ROSEOPURPUREUM - ПРОДУЦЕНТ КУРВУЛАРИНА

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма гриба Penicillium roseopurpureum, который может быть использован для получения микотоксина (вторичного метаболита) курвуларина, что в составе препаратов с фунгицидной активностью применяется для профилактики и защиты от болезней лекарственных растений, садовых, декоративных и других сельскохозяйственных культур.

Известны штаммы Penicillium citreo-viride, Penicillium baradicum и ряд других видов штаммов - продуцентов курвуларина. (Vesonder RF, Ciegler A., Fennell D., Tjarks LW, Jensen AH - Curvularin from Penicillium baradicum baghdadi NRRL 3754, and biological effects. / / Journal of environmental science and health. J Environ Sci Health Part В Pestic Food Contam Agric Wastes 1976, 11 (4) p. 289-297; S. Kosemura - Meroterpenoids From Penicillium citreo-viride B. IFO 4692 and 6200 Hybrid / / Tetrahedron, 2003, v.

Известные штаммы имеют меньшую способность к синтезу курвуларина и его производного гидрооксикурвуларина, а также характеризуются тем, что производят, кроме курвуларина, другие вторичные метаболиты, которые являются токсичными для млекопитающих, что ограничивает возможность их использования для защиты растений. В настоящее время в сельскохозяйственной микробиологии неизвестны штаммы-продуценты курвуларина, имеющие более высокую активность в готовом препарате и не токсичные для млекопитающих.

Наиболее близким к предложенному штамму является Penicillium citreo-viride (S. Kosemura - Meroterpenoids From Penicillium citreo-viride B. IFO 4692 and 6200 Hybrid / / Tetrahedron, 2003, v. 59, Ш 27, pp. 5055-5072), который, кроме курвуларина, производит вторичный метаболит цитреовиридин, он токсичен для млекопитающих, что препятствует его использованию в сельскохозяйственном производстве.

В основу изобретения поставлена задача получить штамм гриба Penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларина, путем использования методов селективного отбора из природной популяции штамма, который, имея способность к синтезу курвуларина и его производного гидрооксикурвуларина, характеризуется тем, что не производит, кроме курвуларина, другие метаболиты, это позволяет при его использовании получать препараты пригодные для экологически чистых технологий защиты растений.

Поставленная задача решается путем получения нового штамма гриба Penicillium roseopurpureum - продуцента курвуларина, который выделен из эпифитной микрофлоры хризантем, гриб был идентифицирован как Penicillium roseopurpureum (Dierckx, 1901), секция Monoverticillata lanata, стандартным методом микологических исследований, депонированный в депозитарии Института микробиологии и вирусологии имени Д.К.Заболотного НАН Украины с регистрационным номером Penicillium roseopurpureum 1MB F- 100055 (22 марта 2010 года).

В результате серии отборов предложеный (депонированный) штамм приобретает такие культурально-морфологические признаки и физиолого- биохимические свойства, обеспечивающие выработку курвуларина, который не проявляет токсические свойства по отношению к млекопитающим и, в составе препаратов защиты растений, является безопасным к окружающей среде.

Полученный штамм имеет следующие культурально- морфологические признаки и физиолого-биохимические свойства.

Культивируется на средах Чапека, Ваксмана, картофельно-глюкозном агаре (КГ А), сусло-агаре. Оптимальная температура культивирования - 25 - 28 ⁰ С. Максимальная скорость роста наблюдается в КГА (0,26 мм / час), меньше на сусло-агаре (0,21 мм / час), наименьшая скорость роста на среде Ваксмана (0,19 мм / час). На среде Чапека колонии растут медленнее (скорость роста составляет 0,18 мм / час). Колонии в центральной части повышенные, бороздчатые, серовато-белые, бледно-розовые, серовато- зеленые до орехово-зеленых. Конидиеносцы короткие 50 х 1,5 - 2 μ, отходят от ветвления переплетенных между собой воздушных гиф, иногда от погруженных в агар гиф, тогда они достигают до 100μ длиной, редко разветвленные, гладкостенные, на верхушке с моновертицилятными кисточками, которые состоят из 8 -20 стеригм, 6-7 х 1,5-2μ. Конидии шаровидные слабошероховатые 2-2,5 μ, быстро отпадают от стеригм. Реверзум оранжево-красный, ярко розовый или кирпичного цвета агар окрашен в те же цвета, но менее интенсивно.

Оптимальная температура роста штамма + (25-28) ⁰ С, растет и при более высоких температурах до +32 ° С и при низких температурах до +5 ° С. Оптимальная температура токсинообразования + 26 ° С.

Наибольшая активность штамма к тест культурам (в том числе и фитопатогенных организмов) наблюдается на 21 сутки культивирования на КГА (картофельно-глюкозного агаре).

Полученный штамм хорошо усваивает глюкозу.

Пример Ν° 1. Гриб Penicillium roseopurpureum-продуцент курвуларина культивировали в колбах Эрленмейера объемом 700 мл, содержащих 100 мл жидкой среды Чапека с глюкозой (20 г / л) как единственным источником углерода, в течение 21 суток при температуре (27-28) ⁰ С без доступа света. Из полученных культуральных фильтратов этого гриба путем трехкратной экстракции хлороформом и последующим упариванием экстрактов, был получен маслянистый остаток, после предварительной очистки от неполярных липидных примесей с помощью жидкость-жидкостного перераспределения (н-гескан-ацетонитрил), фракционировали с применением колоночной хроматографии. Элюция из колонки показала, что фракции No JNb 7-10 (хлороформ) имеют высокую активность в отношении индикаторных культур, а хроматографически представлены одним пятном с Rf 0,56 (система бензол: этилацетат: метанол, 5: 5: 1). Эти фракции объединяли и упаривали под пониженным давлением. Путем кристаллизации из бензола было получено 82,6 мг соединения белого цвета, которое было обозначено как Рг 10.

Содержание курвуларина определяли методом экстракции и колоночной хроматографии активных соединений / экстрагентов: хлороформ или этилацетат; динамиком хроматография: сорбент силикагель II степени активности по Брокману (100/160 мкм) элюента: н-гексан, хлороформ, ацетон и их системы; кристаллизации: из бензола или смеси метанол: н- гексан. С одного килограмма субстрата после вышеперечисленного токсинообразования получается курвуларин в количестве 16 г \ л.

Исследованые физико-химические и спектральные характеристики выделенных соединений (t ⁰ С, UV-и РЖ-спектры) дают основания для идентификации их с курвуларином и его производным гидрооксикурвуларином.

Пример N° 2. Содержание курвуларина определяли по кристаллическому выходу препарата. После биосинтеза гриба - продуцента на зерновом субстрате, выделение курвуларина с нативной культуры проводили путем трехкратной экстракции хлороформом с последующим упариванием. Выделение токсина из экстракта включало очистку путем жидкость- жидкостного перераспределения в системе ацетонитрилгексан с последующей переэкстракцией токсина в системе бензол: этилацетат: метанол (5:5: 1) и толуол: изопропанол: муравьиная кислота (6:3: 1), высушиванию, упариванию, осаждению до минимального объема селикагеля и хроматографией на колонке. Содержание курвуларинсодержащих фракций объединяли и проводили кристаллизацию митотоксина при комнатной температуре. Выход курвуларина путем кристаллизации из бензола составляет 82.6 мг, а гидрооксикурвуларина 12,7 мг с 5 л культурального фильтрата гриба.