含嘧啶或吡啶的稠环化合物及其作为抗肿瘤药 物的应用 技术领域

本发明涉及一类稠环类化合物、 其制备方法及该类化合物在防治 肿瘤等相关疾病中的应用。 背景技术

蛋白酪氨酸激酶家族以跨膜受体或胞质形式通 过磷酸化和去磷酸 化广泛地参与细胞信号转导。 在肿瘤发生过程中， 变异或过度表达的 蛋白酪氨酸激酶可以将正常细胞转变为癌细胞 ， 同时促进肿瘤细胞的 生长和有丝分裂。 因此， 可以使用这些酶的激动剂或抑制剂应用于肿 瘤的治疗。 表皮生长因子受体 (EGFR)酪氨酸激酶家族， 包括四个成员： ErbB-K ErbB-2、 ErbB-3, ErbB-4。 已知 60°/。的肿瘤中存在 1个或多个 ErbB受体过度表达， 尤其在实体瘤中， 如肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 前 列腺癌、 胃癌、 卵巢癌等。血管内皮生长因子受体 (VEGFR)家族成员目 前已发现有 5 种， 其中 3 种属于酪氨酸激酶受体超家族， 依次为 VEGFR-K VEGFR-2 、 VEGFR-3。 VEGFR的高表达以及新生血管是 肿瘤生长的先决条件， 因而阻断 VEGF 的信号转导， 抑制血管生成成 为非常有吸引力的肿瘤治疗策略。 单独使用 VEGF抑制剂可以抑制血管生成， 但早期实验室研究表 明， 单独运用 VEGF抑制剂药物如贝伐单抗或舒尼替尼来抑制 VEGF 信号可能会引起一些副作用包括促进肿瘤细胞 的侵袭转移。 肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF), 也称离散因子 (Scatter Factor, SF)， 是一种多功能的细胞因子， 具有促进肝细胞、 上 皮细胞、 内皮细胞、 造血细胞等多种类型细胞的生长、 迁移和形态发 生的作用。 c-Met跨膜蛋白是一种由 c- met原癌基因编码的蛋白产物， 为 HGF的髙亲和性受体。 当 HGF与其受体 c-Met结合后， 导致 c-Met 酪氨酸激酶发生自身磷酸化，从而激活 c-Met酪氨酸激酶活性，进一歩 活化细胞内多种不同的下游信号分子， 诱导细胞发生一系列生物学效 应， 如细胞分散、 运动、 增殖、 侵袭、 迁移、 以及最终转移及血管生 成等 (Bottaro等， Science, 1991 , 251， 802-804)。 大量研究巳表明， HGF/c-Met信号传递在恶性肿瘤的发生、 发展 及继发的转移中发挥着重要的作用， 同时与患者的不良预后密切相关 (Sattler等， Curr Oncol Rep, 2007， 9， 102-108； Mazzone等， FASEB J， 2006, 20， 1611-1621； Tmsolino等， Nature Rev, Cancer 2002, 2, 289-300)。 c-Met的持续激活将破坏肿瘤细胞间的粘附， 促进细胞运动 及肿瘤新生血管的生成， 使肿瘤细胞易于进入血液循环并获得侵袭转 移的能力。 在多种癌症中， c-Met和 HGF相对于周围组织呈过度表达， 如甲状腺癌、 乳腺癌、 肺癌、 胃癌、 结肠癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 肾 癌、肝癌、卵巢癌、和脑胶质瘤等 (Birchmeier等， Nat Rev Mol Cell Biol, 2003 , 4， 915-925； Otsuka等， Cancer Res, 1998， 58 , 5157-5167；

Parr等， Clin Cancer Res, 2004, 10， 202-211)。 另有研究显示， MET 基因扩增与 20%的表皮生长因子抑制剂 (如 VEGFR抑制剂、 EGFR抑制 剂)获得性耐药密切相关 (Engelman等， Science, 2007， 316, 1039-1043)。 研究发现当 VEGF和 c-Met同时被抑制时， 不但肿瘤体积减少， 其侵 袭转移也被会抑制。 因此， 开发同时靶向 VEGF信号通路和 HGF/c-Met信号通路及其 他肿瘤通路的多靶点抗肿瘤化合物可以有效改 进目前的癌症治疗。 发明内容

本发明的目的是公开一类稠环化合物及其作为 抗肿瘤药物的应 用， 以发现具有新结构类型多靶点抗肿瘤化合物， 满足临床应用的需 要。 本发明所述的稠环类类化合物， 为具有如式 (I)所示的化合物或其 药学

其中：

和 R ₃ 各自独立地选自氢、 Cw垸基、 d_ ₅ 烷氧基、 氨基、 卤素、 氰基、 硝基、 取代氨基、 杂环基或取代杂环基；

其中：

所述的 烷基优选甲基、 乙基或异丙基；

所述取代氨基优选 C^垸基氨基、 吗啡啉 -N-丙基氨基、 哌啶 -4- 甲基氨基或哌嗪 -1-丙基；

所述杂环基优选吗啡啉 -1-基、 哌啶 -4-基或哌嗪 -ί-基；

所述取代取代杂环基为杂环基含有 1〜4个取代基， 取代基优选羟 基、 甲氧基、 甲基或氨基；

Υ选自 ΝΗ, 0或 S ;

选自 C或 Ν;

选自 0或丽；

Ar是 5至 7元环芳香环体系， 其任选被 0至 2个卤素取代， 所述 的 Ar优选苯基或吡啶， 其中所述苯基或吡啶中的每一个任选被 0至 2 个卤素取代；

G是基团 B-L-T， 其中：

B是 -N(R ¹³ )-、 -C(=S)-或 -C(=0)- _;

L选自 -CCO)N(R ^I3 )-、 -C(=0)Q 烷基 _C(=0)N(E °)-、 和 -C(=0)-， 其中上述 L基团的垸基是任意取代的；

T选自: -CG. ₅ 烷基、 -Co. ₅ 烷基 -Q、 -0- C _Q . ₅ 烷基 -Q、 -0- .5垸基、 -C(=S)-N(R ¹³ )-C。_ ₅ 烷基- Q、 -C(=0)-N(R ¹³ )-C。. ₅ 烷基 -Q、 -C。 _-5 烷基 -S(0) ₂ -Q、 -C(-S)-N(R ^I3 )-C ₀ -5烷基和 -C(=0)-N(R ⁱ³ )-C。_ ₅ 烷基,其中每个 C _fl . ₅ 烷基是任意取代的；

优选的所述的 0为： 其中：

R ¹³ 独立地选自 -H或 d. ₅ 烷基；

Q是三至十元环体系， Q任选被 0至 4个 R ^2Q 取代， 其中所述的 R ^2G 优选氢、卤素、三卤甲基、 -OR ³ . - S(OV ₂ R ³ 、 -S(0) ₂ NR ³ R ³ -C(0)OR ³ 、 -C(0)NR ³ R ³ 、 -(CH ₂ )。. ₅ (杂环基)、 C _r C ₆ 烷基、 -(CH nP OXd-Ce烷基 )2， 其中 n是 0至 6的整数，且杂环基和 C _r C ₆ 烷基是任选取代的， R ³ 独立 地选自 -H或 ^-^的垸基； Q优选苯基、 环丙基、 异噁唑基、 环己基、 噻唑基、 吡唑基、 吡啶基、 环丁基或环戊基。 为方便理解本发明， 从式 (I)结构的化合物中， 优选了下述具体的 化合物， 但本发明的稠环类化合物不限于下述化合物：

1 -1 N-(4-((5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基)氧代)苯基) -N-(4-氟苯基) 环丙烷 -1,1-二酰胺、

I -2 N-(4-氟苯基) -N-(4-((7-甲氧基 -5H-嘧啶并 [5，4-b]吲哚 -4-基) 氧代)苯基)环丙烷 -1, 1-二酰胺、

I -3 N-(4-氟苯基) -N-(4- ((6，7-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚- 4- 基)氧代)苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺、

I -4 N- (4-((7,8-二甲氧基 -5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 -4-基）氧代）苯 基) -N-(4-氟苯基)环丙烷 -U-二酰胺、

I -5 N-(4- ((7，8-二甲氧基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 _ ⁴ -基)氧代) -3-氟 苯基) - N-(4-氟苯基)环丙垸 - 1,1-二酰胺、

I -6 1-(4-氟苯基 )-3-(4-((7-甲氧基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 1-4-基) 氧代)苯基)脲、

I -Ί N-(4-((7,8-二甲氧基苯并呋喃 [3 ,2-d]嘧啶 -4-基）氧代）苯 基) -N-(4-氟苯基)环丙垸 -1，1-二酰胺、 I -8 N-(4-((7,8-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基）氨基）苯 基)- N-(4-氟苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺、

I -9 N-(4-((5H-嘧啶并 [5，4- b]吲哚 -4-基)氧代) -3-氟苯基) 苯基 环丙垸 -1，1-二酰胺、

I -10 N-(4-((7-氟 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 1-4-基)氧代)苯基) -N-(4- 氟苯基)环丙烷 -1，1-二酰胺、

I -11 N-(4-((7,8_:甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4- b]吲哚 1-4-基)氨基)苯 基)— 4-氟苯甲酰胺、

I -12 N-(4-((7,8-二甲氧基苯并 [4,5]噻吩 [3,2- b]嘧啶 -4-基)氧代） 苯基) -N-(4-氟苯基)环丙垸 -1,1-二酰胺、

I -13 N-(4-((7,8-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4- b]吲哚 -4-基)氧代) -3- 氟苯基 )-2-氟苯甲酰胺、

I -14 N-(4-((7,8-二甲氧基苯并呋喃 [3,2-b]嘧啶 -4-基)氧代) -3-氟 苯基) _ _N _ ₍₄ _氟苯基） 环丙垸 -1,1-二酰胺、

I -15 N-(4-氟苯基) -N-(4- ((7-甲基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 -4-基)氧 代)苯基)环丙垸 - 1，1-二酰胺、

I -16 1-(4-((7-氨基- 8-甲氧基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 -4-基)氧代)苯 基) -3-环丙基脲、

I -17 N-(4氟苯基 1)-N- (4-((8-甲氧基 -7-((3-吗啡啉丙基)氨基) -5H- 吡啶并 [3,2-b]吲哚 -4-基)氧代)苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺、

1 -18 4-氟苯甲基 （4-((2-甲基 -7-吗啡啉 -5H-吡啶并 [5,4-b]吲哚 -4- 基)氨基)苯基） 氨基甲酸酯、

I -19 4-氟 -N-(5-((7_硝基 -5H-嘧啶并 [5，4- b]吲哚 -4-基)氨基)吡啶 -2- 基;!苯甲酰胺、

I -20 N-(4- (苯并呋喃 [3，2-d]嘧啶 -4-氧代) -3-氟苯基) -N-(p-甲基)环 丙烷 - l _s l -二酰胺或

I -21 N_(4»((5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基)氧代) -3-氟苯基) -N-(5-甲 基吡啶 -3-基: I环丙垸 -1，1-二酰胺。 所述的式 (I)化合物或 1-1至 1-21任一化合物的盐， 为盐酸盐、 氢 溴酸盐、 硫酸盐、 乙酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 鞣酸盐、 枸櫞酸盐、 三氟醋酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐、 琥珀酸盐、 对甲苯磺酸或甲磺酸 nri.。

上述化合物的结枸式见表 1。

本发明的化合物可采用方案 1 的方法进行目标化合物 II和 III的合

向化合物 3(0.15mol)、 N， N-二甲基甲酰胺 (lml)、 二氯甲烷 (15ml) 的溶液中， 室温搅拌下， 滴加二氯亚砜 (14.9g) (草酰氯或三氯氧磷)， 滴 加完毕， 加热回流 6h。 将反应液冷却至室温， 用氢氧化钠水溶液调 PH 至 7-8， 静置， 取有机相， 减压浓缩中间体 4。 在目标化合物 II的合成屮， 参考文献 ； Γ. Org. Chem, 1959, 24, 1314-1317和 Synthetic Communications, 2006, 36, 347-354, 中间体 4与 取代的芳胺 1在浓盐酸催化下， 以乙醇和水 (V/V， 1/6)为溶剂， 回流搅 拌反应过夜， 得到目标化合物 Π ; 在目标化合物 ΠΙ的合成中， 参考文 献 Bioorg. Med. Chem. Lett, 2006, 16, 5102-5106, 中间体 4与取代的苯 酚 1以 K ₂ C0 ₃ 为碱， 于 60°C在 DMF溶液中搅拌反应 8 h， 得到目标化 合物 III。 本发明的化合物可采用方案 2 的方法进行目标化合物 IV和 V的合

中间体 5在三氯氧磷和多聚磷酸中回流， 得到中间体 6。 在目标 化合物 IV 的合成 中 ， 参考文献 Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2011 ,19(2)， 939-950 , 中间体 6与取代的芳胺 1在 150。C微 波反应 15min， 得到目标化合物 IV； 目标化合物 V的合成， 参考文献 Tetrahedron Letters, 2006, 47, 5045-5048, 中间体 6与中间体 2在 Cu催 化下， 发生 Ullmann反应， 制备目标化合物 。 上述制备方法还可以进一步包括式 (I)结构的化合物与无机酸、 有 机酸反应， 冷却析出式 (I)结构的化合物的盐。 上述反应通法中的 Ri、 R ₂ 、 R ₃ 、 Y、 Ar及 G同上所述；

化合物 1、 2、 3、 5等可以通过商业渠道购买。 本发明的稠环结构化合物，具有有效的蛋白酪 氨酸激酶抑制活性， 可通过对多个肿瘤信号通路的抑制来有效防治 肿瘤。 体外抑酶试验表明， 本发明所述化合物， 大部分对 c-Met具有较 强的抑制作用（实施例 22)，化合物 1-2、 1-3、 1-4、 1-7、 1-8 、 1-14和 1-17， 对 c-Met的抑制活性与阳性对照药 Cabozantinib(XL-184)相当或更优。 例如， 化合物 1-3， 其活性为阳性对照药 XL-184的 4倍。 体外抑酶实验表明， 本发明所述化合物， 对 VEGFR2和 EGFR也 显示了良好抑制活性 (实施例 23)，如化合物 1-2、 1-3和 1-14对 VEGFR2 和 EGFR的抑制活性优于 XL-184。 体外抑酶实验表明， 本发明所述化合物， 对其他酪氨酸激酶如 PDGFR, FGFR-1, FLT1, FLT3, FLT4, Tie2, 和 AXL也有较好的抑制活 性 (实施例 24)，如化合物 1-3对 PDGFR, FGFR-1, FLT1, FLT3, FLT4, Tie2 _: 和 AXL的 IC ₅ 。抑制活性均达到 ΙΟηΜ以下， 具有多靶点抑制效果。 体外抗肿瘤细胞增殖活性试验表明， 本发明所述化合物， 对多种 肿瘤细胞均具有较强的诱导分化和抗增殖活性 (实施例 25)。其中，化合 物 1-3、 1-4、 1-7、 1-8、 1-12和 1-14, 对人甲状腺癌细胞株 SW579, 人 肾透明细胞癌皮肤转移细胞株 Caki-1、 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435S,人肺癌细胞株 A549和人结直肠癌细胞株 HCT- 116均 具有较高的抑制活性， 与阳性对照药 XL-184相当或更优。 例如化合物 1-3 , 对人肾癌细胞株 Caki-1、 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435S和人结 直肠癌细胞株 HCT-116的 IC ₅₀ 分别为 2.24 μΜ、 1.97 μΜ和 2.31 μΜ， 与阳性对照药 L-1S4相比， 提高了 2-3倍， 具有广谱髙效的特点。 药理试验表明， 本发明所述化合物， 对正常细胞的抑制活性很弱， 说明具有更低的毒副作用 (实施例 26)，提示本发明的稠环类类化合物对 肿瘤细胞和正常细胞的抑制增殖方面具有更好 的选择性， 预示其作为 抗肿瘤药物使用时将具有更低的毒副作用。 药理试验表明， 本发明所述化合物， 动物体内毒性较低， 如化合 物 1-3、 1-4和 1-14小鼠单次灌服的 LD50均大于 2.0g/kg (实施例 27); 本发明所述化合物对 hERG钾电流抑制作用 IC50大于 10μΜ， 提示化 合物引起 QTc间期延长的副作用可能性很小， 即潜在心脏毒性小 (实施 例 28)。 药理实验表明， 本发明所述化合物具有以下有益效果：

1)本发明所述化合物具有良好的对 c-Met酶的抑制活性，并且对人 体多种肿瘤细胞均有很好的抑制效果， 具有广谱高效的特点。

2)本发明所述化合物具有多靶点抑制活性， 对 c-Met、 VEGFR-2, PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2, 和 AXL具有良好的抑制活 性， 对于克服肿瘤细胞耐药性具有重要意义。

3)本发明所述化合物在有效抑制肿瘤细胞的同� ��， 对正常细胞的 抑制作用很弱， 表现出较好的选择抑制活性， 具有很好的抗肿瘤临床 应用前景。

4)本发明所述化合物， 动物体内毒性低， 对 hERG钾电流抑制作 用弱， 提示本发明所述化合物具有更小的毒副作用。 综上所述， 本发明所述的化合物具有化学结构的新颖性和 很好的 理化性质， 作为抗肿瘤药物应用时， 具有多靶点的作用机制， 更强的 抗肿瘤活性， 更好的肿瘤细胞选择性及更小的毒副作用， 易于作为新 型抗肿瘤药物的使用。 本发明所述化合物可以以组合物的形式通过口 服、 注射等途径施 用于需要肿瘤治疗的哺乳动物 (包括人)； 其中尤以口服方式最佳。 用药 剂量为每日 0.0001mg/kg〜200mg/kg体重。最佳剂量视个体而定� � 通常 开始时剂量较小， 然后逐渐增加用量。 所述组合物包括治疗有效量的式 (I)所示的化合物或其药学上可接 受的盐和药学上可接受的载体；

所述的载体是指药学领域常规的载体， 例如： 稀释剂、 赋形剂如 水等； 粘合剂如纤维素衍生物、 明胶、 聚乙烯吡咯垸酮等； 填充剂如 淀粉等； 崩裂剂如碳酸钙、 碳酸氢钠； 另外， 还可以在组合物中加入 其他辅助剂如香味剂和甜味剂。 本发明的组合物可以制备成常规的固体制剂， 如片剂、 胶囊等， 用于口服； 也可以将其制备成注射剂等剂型用于注射。 本发明的组合物的各种剂型可以采用药学领域 常规的方法进行制 备， 其中活性成分式 I 结构的化合物的含量为组合物重量的 0.1%〜 99.5% (重量比）。 本发明所述化合物是在进行一系列体外抑酶及 抗肿瘤细胞增殖试 验研究后发现， 此类化合物确实具有较强的体外抑酶活性和抗 肿瘤细 胞活性。 此外， 在研究中， 本新结枸化合物在具有较强酶抑制活性的 同时， 对肿瘤细胞和正常细胞也显示出特异性和选择 性， 具有显著的 科学进步和深入的研究开发价值。 本发明优点在于， 所述化合物对肿瘤细胞信号转导通路具有多靶 点抑制活性， 对靶酶 c-Met、 VEGFR-2, EGFR及其他胂瘤潜在靶点 PDGFR, FGFR-1, FLT1, FLT3, FLT4, Tie2, 和 AXL等均具有较好的抑 制效果， 对多种肿瘤细胞均显示了良好的抑制活性及具 有抗肿瘤细胞 耐药性的前景， 适于作为广谱、 高效和低毒抗肿瘤药物的使用。 本发明优点在于， 所述化合物及其药用制剂对于治疗基因表达异 常而引起的疾病， 如： 肿瘤、 内分泌紊乱、 免疫系统疾病、 遗传病和 神经系统疾病有很好的疗效。 综上所述， 本发明所述的化合物作为抗肿瘤药物应用时， 具有更 好的多靶点作用机理， 抗肿瘤活性高、 选择性好及毒副作用低， 更易 于作为新型抗肿瘤药物使用， 相当于现有技术， 本发明具有新颖性、 创造性和实质的科学进步。 具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述 ， 但发明的实施方 式不限于此。 实施例 1

1 -1 N-(4-((5H-嘧啶并 [5,4-b】吲哚 -4-基)氧代)苯基) -N-(4-氟苯基) 环丙垸 -U-二酰胺的合成

将 5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-酮 (0.62g， 3.33mmol)， 溶于 3ml三氯 氧磷， 升温至回流反应约 2h， 蒸除未反应的三氯氧磷， 将残液加至冰 水中， 饱和碳酸钠水溶液调 PH至 10左右， 乙酸乙酯萃取 3次， 合并 有机相， 依次用水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 过滤， 取虑 液， 减压浓缩， 得粗品为浅黄色固体， 柱色谱分离得中间体 4-氯 -SH嘧啶并 [5,4-b]吲哚 (M-l)0.49g， 收率为 72.06%。 取 4-氯 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 (M-l)(1.22 g, 6 mmol)和 ^(4_氟苯 基) _ _N _(4_羟基苯基)环丙垸 -1，1-二酰胺 (1.57 g, 5 mmol)(M-l，)溶于 DMF 35 mL中， 向其中加入 K ₂ CO ₃ (2.07 g, 15 mmol) o 该反应液在氮气保护 下， 于 80°C搅拌反应 24 h。 反应结束后， 加入乙酸乙酯 100 mL稀释， 分别用水 100 mL和饱和食盐水 100 mL洗，有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压浓缩。 残余物用石油醚和乙酸乙酯 (V/V, 10:1)打浆洗涤， 得 到白色 2.17 g目标产物 1 -1， 收率： 75.1%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 482.9

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 6ppm: 10.31 (s, 1H, NH), 10.11 (s,

1H， NH), 8.06 (s, 1H， pyrimidine-H), 7.10-8.01 (m, 8H， Ar-H), 5.81 (br, 2H, NH ₂ )， 1.46 (s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 2

I -2 N-(4-氟苯基) -N-(4-((7-甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基） 氧代)苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 1中间体 M-1操作方法， 以 7-甲氧基 _5H-嘧啶并 [5,4-b] 吲哚 -4-酮 (0.54g， 2.5mmol)为原料制备中间体 4-氯 -7-甲氧基 -5H-嘧啶 并 [5,4-b]吲哚 (M-2)0.48g， 收率为 82.6%。 按照实施例 1 目标产物 1 -1制备方法， 以中间体 M-2(0.28 g, 1.2 mmol)禾卩 Μ-Γ (0.31 g, lmmol)为原料， 制得 0.43g目标产物 I -2，收率： 84.9%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 512.2

1H NM (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.09 (s, 1H, NH)， 7.78 (s, 1H, pyrimidine-H), 7.06-7.71 (m, 13H， Ar-H), 4.38 (s， 2H, Cf^NH), 3.83 (s, 3H, OC¾)， 1.46 (s, 4H, C¾CH ₂ ). 实施例 3

I -3 N-(4-氟苯基) -N- (4-((6， 7-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基)氧代)苯基)环丙垸 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 1 中间体 M- 1操作方法， 以 6， 7-甲氧基 -5H-嘧啶并 [5，4_b]吲哚 -4-酮 (0.61g， 2.5mmol)为原料制备中间体 4-氯 -6， 7-二甲氧 基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 (M-3)0,43g, 收率为 65%。 按照实施例 1 目标产物 1 -1制备方法， 以中间体 M-3(0.34 g, 1.2 mmol)和 Μ-Γ (0.31 g， lmmol)为原料， 制得 0.42g目标产物 I -3，收率： 78.9%。 将上述 1-3(0.25 g)溶于热的乙醇 (5 mL)中， 向其中加入甲磺酸乙醇 溶液， 加热回流 30 min后， 浓縮蒸干溶剂， 再经丙酮重结晶， 冷却析 出固体， 即为 1-3的甲磺酸盐化合物。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 542.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.12 (s, 1H, H), 7.80 (s, 1H, pyrimidine-H), 7.06-7.77 (m， 13H, Ar-H), 4.32 (s， 2H, CH2NH), 3.89 (s, 6H, OCH ₃ ) ₅ 1.41 (s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 4

I -4 N-(4- ((7，8-二甲氧基 -5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 -4-基）氧代）苯 基) -N-(4-氟苯基)环丙烷 -1，1-二酰胺的合成

将 7,8-二甲氧基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 -4-酮 (0.24 g， 1 mmol)和 PPA(0.51 g, 1.5 mmol)溶于 P0C1 ₃ 6 mL中， 回流反应过夜。 反应结束 后， 蒸干溶剂， 残余物加水 20 mL稀释， 乙酸乙酯提取 (15 mL X 3)， 水层用 I N NaOH溶液调 PH至 9~10， 乙酸乙酯提取 (10 mL χ 2)， 合并 有机层， 分别用饱和 NaHC0 ₃ 溶液和饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干 燥， 过滤， 浓缩。 残余物柱层析纯化， 洗脱剂为石油醚： 乙酸乙酯 (V/V, 5:1)， 得到 0.20 g黄色中间体 M-4， 收率 76.9%。 取中间体 M- 4(0.26 g, 1 mmol)和中间体 Μ-Γ(0.47 g， 1.5 mmol)溶 于 DMF 3 mL中， 向其中加入 Cu粉 (6.1 mg, 0.1 mmol)和 Cs ₂ CO ₃ (0.98 g,

3 mmol), 置于微波反应器中， 功率设定 60 W, 于 100°C搅拌反应 10 min。 反应结束后， 过滤， 蒸干溶剂， 搅拌下缓慢滴加水 10 mL， 析出 固体， 柱层析纯化， 洗脱剂为石油醚： 乙酸乙酯 (V/V, 1:1), 得到 0.45g 目标产物 1 -4， 收率： 83.3%。

ESI-MS [M+H] ^÷ : m/z 541.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) δρρπι: 10.20 (s, 1H, NH)， 8.38 (s， 1H, pyridine-H), 7.06-7.77 (m, 14H)， 4.40 (s, 2H, CHsNH), 3.85 (s, 6H, OCH ₃ ), 1.40 (s, 4H， CH ₂ CH ₂ ). 实施例 5

I -5 N-(4-((7，8-二甲氧基 -5H-吡啶并 [3，2-b]吲哚 _4-基)氧代) -3-氟 苯基) - _N _ ₍₄ _氟苯基)环丙烷 -1，1_二酰胺的合成

按照实施例 4目标产物 I -4制备方法， 中间体 M- 4(0.26 g, 1 mmol) 和中间体 N-(3-氟 -4-羟基苯基) -N-(4-氟苯基） 环丙垸 -1,1-二酰胺 (M-2')(0-50 g, 1.5 mmol)为原料制备 0.36g目标产物 I -5，收率： 64.3%。 ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 541.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.09 (s, 1H， NH), 8.30 (s， lH _f pyridine-H), 7.06〜7.71 (m, 1 1H, Ar-H), 4.38 (s， 2H, CHsNH), 3.83 (s, 6H, OCH ₃ ), 1.46 (s， 4H, CH ₂ CH ₂ ), 实施例 6

I -6 l-(4-氟苯基 )-3-(4-((7-甲氧基 -5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 1-4-基) 氧代)苯基)脲的合成

按照实施例 4目标产物 I -4制备方法， 中间体 4-氯 -7-甲氧基 -5H- 吡啶并 [3，2-b]吲哚 (M-6)和中间体 1-(4-氟苯基 )-3-(4-羟基苯基)脲 (Μ-3 ') 为原料制备目标产物 1 -6， 收率： 77.9%。 将上述 1-6(0.25 _g )溶于热的乙醇 (5 mL)中， 向其中加入苹果酸 (0.1 g), 加热回流 30 nxin后， 浓缩蒸干溶剂， 再经乙醇重结晶， 冷却析出 固体， 即为 1-6的苹果酸盐化合物。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 457.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.1 (s, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, pyridine-H), 7.06〜7.98 (m, 12H, Ar-H), 6.25(s, 2H， CONH),4.25(s, 2H, CH2丽)， 3.81 (s, 3H, OCH ₃ ) 实施例 7

I -7 N-(4-((7,8-二甲氧基苯并呋喃 [3，2-d]嘧啶 -4-基）氧代）苯 基) -N-(4-氟苯基)环丙烷 -1，1-二酰胺的合成

按照实施例 1 目标产物 I -1制备方法， 以中间体 4-氯 -7，8-二甲氧 基苯并呋喃 [3,2-d]嘧啶 M-7 和 M-1 '为原料， 制得目标产物 1 -7， 收 率： 80.1%。 将上述目标产物 1-7(0.25 g)溶于热的乙醇 (5 mL)中，缓慢滴加浓硫 酸 (98%)0.1 mL， 浓縮蒸干溶剂， 再经乙醇重结晶， 冷却析出固体， 即 为 1-7的硫酸盐化合物。 ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 543.1

1H NM (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 7.80(s, 1H, pyrimidine-H), 7.09-7.79 (m, 13H， Ar-H), 4.35 (s, 2H, CHjNH), 3.80 (s, 6H, OCH ₃ ), 1.41 (s， 4H， CH ₂ CH ₂ ). 实施例 8

1 -8 N-(4-((7, 8-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5，4-b]吲哚 -4-基）氨基）苯 基) -N-(4-氟苯基)环丙烷 -U-二酰胺的合成

取中间体¾4_3(2.63 lO mmol)和 N- (4-氨基苯基) -N-(4-氟苯基） 环 丙烷 -1,1-二酰胺 (Μ-8，)(4·07 g, 13 mmol)溶于乙醇： 7j (V/V, 1:6)30 mL 中， 向其中加入浓盐酸 0.5 mL， 升温至 100°C， 回流反应 8 h。反应结 束后， 冷却至室温， 析出白色固体， 抽滤， 滤饼用水洗后， 加入饱和 NaHC0 ₃ : EtOAc(V/V, 1:1)的混合溶液 140 mL。 搅拌 30 min后， 分层， 有机层用饱和氯化钠溶液洗后， 干燥， 过滤， 浓缩， 得 4.11 g灰白色 固体 I -8， 收率 76.1%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 541.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.12 (s, 1H,丽)， 7.80 (s, 1H, pyrimidine-H), 7.06-7.77 (m, 13H, Ar-H), 4.32 (s, 2H, CHzNH), 4.01 (s， 1H, NH), 3.89 (s, 6H, OCH ₃ ), 1.41 (s， 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 9

I -9 N-(4-((5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚- 4-基)氧代) -3_氟笨基) -N-苯基 环丙垸 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 1目标产物 I -1制备方法， 以中间体 M-1和 N-(3-氟 -4- 羟基苯基) -N-苯基环丙烷 -1,1-二酰胺 (Μ-9')为原料， 制得目标产物 Ϊ -9， 收率： 84.9% 将上述 1-9(0.25 g)于 4 mol/L盐酸 /乙醇 (5 mL)中加热溶解， 浓缩蒸 干溶剂， 再经乙醇重结晶， 冷却析出固体， 即为 1-9的盐酸盐化合物。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 482.7 Ή NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.30 (s, IH, NH), 10.01 (s, IH, NH), 8.11 (s， IH, pyrimidine-H), 7.09^8.23 (m, 8H, Ar-H), 5.83 (br, 2H,丽 ₂ ), 1.42 (s， 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 10

I -10 N_(4-((7-氟- 5H-嘧啶并 [5,4-b]吲垛 1-4-基)氧代)苯基) - N-(4- 氟苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 1 目标产物 I -1制备方法， 以中间体 4-氯 -7-氟 -5H-吡 啶 [5，4-b]吲哚 (M-10)和 M- Γ为原料， 制得目标产物 1 -10， 收率： 45.2%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 500.1

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.30 (s, 1H， NH), 10.09(s, IH, NH), 8.06 (s, IH, pyrimidine-H), 7.10〜8.01 (m, 7H, Ar-H), 5.81 (br, 2H _f NH ₂ ), 1.46 (s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 11

I -11 N-(4-((7,8-二甲氧基- 5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 1-4-基)氨基)苯 基) -4-氟苯甲酰胺的合成

按照实施例 8 目标产物 1 -8 制备方法， 以中间体 M-3 和中间体 N-(4-氨基苯基) -4-氟苯甲酰胺 Μ_11 '为原料， 反应制备目标产物 I -11 , 收率： 89.0%

ESI-MS [M+H]+: m/z 458.1

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.12 (s, IH, NH), 9.15 (s， IH, CONH),7.80 (s, 1H， pyrimidine-H), 7.06-7.77 (m, 11H, Ar-H),4.05(s, IH, NH),3.89 (s, 6H, OCH ₃ ). 实施例 12

I -12 N-(4-((7,8-二甲氧基苯并 [4,5]噻吩 [3，2- b]嘧啶 -4-基)氧代） 苯基)— _N _(4-氟苯基)环丙垸 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 4目标产物 I -4制备方法， 中间体 4-氯 -7,8-二甲氧基 苯并 [4,5]噻吩 [3，2-b]嘧啶 (M-12)和 Μ-Γ为原料制备目标产物 I -12， 收 率： 61.32%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 558.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 8.54 (s, 1H, pyridine-H), 7.06-7.71 (m， 1 1H， Ar-H), 4.39 (s， 2H, CHaNH), 3.83 (s， 6H, OCH ₃ ), 1.42

(s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 13

1 -13 N-(4-((7，8-二甲氧基 -5H-嘧啶并 [5,4- b]吲哚 -4-基)氧代) - 3- 氟笨基 )-2-氟苯甲酰胺的合成

按照实施例 1 目标产物 I -1制备方法， 以 M-3和 2-氟 -N- (3-氟 -4- 羟基苯基)苯甲酰胺 M-13'为原料， 制得目标产物 1 -13 , 收率： 79.1%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 477.3

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) Sppm: 10.12 (s, 1H, NH)， 9.15 (s， 1H, 丽)， 7.80 (s, 1H, pyrimidine-H), 7.06-7.77 (m, 9H, Ar-H), 3.89 (s, 6H,

OCH ₃ ) 实施例 14

I -14 N-(4-((7，8-二甲氧基苯并呋喃 [3,2-b]嘧啶 -4-基)氧代) -3-氟 苯基) -N-(4-氟苯基） 环丙烷 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 4目标产物 1 -4制备方法， 中间体 4-氯 -7,8-二甲氧基 苯并呋喃 [3，2-b]吡啶 (M-14)和 M-5'为原料制备目标产物 1 -14， 收率： 61.32%。 将上述 1-14(0.15 g)溶于热的乙醇 (5 mL)中， 向其中加入甲磺酸乙 醇溶液， 加热回流 30 min后， 浓缩蒸干溶剂， 再经丙酮重结晶， 冷却 析出固体， 即为 1-14的甲磺酸盐化合物。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 560.2

lU NMR (400MHz, D SO-d ₆ ) Sppm: 8.33(s, 1H, pyridine-H), 7.06-7.71 (m， 11H, Ar-H), 4.38 (s, 2H, CI^NH), 3.83 (s, 6H, OCH ₃ ), 1.46 (s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 15

I -15 N-(4-氟苯基) -N-(4-((7-甲基- 5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 -4-基)氧 代)苯基)环丙烷 -1，1-二酰胺的合成

按照实施例 4目标产物 I -4制备方法， 中间体 4-氯- 7_甲基 -5H-吡 啶并 [3，2-b]吲哚 (M-15)和 Μ-Γ为原料制备目标产物 1 -15， 收率： 78.2%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 496.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 6ppm: 10.20 (s， 1H,丽)， 8.38 (s, 1H， pyridine-H), 7.06-7.77 (m， 14H), 4.40 (s, 2H, CHaNH), 2.34 (s,3H, -CH ₃ ), 1 ,40 (s, 4H， CH ₂ CH ₂ ). 实施例 16

I -16 l-(4- ((7-氨基 -8-甲氧基 -5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 -4-基)氧代)苯 基) -3-环丙基脲的合成

按照实施例 4目标产物 I -4制备方法， 中间体 4-氯 -8-甲氧基 -5H- 吡啶并 [3,2-b]吲哚 -7-氨基和 1-环丙基 -3-(4-羟基苯基)脲为原料， 制备 目标产物 1 -16， 收率： 39.0%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 404.1

lH NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) 5ppm: 10.01 (s， 1H, NH), 8.41 (s, 1H, pyridine-H), 6.80-7.45 (m,7H)， 6.27(s _s 2H,-NH2), 6.01 (s, 2H, Ci^NH), 3.34 (s,3H, -OC¾), 2.40 (s, 1¾ CH ₂ CH ₂ ), 0.57(m,4H) 实施例 17

I -17 N-(4氟苯基 l)-N-(4-((8-甲氧基 -7-((3-吗啡啉丙基)氨基) -5H- 吡啶并 [3,2-b]吲哚- 4-基)氧代)苯基)环丙烷 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 4 目标产物 1 -4 制备方法， 中间体 4-氯 -8-甲氧基 • _N -(3-吗啡啉丙基) -5H-吡啶并 [3,2-b]吲哚 -7-氨基和 Μ-Γ为原料， 制备 目标产物 1 -17， 收率： 67.1%。 ESI-MS [M+H】 ⁺ : m/z 653.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) Sppm: 10.20 (s, 1H， NH), 8.38 (s, 1H _? pyridine-H), 7.06-7.77 (m， 12H), 4.40 (s, 2H, CHbNH), 3.85 (s, 3H, OCH ₃ ),3.65(s,4H), 2.36(s,4H), 2.06(m,6H), 0.87 (s， 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 18

I -18 4-氟苯甲基 （4-((2-甲基 -7-吗啡啉 -5H-吡啶并 [5，4-b]吲哚 -4- 基)氨基)苯基） 氨基甲酸酯的合成

按照实施例 8 目标产物 1 -8制备方法， 以中间体 4-(4-氯 -2-甲基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -7-基)吗啡啉和中间体 4-氟苯基 (4-氨基苯基)氨 基甲酸酯为原料， 反应制备目标产物 1 -18， 收率： 49.0%。 将上述目标产物 1-18(0.15 g)溶于热的乙醇 (5 mL)中， 缓慢滴加浓 硫酸 (98%)0.1 mL， 浓缩蒸干溶剂， 再经乙醇重结晶， 冷却析出固体， 即为 1-18的硫酸盐化合物。

ESr-MS [M+Hj ⁺ : m z 523.1

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) Sppm: 10.12 (s， 1H， NH), 9.15 (s, 1H, CONH),7.80 (s, 1H, pyrimidine-H), 7.06-7.77 (m, 10H, Ar-H), 4.65(s,2H),4.05(s, 1H, NH), 3.65(s,4H),2.44(s _; 3H),3.18(s,4H) 实施例 19

1 -19 4-氟 -N-(5-((7-硝基 -5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基)氨基)吡啶 -2- 基)苯甲酰胺的合成

按照实施例 8目标产物 I -8制备方法， 以中间体 4-氯 -7-硝基 -5H- 嘧啶并 [5,4-b]吲哚和中间体 N-(5-氨基吡啶 -2-基) -4-氟苯甲酰胺为原 料， 反应制备目标产物 1 -19， 收率： 76.2%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 444.1

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) Sppm: 10.12 (s， 1H, NH), 9.15 (s, 1H, CONH),7.80 (s, 1H, pyrimidine-H) ₅ 7.17-7.77 (m， 8H, Ar-H), 6.72(m,2H),4.01(s, 1H， NH), 实施例 20

I -20 N-(4- (苯并呋喃 [3，2-d]嘧啶 -4-氧代) -3-氟苯基) -N-(p-甲基)环 丙烷 -1,1-二酰胺的合成

按照实施例 1 目标产物 1 -1 制备方法， 以中间体 4-氯苯并咲喃 [3，2- d]嘧啶和 N- (3-氟- 4-羟基苯基) -N-(p-甲基） 环丙烷 -1,1-二酰胺为原 料， 制得目标产物 1 -20， 收率： 35.2%。

ESI-MS [M+H] ⁺ : m/z 497.1

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) Sppm: 7.80(s, 1H, pyrimidine-H), 7.09-7.79 (ra, 13H, Ar-H), 4.35 (s, 2H, CH2NH), 2.34 (s, 3H)， 1.41 (s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 21

I -21 N-(4-((5H-嘧啶并 [5,4-b]吲哚 -4-基)氧代) -3-氟苯基) -N-(5-甲 基吡啶 -3-基） 环丙烷 -1，1-二酰胺的合成

按照实施例 1 目标产物 1 -1制备方法， 以中间体 4-氯 -5H-嘧啶并 [5，4-b]吲哚和 N-(3-氟 -4-羟基苯基) -N-(5-甲基吡啶 -3-基） 环丙烷 -1,1-二 酰胺为原料， 制得目标产物 1 -21， 收率： 20.1%。 将上述 1-21(0.10 _g )溶于热的乙醇 (5 mL)中， 向其中加入甲磺酸乙 醇溶液， 加热回流 30 min后， 浓縮蒸干溶剂， 再经丙酮重结晶， 冷却 析出固体， 即为 1-21的甲磺酸盐化合物。

ESI-MS [M+HJ+: m/z 497.2

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) δρραι: 10.12 (s, 1H, 丽)， 9.34 (s, 1H), 8.34 (ra, 3H),7.93(s, 1H, pyrimidine-H), 7.09〜7.79 (m,6H, Ar-H), .35 (s, 2H， CH2NH), 2.31 (s, 3H), 1.41 (s， 4H, CH ₂ CH ₂ ). 实施例 22

化合物体外对 c-Met酶抑制活性试验：

选用 Millipore出品的 MET enzyme(Cat: 14-526)试剂盒测试化合物 对 c-Met的抑制活性，实验操作参照试剂盒说明书� ��行。首先测试 10 μΜ 和 Ι μΜ两个浓度下， 化合物对 c-Met酶的抑制百分率， 选取酶抑制活 性较好的化合物继续进行抑酶 IC ₅ 。测试。 实验结果见表 2 表 2 化合物对 c-Met体外抑酶试验活性结果

f. c-Met % Inhibition Rate c-Met 1

10 μΜ 1 μΜ IC ₅₀ (nM)

XL- 184 100.12 100.6 60.9

1-1 92.51 90.19 351.6

1-2 99,99 99.79 75.8

1-3 100.15 100.02 15.7

1-4 104.17 99.59 45.6

1-5 90.89 89.63 481.4

1-6 89.49 42.35 NT

1-7 102.08 100.40 29.3

1-8 100.13 100.05 25.0

1-9 98.64 99.39 180.4

1- 10 90.69 64.21 NT

1-1 1 60.29 30.48 NT

1-12 65.91 34.69 NT

1-13 96.83 82.49 200.9

1-14 100.11 100.09 24.6

1-15 97.65 87.34 145.2

1-16 105.06 100.40 59.3

1-17 100.34 100.05 55.0

1-18 96.64 96.37 160.4

1-19 90.67 64.51 NT

1-20 60.59 30.46 NT

1-21 65.71 34.67 NT

NT: not tested 从上表 2可见， 进行测试的本发明化合物对 c-Met酶具有较强的 抑制活性， 其中， 部分化合物如 1-2、 1-3、 1-4、 1-7、 1-8、 1-14和 1-17， 对 oMet的抑制活性与阳性对照药 Cabozantinib(XL-184， III期临床药) 相当或更优。 实施例 23

部分化合物体外对 VEGFR2和 EGFR酶抑制活性试验：

选取体外对 c-Met 抑制活性较好的部分化合物， 进行其体外对 VEGFR2和 EGFR的酶抑制活性试验。分别选用 Sigma出品的 VEGFR2 enzyme(Cat: K2643)试剂盒和 Invitrogen出品的 EGFR(Cat: PV3872)试剂 盒进行化合物对 VEGFR2和 EGFR的抑酶 IC ₅ 。测试， 实验操作参照试 剂盒说明书进行。 实验结果见表 3。 表 3 部分化合物对 VEGFR2和 EGFR体外抑酶试验活性结果

IC ₅₀

编号 VEGFR2 EGFR

(nM) (μ )

XL- 184 74.8 >10

1-2 60.40 3.42

1-3 70.05 3.56

1-4 99.39 2.31

1-7 190.5 1.21

1-8 150.4 1.03

1-14 70.8 0.86

1-17 80.9 2.98 从上表 3可见， 进行测试的本发明化合物对 VEGFR2和 EGFR也 显示了良好抑制活性，且其抑制活性与阳性对 照药 XL-184相当或更优， 尤其对 EGFR抑制活性显著 (iC ₅ 。>10 μΜ)。其中，化合物 1-2、 1-3和 1_14 对三个靶酶 c-Met、 VEGFR2 和 EGFR 的抑制活性优于阳性对照药 XL- 184。 实施例 24

部分化合物体外对 PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2的酶 抑制活性试验：

选取化合物 1-3进行其体外 PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2 的酶抑制活性试验。 分别选用 ELISA 出品的 PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4， Tie2试剂盒进行化合物抑酶 IC ₅ 。测试， 实验操作参 照试剂盒说明书进行。 实验结果见表 4。 表 4化合物 1-3对 PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2体外 抑酶试验活性结果

IC ₅₀ (nM)

编号

PDGFR FGFR-1 FLTl FLT3 FLT4 Tie2

1-4 4.1 3.2 7.90 8.1 9.6 2.1 从表 4 可以看出， 本发明所述化合物 1-3， 对其他酪氨酸激酶如 PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2, 和 AXL也有较好的抑制活 性， PDGFR, FGFR-1, FLTl, FLT3, FLT4, Tie2, 和 AXL的 IC ₅ Q抑制 活性均达到 ΙΟηΜ以下， 具有多靶点抑制效果。 实施例 25

本发明化合物的肿瘤细胞体外抑制活性试验测 定- 测定本发明化合物对 SW579(人甲状腺癌细胞株)、 Caki-1(人肾透 明细胞癌皮肤转移细胞株)、 MDA-MB-435S (人乳腺癌细胞株)、 A549(人 肺癌细胞株)和 HCT-116(人结直厫癌细胞株)的活性， 其 iC _5Q 值通过 CCK-8法 (Cat# CK04-13， Dojindo)测得， 选择 XL- 184为对照药物。 具 体结果如表 5(单位为： μΜ): 表 5 本发明化合物对肿瘤细胞的体外抑制活性 编号 SW579 Caki-1 MDA-MB-435S A549 HCT-116

XL- 184 4.29 6.26 >100 8.61 5.50

1-2 18.94 46.81 4.89 13.15 26.79

1-3 3.79 2.24 1.97 3.78 2.31

1-4 4.50 3.64 2.18 7.67 3.53

1-5 10.34 14.81 1.31 10.49 1 1.15

1-7 3.81 2.43 2.08 4.05 2.69

1-8 4.50 3.64 2.18 7.67 3.53

1-12 4.45 3.52 2.86 5.44 3.42

1-14 6.24 5.72 3.01 5.67 3.56 从上表 5可见， 进行测试的本发明部分化合物显示了良好的体 外 抗肿瘤细胞增殖活性， 部分化合物抗肿瘤细胞增殖活性优于阳性对照 药 XL-184, 化合物尤其对 MDA-MB-435S人乳腺癌抗增殖活性明显。 其中， 化合物 1-3、 1-4、 1-7、 1-8、 1-12和 1-14， 对人甲状腺癌细胞株 SW579 , 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞株 Caki-1、 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435S> 人肺癌细胞株 A549和人结直肠癌细胞株 HCT-116均 具有较高的抑制活性， 与阳性对照药 XL-184相当或更优。 例如化合物 1-3 , 对人肾癌细胞株 Caki-1、 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435S和人结 直肠癌细胞株 HCT-116的 IC ₅ 。分别为 2.24 μΜ、 1.97 μΜ和 2.31 μΜ， 与阳性对照药 XL- 184相比， 提高了 2-3倍。 实施例 26

化合物对正常细胞体外抑制活性试验测定：

测定本发明化合物对 MRC-5人胚肺成纤维细胞的活性， IC ₅ 。值通 过 CCK-8法 (Cat# CK04-13 , Dojindo)测得。选择 XL-184为阳性对照药 物进行正常细胞株的体外抑制活性 IC _5Q 测试。 具体结果如下 (单位为： μΜ) _: 表 6 本发明化合物及对照药物对正常细胞的体外抑 制活性

编号 MRC-5

XL- 184 58.2

1-3 178.5

1-4 >300

1-7 >300

1-8 190.7

1-12 260.2

1-14 >300 从上表 6可以看出， 进行测试的本发明化合物对正常细胞的抑制 活性较弱， 具有更低的毒副作用， 说明本发明的稠环类化合物对肿瘤 细胞和正常细胞的抑制增殖方面具有更好的选 择性， 预示其作为抗肿 瘤药物使用时将具有更低的毒副作用， 易于作为肿瘤药物使用。 实施例 27

急性毒性试脸：采用张均田主编的〈〈现代药 理实验方法〉〉 (北京医科 大学、 中国协和医科大学联合出版社， 1998年出版)报道的方法， 初步 筛选，经用 Bliss法统计（《实用药物制剂技术》，人民卫� ��出版社， 1999 年出版)，化合物 1-3、1-4和 1-14小鼠单次灌服的 LD ₅₍₎ 分别为 2.09 g/kg、 2.74g/kg和 2.34g/kg。 实施例 28

human Ether-a-go-go Related Gene(hERG)钾通道影响实验：受试化 合物和阳性对照药均用 DMSO 溶解， 配置成 10mM或 100mM 的浓 缩液， 临用时用细胞外液稀释至不同浓度。 检测方法： 稳定表达 hERG 的 CHO细胞， 在室温下用全细胞膜片钳技术记录 ERG钾通道电流。 尖端电阻为 1- 4ΜΩ左右的玻璃微电极连接至 Axon 200A膜片钳放大 器。 钳制电压和数据记录由 clampex 9.2软件经 Axon DigiData 1322A A/D 转换器通过电脑控制， 细胞钳制在 -80mV， 诱发 hERG 钾电流 (IhERG)的步阶电压从 -80mV给予一个 2s的去极化电压到 +20mV， 再 复极化到- 40mV， 持续 4s后回到 -80mV。 分别在给药前后给予此电压 步阶诱发出 hERG钾电流。 不同药物浓度对 hERG钾电流的抑制程度用以下公式计算: 抑制率％

其中，抑制率代表药物对 I hERG的抑制程度， IhE G-Dru和 IhERG 分别表示在加药后和加药前 i _hERQ 的幅度。 表 Ί化合物对 hERG抑制作用

编号 Ι。 ₅₀ (μΜ)

1-3 >10

1-4 >10 实验结果表明： 化合物 1-3和 1-4对 hERG钾电流抑制作用 IC ₅₀ 大 于 ί0μΜ，提示化合物引起 QTc间期延长的副作用可能性很小， 即潜在 心脏毒性小。 实施例 29

片剂： 任一选自 1-1至 1-21的化合物 lOOmg 蔗糖 150mg

玉米淀粉 38mg 硬脂酸钙 2mg

制备方法： 将活性成分 1-1至 1-21任一化合物与蔗糖、 玉米淀粉 混合， 加水湿润， 搅拌均匀， 干燥， 粉碎过筛， 加入硬脂酸钙， 混合 均匀， 压片。 每片重 290 mg, 活性成分含量为 100 mg。 实施例 30

注射剂： 任一选自 1-1至 1-21的化合物 15mg 注射用水 80mg 制备方法. · 将活性成分 1-1至 1-21任一化合物溶解于注射用水， 混合均匀， 过滤， 将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中 ， 每 瓶 95 mg， 活性成分含量为 15 mg/瓶。 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不 受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都 包含在本发明的包含范围之内。