehenden Tabellen II und III zeigen das Pipettier- schema für die Mikrotiterplatte sowie die Werte für die optische Dichten.

Als Standard wurden Lösungen von 25-OH-Vitamin-D zentrationen eingesetzt : 50,125 und 312 nMol/L (siehe Eichkurve in Fig. 5A). Als Kontrolle bzw. Proben dienten vier Seren von Patienten mit einer D-Hypovitaminose (Proben-Nrn.

24,203,963,965) und sowie vier willkürlich ausgewählte Normalseren (Proben-Nrn. NP 18, NP 25, NP 34, NP 37-Testreihen 3 und 4). Von den Vitamin-D-Mangelseren wurde zudem die 25-OH- Vitamin-D-Konzentration durch kompetitiven Bindungsassay mit Hilfe VOIl 3H-25-OH-Vitamin-D bestimmt. Als weitere"Kontrolle"dienten vier Lösungen, bei denen die jeweilige Konzentration an 25-OH-Vitamin-D aus anderweitigen Bestimmungen bekannt war, entxveder aus den Hersteller- angaben oder durch einen kompetitiven Bindungsassay (CBPA) mit 3H-25-OH-Vitamin-D.

Tabelle II Probenanordnung Pipettier Standard Doppelwert Serumprobe Doppelwert Kontrollen Doppelwert Schema nMol/L v on Spalte I Nr. v on Spalte 3 von Spalte 5 Reihe/1 2 3 4 5 6 Sparte A NSB NSB 24 24 K1(CBPA) K1(CBPA) B 0 0 203 203 K2 (CBPA) K2 (CBPA) C 8 8 963 963 K3 (HPLC) K3 (HPLC) D 20 20 965 965 K4 (HPLC) K4 (HPLC) E 50 50 NP 18 NP 18 F 125 125 NP 25 NP 25 G 312 312 NP 34 NP 34 H NP 37 NP 37

NSB : Nichtspezifischer Bindungspuffer (Assaypuffer ohne Vitamin-D-Bindungsprotein) Tabelle III Messwerte nach 30 Minuten Farbentwicklung

OD Standard Doppelxvert Serumprobe Doppeixvert Kontrollen Doppelvvert zu 450 nm zu Spalte I Nr zu Spalte 3 Spalte 5 Reihe/6 Spaite A-------0. 947 1. 023 1. 903 2.300 B _ 2. 256 2. 182 0. 853 0. 910 0. 393 0. 371 C 1,845 1.861 0.646 0. 637 1. 674 1.586 D 1.432 1.456 1.429 1.303 0.578 0.634 E 0.625 0. 612 0.524 0. 547 F 0. 287 0. 261 0.454 0. 419 G 0. 156 0. 176 0. 341 0.368 H-------0, 421 0.386 Bmax2.801 2.676

Aus den Mittelwerten der Spalten I und 2 und den bekannten Konzentration an 25-OH- Vitamin-D wurde die in Fig. 5A gezeigt Eichkurve erstellt. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert der beiden Messungen bei 450 nm ; die Abszisse die Konzentration an 25-OH- Vitamin-D in nMol/1. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefasst.

Beispiel 4 : Vergleichende Bindungsanalyse mit 3H-25-OH-Vitamin-D als kompetitiver Partner Soweit nicht anders angegeben ist, waren alle Reagenzien Puffer und Materialien gleich wie im vorgenannten Beispiel 3. Als kompetitiver Bindungspartner (Tracer) diente Tritium-markiertes 25-OH-Vitamin-D3.

Abweichend zu Beispiel 3 wurden die Messproben durch Extraktion (in Einzelwerten) aufgereinigt. Hierzu wurde jeweils 50 pLI Probe [nicht-spezifischer Assaypuffer NSB, Standard, Kontrolle, Patientenprobe (Plasma, Serum oder Urin)] in ein 1.5 mi Einmalreaktionsgefäl3 gegeben, 200 nul Acetonitril hinzugefügt,, gemischt, die Gefäßwände freizentrifugiert, und die Mischung 20 bis 30

Minuten bei 4°C inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 1700 x g zentrifugiert. Die Bestimmungen erfolgten in Doppelwerten mit den Überständen.

Hierzu wurde 25 u. t kiarer Überstand in ein Glasröhrchen (oder in ein Spezial-RIA-Gefäß von Sarstedt Darmstadt) überführt, und 10 µl Tracer (³H-25-OH-D), 300 µl Assaypuffer und 100 p1 Vitamin-D-bindendes Protein (nicht in NSB) hinzugeben. Der Röhrcheninhalt wurde gemischt, eine Stunde bei 4°C inkubiert. und zum Entfemen von nicht gebundenem radioaktiven Tracer ! 00 fit Aktivkohlesuspension (aktivkohlehaltiger Phosphatpuffer mit 0. 1 % NaN3) zugegeben. Der Röhrcheninhalt wurde gemischt. 3 bis 5 Minuten bei 4°C inkubiert, und die Aktivkohle durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 1700 x g pellettiert. Es wurde dann jeweils 400 p1 Überstand in ein Zählgefäß (7 ml) überführt und nach Zugabe von 2 ml Szintillatorflüssigkeit wie AquasafeTM 300 oder HiSafeT". III die im Überstand befindliche Radioaktivitat gezählt (2 Minuten in einem Beta-Counter).

Die Messwerte für die Kontrollen nach Erstellung der Eichkurve sind in Tabelle 5 gezeigt.

Der Vergieich mit dem ELISA nach Beispiel 3 zeigt, dass für beide Assayverfahren (ELISA und CBPA) gilt, dass der Nonnbereich für 25-OH-Vitamin-D im Plasma oder Serum etwa 25- ! 25 nmoLI ist. Die Nachweisegrenze dieser Testsysteme wurde festgesetzt als Bo + 2SD. Sie beträgt etwa 2,5 nmot/i.

Kreuzreaktionen : Zu Aktivkohle behandeltem Serum wurde 25-OH-Vitamin-D2 (125 nmol/1), 24,25-(OH)2-Vitamin-D3 (250 mmol/l) und 1,25- (OH) 2-Vitamin-D3 (250 nmol/l) zugesetzt. Das 25-OH- Vitamin-D2 reagierte zu 60%, das 24,25-(OH)2-Vitamin-D3 zu 100% kreuz, während das 1, 25-(OH)2- Vitamin-D3 keine Kreuzreaktivität zeigte. Ähnliche Ergebnisse werden auch für erfindungsgemäße multifunktionelle 25-OH-Vitamin-D-Konjugate gefunden bzw. erwartet.

Reproduzierbarkeit : In Wiederholungsmessungen (n=l l) einer 25-Dihydroxy-Vitamin-D3- haltigen Probe wurden nachstehende Resultate erzielt. Ähnliches gilt auch für Messungen mit Hilfe der multifunktionellen 25-OH-Vitamin-D-Konjugate gemäß der Erfindung : Tabelle IV Intraassayvarianz : Anzahl Mittelwert VK % nmol/l Probe 1 32 11. 3 12.5 Probe 2 32 318 7. 2 Interassayvarianz Anzahl Mittelwert VK % nmol/l Probe 1 9 9. 9 17 Probe 2 310 11 Klinik : Anzahl Mittelwert mol/1 \ omalpersonen 3 5 54 Patienten mit Schenkelhalsbrüchen 43 9, 5

Für die in Beispiel 3 genannten Proben wurden mit den Verfahren nach Beispiel 3 und 4 folgende 25-OH-Vitamin-D-Konzentrationen ermittelt.

Tabelle V Serumproben ELISA mit CBPA mit Kontrollen ELISA mit Alternative Nr. 25-OH-D-H-25-OH-25-OH-D-Bestimmung Biotin D Biotin nMol/L nMol/L nMol/L nMol/L 24 32.9 33.3 Kt Fehlwert 20 (a) 203 36.8 29. 19 K2 76.8 75-125 (a) 963 48.9 38. 4 K3 76.8 75-125 (a) 15. 0 20-33 (b) 965 21.8 15.8 K4 51. 3 72-) 20 (b) NP 18 57.0 NP2367. 9" (a) CBPA mit'H-25-OH. D NP 34 82.4 (b) Herstelleranzabe NP 37 72. 9 Die von den Herstellern angegeben Werte waren generell höher als die im kompetitiven Bindungsassay ermittelten Konzentrationen. Dies lässt vermuten, dass sich in den überlassenen Proben bereits ein erheblicher Teile des 25-OH-Vitamin-D zersetzt bzw. durch Lichteinwirkung umgelagert hatte.

Beispiel 5 : Kontrolle der ELISA-Bestimmung durch HLPC Es wurden daher in verschiedenen Proben die 25-OH-Vitamin-D-Konzentration durch ELISA gemäß Beispiel 3 und zur Kontrolle durch HPLC nachbestimmt. Für die Eichkurve wurden Standards verwendet mit Vitamin-D3-Konzentrationen von 0,8,20,50,125 und 312 nMol/l. Alle Proben und Standards wurden in Doppelwerten bestimmt. Die 25-OH-Vitamin-D3-Konzentration der Proben wurde dann anhand der Eichkurve aus den Mittel der Doppelwerte berechnet.

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle VI gezeigt.

Tabelle VI Probe 25-OH-Vitamin-D3 [nMol/L] HPLC ELISA ) 20-3330 2 72-120 76 3 79-102 96 15 < Nacheteisgrenze <t5"7. 4

Beispiel 6 : Langzeitstabilität von 25-Hydroxyvitamin-D-Konjugat in der ELISA-Bestimmung.

Es wurden Eichkurven mit gleichen Standardlösungen und Reagenzien gemäß dem Beispiel 3 nach 60 und 100 Tagen wiederholt, um zu ermitteln, inwieweit sich eine ELISA-Bestimmung mit erfindungsgemäßen Biotin-25-OH-Vitamin-D-Konjugat im Laufe der Zeit verändert, wenn die Reagenzien zwischenzeitlich bei 4 bis 6°C im Dunkeln gelagert werden. Die nachstehende Tabelle zeigt die jeweiligen optischen Dichten nach 30 Minuten Entwicklung (siehe Beispiel 3) Tabelle VII Standard Standard Doppelwert Nach 60 Doppelwert Nach 100 Doppelwen zu zuSpalte I Tagen zu Spalte 3 Tagen Spalte 5 nMol/L 1 2 3 4 5 6 NSB-------0. 191 0.280 0. 088 0. 109 0 2.256 2.182 2.227 2.285 1,471 1.562 1, 845 1. 861 2.041 2.125 1. 345 1.366 20 1.432 1.456 1.860 1.903 1.079 1.060 50 0. 625 0. 612 1. 293 1. 214 0. 610 0.690 125 0.287 0. 261 0.606 0. 615 0.442 0.329 312 0.156 0.176 0.448 0.434 0.293 0.257 Werden die Werte der verschiedenen Eichkurven, abzüglich der jeweiligen nichtspezifi- schen Bindung, in ein Diagramm aufgetragen (siehe Fig. 5B), so ist leicht ersichtlich, dass die Eichkurven abgesehen einer relativen vertikalen Verschiebung die gleiche Form besitzen. Dies zeigt, dass sich die Empfindlichkeit und Spezifität der ELISA-Bestimmungen über den genannten Zeitraum nicht verändert hat.

Beispiel 7 : 25 (OH)-Vitamin-D3-ELISA-MTP mit anti-Vitamin-D-Bindungsprotein Der Versuch erfolgte im Wesentlichen nach dem Protokoll von Beispiel 3 und dem in Fig. 4 gezeigten Prinzip. Es wurden folgende Puffer verwendet : a) Waschpuffer : PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20 ; b) Assaypuffer : 5 g Casein wurden in 100 ml 0.1 N NaOH gelöst und mit PBS, pH 7,4 auf I I aufgefüllt. Dann wurden 3% (w/v) PEG-6000 sowie 0.1 g ThimerosalTM hinzugefügt. Alle Inkubationen erfolgten im Dunkeln und unter Schütteln.

(i)Beschichtung der Mikrotiterplatte In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden jeweils 100 pi Kaninchen-anti-Vitamin-D- Bindungsprotein in 60 mM NaHCO3, pH 9,6 gegeben und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert.

Die Lösungen wurden entfernt und jede Vertiefung fünfinal mit 200 u1 Waschpuffer gewaschen.

Dann wurde 250 1 Assaypuffer in jede Vertiefung gegeben und die Platte eine Stunde bei Raum- temperatur inkubiert. Der Assaypuffer wurde entfernt und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 111 Waschpuffer gewaschen.

(ii) Probe » vonbereitung Es wurde 50 Ri Serum, Plasma oder Standard in einem 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefaß mit 200 111 Ethallolabs (vorgeloühlt auf-20 C) gemischt, gevortext und dann 20 Minuten bei-20°C ausgefallt.

Die Proben wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehung zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und im ELISA eingesetzt.

(iii) ELISA Als Erstes wurde in eine jede Vertiefung ! 00 u1 Vitamin-D-Bindungsprotein, verdünnt in Assaypuffer, gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte ausgeschlagen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 Ill Waschpuffer gewaschen.

Danach wurden je 100 pl Biotin-Vitamin-D, verdünnt in Assaypuffer, zusammen mit 10111 Standard, Probe oder Kontrolle in die Vertiefungen gegeben. Die Platte wurde 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Lösungen wurden wiederum entfernt und eine jede Vertiefung fünfinal mit je 200 Ill Waschpuffer gewaschen.

Als Drittes wurde jeweils 100 1ll Peroxidase-gekopppeltes Streptavidin einer 1 : 10000- Verdünnung in Waschpuffer in die Vertiefungen gegeben und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde ausgeschlagen und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 Ill Waschpuffer gewaschen.

Für die Farbreaktion wurden 100 u1 TMB-Substrat-Lösung hl jede Vertiefung gegeben.

Nach ausreichender Farbentwicklullg (30 Minuten) wurde die Reaktion mit 50 ut 2M H, S04 pro Vertiefung beendet. Die Messungen der optischen Dichte erfolgte bei 450 nm. Es wurden ähnliche bis gleiche Ergebnisse erhalten, wie in Beispiel 3 bzw. Tabelle V.

Beispiel 8 : Inhalt einer Testpackung bzw. eines Reagenziensatzes zur Bestimmung on 25-H+droxA « itamin-D und la, 25-Dihydroxyvitamin-D : Inhalt der Testpackung bzw. Testreagenzien und deren Vorbereitung : Standards, bspw. 6 Fläschchen 25-OH-Vitamin-D-Standards mit den Konzentrationen 0,8,20,50, 125 und 312 nmol/l ; gebrauchsfertig in Waschpuffer.

Mikrotiterplatten, bspw. mit Streptavidin beschichtet, steril verpackt und vorgewaschen.

Pufferlösungen, bspw. Waschpuffer, NSB-Puffer und Assaypuffer, Stopplösung.

Kontrollen, bspw. zwei Fläschchen 25-OH-Vitamin-D-Kontrollen in Humanserum. Kontrolle 1 (30 nMol 25-OH-D/L), Kontrolle 2 (80 nMol 25-OH-D/L).

Tracer, bspw. ein Fläschchen mit Biotin-Vitamin-D (25-OH-Vitamin-D3-3ß-3'[6-N-(biotinyl)- hexamido] amidopropylether) in Waschpuffer (100 ng/ml) Vitamin-D-Bindungsprotein, bspw. ein Fläschchen mit Bindungsprotein aus Ziegenserum in Phosphatpuffer mit 0, 1% NaN3 als Stabilisator.

Marker, bspw. ein Däschchen anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase in Waschpuffer.

TMB-Entwicklerlosung, bspw. ein Fläschchen stabilisierte Tetramethylbenzidin-Enltwicl ; lerlosung in Waschpuffer.

Beispiel 9 : ELISA zur quantitativen Bestimmung von 1,25-Dihydroxyvitamin-D Die Bestimmung von 1,25-Vitamin-D3 erfolgte nach dem in Fig. 2 dargestellten Prinzip, nur dass als Tracer 1 25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Biotin-Verbindung diente. Bei der Kompetition wird 1,25- Dihydroxyvitamill-D) aus Standard oder Probe zusammen mit einem 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D- Bindungsprotein. einem monoklonalen Maus-anti-la, 25-Dihydroxyvitamill-D-Antikörper (B. Mawer et al. in Steroids, 1985,46,741-754), zusammengegeben. Das 1,25-Dihydroxyvitamin-D3 aus Standard oder Probe und die immobilisierte 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Biotin-Verbindung konkurrieren dann um die Bindunassteiie des Antikõrpers. Der Nachweis erfolgt mittels Peroxidase-markierten Antikörpem (Zie (Je-anti-Maus-lgG-POX).

(i) Die Beschichtung der Mikrotiterplatten mit Streptavidin erfolgte wie in Beispiel 3, wobei aber der Waschpuffer 0.1% TritonTM X-100 als Detergens enthielt. Anders als in Beispiel 3 wurden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte nach der Behandlung mit der Streptavidin-Lösung nicht mehr mit Waschpuffer gewaschen, sondern jeweils eine Stunde mit 250 pI wässriger Sorbitol-Lösung (KarionTM F 1 : 4 in Wasser) behandelt. Die Bindung des Tracers (1,25-Dihydroxyvitamin-D-Biotin) erfolgte wie in Beispiel 3, nur dass in jede Vertiefung 200 pI Tracer-Lösung gegeben wurde (20 ng 1.25-Dihydroxy- Vitamin-D-3ß-3' [6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropylether in Waschpuffer). Das 1. ? 5-Dihydroxy- vitamin-D-Biotin wurde wie in Fig. 1 schematisch aufgezeigt synthetisiert, nur dass nach dem ersten Schritt die im Unterschuss 3-cyanoethylierte 1-OH-Vitamin-D-Zwischenverbindung isoliert wurde. Es kann aber auch beliebig eine der nachfolgenden Zwischenverbindungen bzw. nach einer Mischsynthese <BR> <BR> <BR> spezifisch der 1. 25-Dihydroxy-Vitanin-D-3ß-3' [6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyletUer mittels HPLC isoliert werden.

(ii) Da im menschlichen Serum das Verhaltnis von 25-OH-Vitamin-D ; zu 1,25- Dihydroxyvitamin-D in der Regel im Bereich von 1000 : 1 lient, bedarf die quantitative Bestimmung von 1,25-Dihydroxvvitamin-D einer grundlichen Vorbereitung der Proben durch eine kombinierte Verteilungs-und Adsorptionschromatographie. Im ersten Schritt wurden hierzu ExtrelutT"-Kieselgur- Säulen (Merck, Darmstadt) mit je 500 µl Tris-Puffer äquilibriert und dann auf die Saulen jeweils 500 ul Standard, Kontrolle oder Untersuchungsprobe-in Duplikaten-aufgetragen ; die Proben konnten dann 10 Minuten auf den Säulen einziehen. Die Abtrennung der Vitamin-D-Verbindungen von der Extrelut-Säule erfolgte durch 4 mal 1 ml Diisopropylether im Abstand von jeweils drei Minuten. Der ExtrelutTM-Extrakt wurde unmittelbar auf eine Silica-Kartusche (Merck, Darmstadt) überführt und die ExtrelutTM-Säule venvorfen. Die Silicasäule wurde 5 mal mit 2 mi Isopropanol/Hexan (4/96 v/v) und 3 mal mit 2 mi Isopropanol/Hexan (6/94 (v/v)) gewaschen. Das 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D wurde dann mit 2 mal 2 ml Isopropanol/Hexan (25/75 v/v) von der Silicasäule eluiert und unter Stickstoffstrom bei 37°C oder in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Standard-und Untersuchungsproben wurden schließlich in 20 pI Ethanol p. a. aufgenommen, mit je 200 Ill Maus-anti-1,25-Dihydroxyvitamin-D- Antikörperiösuna (1 : 150000 in RRA-Assaypuffer : 50 mM KHP04, 15 mM KCI, 1,25 mM EDTA,

3mM Mercaptoethanol, pH 7,5) versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert-möglichst zeitgleich mit der Belegung der Streptavidin-behandelten Mikrotiterplatte mit dem 1,25-Dihydroxy- vitamin-D-Biotin-Tracer.

(iii) Die Vertiefungen der Tracer-beschichteten Mikrotiterplatte wurden 5 mal mit je 300 ut Triton-Waschpuffer gewaschen und auf saugfähigem Papier ausgeschlagen. Dann wurde 200 p1 Ajitikörper-Probeniösung aus der Vorinkubation in die Vertiefungen überführt und eine Stunde im Dunkeln und unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Entfemen der Lösungen aus den Vertiefungen wurden diese fünfinal mit je 200 pI Waschpuffer gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte analog Beispiel 3 durch eine Stunde Inkubation mit 200 ul Kaninchen-anti-Maus- IgG-Peroxidase (1 : 10000 in Waschpuffer) bei Raumtemperatur, fünfinal Waschen der Vertiefungen mit 300 pI Waschpuffer, eine Farbreaktion im Dunkeln mit 200 pI TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach), Stoppen der Farbreaktion nach 15 Minuten durch Zugabe von 50il 2 M HrSO4 und Bestimmen der Extinktion bei 450 nm.

Die nachstehende Tabelle VIII zeigt die Ergebnisse der 1,25-Dihydroxyvitamin-D-Bestim- mung im Serum von 11 Dialysepatienten und sechs willkürlich ausgewählten Normalpersonen.

Zur Ermittlung der Eichkurve bzw. als Standard wurden Lösungen von 1,25-Dihydroxyvitamin-D in Assaypuffer mit folgenden Konzentrationen eingesetzt : 0,6,6,20,60 und 180 pg/ml (siehe Eichkurve in Fig. 5C).

Tabelle VIH Pipettier Standard Anmerkungen OD Doppel-Mittelwert Standard- Schema 1.25-OH-Vit. D 450 nm wert Abweichung {Pg/mll 1 0 0,784 0.781 0.782 0.002 2 6.6 Eichkurve 0.732 0.741 0.737 0.006 20 Siehe Fig. 5C 0, 628 0. 628 4 60 0,484 0,484 S 180 0. 233 0.233 Kontroll-50, 1 Sollbereich : 23-63 pg/ml 0,493 Serum 98-08-295 Mittel : 43.21 pg/ml S. D. : 6.62 pg/ml Proben-Messwert Nummer lpg/mil 6. 5 0. 705 0.733 0. 719 0.020 2 39. 1 Serumproben von 0.564 0.508 0.5360.040 3 57. 8 Dial) sepatienten 0. 475 0. 458 0. 466 0. 012 4 2. 2 0,672 0.687 0.679 0, 010 Mittelwert: 20,5 5 0.3 0,776 0,774 0,775 0,002 6 4,0 S.D 17.2 0,667 0,816 0.741 0,105 7 13.4 Median 13,4 0.642 0,700 0,671 0,041 8 39,4 0,565 0,504 0,535 0,043 9 22,1 0,619 0,618 0.000 10 22.6 0.531 0.700 0.616 0, 119 11 8,6 0,705 0,705 Vergleichs- proben 1 52.9 Serumproben von 0.502 0.464 0.483 0.027 2 42.6 Normalpersonen 0.518 0.525 0.522 0,005 3 35,3 0,522 0,583 0.553 0,043 432. 9. Mittehvert 46.0 0.571 0.556 0.563 0,010 5 59,2 S.D. 9,7 0,410 0.073 6 53,1 Median 47,8 0,480 0,482 0,003

Fig. 14 veranschaulicht in einem Balkendiagramm nochmals die gefundenen Werte für Dialyse-und Normalpatienten, wonach das Serum von Dialysepatienten im Schnitt deutlich weniger aktives 1,25-Dihydroxyvitamin-D enthält. Die große Varianz der Werte bei den Dialysepatienten zeigt zudem die Notwendigkeit, bei Dialysepatienten den Gehalt an aktiviertem 1,25-Dihydroxy- vitamin-D im Serum noch verstärkt zu kontrollieren, um den typischen Folgen eines Vitamin-D- Mangels besser entgegentreten zu können.