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Patent Searching and Data


Title:
FUNCTIONALIZED METAL NANOPARTICLE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/129365
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a prefunctionalized metal nanoparticle (10) as a standardized basic module of biofunctionalized nanoparticles (40), comprising a thiol-reactive metal nanoparticle (12) which is prefunctionalized using a bi-functional module (20) that consist of an anchor component (22) and a short additional functionalization stub (24). The anchor component (22) comprises one or more dithiol phosphate groups, and the short additional functionalization stub (24) is designed for attaching a desired biofunctionalization (30) and is selected from the group consisting of i) an unmodified standardized oligonucleotide strand (26) with 2 to 18 bases for an additional functionalization with biomolecules (30) with a terminal complementary counter strand (36) of the standardized oligonucleotide strand (26), and ii) a 2 to 18 base-long oligonucleotide strand (50; 60) which is modified using a terminal reactive group (52; 62) for biomolecules.

Inventors:
HARTWICH GERHARD (DE)
Application Number:
EP2017/000097
Publication Date:
August 03, 2017
Filing Date:
January 27, 2017
Export Citation:
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Assignee:
FRIZ BIOCHEM GES FÜR BIOANALYTIK MBH (DE)
International Classes:
A61K9/14
Domestic Patent References:
WO2010081049A12010-07-15
WO2010120420A12010-10-21
Foreign References:
US6506564B12003-01-14
EP1301625B12010-11-03
US20100167290A12010-07-01
Other References:
S.-H. WANG; C.-W. LEE; A. CHIOU; P.-K. WEI, JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY, vol. 8, 2010, pages 33
H, J, YEN; S, H. HSU; C. L. TSAI, SMALL, vol. 5, 2009, pages 1553
Attorney, Agent or Firm:
ZEUNER, STEFAN (DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel als standardisierter Grundbaustein biofunktionalisierter Nanopartikel, mit einem thiolreaktiven metallischen Nanopartikel, das durch ein bifunktionelles Molekül vorfunkti- onalisiert ist, welches aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Wei- terfunktionalisierungssturnmel besteht, wobei - der Ankerbestandteil eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, und der kurze Weiterfunktionalisierungsstummel für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

i) einem unmodif izierten standardisierten Oligonukleotid- Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktionalisierung mit Biomolekülen mit einem terminalen komplementären Gegenstrang des standardisierten Oligonukleotid-Strangs, und

ii) einem 2 bis 18 Basen langen Oligonukleotid-Strang, der mit einer terminalen reaktiven Gruppe für Biomoleküle modifiziert ist.

2. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall ii) die terminale reaktive Gruppe ein Alkin-Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Azid-terminierten Biomolekülen ist, Ni-Nitriloessigsäure zur Weiterfunktionalisierung mit His-Tag- terminierten Biomolekülen, oder ein Biotin-Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Avidin-terminierten Biomolekülen ist.

3. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach Anspruch 1 o- der 2, dadurch gekennzeichnet, dass der unmodifizierte standardisierten Oligonukleotid-Strang im Fall i) bzw. der mit einer terminalen reaktiven Gruppe modifizierte Oligonukleotid-Strang im Fall ii) so ausgewählt sind, dass das vorfunktionalisierte metallische Nanopartikel lagerstabil ist.

4. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) der Oligonukleotid-Strang eine Schmelztemperatur oberhalb von 40 °C, vor- zugsweise zwischen 40 °C und 70 °C aufweist.

5. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) der Oligonukleotid-Strang nicht codierend, insbesondere nicht humangenomco- dierend ist.

6. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) mehr als 60%, bevorzugt mehr als 65%, besonders bevorzugt mehr als 70% der Ba- sen des Oligonukleotid-Strangs Guanin und/ oder Cytosin sind.

7. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nanopartikel mit mehreren bifunktionellen Molekülen mit demselben Weiterfunktionali- sierungsstummel versehen ist, oder dass das Nanopartikel zwei, drei oder vier unterschiedliche bifunktionelle Moleküle mit einem jeweils anderen standardisierten Weiterfunktionalisierungsstummel aufweist.

8. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die metallische Oberfläche des Nanopartikels abseits der bifunktionellen Moleküle mit einer Passivierung, insbesondere über Alkanthiole oder Polyethylenglycole verse- hen ist.

9. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das vorfunktio- nalisierte metallische Nanopartikel durch einfache Inkubation in wässrigem oder nicht- wässrigem Medium weiterfunktionalisierbar ist.

10. Biofunktionalisiertes metallisches Nanopartikel, bei dem ein Biomolekül an den Weiterfunktionalisierungsstummel eines vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 9 angebunden ist.

11. Verfahren zum Herstellen eines biofunktionalisierten metallischen Nanopartikels, bei dem ein Biomolekül an den Weiterfunktionalisierungs- stummel eines vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 9 angebunden wird.

12. Verwendung vorfunktionalisierter metallischer Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Anbindung von Biomolekülen. 13. Nanopartikel, Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 10, 11 o- der 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül durch ein Nuklein- säure-Oligomer, insbesondere ein einzel- oder partiell doppelsträngiges Nukleinsäure-Oligomer oder ein Protein gebildet ist.

14. Nanopartikel-Baukasten zur Herstellung biofunktionalisierter Nanopartikel, der als standardisierte Grundbausteine vorfunktionalisierte metallische Nanopartikel enthält, und bei dem jeder Grundbaustein durch ein thiol- reaktives metallisches Nanopartikel gebildet ist, das durch ein oder mehrere bifunktionelle Moleküle vorfunktionalisiert ist, welche jeweils aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Weiterfunktionalisierungsstummel besteht, wobei der Ankerbestandteil für jedes bifunktionelle Molekül eines Grund- bausteins eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, der kurze Weiterfunktionalisierungsstummel für jedes bifunktionelle Moleküle eines Grundbausteins für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und aus einem unmodifi- zierten Oligonukleotid-Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktiona- lisierung mit Biomolekülen mit einem terminalen komplementären Gegenstrang des Oligonukleotid-Strangs besteht, und wobei der unmodif izierte Oligonukleotid-Strang jedes der bifunktionellen Moleküle eines Grundbausteins aus einer Grundmenge vorbestimmter unmodifizierter Oligonukleotid-Stränge ausgewählt ist, die vier oder weniger unmodifizierte Oligonukleotid-Stränge enthält.

15. Nanopartikel-Baukasten nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel-Baukasten

erste standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle nur einen unterschiedlichen Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, der durch einen ersten unmodif izierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet ist, und zweite standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau zwei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, die durch den genannten ersten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang und einen zweiten unmodifizierten Oligonuk- leotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind.

16. Nanopartikel-Baukasten nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel-Baukasten weiter

dritte standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau drei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungssturnmel enthalten, die durch den genannten ersten und zweiten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang und einen dritten unmodifizierten Oligonukleotid- Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind, vorzugsweise dass der Nanopartikel-Baukasten weiter

- vierte standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau vier unterschiedliche Weiterfunktionalisierungsstummel enthalten, die durch den genannten ersten, zweiten und dritten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang und einen vierten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind.

17. Nanopartikel-Baukasten nach wenigstens einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel-Baukasten Grundbausteine mit unterschiedlicher Partikelgröße und/ oder unterschiedlicher thermischer und/ oder chemischer Stabilität der verankerten Weiterfunktionali- sierungsstummel und/ oder unterschiedlicher Belegungsdichte mit den bifunktionellen Molekülen und/ oder unterschiedlichem Koadsorbat zur Passivierung enthält.

Description:
Funktionalisierte metallische Nanopartikel

Die Erfindung betrifft allgemein funktionalisierte metallische Nanopartikel und betrifft insbesondere vorfunktionalisierte metallische Nanopartikel als standardisierte Grundbausteine biofunktionalisierter Nanopartikel. Die Erfindung betrifft weiter biofunktionalisierte metallische Nanopartikel sowie einen Nanopartikel-Baukasten zur Herstellung biofunktionalisierter Nanopartikel.

Die biomedizinische Anwendung von Gold-Nanopartikeln nimmt ständig zu, wie weit über 10.000 Publikationen in peer-reviewed Journalen in den letzten 8 Jahren belegen. Gold-Nanopartikel werden beispielsweise als diagnostisches Imaging Agens bei in vivo Untersuchungen oder als therapeuti- sches Agens beim experimentellen Gen- und Drug Delivery eingesetzt. Insbesondere auf Gold-Nanopartikeln basierende Delivery-Systeme für die Tumor-Chemotherapie wurden ausführlich untersucht, da sie eine höhere Wirkstoff-Effizienz bei geringerer Zytotoxizität für gesundes Gewebe erwartet lassen. Für das Delivery von Nukleinsäuren haben Gold-Nanopartikel gegenüber anderen„synthetischen Vektoren" (Delivery-Systemen) wie Lip- id-basierten Vektoren den Vorteil, dass sowohl ihre physikalischen Eigenschaften, beispielsweise ihre Größen- und Oberflächeneigenschaften, als auch ihre chemisch-biologischen Eigenschaften, nämlich insbesondere die multifunktionelle Derivatisierbarkeit der Oberfläche, und damit die Zytoto- xizität, Biodistribution und in-vivo-Exkretion nahezu beliebig modulierbar sind.

Diese hohe Modularität funktionalisierter Gold-Nanopartikel bedingt anderseits allerdings auch, dass die Mechanismen für Delivery, Zellgängigkeit, Wirksamkeit und dergleichen in der Literatur noch vielfach kontrovers dis-

BESTÄTIGUNGSKOPIE kuriert werden, zumal die verschiedenen Forschergruppen jeweils ihre eigenen, sich aufgrund unterschiedlicher Herstellungsverfahren und -parameter unterscheidenden Kompositionen von derivatisierten Gold-Nanopartikeln verwenden.

Gold-Nanopartikel erhält man z.B. durch Reduktion von Tetrachloridogold- säure H[AuCl 4 ] in siedender wässriger Lösung mit Citronensäure. Kolloidales nanopartikuläres Gold ist instabil und neigt zur Koagulation

/ Aggregation. Deswegen werden üblicherweise Stabilisatoren wie zum Bei- spiel Ci träte und/ oder Detergentien zugesetzt. Kolloidale Gold-Nanopartikel besitzen im sichtbaren Bereich des Lichts eine starke Oberflächen- plasmonen- Absorption, wodurch sie ein großes Potential für photothermische und photometrische Anwendungen haben. In einer Studie zur Anwendung von Gold-Nanopartikeln im medizinischen Bereich, wie z.B. in Zelluntersuchungen, konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme der Nanopartikel durch Endozytose größenabhängig ist. Gold- Nanopartikel mit einer Größe von 45nm werden dabei besser von HeLa- Zellen aufgenommen als 70nm große Gold-Nanopartikel (S.-H. Wang, C.-W. Lee, A. Chiou, P.-K. Wei, Journal of Nanobiotechnology 2010, 8, 33). Es ist daher erforderlich, dass die Nanopartikel in wässrigen, salzhaltigen Lösungen eine stabile Dispersion bilden und keine Agglomerate bilden. In der Regel sind jedoch selbst Citrat- oder Detergens-stabilisierte Gold-Nanopartikel in reinem Zellkulturmedium nicht stabil. Die Folge ist eine starke Agglome- ration der Nanopartikel in diesem Medium. Dies kann einerseits durch die Zusätze an Proteinen, wie z.B. BSA (bovine serum albumin) verhindert werden (H. J. Yen, S. H. Hsu, C. L. Tsai, Small 2009, 5, 1553), die den Nanopartikel mit einer monomolekularen Proteinlage aus BSA überziehen und zu einer Zunahme des Partikeldurchmessers um ca. 4-6 nm führen. Andererseits hindert diese Protein-Umhüllung der Goldnanopartikel eine gezielte chemische Derivatisierung der Partikel in wässrigen oder nichtwässrigen Systemen. Aus der Druckschrift EP 1 301 625 Bl ist ein Verfahren und ein Kit zum De- tektieren eines Analyten in einer Probe bekannt, bei dem metallische Nano- partikel-Konjugate verwendet werden, an die Oligonukleotide gebunden sind. Aus der US 2010/0167290 AI sind molekülmodifizierte Gold- Nanopartikel bekannt, die kovalent gebundene Oligonukleotide umfassen.

Ausgehend davon liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Nachteile des Stands der Technik zu vermeiden, und insbesondere metallische Nanopartikel bereitzustellen, die einfach, schnell und dennoch hochreproduzierbar mit einer gewünschten Biofunktionalisierung versehen werden können. Die Erfindung soll auch solchermaßen biofunk tionalisierte metallische Nanopartikel bereitstellen.

Unter einer Biofunktionalisierung wird dabei wie üblich die Anpassung von Eigenschaften eines Stoffs für sichere biomedizinische Anwendungen ver- standen.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Die Erfindung stellt ein vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel als standardisierten Grundbaustein biofunktionalisierter Nanopartikel bereit. Das vorfunktionalisierte metallische Nanopartikel umfasst ein thiolreaktives metallisches Nanopartikel, das durch ein bifunktionelles Molekül vorfunkti- onalisiert ist, welches aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Wei- terfunktionalisierungsstummel besteht. Dabei ist vorgesehen, dass der Ankerbestandteil eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, und der kurze Weiterfunktionalisierungsstummel für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

i) einem unmodifizierten standardisierten Oligonukleotid-

Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktionalisierung mit Biomolekülen mit einem terminalen komplementären Gegenstrang des standardisierten Oligonukleotid-Strangs, und

ii) einem 2 bis 18 Basen langen Oligonukleotid-Strang, der mit einer terminalen reaktiven Gruppe für Biomoleküle modifiziert ist.

Der Begriff Oligonukleotid ist dabei ein Äquivalent zu dem Begriff Nuklein- säure-Oligomer und bezeichnet eine Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge. Eine Nukleinsäure umfasst wenigstens zwei kovalent verbun- dene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin-

(z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Gua- nin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges Rückgrat der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid- Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen. Der Begriff Basen bezeichnet die natürlich vorkommenden Nucleobasen Cytosin, Thymin, Uracil, Adenin und Guanin, und auch deren künstliche Analoga solange diese zur Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden geeignet sind. Als thiolreaktives metallisches Nanopartikel wird dabei ein metallisches Na- nopartikel (M) bezeichnet, das mit Thiolen (HS-R, R= Rest) oder Disulf iden (R-S-S-R) reagiert, beispielsweise unter Ausbildung spontaner, überwiegend chemisorptiver, gegebenenfalls kovalenter oder (teil-)ionischer Wechselwir- kungen/Bindung(en) mit den Thiol- (HS-R) oder Disulf id-Gruppen (R-S-S- R') des Bindungspartners zur Adduktbildung M-S-R bzw. M-S-S-R oder R-S- M-...-M-S-R' (wobei die Punkte andeuten, dass nicht notwendigerweise zwei direkt benachbarte M- Atome die Bindung ausbilden). Das thiolreaktive metallische Nanopartikel ohne die Vorfunktionalisierung wird nachfolgend oft auch als Kernbestandteil des Nanopartikels bezeichnet.

Im Fall ii) ist die terminale reaktive Gruppe mit Vorteil ein Alkin-Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Azid-terminierten Biomolekülen, ein Azid- Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Alkin-terminierten Biomolekü- len, ist Ni-Nitriloessigsäure zur Weiterfunktionalisierung mit His-Tag- terminierten Biomolekülen, oder ist ein Biotin-Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Avidin-terminierten Biomolekülen. Es versteht sich, dass für die terminale reaktive Gruppe und die entsprechende Gegengruppe der Biomoleküle auch andere, dem Fachmann bekannte Paare reaktiver Gruppen in Frage kommen.

Der unmodifizierte standardisierte Oligonukleotid-Strang im Fall i) bzw. der mit einer terminalen reaktiven Gruppe modifizierte Oligonukleotid-Strang im Fall ii) ist dabei mit besonderem Vorteil so ausgewählt, dass das vorfunk- tionalisierte metallische Nanopartikel lagerstabil ist. Lagerstabilität bedeutet dabei, dass die vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikel über einen Zeitraum vom mindestens 4 Wochen, bevorzugt von mindestens 3 Monaten, von mindestens 6 Monaten oder sogar von mindestens 12 Monaten gelagert werden können, ohne aufgrund des Kontakts mit Luftfeuchtigkeit, Licht und anderen Umwelteinflüssen zu degradieren. Die hohe Lagerstabilität ermöglicht es, die Biofunktionalisierung der Nanopartikeln zur Effizienzsteigerung in zwei Teilschritte 'Vorfunktionalisierung' und 'Nutzerspezifische Weiter- funktionalisierung' zu zerlegen, da die Nanopartikel nach der aufwendigen Vorfunktionalisierung beim Hersteller längere Zeit gelagert und dann an Endnutzer vertrieben werden können. Die Endnutzer können dann die vom Hersteller vorfunktionalisierten Nanopartikeln selbst in einfacher Weise nutzerspezifisch weiterfunktionalisieren, und auch beim Endnutzer können die vorfunktionalisierten Nanopartikel und die weiterfunktionalisierten Nano- partikel über längere Zeit gelagert und nach und nach eingesetzt werden.

Bei der nutzerspezifischen Weiterfunktionalisierung ist das vorfunktionali- sierte metallische Nanopartikel mit Vorteil durch einfache Inkubation in wässrigem oder nicht-wässrigem Medium weiterfunktionalisierbar.

Ein bedeutender weiterer Vorteil der Zerlegung in die zwei genannten Teilschritte besteht darin, dass der Endnutzer die eigentliche Biofunktionalisierung dem Hersteller nicht offenlegen muss, sondern diese geheim halten und selbst vornehmen kann.

Für den Weiterfunktionalisierungsstummel ist in der Fallgruppe i) in einer bevorzugten Ausgestaltung vorgesehen, dass der OTigonukleotid-Strang eine Schmelztemperatur oberhalb von 40 °C, vorzugsweise zwischen 40 °C und 70 °C aufweist. Weiter ist der Oligonukleotid-Strang in diesem Fall mit be- sonderem Vorteil nicht codierend, insbesondere nicht humangenomcodie- rend. Schließlich ist noch in der Fallgruppe i) weiter vorteilhaft vorgesehen, dass mehr als 60%, bevorzugt mehr als 65%, besonders bevorzugt mehr als 70% der Basen des Oligonukleotid-Strangs Guanin und/ oder Cytosin sind. Der Oligonukleotid-Strang weist dann bei gegebener Basenlänge eine besonders hohe Schmelztemperatur auf.

Das genannte Nanopartikel kann mit nur einem bifunktionellen Molekül vorfunktionalisiert sein, für die meisten Anwendungsfälle ist es aber von Vorteil, wenn das Nanopartikel mit mehreren bifunktionellen Molekülen mit demselben Weiterfunktionalisierungsstummel vorfunktionalisiert ist, wobei die Belegungsdichte vorteilhaft sogar so groß wie möglich gewählt wird. Eine Obergrenze ist in der Praxis dabei durch die in der Regel gewünschte Bedingung gegeben, dass an jedem Weiterfunktionalisierungsstummel noch eine Doppelstrangausbildung möglich sein soll.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das vorfunktionali- sierte Nanopartikel für die Anbindung mehrerer unterschiedlicher Biomole- küle eingerichtet und weist dazu zwei, drei oder vier unterschiedliche bifunktionelle Moleküle mit einem jeweils anderen standardisierten Weiter- funktionalisierungsstummel auf. Mit Vorteil sind die unterschiedlichen Wei- terfunktionalisierungsstummel alle durch standardisierte, aber voneinander verschiedene Oligonukleotid-Stränge nach der oben genannten Fallgruppe i) gebildet. Alternativ können die Fallgruppen i) und ii) auch gemischt sein, so dass beispielsweise ein oder zwei Weiterfunktionalisierungsstummel nach Fallgruppe ii) und ein oder zwei Weiterfunktionalisierungsstummel nach Fallgruppe i) vorliegen. Abseits der bifunktionellen Moleküle ist die metallische Oberfläche des Na- nopartikels mit einer Passivierung, insbesondere über Alkanthiole oder Po- lyethylenglycole versehen. Der Ankerbestandteil enthält vorzugsweise genau eine, zwei oder drei Dithiol-Phosphat-Gruppen je bifunktionellem Molekül.

Neben den bisher beschriebenen vorfunktionalisierten metallischen Nano- partikeln enthält die Erfindung auch ein biofunktionalisiertes metallisches Nanopartikel, bei dem ein Biomolekül an den Weiterfunktionalisierungs- stummel eines vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikels der oben beschriebenen Art angebunden ist. Sie enthält auch ein Verfahren zum Herstellen eines biofunktionalisierten metallischen Nanopartikels, bei dem ein Biomolekül an den Weiterfunktionalisierungsstummel eines vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikels der oben beschriebenen Art angebunden wird, und betrifft schließlich auch die Verwendung vorfunktionalisierter metallischer Nanopartikel der oben beschriebenen Art zur Anbindung von Biomolekülen.

Dabei kann sowohl bei dem genannten Nanopartikel, dem Verfahren oder der Verwendung vorgesehen sein, dass das Biomolekül durch ein Nuklein- säure-OIigomer, insbesondere ein einzel- oder partiell doppelsträngiges Nukleinsäure-Oligomer oder ein Protein gebildet ist.

Die Erfindung enthält weiter einen Nanopartikel-Baukasten zur Herstellung biofunktionalisierter Nanopartikel, der als standardisierte Grundbausteine vorfunktionalisierte metallische Nanopartikel enthält, und bei dem jeder Grundbaustein durch ein thiolreaktives metallisches Nanopartikel gebildet ist, das durch ein oder mehrere bifunktionelle Moleküle vorfunktionalisiert ist, welche jeweils aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Weiter- funktionalisierungsstummel besteht. Dabei ist vorgesehen, dass der Ankerbestandteil für jedes bifunktionelle Molekül eines Grundbausteins eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, der kurze Weiterfunktionalisierungsstummel für jedes bifunktionelle Moleküle eines Grundbausteins für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und aus einem unmodifi- zierten Oligonukleotid-Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktiona- lisierung mit Biomolekülen mit einem terminalen komplementären Gegenstrang des Oligonukleotid-Strangs besteht, und wobei der unmodifizierten Oligonukleotid-Strang jedes der bifunktionellen Moleküle eines Grundbausteins aus einer Grundmenge vorbestimmter unmodif izierter Oligonukleotid-Stränge ausgewählt ist, die vier oder weniger unmodif izierte Oligonukleotid-Stränge enthält.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung ist dabei vorgesehen, dass der Nanopartikel-Baukasten

erste standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle nur einen unterschiedlichen Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, der durch einen ersten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet ist, und zweite standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau zwei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, die durch den genannten ersten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang und einen zweiten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind.

Bevorzugt enthält der Nanopartikel-Baukasten weiter dritte standardisierte Grundbausteine, deren bifunktionelle Moleküle genau drei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungssturnrnel enthalten, die durch den genannten ersten und zweiten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang und einen dritten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind.

In einer zweckmäßigen Ausgestaltung enthält der Nanopartikel-Baukasten weiter vierte standardisierte Grundbausteine, deren bifunktionelle Moleküle genau vier unterschiedliche Weiterfunktionalisierungsstummel enthalten, die durch den genannten ersten, zweiten und dritten unmodifizierten Oligo- nukleotid-Strang und den vierten unmodifizierten Oligonukleotid-Strang der genannten Grundmenge gebildet sind.

In allen Ausgestaltungen kann der Nanopartikel-Baukasten Grundbausteine mit unterschiedlicher Partikelgröße und/ oder unterschiedlicher thermischer und/ oder chemischer Stabilität der verankerten Weiterfunktionalisierungs- stummel und/ oder unterschiedlicher Belegungsdichte mit den bifunktionellen Molekülen und/ oder unterschiedlichem Koadsorbat zur Passivierung der freien metallischen Nanopartikel-Oberfläche enthalten. Beispielsweise können die oben genannten ersten standardisierten Grundbausteine in ver- schiedenen Partikelgrößen vorliegen, oder die Weiterfunktionalisierungs- stummel der ersten standardisierten Grundbausteine können über eine unterschiedliche große Anzahl an Dithiol-Phosphat-Gruppen (insbesondere 1, 2 oder 3) an die Metalloberfläche angebunden sein. Die die Grundbausteine bildenden vorfunktionalisierten metallischen Nano- partikel sind dabei vorteilhaft lagerstabil, wie oben bereits genauer beschrieben. Die vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikel und die biofunktionali- sierten metallische Nanopartikel weisen als Kernbestandteil vorzugsweise jeweils ein Gold-Nanopartikel auf, wobei allerdings auch andere thiolreakti- ve Metalle, wie etwa Silber, Platin oder Eisen als Material des Kernbestand- teils der Nanopartikel in Frage kommen.

Als Nanopartikel werden im Rahmen dieser Beschreibung Partikel mit einer Abmessung unterhalb von 250 nm bezeichnet, wobei sich die Größenangabe auf den Kernbestandteil, also die Nanopartikel ohne die angebundenen Vor- oder Weiterfunktionalisierungen bezieht. Mit Vorteil liegt die Größe der Nanopartikel sogar unterhalb von 100 nm, insbesondere zwischen 5 nm und 50 nm. Gegenwärtig sind im Wesentlichen kugelförmige Nanopartikel bevorzugt, allerdings können neben kugelförmigen Nanopartikeln auch anders geformte Partikel als Kernbestandteil verwendet werden, beispielsweise el- lipsoid-, Würfel-, Stäbchen- oder polyederförmige Partikel. Bei anisotropen Partikelformen bezieht sich die Größenangabe auf die größte Abmessung des Partikels.

Vorteile der Erfindung sowie weitere Ausführungsbeispiele werden nach- folgend anhand der Figuren erläutert, bei deren Darstellung auf eine maß- stabs- und proportionsgetreue Wiedergabe verzichtet wurde, um die Anschaulichkeit zu erhöhen.

Es zeigen:

Fig. 1 in (a) schematisch ein vorfunktionalisiertes Gold-Nanopartikel, das als Grundbaustein biofunktionalisierter Nanopartikel dient, in (b) ein zur Anbindung an den Weiterfunktionalisierungs- stummel des Gold-Nanopartikels der Fig. 1 eingerichtetes Bio- molekül, und in (c) das durch Anbindung des Biomoleküls von (b) entstandene biofunktionalisierte Gold-Nanopartikel, die Herauslösung des Fluorophor-markierte Gegenstrangs aus dem Biomolekül des biofunktionalisierten Nanopartikels der Fig. 1(c) durch eine Ziel-RNA, schematisch einen Ausschnitt der Oberfläche des Gold- Nanopartikels der Fig. 1 im Bereich des angebundenen bifunktionellen Moleküls, ein vorfunktionalisiertes Gold-Nanopartikel mit mehreren gleichartigen bifunktionellen Molekülen, in (a) und (b) jeweils ein vorfunktionalisiertes Gold- Nanopartikel mit alternativen Weiterfunktionalisierungsstum- meln und einem jeweils entsprechend ausgebildeten anzubindenden Biomolekül, in (a) und (b) zwei Ausführungsbeispiele für Gold- Nanopartikel, an die vier verschiedene bifunktionelle Moleküle mit jeweils anderen Weiterfunktionalisierungssturnmeln angebunden sind, jeweils links Absorptionsspektren verschiedener wässrig- gelöster Gold-Nanopartikel-Sorten unmittelbar nach Zugabe von 6fach PBS und die gleiche Lösung nach 120 min; rechts sind jeweils die Differenzspektren gezeigt, Fig. 8 Messergebnisse zur (Maximal-)Belegung in Abhängigkeit von der Ankerfunktion / Zugänglichkeit,

Fig. 9 Messergebnisse zur mengennormierten Gold-Nanopartikel- Thiol Temperaturstabilität, und

Fig. 10 in (a) eine Durchlichtaufnahme und in (b) eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Makrophage, die zur Expression von miRNA 146a angeregt und mit funktionalisierten Gold- Nanopartikeln inkubiert wurde.

Die Erfindung wird nun am Beispiel von funktionalisierten Gold- Nanopartikeln erläutert, sie ist allerdings nicht auf die zur Illustration gezeigten Gold-Nanopartikel beschränkt, sondern kann auch bei anderen Na- nopartikeln mit thiolreaktiven metallischen Oberflächen, wie etwa Silberoder Platin-Nanopartikeln eingesetzt werden.

Figur 1(a) zeigt hierzu ein vorfunktionalisiertes Gold-Nanopartikel 10, dessen Funktionalisierung 20 zwar selbst keine Biofunktionalisierung darstellt, es jedoch einem Endnutzer erlaubt, das vorpräparierte Nanopartikel einfach und schnell, beispielsweise durch Inkubation in wässrigem oder nicht- wässrigem Medium, mit einer beliebigen gewünschten Biofunktionalisierung 30 (Fig. 1(b)) zu versehen. Die Funktionalisierung 20 des Nanopartikels 10 wird daher im Rahmen dieser Beschreibung als Vorfunktionalisierung bezeichnet, da sie der gewünschten Biofunktionalisierung vorangeht und diese vorbereitet.

Der Kernbestandteil des vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikels 10 ist durch ein im Wesentlichen kugelförmiges Gold-Nanopartikel 12 mit einem Durchmesser von etwa 15 nm gebildet. Das kugelförmige Gold-Nanopartikel 12 ist durch ein bifunktionelles Molekül 20 vorfunktionalisiert, welches in seiner ersten Funktion aus einen Ankerbestandteil 22 zur Verankerung an der Gold-Oberfläche des Kernbestandteils und in seiner zweiten Funktion aus einem kurzen Weiterfunktionalisierungsstummel 24 besteht, welcher für die Anbindung der gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist.

Der in Fig. 1 nur schematisch dargestellte Ankerbestandteil 22 umfasst dabei eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen, die eine stabile Verankerung des Moleküls 20 an der Goldoberfläche des Nanopartikels 12 gewährleisten, wie weiter unten in Zusammenhang mit Fig. 3 näher erläutert.

Der mit dem Ankerbestandteil 22 verbundene kurze Weiterfunktionalisie- rungsstummel 24 ist im Ausführungsbeispiel der Fig. 1 durch einen standar- disierten Oligonukleotid-Strang 26 mit vier Basen gebildet. Der Weiterfunk- tionalisierungsstummel 24 ist selbst nicht codierend, insbesondere nicht hu- mangenomcodierend und dient ausschließlich als spezifische Andockstation für geeignet präparierte Biomoleküle. In den nicht mit bifunktionellen Molekülen 20 belegten Bereichen ist die freie Gold-Oberfläche des Nanopartikels 12 mit einer Passivierung 14 versehen, im Ausführungsbeispiel etwa über Polyethylenglycole.

Die gewünschten Biomoleküle 30 müssen für die Anbindung an das Nano- partikel 12, wie in Fig. 1(b) gezeigt, einen terminalen komplementären Gegenstrang 36 zu dem Oligonukleotid-Strang 26 des Weiterfunktionalisie- rungsstummels 24 aufweisen. Der Oligonukleotid-Strang 26 des Gold- Nanopartikels 10 und der terminale komplementäre Gegenstrang 36 des Biomoleküls 30 passen wie Schlüssel und Schloss zueinander, so dass sicherge- stellt ist, dass nur Biomoleküle 30, die mit einem geeigneten Gegenstrang 36 präpariert worden sind, an das vorfunktionalisierte Gold-Nanopartikel 10 anbinden können. Im konkreten Ausführungsbeispiel besteht das Biomolekül 30 etwa aus einem längeren Oligonukleotid 32 mit einem gewünschten Nutzbereich 34, an den der bereits genannte terminale komplementäre Gegenstrang 36 anschließt. Im Nutzbereich 34 ist das Oligonukleotid 32 mit einem mit einem Fluorophor 35 markierten Gegenstrang 38 hybridisiert, der zur Genexpressi- onsanalyse auf eine bestimmte zellspezifischen mRNA zielt.

Eine wesentliche Besonderheit der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, dass das Biomolekül 30 der Fig. 1(b) dank der Vorfunktionalisierung durch einfache Pipettierschritte idealerweise in wenigen Minuten an das vor- funktionalisierte Gold-Nanopartikel 10 der Fig. 1(a) angebunden werden kann, wodurch das in Fig. 1(c) gezeigte, mit der gewünschten Biofunktiona- lisierung versehene Partikel 40 entsteht.

Bei dem im Ausführungsbeispiel gezeigten biofunktionalisierten Nanoparti- kel 40 ist die Fluoreszenz des angebundenen Fluorophors 35 zunächst durch die unmittelbare Nachbarschaft der Goldoberfläche 12 gelöscht. Trifft das Nanopartikel 40 in einer Zelle auf die Ziel-RNA 42, so wird der Fluorophor- markierte Gegenstrang 38 durch Hybridisierung mit der mRNA aus dem Biomolekül 30 herausgelöst (Pfeil 44) und der Fluorophor 35 kann fluorimet- risch detektiert werden, wie in Fig. 2 schematisch dargestellt.

Grundsätzlich kann ein Gold-Nanopartikel 12 natürlich auch ohne Vorfunktionalisierung 20 direkt mit einem gewünschten Biomolekül 30 (ohne den terminalen Gegenstrang 36) funktionalisiert werden, wie diese im Stand der Technik bereits beschrieben ist. Allerdings gelingt eine solche Biofunktiona- lisierung von Gold-Nanopartikeln in der Regel nur in einer oft mehrtägigen Prozedur durch gut ausgebildetes Personal und geht mit entsprechend hohen Kosten einher. Dies kann insbesondere dann ein Hindernis darstellen, wenn eine größere Zahl unterschiedlicher Biomoleküle 30 an Gold-

Nanopartikel angebunden werden sollen oder wenn die Ergebnisse von Bio- funktionalisierungen unterschiedlicher Forschergruppen miteinander verglichen werden sollen. Da meist jede Gruppe eigene Kompositionen von deri- vatisierten Gold-Nanopartikeln verwendet, weisen selbst mit nominal iden- tischen Biomolekülen funktionalisierte Nanopartikel oft unterschiedliche Eigenschaften auf, so dass Ergebnisse verschiedener Forschergruppen teilweise nur schwer miteinander in Beziehung gesetzt werden können.

Hier schaffen die jetzt vorgeschlagenen vorfunktionalisierten Gold- Nanopartikel 10 wirksam Abhilfe. Durch den Einsatz standardisierter Oligo- nukleotid-Stränge 26 im Weiterfunktionalisierungsstummel 24 kann ein Na- nopartikel-Baukasten mit hochreproduzierbarem Grundmaterial mit maßgeschneiderten Eigenschaften für beliebige Anwendungen oder Untersuchungen bereitgestellt werden. Die aufwendige Biofunktionalisierung von Nano- partikeln wird durch die Erfindung in zwei Teilschritte zerlegt, nämlich einerseits eine standardisierte Vorfunktionalisierung und andererseits eine nutzerspezifische Weiterfunktionalisierung.

Die Vorfunktionalisierung stellt dabei als Erstfunktionalisierung der Gold- Nanopartikel den zeitlich, apparativ und personell aufwendigen Teilschritt dar, der großes Know-How und viel Erfahrung mit der Funktionalisierung von Goldoberflächen erfordert. Diese Vorfunktionalisierung wird nun erfindungsgemäß standardisiert nur für eine relativ kleine Anzahl unterschiedlicher Vorfunkrionalisierungen in einem Nanopartikel-Baukasten durchge- führt und erfolgt zentral durch einen Anbieter vorfunktionalisierter Nano- partikel. Der Endnutzer bezieht die vorfunktionalisierten Nanopartikel vom Anbieter und muss selbst nicht über die zur Erstfunktionalisierung notwendigen Kenntnisse und apparativen Mittel verfügen. Die Lagerstabilität der vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikel stellt sicher, dass die beiden Schritte 'Vorfunktionalisierung' und Weiterfunktionalisierung' zeitlich und räumlich voneinander entkoppelt werden können.

Ausgehend von den vorfunktionalisierten Nanopartikeln kann die Weiter- funktionalisierung durch den Endnutzer dann sehr einfach und schnell durchgeführt werden und kann auch von wenig geschultem Personal mit wenigen Pipettierschritten erfolgen. Dies hat neben dem geringen Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand insbesondere auch den Vorteil, dass der Endnutzer mit demselben Grundmaterial rasch eine Vielzahl unterschiedlich bio- funktionalisierter Nanopartikeln herstellen kann, so dass eine hohe Vergleichbarkeit der Ergebnisse gesichert ist. Da die Weiterfunktionalisierung vom Endnutzer selbst durchgeführt werden kann, muss dieser zudem keine möglicherweise sensiblen Informationen über die anzubindenden Biomoleküle an Dritte geben, was gerade bei Forschungs- und Entwicklungsarbeiten von großer Bedeutung sein kann.

Zur genaueren Erläuterung der Funktionsweise des Ankerbestandteils 22 zeigt Fig. 3 schematisch einen Ausschnitt der Oberfläche des Gold- Nanopartikels 12 im Bereich des angebundenen bifunktionellen Moleküls 20. Für die Verankerung wurde der Weiterfunktionalisierungsstummel 24, hier in Form eines standardisierten Oligonukleotid-Strangs 26, an dessen 3'-Ende mittels l,2-Dithian-4-0-Dimethoxytrityl-5-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropyl)]-phosphoramidit (DTPA) mit Dithiol-Modifikationen versehen, die einen stabilen Thiol- Anker auf der Gold-Oberfläche das Nanopartikels 12 ausbilden können. Figur 3 zeigt dabei konkret ein Ausführungsbeispiel mit zwei Dithiol-Phosphat-Gruppen. Ist eine geringere thermische und/ oder chemische Stabilität der Verankerung gewünscht, kann die Anbindung statt dessen mit einem Ankerbestandteil mit nur einer Dithiol-Phosphat-Gruppe erfolgen, bei einer gewünschten höheren thermischen und/ oder chemischen Stabilität kann die Anbindung mit einem Ankerbestandteil mit drei Dithiol- Phosphat-Gruppe erfolgen.

Auf diese Weise kann die thermische und/ oder chemische Stabilität der Verankerung des Weiterfunktionalisierungsstummels 24 nach Wunsch unterschiedlich gewählt werden. Ein Nanopartikel-Baukasten kann daher beispielsweise auch Nanopartikel mit gleichem Weiterfunktionalisierungs- stummel, aber unterschiedlich stabiler Verankerung des Weiterfunktionali- sierungsstummels enthalten.

Ein vorfunktionalisiertes Gold-Nanopartikel 10 kann selbstverständlich nicht nur ein bifunktionelles Molekül enthalten, wie der einfacheren Darstellung halber in Fig. 1 gezeigt. Vielmehr werden für eine gewünschte Weiterfunkti- onalisierungsfunktion vorteilhaft mehrere gleichartige bifunktionelle Mole- küle 20 an ein Gold-Nanopartikel 12 angebunden, wie in Fig. 4 illustriert. Die Belegungsdichte wird dabei mit Vorteil sogar so groß wie möglich gewählt, was in der Praxis bedeutet, dass die Belegungsdichte so groß gewählt wird, dass an jedem Weiterfunktionalisierungsstummel gerade noch eine Doppelstrangausbildung möglich ist.

Neben den bisher beschriebenen Weiterfunktionalisierungsfunktionen in Form eines Oligonukleotid-Strangs kommen mit Bezug auf Fig. 5(a) auch Gestaltungen in Betracht, bei denen der Weiterfunktionalisierungsstummel 24' eines vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikels 12 aus einem ultrakurzen Oligonukleotid 50 mit einem Alkin-Terminus 52 besteht. Die anzubindenden Biomoleküle 30' müssen in diesem Fall mit einem Azid-Terminus 54 versehen werden, wie in Fig. 5(a) ebenfalls schematisch dargestellt. Das der An- bindung des Alkin-Terminus 52 an den Ankerbestandteil 22 dienende ultra- kurze Oligonukleotid 50 weist 2 bis 18, vorzugsweise sogar nur 2 bis 8 Basen auf.

Die kupferkatalysierte Alkin- Azid-Cycloaddition (CuAAC) ist ein Beispiel sogenannter Click-Reaktionen. Sie ist stark selektiv und läuft praktisch nur zwischen den Komponenten Azid und Alkin ab. Die Reaktion wird auch durch die meisten anderen organischen Gruppen, die in anzubindenden Biomolekülen vorkommen, wie zum Beispiel Amino- oder Carboxylgruppen, nicht beeinträchtigt. Zudem kommen in nativen Biomolekülen Azide und Alkine nicht vor. Alkin-Modifikationen können beispielsweise in einer Stan- dard-Oligosynthese mit Alkinphosphoramidit erzeugt werden. Mit Azid- und Alkingruppen markierte Proteine können etwa unter Verwendung von aminoreaktivem Azid-NHS-Ester bzw. Alkin-NHS-Ester, oder biotechnologisch mit den entsprechenden modifizierten Aminosäurebausteinen hergestellt werden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, den Weiterfunktionalisierungs- stummel 24" eines vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikels 12 aus einem ultrakurzen Oligonukleotid 60 und einer terminalen Ni-Nitriloessigsäure 62 auszubilden. Die anzubindenden Biomoleküle 30" müssen in diesem Fall einen His-Tag-Terminus 64 aufweisen, wie in Fig. 5(b) schematisch gezeigt. Auch bei dieser Variante weist das der Anbindung des Ni-Nitriloessigsäure- Terminus 62 an den Ankerbestandteil 22 dienende ultrakurze Oligonukleotid 60 nur 2 bis 18, vorzugsweise sogar nur 2 bis 8 Basen auf. Die Ausgestaltungen der Fig. 5 nutzen für die Anbindung der Biomoleküle ebenfalls das Schlüssel-Schloss-Prinzip, da der Alkin-Terminus 52 des Wei- terfunktionalisierungsstummels 24' des Gold-Nanopartikels 10 und der Azid-Terminus 54 der Biomoleküle 30' (Fig. 5a), bzw. die terminale Ni- Nitriloessigsäure 62 des Weiterfunktionalisierungsstummels 24" des Gold- Nanopartikels 10 und der His-Tag-Terminus 64 des Biomoleküls 30" (Fig. 5b) jeweils wie Schlüssel und Schloss zueinander passen. Dadurch ist sichergestellt, dass nur jeweils entsprechend modifizierte Biomoleküle 30' bzw. 30" mit ihrem jeweiligen "Schlüssel" 54 bzw. 64 an das am vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikel angebrachte "Schloss" 52 bzw. 62 anbinden können.

Die vorfunktionalisierten Gold-Nanopartikel können auch mehrere, unterschiedliche Weiterfunktionalisierungsstummel aufweisen um gezielt mit unterschiedlichen Biomolekülen weiterfunktionalisierbar zu sein. Wie in Fig. 6 illustriert, können an ein Gold-Nanopartikel hierzu bifunktionelle Moleküle angebunden sein, die insbesondere zwei, drei oder vier unterschiedliche Weiterfunktionalisierungsstummel aufweisen. Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 6(a) enthält das vorfunktionalisierte Gold-Nanopartikel 70 vier unterschiedliche bifunktionelle Moleküle mit einem jeweils anderen Weiter- funktionalisierungsstummel. Die Weiterfunktionalisierungsstummel sind in Fig. 6 exemplarisch alle durch standardisierte, aber voneinander verschiedene Oligonukleotid-Stränge 72, 74, 76, 78 mit jeweils 3 bis 5 Basen gebildet.

Das Ausführungsbeispiel der Fig. 6(b) zeigt ein vorfunktionalisiertes Gold- Nanopartikel 80, bei dem zwei der bifunktionellen Moleküle Weiterfunktio- nalisierungsstummel in Form unterschiedlicher standardisierter Oligonukleotid-Stränge 82, 84 aufweisen, während ein dritter Weiterfunktionalisie- rungsstummel aus einem ultrakurzen Oligonukleotid 86 mit einem Alkin- Terminus 88 besteht und ein vierter Weiterfunktionalisierungsstummel aus einem ultrakurzen Oligonukleotid 90 mit einer terminalen Ni-Nitriloessig- säure 92 besteht.

Während bisher zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Prinzips jeweils nur einzelne, vorfunktionalisierte Gold-Nanopartikel gezeigt wurden, enthält die Erfindung insbesondere auch einen Nanopartikel-Baukasten zur Herstellung biofunktionalisierter Nanopartikel. Ein solcher Baukasten enthält eine Anzahl von standardisierten Grundbausteinen in Form vorfunktio- nalisierter Gold-Nanopartikel der oben beschriebenen Art. Um die genannte Standardisierung zu erreichen, wird dabei eine Grundmenge von Oligonuk- leotid-Strängen vorgegeben, die nur ein, zwei, drei, oder vier Elemente enthält. Beispielsweise wird eine Grundmenge M vorgegeben, die vier unterschiedliche Oligonukleotid-Stränge A, B, C, D mit jeweils 2 bis 18 Basen enthält.

Wie oben bereits allgemein erläutert, sind die Oligonukleotid-Stränge A, B, C, D mit Vorteil nicht codierend, insbesondere nicht humangenomcodierend, und weisen eine Schmelztemperatur oberhalb von 40 °C, insbesondere zwischen 40 °C und 70 °C auf. Dabei können insbesondere mehr als 60%, 65% oder sogar 70% der Basen der Oligonukleotid-Stränge Guanin und/ oder Cy- tosin sein.

Jedes vorfunktionalisierte Gold-Nanopartikel, das als standardisierter Grundbaustein des Baukastens in Frage kommt, ist durch ein oder mehrere bifunktionelle Moleküle der oben beschriebenen Art vorfunktionalisiert, wobei die kurzen Weiterfunktionalisierungsstummel der bifunktionellen Moleküle ausschließlich aus der Grundmenge M ausgewählt sind, also durch einen oder mehrere der Oligonukleotid-Stränge A, B, C oder D gebildet sein müssen. Konkret enthält ein erfindungsgemäßer Nanopartikel-Baukasten als erste standardisierte Grundbausteine Bi vorfunktionalisierte Gold-Nanopartikel, deren bifunktionelle Moleküle nur einen unterschiedlichen Weiterfunktiona- lisierungsstummel enthalten, der durch einen Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge M gebildet ist. Es gibt somit vier erste Grundbausteine, nämlich

Bi = {Au-NP:A, Au-NP:B, Au-NP:C, Au-NP:D}, wobei die Bezeichnung Au-NP:X bedeutet, dass der oder die Weiterfunktio- nalisierungsstummel des Gold-Nanopartikels (=Au-NP) durch den Oligonukleotid-Strang X gebildet ist. Es versteht sich, dass ein vorfunktionalisier- tes Gold-Nanopartikel Au-NP:X mehrere gleichartige bifunktionelle Molekü- le mit demselben Oligonukleotid-Strang X enthalten kann, um die Belegungsdichte zu erhöhen. Der einfachste Nanopartikel-Baukasten Ki besteht nun nur aus den vier Grundbausteinen Bi, also Ki = Bi.

Der nächst komplexeren Baukasten erhält man, wenn zu den ersten Grund- bausteinen Bi zweite standardisierte Grundbausteine hinzugefügt werden, bei denen die bifunktionellen Moleküle genau zwei unterschiedliche Weiter- funktionalisierungsstummel enthalten, die durch einen ersten bzw. zweiten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge M gebildet sind. Es gibt somit sechs zweite Grundbausteine, nämlich

{Au-NP:A,B, Au-NP:A,C, Au-NP:A,D

Au-NP:B,C, Au-NP:B,D, Au-NP:C,D}, wobei die Bezeichnung Au-NP:X,Y entsprechend bedeutet, dass die Weiter- funktionalisierungssturnmel des Gold-Nanopartikels zum Teil durch den Oligonukleotid-Strang X und zum Teil durch den Oligonukleotid-Strang Y gebildet sind. Der komplexere Nanopartikel-Baukasten K2 besteht somit aus den zehn ersten und zweiten Grundbausteinen K2 = Bi U B 2 .

Ein dritter Baukasten enthält neben den Grundbausteinen und B 2 noch dritte standardisierte Grundbausteine B3, deren bifunktionelle Moleküle genau drei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungsstummel enthalten, die durch drei verschiedene Oligonukleotid-Stränge aus der genannten Grundmenge M gebildet sind. Es gibt vier derartige dritte Grundbausteine, nämlich

B 3 = {Au-NP:A,B,C, Au-NP:A,B,D, Au-NP:A,C,D, Au-NP:B,C,D}, so dass der dritte Baukasten K3 = Bi U B 2 U B3 vierzehn Grundbausteine enthält. Schließlich enthält der vollständige Baukasten K4 auf Grundlage der Grundmenge M zusätzlich zu den genannten Grundbausteinen Bi, B 2 und B3 noch den standardisierten Grundbaustein, der alle vier Oligonukleotid- Stränge der Grundmenge M als Weiterfunktionalisierungsstummel enthält,

B 4 = {Au-NP:A,B,C,D}, und 4 = Βϊ U B 2 U B3 U B 4 . Mit einem solchen Baukasten K4 können bis zu vier unterschiedliche Biomoleküle in beliebiger Kombination und Reihenfolge an jeweils passende Grundbausteine des Baukastens angebunden werden. Die Grundbausteine sind standardisiert, da sie nur Oligonukleotid-Stränge aus der vorgegebenen Menge M enthalten. In einer Abwandlung enthält ein Nanopartikel-Baukasten Ks auf Grundlage der genannten Grundmenge M für jede Anzahl an unterschiedlichen Weiter- funktionalisierungsstummel nur jeweils einen Grundbaustein, also beispielsweise

Ks = {Au-NP:A, Au-NP:A,B, Au-NP:A,B,C, Au-NP:A,B,C,D}

Bei Verwendung dieses Baukastens Ks müssen die ersten anzubindenden Biomoleküle stets mit dem komplementären Gegenstrang zum Oligonukleo- tid-Strang A terminiert werden, die zweiten anzubindenden Biomoleküle mit dem komplementären Gegenstrang zum Oligonukleotid-Strang B, die dritten anzubindenden Biomoleküle mit dem komplementären Gegenstrang zum Oligonukleotid-Strang C und die vierten anzubindenden Biomoleküle mit dem komplementären Gegenstrang zum Oligonukleotid-Strang D.

Neben den genannten unterschiedlichen Vorfunktionalisierungen kann ein Nanopartikel-Baukasten auch Nanopartikel unterschiedlicher Partikelgröße, unterschiedlicher thermischer und/ oder chemischer Stabilität der Vorfunktionalisierungen, unterschiedlicher Belegungsdichte mit den Vorfunktionali- sierungsfunktionen und/ oder unterschiedlichem Koadsorbat zur Passivierung enthalten.

Die Herstellung von erfindungsgemäßen vorfunktionalisierten Gold- Nanopartikeln (Au-NP), vorteilhafte Eigenschaften derselben und einige Ausführungs- und Anwendungsbeispiele sind nachfolgend näher beschrieben. Beispiel 1: Darstellung von Au-NP-Bausteinen mit Oligonukleotid-Anker- Funktionen Zur Derivatisierung von Gold-Nanopartikeln sind mehrere Verfahren bekannt, beispielsweise die sogenannte Aussalzmethode, bei der die Anbin- dung Thiol modifizierter Oligonukleotide an citrat-stabilisierte Gold-NP in wässriger Lösung dadurch bewerkstelligt wird, dass die Salzkonzentration der Lösung über mehrere Tage erhöht wird.

Eine langsame Zunahme der Salzkonzentration lässt sich aber nicht nur wie bisher üblich durch Zugabe kleiner Salzmengen über einen längeren Zeitraum erreichen, sondern auch durch ein kontinuierliches Eindampfen der Lösung (aufkonzentrieren). Dies kann einfach und reproduzierbar in einem Vakuumkonzentrator (Speed- Vac) erreicht werden. Der Zeitaufwand wird dabei auf etwa 2 Stunden reduziert. Die Isolierung der derivatisierten Au- NP vom Lösungsansatz erfolgt über (mehrmalige) Ultrazentrifugation und Re-Suspendierung der pelletierten Au-NP. Andere Aufreinigungsmethoden über Chromatographie, Size Exclusion etc. sind weitaus aufwendiger als eine (mehrfache) Zentrifugation und weniger vollständig.

Es wurde gefunden, dass auf diese Weise auch routinemäßig gemischte De- rivatisierungen gelingen, d.h. die gleichzeitige Anbindung verschiedener thiol-modifizierter Oligonukleotide, wenn diese im entsprechenden Molver- hältnis angeboten werden, wobei der Molenbruch x des unterrepräsentierten Oligonukleotids im Verhältnis 1,4 x/ sqrt(l-x) eingesetzt werden soll, um eine x zu (1-x) Anbindung zweier verschiedener Oligonukleotide zu erreichen. Die Passivierung der Au-NP muss, unabhängig von der Art der Passivierung, nach Anbindung der Ankeroligos, idealerweise aber vor der Aufreinigung über Zentrifugation, durch Inkubation mit den Passivierungssubstan- zen (i.d.R. Alkanthiole oder Polyethylenglycole, PEG) in der Konzentration 10 mM über ca. 15 min erfolgen. Eine Passivierung gleichzeitig mit der Anbindung der Ankeroligos führt nicht zu einem einheitlichem Anbindungsund Passivierungsverhalten.

Die Belegungsdichte der Au-NP mit Thiol-Oligonukleotid- Ankern kann durch die Wahl der Oligonukleotid-Konzentrationsverhältnisse 'Oligonukle- otide zu unmodifizierte Nanopartikel', aber auch durch die Anzahl der Thi- olfunktionen bestimmt werden. Diese Methode ist auch für die Anbindung von Doppelsträngen und komplexen Konstrukten gut geeignet. Die Belegungsdichte der Nanopartikel kann dabei über die Anzahl der Thiolfunktio- nen und damit über den„footprint" der Ankerfunktion gezielt variiert werden kann. Es gelingen gezielte Variationen der Belegung von 20nm Nanopartikel mit 1-3, 10 (+2), 20 (+2), 40 (+3) und 60 (+3) Anbindungsoligos. Für eine optimale Weiterfunktionalisierung mit der Oligonukleotid- modif izierten Au-NP mit weiteren Oligonukleotiden über Gegenstrang- Hybridisierung ist neben der gezielten Belegungsdichte wichtig, die Oligo- nukleotid-Derivatisierungen an die citrat-stabilisierten Au-NP in Form von Doppelsträngen anzubinden und den (nicht thiol-modif izierten) Gegenstrang nachträglich vom Au-NP zu entfernen. Dies wird zeitgleich mit der Aufreinigung über Zentrifugation / Isolierung der vorfunktionalisierten Au- NP erreicht, indem die Au-NP bei einer Temperatur zentrifugiert werden, die knapp über dem Schmelzpunkt der anmodifizierten doppelsträngigen Oligonukleotide liegt. Im durch Zentrifugation erhaltenen Isolat aus Oligonukleotid-derivatisierten Au-NP können noch Au-NP-Edukte enthalten sein; deren Anteil lässt sich - bei gewünschter hoher Belegungsdichte- deutlich reduzieren, wenn die Thi- ol-modifizierten Oligonukleotide des Lösungsansatzes in deutlichem mola- rem Überschuss eingesetzt werden (z.B. zehn bis fünf zigfacher molarer Überschuss).

Beispiel 2: Agglomeration Unmodifizierte Au-NP sind in salzhaltigen Lösungen instabil und neigen dazu, zu agglomerieren. Dies führt unter anderem dazu, dass unmodifizierte Au-NP nach einer Pelletierung durch (Ultra-) Zentrifugation nur schwer zu re-suspendieren sind (was wiederum zur Abtrennung der unmodif izierter Au-NPs von (leichter re-suspendierbaren, vide infra) modifizierten Au-NPs ausgenutzt werden kann). Das Ausmaß einer solchen Agglomeration kann einfach anhand der Absorptionseigenschaften suspendierter/ gelöster Au- NP verfolgt werden.

Die Absorption wird durch das Gesetz von Lambert und Beer beschrieben (A = log (Io/I )= ecd; A: Absorption, Io:Intensität des eintretenden Lichtstrahls, I: Intensität des austretenden Lichtstrahls, e:Absorptions- / Extinktionskoeffizient, c: Konzentration und d:Schichtdicke). Da die optischen Eigenschaften im UV- Vis Spektrum durch die Oberflächenplasmonen des Goldes bestimmt werden, die größenabhängig sind, kann die Agglome- ration photospektrometrisch verfolgt werden: Zunehmende Agglomeration äußert sich entsprechend durch eine Verschiebung des Absorptionsmaximums zu längeren Wellenlängen, einer Abnahme der Absorption im Maximum und einer Verbreiterung des Spektrums. Entsprechende Re-Suspendierungsversuche wurden durchgeführt, bei denen sich in einer ersten Tube citrat-stabilisierte unmodifizierte Gold-NP (1) befinden, in einer zweiten Tube Au-NP, die über drei gekoppelte DTPA Funktionen (abgekürzt ,,(SS)3") mit Amino-C6-TTT-(SS)3 modifiziert wur- den und in einer dritten Tube Au-NP, die mit 5' CCT CCT TTA CCG TG A TT-(SS)3 modifiziert wurden, jeweils nach Trocknung der (gleichkonzentrierten) Lösungen über Nacht in der Vakuumzentrifuge und anschließend 0,2% PEG-SH durch einfaches schütteln re-suspendiert . Die beobachtbare Intensität der Rotfärbung der Lösung ist dabei direkt proportional zum Re-Suspendierungsgrad.

Unbehandelte citrat-stabilisierte Au-NP sind bei niedrigem Salzgehalt der Lösung gut löslich. Bei zunehmender Salzkonzentration agglomerieren jedoch auch citrat-stabilisierte Au-NP. Dies kann durch Modifikation der Au- NP mit Oligonukleotiden weitgehend vermieden werden wie in Fig. 7 dargestellt:

Fig. 7 zeigt jeweils links Absorptionsspektren verschiedener wässrig-gelöster Au-NP-Sorten unmittelbar nach Zugabe von 6fach PBS (Bezugszeichen 100, 102, 104) und die gleiche Lösung nach 120 min (Bezugszeichen 110, 112, 114): Oben: citrat-stabilisierte unmodifizierte Au-NP; Mitte Amino-C6-l 1 1-(SS)3; Unten Au-NP, die mit 5' CCT CCT TTA CCG TGA TT-(SS)3 modifiziert wurden. In der rechten Bildhälfte sind jeweils die Differenzspektren (Bezugszeichen 120, 122, 124) gezeigt. (PBS: Phosphate Buffered Saline: 37 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid und 12 mM Gesamt-Phosphat (in Form von HP0 4 2_ und H 2 P0 4 ~ ); der pH- Wert der eingestellten Pufferlösung ist 7,4. Die Eigenschaft als Pufferlösung ermöglicht das Arbeiten bei diesem konstanten pH- Wert, durch die verschiedenen Salze besitzt die Lösung den osmotischen Druck des menschlichen Organismus - isotonische Salzlösung). Beispiel 3: (Maximal-) Belegung in Abhängigkeit von der Ankerfunktion/ Zugänglichkeit 1ml citrat-stabilisierte Au-NP (2,7 pmol) werden mit 5nmol Oligonukleotide umgesetzt (vide supra). Die Oligonukleotide tragen am 3' Ende die unterschiedliche Thiol- Ankergruppe und am 5' Ende Fluoreszein (Abkürzungen für Thiol-Modifikationen der Oligonukleotide:„SH": einfache Thiol- modifizierte Oligonukleotide, HS-(CH2)6-Oligo;„SS": einfache Dithiol- Oligonukleotid R-S-S-Oligo, hier HO-(CH 2 ) 6 -S-S-( CH 2 )6-oligo, " (SS)N, N= 1...3, DTPA-modifizierte Oligonukleotide mit einem DTPA- Anker, zwei bzw. 3 direkt kovalent aneinander gekoppelten DTPA-Funktion).

Die Oligosequenz ist immer die gleiche (5' Fluo-CCT CCT TTA CCG TGA TT-Thiol), die Oligos werden als Einzelstrang eingesetzt (ohne Gegenstrang „GS", letzte Zeile, Bezugszeichen 130 in Fig. 8), mit kurzem GS (5' TCA CCG TAA AGG, mittlere Zeile, Bezugszeichen 132 in Fig. 8) hybridisiert oder hybridisiert mit vollständig komplementären Gegenstrang (5' CAA TCA CGG TAA AGG AGG; langer GS, vorderste Zeile, Bezugszeichen 134 in Fig. 8). Nach Inkubation der Au-NP mit dem jeweiligen Oligos für 2h werden nicht besetzte freie Au-Stellen mit PEG-SH„passiviert" (0,2%, 5min) und die Au- NP über Zentrifugation von der Lösung abgetrennt und in H 2 O resuspendiert. Danach werden die Konzentrationen der Partikel über UV-vis Messung bestimmt (je ca. 0,2 pmol/ ml) und 300μ1 der Partikelsuspension werden mit ΙΟΟμΙ 0,1M Kaliumcyanid-Lösung versetzt und lh bei Raumtemperatur inkubiert, um die Au-NP aufzulösen analog 2 Au + 4 CN- + H2O +1/2 O2 = 2 [Au(CN) 2 ]- + 2 OH-

Die rote Farbe der Gold-NP verschwindet, die Fluorophor-markierten Oligonukleotide werden frei und deren Fluoreszenz nicht mehr gequencht. Der Gehalt an fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide wird mit dem Fluorimeter bestimmt. Figur 8 zeigt die Messergebnisse, wobei entlang der y- Achse die untereinander korrelierte aber unnormierte Fluoreszenzintensität gezeigt ist.

Beispiel 4: Temperaturstabilität

Figur 9 illustriert die Temperaturstabilität. Dabei wurden zur Ermittlung der Temperaturstabilität der verschiedenen Thiol- Ankerfunktionen - wie bei Beispiel 3 geschildert - Oligo-modifizierte Au-NP mit langem (unmarkierten) GS verwendet. Die Partikel werden auf die in Fig. 9 angegebenen Tem- peraturen T aufgeheizt, die Temperatur wird für 5 min. gehalten und anschließend wird die Fluoreszenz der Lösung ermittelt, wobei die (Grund-) Fluoreszenz der Lösung bei 20°C abgezogen wird. Die so erhaltene, über die Temperaturerhöhungen akkumulierte, Fluoreszenzzunahme sollte daher ausschließlich durch thermisch abgelöste 5' Fluo-CCT CCT TTA CCG TGA TTG-Thiol-Moleküle entstehen, bei denen die Fluoreszenz von Fluorescein nicht mehr durch den Au-NP gelöscht wird. Die in Fig. 9 dargestellte Fluoreszenz ist zudem auf die Partikelkonzentration und die relative Gesamtbeladung pro Partikel bezogen und stellt daher eine untereinander korrelierende, ansonsten nicht normierte thermische Stabilität der Au-Thiol- Bindungen dar.

Wie aus Fig. 9 ersichtlich, sind bis 40 °C alle DTPA Oligos (1-3 Einheiten, SS , SS2, bzw. SS3) etwa identisch und alle stabiler als die Thiol-Oligos (SH und S-S). Ungewöhnlich erscheint die relativ schwache thermische Stabilität des einfachen DTPA- Ankers (SS)1 ab Temperaturen von 60 °C.

Beispiel 5: Reaktionen in nicht-wässrigem Medien

Die (Aktivierung und) Kopplung von Liganden kann nicht immer in Wasser/Puffer durchgeführt werden, da unpolare Liganden in wässrigen Medien oft unzureichend löslich bzw. einige Aktivierungsmethoden nicht mit Wasser kompatibel sind.

Es wurden daher modifizierte Au-NP für imunhistologische Färbungen hergestellt: Citrat stabilisierte Au-NP, H2N-TTT-(SS)3- Au-NP und H 2 N- CCT CCT TTA CCG TGA TT -(SS)3- Au-NP, je ca. 1,5 pmol in 1 mL werden 2x mit Wasser (Entfernung von Salzen) und anschließend 4 x mit Acetonitril gewa- sehen und zentrifugiert. Dem Pellet werden 500μ1 Acetonitril und ΙΟμΙ Divi- nylsulfon (DVS) zugefügt; die Gold NP sind unter diesen Bedingungen nicht suspendierbar, sie bilden ein Pellet oder (beim Citrat) eine rote Schicht auf der Wandung des Eppendorf f -Gefäßes. Die Proben wurden dann lh auf 60 °C erhitzt (1,4- Addition einer Doppelbindung des DVS an OH (Citrat) bzw. NH 2 ). Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird 3 x mit Acetonitril gewaschen, dann in Wasser aufnehmen. Es zeigt sich, dass nur die Oligo- Au-NP suspendierbar sind, während die Citrat-Gold-NP einen blauen Niederschlag auf der Wandung bilden. Beispiel 6:

Weiterfunktionalisierung der in Beispiel 5 DVS-aktivierten Gold-NP: Addition von Alkalischer Phosphatase / Avidin Konjugat an die aktivierte Dop- pelbindung.

Zu je 500μ1 0,03mg/ ml DVS-aktiviertem bzw. H 2 N- CCT CCT TTA CCG TGA TT -(SS)3- Au-NP in Wasser werden je 5μ1 Alkalischer Phosphatase / Avidin Konjugat (Sigma A-7294) gegeben und 24h bei RT inkubiert. Danach wird 4x mit je 500μ1 Wasser gewaschen.

Die Beladung der oligo-modifizierten Au-NP mit Alkalischer Phosphatase / Avidin kann über die Anbindung von Biotin-4-Fluoreszein an diese modifizierten NP bestimmt werden (Annahmen: keine Fluoreszenzlöschung, alle 4 Biotin Bindungsstellen des Avidins sind zugänglich): Eine erste Tube enthält Alkalischer Phosphatase (AP) / Avidin Konjugat modifizierte H2N- 1 1 1- (SS)3- Au-NP: 3 AP/ Avidin pro Partikel, eine zweite Tube Alkalischer Phosphatase (AP) / Avidin Konjugat modifizierte H 2 N- CCT CCT TTA CCG TGA TT -(SS)3- Au-NP: 15 AP/ Avidin pro Partikel.

Die Aktivität der AP wird über die Zugabe von alkalischem AP-Puffer und Substrat (NBT, Nitroblau-tetrazoliumchlorid /BCIP, 5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat) ermittelt. 5 min nach Zugabe von NBT/ BCIP ist trotz der höheren Anzahl von AP/ Partikel in der zweiten Tube die Farbentwicklung in der ersten Tube intensiver.

Zur Erläuterung der Aktivierung mit DVS: 1,4-Addition; Die Aktivierung von Alkoholen (ROH) erfolgt typischerweise im nichtwässrigen bei erhöh- ten Temperaturen, die Aktivierung von Aminen (RNH 2 ) kann wässrig oder nichtwässrig bei RT erfolgen.

Beispiel 7: Nachweis von miRNA 146a in Makrophagen mit standardisiertem Au-NP-Baustein Makrophagen, die zur Expression von miRNA 146a angeregt wurden, wurden mit 15nm Gold NP inkubiert. Die Gold NP waren wie folgt funktionali- siert:

5' ACT GAA TTC CAT GGG TT - Cy3 CCT CCT TTA CCG TGA TTG (SS)3 -Au-NP AC TCT TGA CTT AAG GTA CCC AA G GGA GGA AAT GGC ACT AAC Diese können einfach mittels des wässrig gut löslichen Au-NP-Bausteins CCT CCT TTA CCG TGA TTG (SS)3 -Au-NP (hergestellt analog Beispiel 1) durch sequentielle oder simultane Inkubation mit den Sequenzen Splint (3' AC TCT TGA CTT AAG GTA CCC AAG GGA GGA AAT GGC ACT AAC) und Target (5' ACT GAA TTC CAT GGG TT - Cy3) erhalten werden. Die Target-Sequenz ACT GAA TTC CAT GGG TT - Cy3 ist komplementär zur gesuchten miRNA 146a der Makrophagen und wird im Addukt bei Vorhandensein der miRNA 146a aus dem Addukt verdrängt. In diesem Fall wird die ansonsten vom Au-NP gelöschte Cy3 Fluoreszenz sichtbar. Figur 10 zeigt in a) eine Durchlichtauf nähme und in b) eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Makrophage, wobei aus der in Fig. 10 b) sichtbaren Fluoreszenz 140 deutlich zu erkennen ist, dass der gewählte Ansatz über den Au-NP-Baustein funktioniert.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung:

Ausgestaltung 1: Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel als standardisierter Grundbaustein biofunktionalisierter Nanopartikel, mit ei- nem thiolreaktiven metallischen Nanopartikel, das durch ein bifunktionelles Molekül vorfunktionalisiert ist, welches aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Weiterfunktionalisierungsstummel besteht, wobei

der Ankerbestandteil eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, und

- der kurze Weiterfunktionalisierungssturnmel für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

i) einem standardisierten Oligonukleotid-Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktionalisierung mit Biomolekülen mit einem ter- minalen komplementären Gegenstrang des standardisierten Oligo- nukleotid-Strangs,

ii) einem 1 bis 4 Basen langen Oligonukleotid mit Alkin- Terminus zur Weiterfunktionalisierung mit Azid-terminierten Biomolekülen, und

iii) einem 1 bis 4 Basen langen Oligonukleotid mit terminaler

Ni-Nitriloessigsäure zur Weiterfunktionalisierung mit His-Tag- terminierten Biomolekülen. Ausgestaltung 2: Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach Ausgestaltung 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) der Oligonukleo- tid-Strang eine Schmelztemperatur oberhalb von 40 °C, vorzugsweise zwischen 40 °C und 70 °C aufweist.

Ausgestaltung 3. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach Ausgestaltung 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) der Oligo- nukleotid-Strang nicht codierend, insbesondere nicht humangenomcodie- rend ist.

Ausgestaltung 4. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einer der Ausgestaltungen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall i) mehr als 60%, bevorzugt mehr als 65%, besonders bevorzugt mehr als 70% der Basen des Oligonukleotid-Strangs Guanin und/ oder Cyto- sin sind.

Ausgestaltung 5. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einer der Ausgestaltungen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nanopartikel mit mehreren bifunktionellen Molekülen mit demsel- ben Weiterfunktionalisierungsstummel versehen ist.

Ausgestaltung 6. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einer der Ausgestaltungen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nanopartikel zwei, drei oder vier unterschiedliche bifunktionelle Moleküle mit einem jeweils anderen standardisierten Weiterfunktionalisie- rungsstummel aufweist.

Ausgestaltung 7. Vorfunktionalisiertes metallisches Nanopartikel nach wenigstens einer der Ausgestaltungen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die metallische Oberfläche des Nanopartikels abseits der bifunktionellen Moleküle mit einer Passivierung, insbesondere über Alkanthiole oder Polyethylenglycole versehen ist. Ausgestaltung 8. Biofunktionalisiertes metallisches Nanopartikel, bei dem ein Biomolekül an den Weiterf unktionalisierungsstummel eines vorfunktio- nalisierten metallischen Nanopartikels nach einer der Ausgestaltungen 1 bis 7 angebunden ist. Ausgestaltung 9. Verfahren zum Herstellen eines biofunktionalisierten metallischen Nanopartikels, bei dem ein Biomolekül an den Weiterfunktio- nalisierungsstummel eines vorfunktionalisierten metallischen Nanopartikels nach einer der Ausgestaltungen 1 bis 7 angebunden wird. Ausgestaltung 10. Verwendung vorfunktionalisierter metallischer Nanopartikel nach einer der Ausgestaltung 1 bis 7 zur Anbindung von Biomolekülen.

Ausgestaltung 11. Nanopartikel, Verfahren oder Verwendung nach Ausge- staltung 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül durch ein Nukleinsäure-Oligomer, insbesondere ein einzel- oder partiell doppel- strängiges Nukleinsäure-Oligomer oder ein Protein gebildet ist.

Ausgestaltung 12. Nanopartikel-Baukasten zur Herstellung biofunktionali- sierter Nanopartikel, der als standardisierte Grundbausteine vorfunktionali- sierte metallische Nanopartikel enthält, und bei dem jeder Grundbaustein durch ein thiolreaktives metallisches Nanopartikel gebildet ist, das durch ein oder mehrere bifunktionelle Moleküle vorfunktionalisiert ist, welche jeweils aus einem Ankerbestandteil und einem kurzen Weiterfunktionalisierungs- stummel besteht, wobei

der Ankerbestandteil für jedes bifunktionelle Molekül eines Grundbausteins eine oder mehrere Dithiol-Phosphat-Gruppen umfasst, - der kurze Weiterfunktionalisierungsstummel für jedes bifunktionelle Moleküle eines Grundbausteins für die Anbindung einer gewünschten Biofunktionalisierung eingerichtet ist und aus einem Oligonukleo- tid-Strang mit 2 bis 18 Basen zur Weiterfunktionalisierung mit Biomolekülen mit einem terminalen komplementären Gegenstrang des OHgonukleotid-Strangs besteht, und wobei

der Oligonukleotid-Strang jedes der bifunktionellen Moleküle eines Grundbausteins aus einer Grundmenge vorbestimmter Oligonukleo- tid-Stränge ausgewählt ist, die vier oder weniger Oligonukleotid- Stränge enthält.

Ausgestaltung 13. Nanopartikel-Baukasten nach Ausgestaltung 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel-Baukasten

erste standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle nur einen unterschiedlichen Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, der durch einen ersten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet ist, und

zweite standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau zwei unterschiedliche Weiterfunktionalisierungs- stummel enthalten, die durch den genannten ersten Oligonukleotid- Strang und einen zweiten Oligonukleotid-Strang aus der genannten

Grundmenge gebildet sind.

Ausgestaltung 14. Nanopartikel-Baukasten nach Ausgestaltung 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel-Baukasten weiter dritte standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau drei unterschiedliche Weiterfunktionalisiemngsstummel enthalten, die durch den genannten ersten und zweiten Oligonukleotid- Strang und einen dritten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grund- menge gebildet sind.

Ausgestaltung 15. Nanopartikel-Baukasten nach Ausgestaltung 14,

dadurch gekennzeichnet, dass Nanopartikel-Baukasten weiter

vierte standardisierte Grundbausteine enthält, deren bifunktionelle Moleküle genau vier unterschiedliche Weiterfunktionalisierungssrummel enthalten, die durch den genannten ersten, zweiten und dritten Oligonukleotid-Strang und einen vierten Oligonukleotid-Strang aus der genannten Grundmenge gebildet sind. Ausgestaltung 16. Nanopartikel-Baukasten nach wenigstens einer der Ausgestaltungen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel- Baukasten Grundbausteine mit unterschiedlicher Partikelgröße und/ oder unterschiedlicher thermischer und/ oder chemischer Stabilität der verankerten Weiterfunktionalisierungsstummel und/ oder unterschiedlicher Bele- gungsdichte mit den bifunktionellen Molekülen und/ oder unterschiedlichem Koadsorbat zur Passivierung enthält.