以下、本発明を詳細に説明する。本発明� ��範囲はこれらの説明に拘束されることはな� ��、以下の例示以外についても、本発明の趣� ��を損なわない範囲で適宜変更し実施するこ� ��ができる。

1.本発明の概要
 本発明者は、図1(a)の概略図に示すように、 プロテインGの一部からなるタンパク質と、� �トレプトアビジンの一部からなるタンパク� �とを連結した融合タンパク質を作製した。� �1(a)は、本発明の融合タンパク質の一態様の� ��成を示す概略図であり、該融合タンパク質� ��、プロテインGの一部1(すなわちIgG抗体のFc� �域に対する結合部位を含む部分)と、ストレ� ��トアビジンの一部2(すなわちビオチンに対� �る結合部位を含む部分)とを構成成分として� ��むものであることを示している。
 また図2では、本発明の融合タンパク質の合 成スキームを概略的に示している。具体的に は、まず、Bo AkerstromらによるプロテインGのI gG抗体Fc領域に対する結合部位の研究結果(J.  Biol. Chem., vol.262, p.13388-13391, 1987)、及び、We berによるストレプトアビジンの結晶構造解析 を用いたビオチンとの結合領域の解析結果(Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p.2190-2194, 1989)� ��基づいて、公知のデータベースから、プロ� ��インG及びストレプトアビジンの各タンパク 質をコードする塩基配列情報を取得する。次 いで、取得した塩基配列情報から、各タンパ ク質の基質(IgG抗体Fc領域、ビオチン)結合部� �を含む部分をコードする塩基配列領域を選� �し、公知の遺伝子クローニング法により当� �塩基配列を有するcDNA断片の調製及び単離を� ��った。その後、当該cDNA断片を鋳型としたPCR 等によりクローニングを行って単離した各cDN A断片を、必要により互いに接合(ライゲーシ� ��ン)させた後、融合タンパク質が得られるよ うに発現ベクターのマルチクローニングサイ トに挿入した。このようにして得られた組換 え発現ベクターを大腸菌に導入して形質転換 体を作製し、形質転換体を培養してタンパク 質発現を行い、産生された融合タンパク質を 回収し精製した。

 本発明の融合タンパク質を用いれば、抗体( IgG抗体)と、ビオチン化した標識物質(オリゴD NA、HRP酵素等)とを、容易に効率よく結合させ ることが可能となる。すなわち、従来のカッ プリング法などを利用することなく、例えば 、適当な溶液に抗体とビオチン化した標識物 質とを混合添加し、その後、本発明の融合タ ンパク質を添加するだけで、極めて効率よく 所望の標識化抗体を作製することができる。
 従って、従来公知の標識物質、例えばHRP酵� ��及びALP酵素などの化学性物質や放射性物質� ��びにオリゴ核酸鎖などを、IgG抗体に結合さ� ��て標識化する場合に、従来より格段に容易� ��つ効率よく標識化を行うことができる。
 また、上述した融合タンパク質は、プロテ� ��ンGを用いた場合に問題となるアルブミン等 との非特異結合を生じる部位、及び、アビジ ン類タンパク質(ストレプトアビジン等)を用� ��た場合に問題となる当該タンパク質同士の� ��特異結合を生じる部位を含まない形で作製� ��ることができる。そのため、野生種のプロ� ��インG及びアビジン類タンパク質を用いて標 識化抗体を作製した場合に比べて、標的抗原 検出時の非特異結合を格段に抑制し、バック グラウンドを大きく低下させることができる 。その結果、検出感度が飛躍的に向上する。

 一方、本発明の融合タンパク質を用いれば� ��表面にビオチンを固相化したプレートやビ� ��ズに所望のIgG抗体を容易に結合させ固定化� ��ることができ、さらには、血液等の被験サ� ��プル中のIgG抗体を効率よく捕捉し回収する� ��とができるため、極めて有用である。
 以上の通り、本発明の融合タンパク質は、� ��的抗原や抗体の検出及び回収など、各種用� ��において極めて有用な態様で用いることが� ��き、実用性の高いものである。

2.融合タンパク質
 (1) 融合タンパク質
 本発明の融合タンパク質は、プロテインG又 はその一部からなるタンパク質と、アビジン 類又はその一部からなるタンパク質とを含ん でなる融合タンパク質である。
 ここで、「融合タンパク質」とは、一方の� ��ンパク質のアミノ酸配列と、他方のタンパ� ��質のアミノ酸配列とが、互いに直接連結し� ��なるか又はスペーサーとなる任意のアミノ� ��配列を介して間接的に連結してなる1つの(� �連の)アミノ酸配列からなるタンパク質を意� ��し、通常、両方のタンパク質の性質(例えば 結合活性など)を合わせ持つものである。ま� �、本発明でいう「融合タンパク質」は、上� �の直接又は間接的に連結したアミノ酸配列� �みからなるタンパク質であってもよいし、� �るいは、当該アミノ酸配列を一部に含むア� �ノ酸配列からなるタンパク質であってもよ� �、限定はされない。後者のタンパク質とし� �は、例えば、前者のタンパク質を構成する� �ミノ酸配列の両端又はいずれか一端に、他� �任意のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配� �からなるタンパク質が挙げられる。他の任� �のアミノ酸配列の長さは、特に限定はされ� �いが、例えば、1~300残基であることが好まし く、より好ましくは1~200アミノ酸残基であり� ��さらに好ましくは1~100アミノ酸残基である� �以下、本明細書において、「融合タンパク� �」とは、上述した前者のタンパク質及び後� �のタンパク質のいずれをも含む意味である� �

 また、「その一部からなるタンパク質」と� ��、所定のタンパク質(プロテインG及びアビ� �ン類)を構成するアミノ酸配列中の一部の領� ��内のアミノ酸配列からなるタンパク質のこ� ��を意味する。
 なお、本発明の融合タンパク質が、前記ス� ��ーサーとなるアミノ酸配列を介してなるも� ��である場合、スペーサーとなるアミノ酸配� ��の長さは、特に限定はされないが、例えば� ��1~100残基であることが好ましく、より好ま� �くは2~50アミノ酸残基であり、さらに好まし� ��は2~20アミノ酸残基であり、特に好ましくは 2~10アミノ酸残基であり、最も好ましくは2~5� �ミノ酸残基である。スペーサー長が上記範� �のときは、融合タンパク質の構成要素とな� �各タンパク質の立体構造が互いに障害とな� �ず、いずれのタンパク質の性質も十分に発� �され得る。また、スペーサーに用いるアミ� �酸残基としては、例えば、セリン、ヒスチ� �ンなどが好ましく、中でもヒスチジンがよ� �好ましい。これらのアミノ酸残基をスペー� �ーに用いた場合は、融合タンパク質の構成� �素となる各タンパク質の立体構造に与える� �響が低減され、いずれのタンパク質の性質� �十分に発揮され得る。

 本発明の融合タンパク質は、プロテインG とアビジン類とを含む融合タンパク質、特に プロテインGとアビジン類との融合タンパク� �であってもよいし、プロテインGとアビジン� ��の一部からなるタンパク質とを含む融合タ� ��パク質、特にプロテインGとアビジン類の一 部からなるタンパク質との融合タンパク質で あってもよいし、プロテインGの一部からな� �タンパク質とアビジン類とを含む融合タン� �ク質、特にプロテインGの一部からなるタン� ��ク質とアビジン類との融合タンパク質であ� ��てもよいし、プロテインGの一部からなるタ ンパク質とアビジン類の一部からなるタンパ ク質とを含む融合タンパク質、特にプロテイ ンGの一部からなるタンパク質とアビジン類� �一部からなるタンパク質との融合タンパク� �であってもよく、特に限定はされないが、� �えば、プロテインGの一部からなるタンパク� ��とアビジン類の一部からなるタンパク質と� ��融合タンパク質が好ましい。ここで、本発� ��でいう「アビジン類」とは、一般にビオチ� ��タンパク質との特異的結合能を有するアビ� ��ンタンパク質全般を意味し、例えば、アビ� ��ン、ストレプトアビジン及びニュートラア� ��ジンが好ましく挙げられ、中でも、ストレ� ��トアビジン及びニュートラアビジンが特に� ��ましい。

 本発明の融合タンパク質としては、例え� ��、プロテインGの一部からなるタンパク質と 、アビジン類又はその一部からなるタンパク 質とを含む融合タンパク質、特にプロテイン Gの一部からなるタンパク質と、アビジン類� �はその一部からなるタンパク質からなる融� �タンパク質であって、当該プロテインGの一� ��からなるタンパク質が、IgG抗体のFc領域と� �結合活性を有するタンパク質であることを� �徴とするものが好ましく挙げられる。プロ� �インG中の当該結合活性を有する部分を抽出� ��たタンパク質は、プロテインGが本質的に有 する各種成分(アルブミン等)との非特異的結� ��を、格段に低減することができるため、IgG� ��体との結合能に特化した融合タンパク質と� ��ることができる。そのため、当該融合タン� ��ク質を用いて作製した標識化抗体を標的抗� ��の検出方法において用いた場合(後述)、検� �時のバックグラウンドを大きく低減するこ� �ができ、検出感度を飛躍的に向上させるこ� �ができる。

 ここで、プロテインGの一部からなるタンパ ク質としては、具体的には、以下の(a)又は(b) のタンパク質が好ましく挙げられる。
(a)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む� �ンパク質、特に配列番号6に示されるアミノ� ��配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列におい� �1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し� ��は付加されたアミノ酸配列を含むか、特に� ��列番号6に示されるアミノ酸配列において1� �しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく� �付加されたアミノ酸配列からなり、かつIgG� �体のFc領域との結合活性を有するタンパク質

 なお、野生型プロテインGのアミノ酸配列 (配列番号2)及び当該アミノ配列をコードする 塩基配列(配列番号1)の情報は、公的データベ ースに登録されており、例えば、Swiss-Prot(http ://tw.expasy.org/uniprot/ からアクセス可能)には� �entry name:SPG1-STRSG、accession number:P06654」とし� ��登録されており、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.go v/ からアクセス可能)には「accession number:M138 25」として公表されている。上記(a)及び(b)で� ��う「配列番号6に示されるアミノ酸配列」は 、野生型プロテインGのアミノ酸配列(配列番� ��2)中の、第228番目~第268番目のアミノ酸配列� ��域からなるアミノ酸配列(計41アミノ酸残基) に相当する。また、野生型プロテインGのア� �ノ酸配列において、配列番号6に示されるア� ��ノ酸配列が、IgG抗体のFc領域との結合領域� �含む部分に相当するアミノ酸配列であるこ� �は、“Stephern R. et al., J. Bacteriology, vol. 1 67, p. 870-880 (1986)”を参照することにより理 解することができる。

 ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 」は、例えば、1個~10個程度、好ましくは1個~ 5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加さ� �たアミノ酸配列であることが好ましい。
 なお、上記「欠失、置換若しくは付加され� ��アミノ酸配列からなるタンパク質」は、IgG� ��体のFc領域との結合活性を安定して発揮し� �るタンパク質であることが重要である。そ� �ため、IgG抗体のFc領域との結合性(基質結合� �)に重要と考えられるアミノ酸残基などは、� ��生型プロテインGのアミノ酸配列から変異(� �失、置換又は付加)されていないことが好ま� ��い。
 本発明において、IgG抗体のFc領域との結合� �性の有無及び程度は、例えば精製した融合� �ンパク質をイムノプレート等に固相化した� �、ヤギ等の精製IgG抗体を添加してインキュ� �ートした後、HRP標識した抗ヤギIgG抗体等を� �作し、固相化したタンパクと結合した抗体� �を、公知の各種検出方法を用いて検出する� �とにより測定することができる(以下同様)。

 また、本発明の融合タンパク質としては� ��例えば、アビジン類の一部からなるタンパ� ��質と、プロテインG又はその一部からなるタ ンパク質とを含む融合タンパク質、特にアビ ジン類の一部からなるタンパク質と、プロテ インG又はその一部からなるタンパク質との� �合タンパク質であって、当該アビジン類の� �部からなるタンパク質が、ビオチンとの結� �活性を有するタンパク質であることを特徴� �するものが好ましく挙げられる。アビジン� �中の当該結合活性を有する部分を抽出した� �ンパク質は、アビジン類が本質的に有する� �己凝集活性(アビジン類分子同士が互いに結� ��する活性)に起因する非特異的結合を、格段 に低減することができるため、ビオチンとの 結合能に特化した融合タンパク質とすること ができる。そのため、当該融合タンパク質を 用いて作製した標識化抗体を標的抗原の検出 方法において用いた場合(後述)、検出時のバ� ��クグラウンドを大きく低減することができ� ��検出感度を飛躍的に向上させることができ� ��。

 ここで、アビジン類の一部からなるタンパ� ��質としては、具体的には、以下の(a)又は(b)� ��タンパク質が好ましく挙げられる。
(a)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む� �ンパク質、特に配列番号8に示されるアミノ� ��配列からなるタンパク質
(b)配列番号8に示されるアミノ酸配列におい� �1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し� ��は付加されたアミノ酸配列を含むか、特に� ��列番号8に示されるアミノ酸配列において1� �しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく� �付加されたアミノ酸配列からなり、かつビ� �チンとの結合活性を有するタンパク質

 なお、野生型ストレプトアビジンのアミ� ��酸配列(配列番号4)及び当該アミノ配列をコ� ��ドする塩基配列(配列番号3)の情報は、公的� ��ータベースに登録されており、例えば、Swis s-Prot(http://tw.expasy.org/uniprot/ からアクセス可� ��)には「entry name:SAV STRAV、accession number:P2262 9」として登録されており、GenBank(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/ からアクセス可能)には「accession  number:X03591」として公表されている。上記(a)� �び(b)で言う「配列番号8に示されるアミノ酸� ��列」は、野生型ストレプトアビジンのアミ� ��酸配列(配列番号4)中の、第39番目~第183番目� ��アミノ酸配列領域からなるアミノ酸配列(計 145アミノ酸残基)に相当する。また、野生型� �トレプトアビジンのアミノ酸配列において� �配列番号8に示されるアミノ酸配列が、ビオ� ��ンとの結合領域を含む部分に相当するアミ� ��酸配列であることは、“Carlos E. et al., Nuc leic Acids Res., vol. 14, p. 1871-1882 (1986)”を� �照することにより理解することができる。

 なお、アビジン類は通常ホモ4量体を形成 しており、1つのサブユニットにつき1つのビ� ��チン結合ドメインを有するため、タンパク� ��体で4つのビオチン結合ドメインを有してい ることになるが、本発明で用いるビオチン結 合ドメインは、1つのサブユニットがあるの� �好ましく、そのためには、4量体を形成せず� ��オチン結合ドメインを1つだけ有するような アビジン類の一部を使用するのが好ましい。 これまで単量体となるアビジン類変異体は活 発に研究されてきたが、成功していないこと が多かった(Qureshi, M. H., and Wong, S. L. (2002 ). Protein Expr Purif 25, 409-415.; Laitinen, O. H.� �et al., (2003). J Biol Chem 278, 4010-4014.)。し� �し、本発明においては、実施例に示すよう� �、ストレプトアビジンの39~183番目のアミノ� �配列を有するペプチドを使用することによ� �、ビオチンとの結合活性を失わない変異体� �作製することができた。

 ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 」としては、例えば、1個~10個程度、好まし� �は1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は� �加されたアミノ酸配列であることが好まし� �。
 なお、上記「欠失、置換若しくは付加され� ��アミノ酸配列からなるタンパク質」は、ビ� ��チンとの結合活性を安定して発揮し得るタ� ��パク質であることが重要である。そのため� ��ビオチンとの結合性(基質結合性)に重要と� �えられるアミノ酸残基などは、野生型スト� �プトアビジンのアミノ酸配列から変異(欠失� ��置換又は付加)されていないことが好ましい 。
 本発明において、ビオチンとの結合活性の� ��無及び程度は、例えば、融合タンパク質を� ��ムノプレート等に固相化した後、ビオチン� ��識したHRPを一定濃度の水溶液として添加し� ��洗浄し、次いで発色基質を添加することで� ��融合タンパク質に結合したビオチンの量を� ��公知の各種検出方法を用いて検出すること� ��より測定することができる(以下同様)。

 本発明の融合タンパク質としては、より具� ��的には、以下の(a)又は(b)のタンパク質が好� ��しく挙げられる。
(a)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む� ��ンパク質、特に配列番号10に示されるアミ� �酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10に示されるアミノ酸配列におい� ��1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し くは付加されたアミノ酸配列を含むか、特に 配列番号10に示されるアミノ酸配列において1 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく は付加されたアミノ酸配列からなり、かつIgG 抗体のFc領域との結合活性及びビオチンとの� ��合活性を有するタンパク質

 上記「配列番号10に示されるアミノ酸配� �」は、前述した配列番号6に示されるアミノ� ��配列と、配列番号8に示されるアミノ酸配列 とをそれぞれ構成成分として一部に含む一連 のアミノ酸配列である。なお、配列番号10に� ��されるアミノ酸配列中、第29番目~第69番目� �アミノ酸配列領域がプロテインGの一部から� ��るタンパク質を構成するアミノ酸配列(配列 番号6)であり、第76番目~第220番目のアミノ酸� ��列領域がアビジン類(具体的にはストレプト アビジン)の一部からなるタンパク質を構成� �るアミノ酸配列(配列番号8)であり、さらに� �70番目~第75番目のアミノ酸配列領域がスペー サー部分(オリゴペプチド)を構成するアミノ� ��配列であって、配列番号6に示されるアミノ 酸配列のC末端と、配列番号8に示されるアミ� ��酸配列のN末端とを連結しているアミノ酸配 列である。また、配列番号10に示されるアミ� ��酸配列中、第1番目~第28番目、及び第221番目 ~第301番目のアミノ酸配列領域が、前述した� �のアミノ酸配列に当たる部分である。

 ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 」としては、例えば、1個~10個程度、好まし� �は1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は� �加されたアミノ酸配列であることが好まし� �。
 なお、上記「欠失、置換若しくは付加され� ��アミノ酸配列からなるタンパク質」は、IgG� ��体のFc領域との結合活性及びビオチンとの� �合活性をいずれも安定して発揮し得るタン� �ク質であることが重要である。そのため、Ig G抗体のFc領域との結合性(基質結合性)に重要� ��考えられるアミノ酸残基、及び、ビオチン� ��の結合性(基質結合性)に重要と考えられる� �ミノ酸残基などは、野生型プロテインG又は� ��生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列か� ��変異(欠失、置換又は付加)されていないこ� �が好ましい。

 (2) 組換え遺伝子
 本発明の遺伝子は、上述した本発明の種々� ��融合タンパク質をコードする遺伝子を全て� ��むものである。中でも、配列番号6に示され るアミノ酸配列(プロテインGの一部からなる� ��ンパク質)と、配列番号8に示されるアミノ� �配列(ストレプドアビジンの一部からなるタ� ��パク質)との融合タンパク質をコードする遺 伝子が好ましい。このような遺伝子としては 、例えば、以下の(a)又は(b)のDNAと、以下の(c) 又は(d)のDNAとを含む遺伝子が好ましく挙げら れる。なお、当該遺伝子は、上記DNAの他に遺 伝子発現に必要な公知の塩基配列(転写プロ� �ーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター� ��)をも含むものであってもよく、限定はされ ない。

(a)配列番号5に示される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号5に示される塩基配列からなるDNA� �対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリ� �ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA� �あり、かつIgG抗体のFc領域との結合活性を有 するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号7に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号7に示される塩基配列からなるDNA� �対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリ� �ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA� �あり、かつビオチンとの結合活性を有する� �ンパク質をコードするDNA

 ここで、プロテインG又はその一部からな るタンパク質をコードする遺伝子DNA(例えば� �記(a)のDNA等)、及びアビジン類又はその一部� ��らなるタンパク質をコードする遺伝子DNA(例 えば前記(c)のDNA等)は、それぞれ、前述した� �生型プロテインGをコードする塩基配列(配列 番号1)及び野生型ストレプトアビジンをコー� ��する塩基配列(配列番号3)の塩基配列情報に� ��づいて、各種クローニング法及び/又は化学 合成法(DNA合成装置を用いる方法)等の公知の� ��製又は合成方法により得ることができる。

 なお、配列番号5に示される塩基配列は、 配列番号1に示される塩基配列のうちの第1259� ��目~第1381番目の領域に相当する塩基配列(123� ��基対)であり、配列番号7に示される塩基配� �は、配列番号3に示される塩基配列のうちの� ��164番目~第598番目の領域に相当する塩基配列 (435塩基対)である。

 本発明の融合タンパク質をコードする遺伝� ��としては、より具体的には、以下の(a')又は (b')のDNAを含む遺伝子が好ましく挙げられる� �なお、当該遺伝子は、上記DNAの他に遺伝子� �現に必要な公知の塩基配列(転写プロモータ� ��、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等)を� �含むものであってもよく、限定はされない� �
(a')配列番号9に示される塩基配列からなるDNA
(b')配列番号9に示される塩基配列からなるDNA� ��対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリ� ��ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA� ��あり、かつIgG抗体のFc領域との結合活性及� �ビオチンとの結合活性を有するタンパク質� �コードするDNA

 上記「配列番号9に示される塩基配列」は 、前述した配列番号5に示される塩基配列と� �配列番号7に示される塩基配列とをそれぞれ� ��成成分として一部に含む一連の塩基配列で� ��る。なお、配列番号9に示される塩基配列中 、第85番目~第207番目の塩基配列領域がプロテ インGの一部からなるタンパク質をコードす� �塩基配列(配列番号5)であり、第226番目~第660� ��目の塩基配列領域がアビジン類(具体的には ストレプトアビジン)の一部からなるタンパ� �質をコードする塩基配列(配列番号7)であり� �さらに第208番目~第225番目の塩基配列領域が� ��ペーサー部分(オリゴペプチド)をコードす� �塩基配列であって、配列番号5に示される塩� ��配列の3'末端と、配列番号7に示される塩基� ��列の5'末端とを連結している塩基配列であ� �。また、配列番号9に示される塩基配列中、� ��1番目~第84番目、及び第661番目~第903番目の� �基配列領域が、前述した他のアミノ酸配列� �コードする塩基配列に当たる部分である。

 前記(b)、(d)及び(b')のDNAは、それぞれ、前記 (a)、(c)及び(a')のDNA若しくはそれらと相補的� �塩基配列からなるDNA、又はこれらを断片化� �たものをプローブとして用い、コロニーハ� �ブリダイゼーション、プラークハイブリダ� �ゼーション、及びサザンブロット等の公知� �ハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAラ� ��ブラリーやゲノムライブラリーから得るこ� ��ができる。ライブラリーは、公知の方法で� ��製されたものを利用してもよいし、市販のc DNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用 してもよく、限定はされない。ハイブリダイ ゼーション法の詳細な手順については、Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Sprin g Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照する ことができる。
 ハイブリダイゼーション法の実施において� ��ストリンジェントな条件」とは、ハイブリ� ��イゼーション後の洗浄時の条件であって、� ��ッファの塩濃度が15~330mM、温度が25~70℃、好 ましくは塩濃度が15~150mM、温度が55~65℃の条� �を意味する。具体的には、例えば100mMで60℃� ��の条件を挙げることができる。さらに、こ� ��ような塩濃度や温度等の条件に加えて、プ� ��ーブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の� ��条件も考慮し、前記(b)、(d)及び(b')のDNAを得 るための条件を適宜設定することができる。

 前記(b)、(d)及び(b')のDNAに関し、ハイブリ ダイズするDNAとしては、それぞれ、前記(a)、 (c)及び(a')のDNAの塩基配列に対して少なくと� �40%以上の相同性を有する塩基配列であるこ� �が好ましく、より好ましくは60%以上、さら� �好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95 %以上、特に好ましくは98%以上、最も好まし� �は99%以上である。

 前記(b)、(d)及び(b')のDNAは、それぞれ、例え ば前記(a)、(c)及び(a')のDNAと比較したときに� �基配列は完全同一ではないが翻訳後のアミ� �酸配列は完全同一となるような塩基配列か� �なるDNA、すなわち前記(a)、(c)及び(a')のDNAに� ��イレント変異が導入されたDNAであることが� ��特に好ましい。このようなサイレント変異� ��導入されたDNAに代表される変異置換型のDNA� ��、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual� �2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)� ��Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley  & Sons (1987-1997) 等に記載の部位特異的変� ��誘発法に準じて調製することができる。具� ��的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手 法により、部位特異的突然変異誘発法を利用 した変異導入用キットを用いて調製すること ができ、当該キットとしては、例えば、QuickC hange ^TM  Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社� �)、GeneTailor ^TM  Site-Directed Mutagenesis System(インビトロジェ� �社製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan- K、Mutan-Super Express Km等:タカラバイオ社製)等 が好ましく挙げられる。また、所望のサイレ ント変異やミスセンス変異が導入されるよう に設計したPCRプライマーを用い、野生型プロ テインGや野生型ストレプトアビジンをコー� �するDNAをテンプレートとして、適当な条件� �でPCRを行うことにより調製することもでき� �。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、正確性の� �いDNAポリメラーゼであることが好ましく、� �えば、Pwo DNA(ポリメラーゼロシュ・ダイア� �ノスティックス)、Pfu DNAポリメラーゼ(プロ� ��ガ)、プラチナPfx DNAポリメラーゼ(インビト ロジェン)、KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡)、KOD- plus-ポリメラーゼ(東洋紡)等が好ましい。PCR� �反応条件は、用いるDNAポリメラーゼの最適� �度、合成するDNAの長さや種類等により適宜� �定すればよいが、例えば、サイクル条件で� �れば「90~98℃で5~30秒(熱変性・解離)→50~65℃� ��5~30秒(アニーリング)→65~80℃で30~1200秒(合成 ・伸長)」を1サイクルとして合計20~200サイク� ��行う条件が好ましい。

 本発明の遺伝子は、翻訳後の個々のアミ� ��酸に対応するコドンは、特に限定はされな� ��ので、転写後、ヒト等の哺乳類において一� ��的に用いられているコドン(好ましくは使用 頻度の高いコドン)を示すDNAを含むものであ� �てもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生� �や、植物等において一般的に用いられてい� �コドン(好ましくは使用頻度の高いコドン)を 示すDNAを含むものであってもよい。

 (3) 組換えベクター
 本発明の融合タンパク質を発現させるため� ��は、まず、上述した本発明の遺伝子が適当� ��発現ベクターに挿入された状態の組換えベ� ��ターを構築することが必要である。
 具体的には、プロテインG又はその一部を含 むタンパク質をコードする遺伝子と、アビジ ン類又はその一部を含むタンパク質をコード する遺伝子との2種の遺伝子をそれぞれ作製� �、両遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し� �組換えベクターを構築する。あるいは、当� �2種の遺伝子DNAを用いて予め作製しておいた� ��本発明の融合タンパク質をコードする遺伝� ��又はその一部(上記2種の遺伝子を含む)を、� ��当な発現ベクターに挿入した組換えベクタ� ��を構築する。
 発現ベクターの種類は、特に限定はされず� ��例えば、プラスミドDNA、バクテリオファー� ��DNA、レトロトランスポゾンDNA、レトロウイ� ��スベクター、人工染色体DNAなど、挿入した� ��伝子を保持し得るものであれば、使用する� ��主細胞に適したベクターを適宜選択して使� ��することができるが、前記2種の遺伝子を挿 入する場合の発現ベクターとしては、一般に 融合タンパク質遺伝子を作製することができ るものとして公知の発現ベクターを使用する ことが好ましい。このような発現ベクターと しては、例えば、pCR2.1(Invitrogen社)、pCR II(Invi trogen社)等が好ましく挙げられる。

 発現ベクターに挿入する遺伝子は、必要に� ��じ、予め、上流に転写プロモーター、SD配� �(宿主が原核細胞の場合)及びKozak配列(宿主が 真核細胞の場合)が連結されていてもよいし� �下流にターミネーターが連結されていても� �く、その他、エンハンサー、スプライシン� �シグナル、ポリA付加シグナル及び選択マー� ��ー等が連結されていてよい。なお、上記転� ��プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要� ��は、挿入する遺伝子に初めから含めておい� ��もよいし、発現ベクターに含まれている場� ��はそれを利用してもよい。
 発現ベクターに遺伝子を挿入する方法は、� ��えば、制限酵素を用いる方法や、制限酵素� ��用いない方法(例えばTAクローニング法)、あ るいはトポイソメラーゼを用いる方法など、 公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法 が採用できる。

 (4) 形質転換体
 上記組換えベクターを適当な宿主に導入し� ��形質転換体を得、これを培養することによ� ��、本発明の融合タンパク質を発現させるこ� ��ができる。なお、本発明で言う「形質転換� ��」とは宿主に外来遺伝子が導入されたもの� ��意味し、例えば、宿主にプラスミドDNA等を� ��入すること(形質転換)で外来遺伝子が導入� �れたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及� �ファージを感染させること(形質導入)で外来 遺伝子が導入されたものを、いずれも含む意 味である。
 宿主としては、組換えベクターが導入され� ��後、本発明の融合タンパク質を発現し得る� ��のであれば、特に限定はされないが、例え� ��、細菌及び酵母のほか、ヒトやマウス等の� ��種動物細胞、及び各種植物細胞等の公知の� ��主が挙げられる。

 細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌(DH5 α等)、枯草菌等が用いられる。
 酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカ� ��ミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、� ��ゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces  pombe)等が用いられる。
 動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒ� ��繊維芽細胞、CHO細胞、サル細胞COS-7、Vero、� ��ウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用い� ��れる。また、Sf9細胞、Sf21細胞等の昆虫細胞 を用いることもできる。
 植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タ� ��コBY-2細胞等が用いられる。
 形質転換体を得る方法は、限定はされず、� ��主と発現ベクターとの種類の組み合わせを� ��慮し、適宜選択することができるが、例え� ��、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒー� ��ショック法、PEG法、リン酸カルシウム法、D EAEデキストラン法、並びに、DNAウイルスやRNA ウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法 などが好ましく挙げられる。
 得られる形質転換体においては、組換えベ� ��ターに含まれる遺伝子のコドン型は、実際� ��用いた宿主のコドン型と一致していてもよ� ��し異なっていてもよく、限定はされない。

 (5) 融合タンパク質の製法
 本発明の融合タンパク質は、前述した形質� ��換体を培養する工程と、得られる培養物か� ��IgG抗体のFc領域との結合活性及びビオチン� �の結合活性を有するタンパク質を採取する� �程とを含む方法により製造することができ� �。
 ここで、「培養物」とは、培養上清、培養� ��胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破� ��物のいずれをも意味するものである。形質� ��換体の培養は、宿主の培養に用いられる通� ��の方法に従って行うことができる。目的の� ��合タンパク質は、上記培養物中に蓄積され� ��。
 形質転換体の培養に用いる培地は、宿主が� ��化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを� ��有し、当該培養を効率的に行うことができ� ��培地であれば、公知の各種天然培地及び合� ��培地のいずれを用いてもよい。例えば、宿� ��が大腸菌等の場合は、LB培地及びTB培地等の 汎用の培地を用いることができる。

 培養中は、形質転換体に含まれる組換えベ� ��ターの脱落及び目的の融合タンパク質をコ� ��ドする遺伝子の脱落を防ぐために、選択圧� ��かけた状態で培養してもよい。すなわち、� ��択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に� ��、相当する薬剤を培地に添加することがで� ��、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子で� ��る場合には、相当する栄養因子を培地から� ��くことができる。例えば、G418耐性遺伝子を 含むベクターで形質導入したヒト線維芽細胞 を培養する場合、培養中、必要に応じてG418(G 418硫酸塩)を添加してもよい。
 誘導性のプロモーターを有する発現ベクタ� ��により形質転換した形質転換体等を培養す� ��場合は、必要に応じ、好適なインデューサ� ��を培地に添加してもよい。
 形質転換体の培養条件は、目的の融合タン� ��ク質の生産性及び宿主の生育が妨げられな� ��条件であれば特に限定はされず、通常、10� �~40℃(好ましくは20℃~37℃)で、5~100時間培養� �行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカ リ溶液等を用いて行うことができる。培養方 法としては、固体培養、静置培養、振盪培養 、通気攪拌培養などが挙げられる。

 培養後、目的の融合タンパク質が菌体内又� ��細胞内に生産される場合は、菌体又は細胞� ��破砕することにより当該タンパク質を採取� ��ることができる。菌体又は細胞の破砕方法� ��しては、フレンチプレス又はホモジナイザ� ��による高圧処理、超音波処理、ガラスビー� ��等による磨砕処理、リゾチーム、セルラー� ��又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍� ��融解処理、低張液処理、ファージによる溶� ��誘導処理等を利用することができる。破砕� ��、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣(細 胞抽出液不溶性画分を含む)を除くことがで� �る。残渣を除去する方法としては、例えば� �遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応� �て、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除� �効率を上げることもできる。残渣を除去し� �後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画� �であり、粗精製したタンパク質溶液とする� �とができる。
 また、目的の融合タンパク質が菌体内又は� ��胞内に生産される場合は、菌体や細胞その� ��のを遠心分離、膜分離等で回収して、未破� ��のまま使用することも可能である。
 一方、目的の融合タンパク質が菌体外又は� ��胞外に生産される場合には、培養液をその� ��ま使用するか、遠心分離やろ過等により菌� ��又は細胞を除去する。その後、必要に応じ� ��硫安沈澱による抽出等により、培養物中か� ��目的の融合タンパク質を採取することがで� ��る。

 以上のように目的の融合タンパク質を採取� ��た後、さらに必要に応じて、透析、各種ク� ��マトグラフィー(ゲルろ過法、イオン交換ク ロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィ ー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニテ ィクロマトグラフィー等)を用いて単離精製� �ることもできる。アフィニティクロマトグ� �フィーを用いる場合は、IgG抗体を固相化し� �セルロース・ビーズ等を用いてアフィニテ� �カラム精製を行うことが好ましい。
 形質転換体等を培養して得られた融合タン� ��ク質の生産収率は、例えば、培養液当たり� ��菌体湿重量又は乾燥重量当たり、粗酵素液� ��ンパク質当たりなどの単位で、SDS-PAGE(ポリ� ��クリルアミドゲル電気泳動)等により確認す ることができる。
 また、目的の融合タンパク質の製造は、形� ��転換体の培養によるタンパク質合成系のほ� ��、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク� ��合成系を用いて行うこともできる。

 無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液� ��用いて試験管等の人工容器内で目的タンパ� ��質を合成する系である。また、使用し得る� ��細胞タンパク質合成系としては、DNAを鋳型� ��してRNAを合成する無細胞転写系も含まれる� ��この場合、使用する細胞抽出液の由来は、� ��述の宿主細胞であることが好ましい。細胞� ��出液としては、例えば真核細胞由来又は原� ��細胞由来の抽出液、より具体的には、CHO細� ��、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細� ��、小麦胚芽、出芽酵母、大腸菌などの抽出� ��を使用することができる。なお、これらの� ��胞抽出液は、濃縮又は希釈して用いてもよ� ��し、そのままでもよく、限定はされない。� ��胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリ� ��チレングリコール(PEG)沈殿等によって得る� �とができる。
 このような無細胞タンパク質合成は、市販� ��キットを用いて行うこともできる。例えば� ��試薬キットPROTEIOS ^TM (東洋紡)、TNT ^TM  System(プロメガ)、合成装置のPG-Mate ^TM (東洋紡)、RTS(ロシュ・ダイアグノスティクス )等が挙げられる。
 無細胞タンパク質合成によって産生された� ��的の融合タンパク質は、前述したように、� ��ロマトグラフィー等の手段を適宜選択して� ��製することができる。

3.標識化抗体
 (1) 標識化抗体
 本発明の標識化抗体は、IgG抗体、本発明の� ��合タンパク質(前記2.参照)、及びビオチン化 標識物質を含んでなるものであり、具体的に は、本発明の融合タンパク質を介して、IgG抗 体にビオチン化標識物質が結合された(固定� �された)ものである。
 IgG抗体としては、その由来は限定されず、� ��えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット� ��ラビット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サ� ��、ヒツジ、ウシ及びウマ等の哺乳類動物由� ��のIgG抗体が挙げられ、中でも、ヒト、マウ� ��、ラット、ラビット及びウサギ由来のIgG抗� ��が好ましい。
 IgG抗体は、所望の標的抗原に対して特異的� ��合能を有するものを用いることができる。� ��的抗原としては、例えば、ウイルス抗原及� ��/又は微生物抗原が挙げられる。ここで、抗 原となるウイルス及び微生物の種類は、特に 限定はされないが、例えば、C型肝炎ウイル� �、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス� ��大腸菌、破傷風菌、黄色ブドウ球菌及びク� ��ミジア等が挙げられ、中でも、C型肝炎ウイ ルスが好ましい。
 IgG抗体は、ポリクローナル抗体であっても� ��ノクローナル抗体であってもよく、限定は� ��れないが、モノクローナル抗体であること� ��好ましい。

 ビオチン化標識物質は、特異的抗体を用� ��た抗原検出方法において抗体の検出標識に� ��用され得る各種物質であって、ビオチン化� ��れたもの(ビオチンと結合させたもの)であ� �ばよく、特に限定はされない。ビオチン化� �識物質としては、例えば、ビオチン化され� �オリゴ核酸鎖(オリゴヌクレオチド鎖等)、並 びにビオチン化された各種化学物質(HRPやALP� �の酵素、蛍光物質、及び放射性物質等)など� ��挙げられ、中でもビオチン化されたオリゴ� ��酸鎖が好ましい。なお、標識物質のビオチ� ��化の方法は、限定はされず、公知の化学的� ��は酵素的処理(好ましくは化学的処理)によ� �ビオチンを導入する方法を採用することが� �きる。

 標識物質として用いる上記オリゴ核酸鎖と� ��ては、検出標識としての機能を持たせるた� ��、例えば、下記(A)~(I)から選ばれる少なくと も1つの処理が施されたものが好ましい。
  (A) 核酸増幅法で増幅可能な領域を設ける 処理
  (B) 制限酵素による切断部位を設ける処理
  (C) 放射性同位体元素を含有させる処理
  (D) 蛍光色素を結合させる処理
  (E) 酵素を結合させる処理
  (F) 光照射による切断部位を設ける処理
  (G) 活性酸素による切断部位を設ける処理
  (H) 標識処理デンドリマを結合させる処理
  (I) 塩基の種類において少なくとも1塩基� �違いを設ける処理

 これらの中でも、(A)、(B)及び(I)の処理は、� ��識処理が容易であり検出感度が高くなる等� ��点で好ましく、より好ましくは(A)及び(B)の� ��理である。
 また、(A)の処理と、(B)、(F)又は(G)の処理と� ��組み合わせた標識処理も好ましく、具体的� ��は、オリゴ核酸鎖を(B)、(F)又は(G)の処理に� ��り切断し、得られた断片を鋳型として(A)の� ��理により増幅することができるようにした� ��識処理等が挙げられる。このような標識処� ��をした場合は、抗原-抗体複合体から検出標 識となる断片を分離及び単離して鋳型とする ことができ、より効率的な増幅反応を行うこ とができるため、より一層検出感度を向上さ せることができる。

 上記(A)の処理を施したオリゴ核酸鎖とは、� ��酸増幅法に用いるプライマーとの結合領域� ��有するオリゴ核酸鎖である。核酸増幅法は� ��例えば、サーマルサイクラー等により複数� ��の温度制御条件下で反応を行う核酸増幅法( 例えばPCR法)や、恒温条件下で反応可能な核� �増幅法(例えばLAMP法、ICAN法)のいずれであっ� ��もよく、限定はされない。また、核酸増幅� ��による増幅領域は、オリゴ核酸鎖の一部で� ��ってもよいし全部であってもよい。
 ここで、PCR法用プライマーと結合する領域� ��は、フォワードプライマー(Fプライマー)及� ��リバースプライマー(Rプライマー)から構成� ��れるプライマーセットを設計する基となる2 領域を含む領域であり、かつ、このプライマ ーセットを用いて増幅され得る領域を意味し 、具体的な核酸配列は特に限定はされない。 なお、PCR法としては、検出及び定量の容易性 からリアルタイムPCR法が好ましいが、特にTaq Man法の場合は、前記オリゴ核酸鎖として、Taq Manプローブとの結合領域も有するものを用い る。

 LAMP法用プライマーと結合する領域とは、FIP 、BIP、F3プライマー、B3プライマー(必要に応� ��てLoop Primer F及び/またはLoop Primer B)から� �成されるプライマーセットを設計する基と� �る6領域を含む領域であり、かつ、このプラ� ��マーセットを用いて増幅され得る領域を意� ��し、具体的な核酸配列は限定されない。
 ICAN法用プライマーと結合する領域とは、2� �のキメラプライマー(F及びRプライマー)から� ��成されるプライマーセットを設計する基と� ��る2領域を含む領域であり、かつ、このプラ イマーセットを用いて増幅され得る領域を意 味し、具体的な核酸配列は限定されない。

 本発明において、標識物質として用い得る� ��リゴ核酸鎖としては、一本鎖若しくは二本� ��のオリゴヌクレオチド鎖(例えばオリゴDNA鎖 及びオリゴRNA鎖(特にオリゴDNA鎖))、オリゴペ プチド核酸鎖(オリゴPNA鎖とも言う)、又はこ� ��らの混合鎖が好ましく挙げられ、中でもオ� ��ゴヌクレオチド鎖がより好ましい。また、� ��発明でいうオリゴ核酸鎖は、その一部にオ� ��ゴペプチド鎖を含むものも包含し得る。な� ��、オリゴ核酸鎖は、天然物であっても合成� ��であってもよいが、通常は、合成物である� ��とが好ましい。
 標識として用いるオリゴ核酸鎖の鎖長は、� ��に限定はされないが、例えば、100~5,000merで� ��ることが好ましく、より好ましくは100~1,000m er、さらに好ましくは100~500merである。オリゴ 核酸鎖の鎖長が上記範囲を満たす場合、検出 感度の向上や検出時間の短縮を図ることがで きる。

 本発明の標識化抗体の作製方法は、前述� ��たIgG抗体、本発明の融合タンパク質(前記2.� ��照)、及びビオチン化標識物質を適宜混合し て互いに結合させればよく、限定はされない が、例えば、まず本発明の融合タンパク質と ビオチン化標識物質とを結合させ、該結合体 に対してIgG抗体を添加して結合させる手順に よる方法が好ましい。なお、必要に応じ、各 種クロマトグラフィー(ゲルろ過法、イオン� �換クロマトグラフィー、等電点クロマトグ� �フィー、疎水性クロマトグラフィー、アフ� �ニティクロマトグラフィー等)を用いて当該� ��識化抗体を精製単離することができる。

 (2) 抗体-融合タンパク質結合体
 本発明は、IgG抗体と本発明の融合タンパク� ��(前記2.参照)とを含んでなる、抗体-融合タ� �パク質結合体を包含するものである。なお� �IgG抗体の詳細については前述した通りであ� �。
 本発明の抗体-融合タンパク質結合体の作製 方法は、IgG抗体と本発明の融合タンパク質と を適宜混合して互いに結合させればよく、限 定はされない。なお、必要に応じ、前述した 各種クロマトグラフィーを用いて当該結合体 を精製単離することができる。
 本発明の抗体-融合タンパク質結合体は、種 々のIgG抗体にそれぞれ所望のビオチン化標識 物質を結合させたい場合、あるいはビオチン 化した支持体(プレート、ビーズ等)に所望のI gG抗体を結合させたい場合などに、有効利用� ��ることができる。

 (3) 融合タンパク質-標識物質結合体
 本発明においては、本発明の融合タンパク� ��(前記2.参照)とビオチン化標識物質とを含ん でなる、融合タンパク質-標識物質結合体を� �含するものである。なお、ビオチン化標識� �質の詳細については前述した通りである。
 本発明の融合タンパク質-標識物質結合体の 作製方法は、本発明の融合タンパク質とビオ チン化標識物質とを適宜混合して互いに結合 させればよく、限定はされない。なお、必要 に応じ、前述した各種クロマトグラフィーを 用いて当該結合体を精製単離することができ る。
 本発明の融合タンパク質-標識物質結合体は 、種々のIgG抗体にそれぞれ所望のビオチン化 標識物質を結合させたい場合などに有効利用 することができる。

 (4) 抗体標識用キット
 本発明の抗体標識用キットは、本発明の融� ��タンパク質(前記2.参照)、本発明の抗体-融� �タンパク質結合体(前記3.(2)参照)、及び本発� ��の融合タンパク質-標識物質結合体(前記3.(3) 参照)からなる群より選ばれる少なくとも1種� ��含むものである。当該キットは、前述した� ��発明の標識化抗体の作製に利用することが� ��き、極めて有用性が高いものである。
 本発明の抗体標識用キットは、上記列挙し� ��構成成分以外に、他の構成成分を含んでい� ��もよい。他の構成成分としては、例えば、I gG抗体及びビオチン化標識物質のいずれか又� ��両方が好ましく挙げられる。なお、IgG抗体� ��びビオチン化標識物質の詳細については前� ��した通りである。さらに、他の構成成分と� ��ては、例えば、各種バッファ、滅菌水、各� ��反応容器(エッペンドルフチューブ等)、ブ� �ッキング剤(Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk,  Goat血清等の血清成分)、アジ化ナトリウム� �の防腐剤、及び実験操作マニュアル(説明書) 等が挙げられる。

4.標的抗原の検出
 (1) 標的抗原の検出方法
 本発明の標的抗原の検出方法は、被験試料� ��含まれる標的抗原を検出する方法であって� ��標的抗原と本発明の標識化抗体(前記3.(1)参� ��)とを接触させて抗原-抗体複合体を形成さ� �る工程(抗原-抗体複合体形成工程)、及び抗� �-抗体複合体中の標識を検出する工程(標識検 出工程)を含む方法である。
 本発明の検出方法の好ましい一態様として� ��、例えば、被験試料に含まれる標的抗原が� ��数種類であり、かつ、本発明の標識化抗体� ��して当該標的抗原の種類に対応して識別し� ��るように標識処理された複数種類の標識化� ��体を用いる方法が挙げられる。すなわち、� ��該方法は、被験試料に含まれる標的抗原を� ��別検出する方法であり、当該識別検出は同� ��に(同一の反応系内で)行うことが好ましい� �
 なお、本発明の検出方法は、上述した各工� ��以外の他の工程を含んでいてもよい。他の� ��程は、公知の手段及び方法を用いて実施す� ��ことができる。

 (1-1) 抗原-抗体複合体の形成工程
 (i) 支持体
 本発明の検出方法においては、標的抗原は� ��支持体に固定された状態であってもよいし� ��支持体に固定されていない状態であっても� ��く、限定はされない。
 本発明において用い得る支持体としては、� ��的抗原を固定することができ、当該抗原に� ��体(抗体溶液)を接触させることができるも� �であればよく、通常、不溶性の材質及び形� �等のものが用いられる。例えば、抗原抗体� �応によるアッセイ系に用い得る支持体が好� �しく、具体的には、マルチプラスチックウ� �ルプレート、プラスチックビーズ、ラテッ� �スビーズ、磁性ビーズ、プラスチックチュ� �ブ、ナイロン膜、ニトロセルロース膜など� �挙げられる。
 また、支持体としては、後述するように、� ��的抗原に特異的に結合し得る抗体が支持体� ��面に固定化されたものを用いることができ� ��。このような支持体を用いれば、抗体を介� ��て標的抗原を固定することができる。支持� ��表面への抗体の固定化は、公知の種々の方� ��を用いて行うことができるが、前述した本� ��明の融合タンパク質(前記2.参照)を利用して 効率的に固定化する方法が好ましく挙げられ る。具体的には、表面をビオチン化しておい た支持体に、本発明の抗体-融合タンパク質� �合体(前記3.(2)参照)を接触させて、アビジン- ビオチン結合反応と同様の反応によって抗体 を固定化する方法、あるいは、表面をビオチ ン化した後に本発明の融合タンパク質を接触 させて当該融合タンパク質を結合させた支持 体に、所望のIgG抗体を接触させて抗体を固定 化する方法などが挙げられる。

 (ii) 標的抗原
 検出対象とする標的抗原の種類は、特に限� ��はされないが、例えば、前述したウイルス� ��び/又は微生物(例えばC型肝炎ウイルス)、各 種タンパク質(抗体タンパク質も含む)、ペプ� ��ド(オリゴペプチド、ポリペプチド等)、多� �類、糖脂質、各種核酸(DNAやRNA)、及びその他 低分子の化学合成物や生体成分等が挙げられ る。また、本発明の一実施形態として、単一 種類の標的抗原を検出対象とし、複数種類の 標識化抗体を用いて、標的抗原がどの標識化 抗体に対してより特異的に結合するかを特定 するアッセイ系も挙げられる。
 被験試料は、例えば、生体成分(組織や血液 )、食肉や野菜等の食品類、土壌や河川水、� �焼廃棄物等を挙げることができるが、限定� �されない。
 被験試料に含まれる標的抗原が複数種類の� ��合、その種類数は、特に限定はされないが� ��本発明の方法によれば、例えば、10種類以� �であっても特定の標的抗原を明確に識別検� �することができ、また50種類以上であっても よいし、さらには100種類以上であってもよい 。

 被験試料中の標的抗原の濃度は、限定はさ� ��ないが、本発明の方法によれば、例えば、� ��験試料1μLあたり標的抗原がngオーダー以下� ��濃度であっても、特定の標的抗原を明確に� ��別検出することができ、またpgオーダー以� �であってもよいし、さらにはfgオーダー以下 であってもよい。特に、本発明の標識化抗体 として、核酸増幅法により増幅可能なオリゴ 核酸鎖で標識したIgG抗体を用いた場合は、よ り低い標的抗原濃度であっても高い感度で識 別検出することができる。
 本発明の検出方法においては、標的抗原を� ��持体に固定しておいた上で本発明の標識化� ��体(溶液)と接触させ、これにより標的抗原� �標識化抗体との抗原抗体反応を行うことが� �き、標的抗原を支持体等へ固定せずに当該� �応を行ってもよい。さらに、これらを組み� �わせて行うようにしてもよい。

 標的抗原を支持体へ固定する方法としては� ��例えば、支持体表面に直接的に標的抗原を� ��定する方法、及び、標的抗原に特異的に結� ��する抗体を予め支持体表面に固定化した後� ��この固定化抗体に標的抗原を結合させるこ� ��で支持体表面に間接的に標的抗原を固定す� ��方法が挙げられるが、限定はされない。後� ��の間接的な固定方法の場合、被験試料中の� ��種多様な物質のうち標的抗原となり得るも� ��を予め選抜するができるため、検出感度や� ��出精度を高めることができる。なお、支持� ��に固定する抗体は、通常、後で添加する抗� ��(標識化抗体等)とは標的抗原に対して認識� �るエピトープが異なるものを用いる。
 標的抗原を支持体へ固定した場合は、その� ��抗体(標識化抗体等)を添加する前に、常法� �従い、ブロッキングを行うことが好ましい� �

 (iii) 標識化抗体
 本発明の検出方法においては、前述した本� ��明の標識化抗体(前記3.(1)参照)を用いる。こ こで、検出対象とする標的抗原が複数種類で ある場合は、本発明の標識化抗体としては、 当該抗原の種類に対応して識別し得るように 標識処理された標識化抗体を複数種類用いる 。標識化抗体における標識処理は、個々の標 的抗原を特異的に認識し得るIgG抗体ごとに単 一の(1種類の)標識処理が施されるようにし、 後の検出工程において標識の数及びその種類 の特定を行うことで、検出された標的抗原の 数及びその種類の特定を行うようにする。し かしこの態様には限定されず、例えば、単一 の標識処理を施した複数種類の標識化抗体(� �まり抗体部分が複数種類)を用いて、複数種� ��の標的抗原を1種類の検出標識で包括的に検 出することもできる。複数種類の標識化抗体 を用いる場合、各抗体はモノクローナル抗体 であることが好ましいが、限定はされない。

 なお、本発明の検出方法において、「支持� ��に固定された標的抗原と標識化抗体とを接� ��させる」とは、標的抗原と標識化抗体とを� ��接接触させて結合させる意味には限定はさ� ��ず、支持体に固定された標的抗原を特異的� ��認識する1次抗体を結合させ、次いでこの1� �抗体(又は1次抗体中の標識物質)を特異的に� �識する本発明の標識化抗体を接触させるこ� �で、標的抗原と標識化抗体とを間接的に結� �させる意味も含む。この間接的な結合の場� �は、1次抗体には、さらに2次抗体、3次抗体� �・・・n次抗体を結合させてもよく、その場� ��、本発明の標識化抗体としてはn次抗体と特 異的に結合し得るものを用いればよい。なお 、上記nの範囲は1~11であることが好ましく、� ��り好ましくは1又は2である。
 本発明の標識化抗体として、標的抗原の種� ��に対応して識別し得るように標識処理され� ��複数種類の標識化抗体を使用する場合につ� ��て、上記識別検出を可能とするための標識� ��質の標識処理の具体的態様を以下に説明す� ��。以下では、オリゴ核酸鎖を標識物質とし� ��前記3.(1)で説明した(A)若しくは(B)又はこれ� �を組み合わせた標識処理が施された標識化� �体を使用する場合を例に挙げて説明する。� �れらの標識処理が施された場合のほか、他� �標識処理が施された場合についても、公知� �術(例えば、WO2006/049289等)を参照することに� �り理解することができる。

 前記(A)の標識処理の場合は、例えば、他の� ��体のオリゴ核酸鎖とは増幅断片の長さが異� ��るようにするか、他の抗体のオリゴ核酸鎖� ��らは増幅断片が得られないようにするか、� ��るいは、これらを組み合わせて行うこと等� ��より、識別検出することができる。
 増幅断片の長さが異なるようにすることは� ��具体的には、同一のプライマーを用いた場� ��であっても、プライマーの結合位置が異な� ��、増幅可能な領域の幅(長さ)がオリゴ核酸� �同士で異なるように合成しておくこと等に� �り実施できる。増幅断片の長さの差は、限� �はされないが、良好な感度で識別検出でき� �点で、5mer以上であることが好ましく、より� ��ましくは10mer以上、さらに好ましくは50mer以 上である。

 前記(B)の標識処理の場合は、例えば、他の� ��体のオリゴ核酸鎖とは制限酵素処理後に得� ��れる断片の長さが異なるようにするか、他� ��抗体のオリゴ核酸鎖からは制限酵素処理後� ��断片が得られないようにするか、あるいは� ��これらを組み合わせて行うこと等により、� ��別検出することができる。
 制限酵素処理後に得られる断片の長さが異� ��るようにすることは、具体的には、抗体に� ��合させるオリゴ核酸鎖の長さは標識化抗体� ��士で実質的に同じであるが、制限酵素によ� ��切断位置が互いに異なるように合成してお� ��か、又は、抗体に結合させるオリゴ核酸鎖� ��長さ自体をオリゴ核酸鎖同士で異なるよう� ��合成しておくこと等により実施できる。制� ��酵素処理後の断片の長さの差は、限定はさ� ��ないが、良好な感度で識別検出できる点で� ��10mer以上であることが好ましく、より好ま� �くは50mer以上、さらに好ましくは100mer以上で ある。
 前記(A)と(B)を組み合わせた標識処理の場合� ��、具体的には、前記(A)の標識処理において� ��オリゴ核酸鎖中の核酸増幅可能な領域より� ��抗体側に、制限酵素切断部位を設けておく� ��外は、前記(A)の標識処理と実質的に同様で� ��る。増幅可能な領域を含む断片(テンプレー ト)を標識化抗体から分離した後に核酸増幅� �を行うことにより、増幅効率を向上させる� �とができ、検出感度を一層高めることがで� �る。

 (iv) 抗原抗体反応
 支持体に固定(コーティング)した標的抗原� �、本発明の標識化抗体(溶液)を接触させる場 合は、通常、予め公知のブロッキング液でブ ロッキング処理を施し、PBS等の公知の洗浄液 でよく洗浄しておく。その後、標識化抗体を 含む溶液を適量添加し、室温で30~60分間攪拌� ��ながら、標的抗原と標識化抗体との結合反� ��を行い、抗原-抗体複合体を形成させ、再度 よく洗浄することが好ましい。
 一方、支持体等に固定していない標的抗原� ��、本発明の標識化抗体(溶液)を接触させる� �合は、通常、標的抗原を含む被験試料に対� �て適当な前処理を行い、標的抗原以外の不� �物を除去あるいは少なくしておくことが好� �しい。

 (1-2) 標識検出工程
 形成した抗原-抗体複合体中の標識物質の検 出は、使用した標識化抗体中の標識物質の種 類により異なる。以下では、オリゴ核酸鎖を 標識物質とし、前記3.(1)で説明した(A)若しく� ��(B)又はこれらを組み合わせた標識処理が施� ��れた標識化抗体を使用する場合を例に挙げ� ��標識物質の検出方法を説明する。これらの� ��識処理が施された場合のほか、他の標識処� ��が施された場合の標識物質の検出方法につ� ��ても、公知技術(例えば、WO2006/049289等)を参� ��することにより理解することができる。

 前記(A)の標識処理の場合は、例えば、常法� ��従い、設計した所定のプライマー等を添加� ��、PCR(例えば約5~30サイクル)等の核酸増幅法� ��より特定の領域を増幅した断片を得る。得� ��れた増幅断片は、濁度測定や目視により容� ��に検出することができるほか、アガロース� ��ル等を用いた各種電気泳動法により検出す� ��ことができ、増幅断片の長さを比較すれば� ��数種類の標識物質を識別検出することがで� ��る。また、蛍光標識したプライマーを用い� ��場合は、得られた増幅断片をDNAシークエン� ��ー(例えばApplied Biosystems社製、製品名:ABI-310 0)を用いたGeneScanソフトウェアで解析するこ� �により検出することができ、ピーク位置及� �その高さを同定し比較すれば複数種類の標� �物質を識別検出することができる。さらに� �蛍光標識したプライマー、及びプローブ(TaqM anプローブ等)を用いた場合は、得られた増幅 断片をリアルタイムPCR法により検出すること もできる(例えば、ストラタジーン社製、製� �名:MX-3005pリアルタイムPCR装置 ; Applied Biosys tems社製、製品名:StepOne ^TM  Real-Time PCR System、7300 Real-Time PCR System等)� ��

 前記(B)の標識処理の場合は、例えば、常法� ��従い、所定の制限酵素溶液を添加して、オ� ��ゴ核酸鎖を切断する。得られた断片は、ア� ��ロースゲル等を用いた各種電気泳動法によ� ��検出することができ、増幅断片の長さを比� ��すれば複数種類の標識物質を識別検出する� ��とができる。当該検出において、抗原の量� ��少なかった場合など、制限酵素処理後の断� ��濃度が低いときは、必要に応じ、当該処理� ��の反応液をスピンカラム等で遠心沈降して� ��縮することが好ましい。
 前記(A)と(B)を組み合わせた標識処理の場合� ��、例えば、制限酵素処理後の遊離断片をテ� ��プレートとして、設計した所定のプライマ� ��等を添加し、PCR(例えば約5~30サイクル)等の� ��酸増幅法により特定の領域を増幅した断片� ��得る。得られた増幅断片の検出方法につい� ��は、(A)の標識処理の場合と同様である。

 本発明においては、標識検出工程で得ら� ��た結果を指標とすることにより、被験試料� ��の標的抗原量(例えばC型肝炎ウイルス量等)� ��定量することもできる。当該定量は、上記� ��各種検出方法と併用される公知の定量手法� ��ら適宜選択して行うことができる。具体的� ��定量方法としては、例えば、デンシトメー� ��ーによる電気泳動後のバンド濃度の測定、� ��光光度計や分光光度計による増幅産物の濁� ��測定(モニタリング)、分光蛍光光度計によ� �蛍光強度測定(モニタリング)等による測定結 果を指標とし、予め作成しておいたコントロ ールの測定結果(検量線など)と比較換算する� ��とにより定量する方法が好ましく挙げられ� ��。

 (2) 標的抗原検出用キット
 本発明の標的抗原検出用キットは、本発明� ��標識化抗体(前記3.(1)参照)を含むものである 。ここで、当該キットが、複数種類の標的抗 原の識別検出を目的とするキットの場合は、 上記標識化抗体は、標的抗原の種類に対応し て識別し得るように標識処理された複数種類 の標識化抗体であることが好ましい。
 また、本発明は、本発明の抗体-融合タンパ ク質結合体(前記3.(2)参照)及びビオチン化標� �物質、又は、本発明の融合タンパク質-標識� ��質結合体(前記3.(3)参照)及びIgG抗体を含む、 標的抗原検出用キットを包含するものである 。
 本発明の標的抗原検出用キットは、前述し� ��本発明の標的抗原の検出方法に利用するこ� ��ができ、極めて有用性が高いものである。

 本発明の標的抗原検出用キットは、上記� ��成成分以外に、他の構成成分を含んでいて� ��よい。他の構成成分としては、例えば、HRP� ��はALP標識一次抗体、制限酵素、DNAポリメラ� ��ゼ、PCRプライマー、dNTP、各種バッファ、滅 菌水、エッペンドルフチューブ、フェノール クロロホルム、クロロホルム、エタノール、 核酸共沈剤、各種ゲル(粉末)、フリーラジカ� ��産生遊離試薬(HRP及びFe錯体等)、ブロッキン グ剤としてBovine Serum Albumin (BSA), Skim milk,  Goat血清等の血清成分、及び各種detergent、DNA� �ンターカレーター等の蛍光試薬、光反応物� �、各種プレート(抗体固定化プレートを含む) 、各種ビーズ(抗体固定化ビーズを含む)、ア� ��化ナトリウム等の防腐剤、並びに実験操作� ��ニュアル(説明書)等のほか、必要に応じ、� �種電気泳動装置やPCR等実験機器等も挙げら� �る。

5.抗原又は抗体の回収
 (1) 抗体固定化支持体
 本発明の抗体固定化支持体は、表面がビオ� ��ン化された支持体、本発明の融合タンパク� ��(前記2.参照)、及びIgG抗体を含んでなる支持 体である。本発明の抗体固定化支持体は、具 体的には、ビオチン化された支持体表面に、 本発明の融合タンパク質を介してIgG抗体が結 合してなる支持体である。
 本発明の抗体固定化支持体は、例えば、サ� ��ドイッチ法を用いた抗原検出方法に用いる� ��持体として使用することができる。また、� ��験試料中の標的抗原の捕捉及び回収に用い� ��ことができる。従って、本発明は、被験試� ��中の標的抗原と上記抗体固定化支持体とを� ��触させる工程、及び当該接触後の前記支持� ��を回収する工程を含む、標的抗原の回収方� ��を包含するものである。
 また本発明は、上記抗体固定化支持体を含� ��抗原回収用キットを包含するものである。� ��該キットには、被験試料からの抗原回収に� ��要な公知の各種構成成分を含めることがで� ��る。

 (2) 融合タンパク質固定化支持体
 本発明の融合タンパク質固定化支持体は、� ��発明の融合タンパク質(前記2.参照)と、表面 がビオチン化された支持体とを含んでなる支 持体である。本発明の融合タンパク質固定化 支持体は、具体的には、ビオチン化された支 持体表面に本発明の融合タンパク質が結合し てなる支持体である。
 本発明の融合タンパク質固定化支持体は、� ��験試料中の標的抗体の捕捉及び回収に用い� ��ことができる。従って、本発明は、被験試� ��中の標的抗体と上記融合タンパク質固定化� ��持体とを接触させる工程、及び当該接触後� ��前記支持体を回収する工程を含む、標的抗� ��の回収方法を包含するものである。
 また本発明は、上記融合タンパク質固定化� ��持体を含む抗体回収用キットを包含するも� ��である。当該キットには、被験試料からの� ��体回収に必要な公知の各種構成成分を含め� ��ことができる。