[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein mit therapeutischem Potenzial, insbesondere zur Behandlung oder Regeneration von Läsionen von Gefäßen, Organen oder Geweben, oder zur Verbesserung der Hämatopoese; ferner betrifft die Erfindung ein dieses Fusionsprotein codierendes Nukleinsäuremolekül, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Fusionsprotein enthält, sowie die Verwendung des Fusionsproteins oder der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Läsionen von Gefäßen oder Geweben, sowie von akuten oder chronischen Gefäßerkrankungen, oder zur Regeneration oder Erneuerung derselben, also zur Angiogenese, sowie zur Verbesserung/Unterstützung der Hämatopoese.

[0002] Der krankhaften Veränderung von Gefäßen und Geweben des menschlichen Körpers können - neben physischen Verletzungen - verschiedene Befunde oder Erkrankungen zu Grunde liegen. Hierzu zählen bspw. Verletzungen, die bei Implantationen von Stents oder Stentgrafts auftreten können, virale oder bakteri- eile Infektionen, das Auftreten von Läsionen bei Diabetes, etc. Auch bei der Arteriosklerose tritt die Degeneration der Arterien als eine Veränderung der Gefäßwände, also insbesondere Wucherungen und Ablagerungen, auf, wobei zu deren Entstehung wiederum verschiedene Faktoren beitragen können. Im Falle von bspw. Erkrankungen des Herzmuskels können Veränderungen der Gefäße zu Infarkten oder einer Myokarditis führen.

[0003] Ganz allgemein können Schäden in der Gefäßwand zur Aufhebung der Integrität der Gefäßwand und zur anschließenden Blutung in umliegendes Gewebe führen. Um dies zu verhindern, bilden Thrombozyten in Verbindung mit löslichen Plasmakomponenten einen hämostatischen Thrombus, der den Schaden abdichtet und die Blutstillung bewirkt. Sobald eine Läsion an einem Gefäß auftritt, werden sofort verschiedene zelluläre und biochemische Mechanismen in Gang gesetzt, die für die Hämostase notwendig sind. Bei der arteriellen Hämostase spielt auch das Endothel durch die Regulation der Permeabilität für Plasmalipoproteine, Leukozytenadhäsion und die Sezernierung von pro- und antithrombotischen Faktoren sowie vasoaktiven Substanzen eine zentrale Rolle.

[0004] Das Endothel ist die einschichtige Gefäßwandauskleidung, die den Blutstrom von den thrombogenen Strukturen des Subendothels trennt. Bei einem Endothelschaden der Gefäßwand und der nun offenliegenden thrombogenen subendothelialen Matrix kommt es im Rahmen der Hämostase zur Adhäsion ruhender, im Blut zirkulierender Thrombozyten an nun freiliegendes Kollagen. Dieser initiale Adhäsionsvorgang wird durch thrombozytäre Membranglycoprotein-Rezeptoren, die Integrine, gesteuert und resultiert in eine Formveränderung, Thrombozytenaktivie- rung und Freisetzung der Inhaltstoffe aus den Speichergranula. Dabei interagiert das thrombozytäre Glycoprotein VI (im Folgenden auch mit "GPVI" abgekürzt) direkt mit dem freiliegenden Kollagen und stabilisiert die Bindung. GPVI als wichtigster Kollagenrezeptor vermittelt nicht nur eine festere Bindung direkt an Kollagen, sondern vermittelt auch die Aktivierung anderer, zur Adhäsion notwendiger Rezeptoren. Nach der Adhäsion folgt als nächster Schritt in der Hämostase die Aggregation, die zu einer Anhäufung von Thrombozyten im Thrombus führt. Daher spielt bei der Aktivierung der Blutplättchen GPVI als Kollagenrezeptor auf der Thrombozytenoberfläche eine entscheidende Rolle und gilt auch als Risikofaktor für Myokardinfarkte. Durch das Auftreten solcher Thromben ist die Versorgung des Gewebes mit Blut nicht mehr gewährleistet, so dass ischämische Zustände des distal des Thrombus gelegenen Gewebes eintreten können.

[0005] So machen Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wie bspw. Angina oder Myokardinfarkt, gegenwärtig immer noch ca. ein Drittel aller weltweiten Todesfälle aus. Bei diesen Erkrankungen ist eine schnelle Reperfusion der von einer Ischämie betroffenen Koronararterien von äußerster Wichtigkeit, um eine Verletzung des Myokards zu verhindern. Sowie der Blutfluss in einem Koronargefäß vermindert wird, treten irreversible Schäden an den Myozyten auf, die den Funktionsstoffwechsel im Myokard zum Stillstand bringen, wodurch es letztendlich zum Zelluntergang durch Nekrose und Apoptose kommt.

[0006] Die Regeneration von Geweben, Gefäßen oder Organen, auch von Myokard, hängt stark von der Rekrutierung und der Akkumulation einer kleinen Population von Stammzellen an die betroffenen verletzten bzw. erkrankten Stellen ab. In der Regel erfolgt auf eine Verletzung der Gewebe/Organe/Gefäße eine Stimulation, aufgrund derer diese Stammzellen vermehrt im Peripherblut zirkulieren und in den beschädigten Bereichen anhaften. So ist bekannt, dass CD34 ⁺ -Stammzellen aus dem Knochenmark die Integrität des Gefäßendothels unterstützen, da diese nach der Anhaftung an der betroffenen Stelle in Endothelzellen differenzieren können.

[0007] Eine gezielte und gesteuerte Rekrutierung dieser Vorläuferzellen an betroffene Stellen würde also ein bevorzugtes Werkzeug zur Unterstützung der natürlichen Re-Endothelialisierung darstellen.

[0008] Aus der WO 2008/101700 ist ein bispezifisches Fusionsprotein bekannt, über welches einerseits gezielt Vorläuferzellen an Gewebe/Gefäße rekrutiert werden können, indem über eine Kollagen-bindende Domäne (GPVI) das Fusionspro- tein an verletzte Gewebe-/Gefäßstellen gebunden wird, und über die die Vorläuferzellen bindende Domäne die Vorläuferzellen rekrutiert werden können.

[0009] Nach wie vor besteht aber ein großer Bedarf an anderen, alternativen Produkten und Substanzen, über welche eine verbesserte Rekrutierung von Vorläuferzellen oder CD34 ⁺ -Zellen an betroffene Stellen erfolgen kann.

[0010] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein neues Mittel bereitzustellen, das zur Behandlung von Gewebe- und Gefäßerkrankungen, insbesondere der Herzgefäße, sowie zur Regeneration von verletztem Gewebe oder Gefäßen eingesetzt werden kann.

[0011] Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Fusionsprotein gelöst, das a) ein erstes Polypeptid aufweist, das ausgewählt ist aus SDF-1 (Stromal Cell derived Factor- 1) oder Varianten oder Fragmenten davon, die die CXCR4-/CXCR7- Bindungsfunktion von SDF-1 besitzen; und b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus GPVI (Glycoprotein VI), oder der extrazellulären Domäne von GPVI, oder Fragmenten oder Varianten der extrazellulären Domäne von GPVI, die die Kollagen- Bindungsfunktion von GPVI besitzen.

[0012] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Fusionsprotein gemäß der Erfindung in einer pharmazeutische wirksamen Menge enthält, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, sowie durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsprotein oder der dieses enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von cardiovaskulären Erkrankungen, zur Endothelregeneration in Geweben, Organen und Gefäßen, sowie zur Unterstützung der Hämatopoese und Angiogenese.

[0013] Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann über das zweite Polypeptid, nämlich das an Kollagen bindende GPVI - bzw. über die extrazellulären Domäne von GPVI, oder Fragmenten oder Varianten der extrazellulären Domäne von GPVI, die die Kollagen-Bindungsfunktion von GPVI besitzen - an Kollagen binden, und über das erste Polypeptid, nämlich SDF-1 (Stromal Cell derived Factor- 1) oder Varianten oder Fragmenten davon, die die CXCR4-/CXCR-7-Bindungsfunktion von SDF-1 besitzen, CD34 ⁺ -Zellen, die die Rezeptoren von SDF-1, CXCR4 oder CXCR7, aufweisen, binden und damit an Stellen rekrutieren, an welchen Kollagen frei liegt, also insbesondere verletzte Gefäße, Organe oder Gewebe. Die über das erfindungsgemäße Fusionsprotein an Läsionen rekrutierten Vorläuferzellen können anschließend in Endothelzellen differenzieren und zur Regeneration - und schließlich zur Behandlung einer Erkrankung des Gewebes, Organs oder Gefäßes dienen.

[0014] Vorliegend wird unter einem "Fusionsprotein" ein Hybridprotein bzw. ein artifizielles Protein verstanden, welches in vitro aber auch in vivo durch im Stand der Technik bekannte molekularbiologische oder chemische Verfahren durch Verbinden oder Verknüpfen zweier (oder mehrerer) (Poly)-Peptide, die ansonsten bzw. natürlich nicht miteinander verbunden oder verknüpft sind und auch sonst nicht natürlich vorkommen, herstellbar ist. So kann das Fusionsprotein bspw. durch Konjugation zweier (oder mehrerer) Polypeptide mittels eines oder mehrerer chemischer Reagenzien oder durch rekombinante DNA-Technologien, also durch genetische "Verknüpfung" der für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren hergestellt werden. Dabei besteht die Möglichkeit, das Fusionsprotein durch Verwendung üblicher Expressionsvektoren zu generieren, die für das erfindungsgemäße Fusionsprotein codieren. Diese Expressionsvektoren werden in eine geeignete Zelle eingebracht, die dann das Fusionsprotein produziert.

[0015] Unter "Fragment" oder unter einer "Variante", das bzw. die die Bindungsfunktion des jeweiligen Polypeptids besitzt, wird vorliegend eine Aminosäuresequenz verstanden, die sich von der Wildtyp-Sequenz bzw. der hierin angegebenen Sequenz durch einen oder mehrere Aminosäureaustausche unterscheidet. Solche modifizierte Aminosäuren können "konservative" Aminosäurenaustausche aufweisen, bei denen die ausgetauschte Aminosäure die gleichen oder ähnlichen Eigenschaften wie die ersetzte Aminosäure aufweist. Ähnliche kleine Veränderungen können auch Aminosäuredeletionen und/oder -Insertionen umfassen. Eine Anleitung zur Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische Aktivität aufzuheben, kann bspw. unter Verwendung vom im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen gefunden werden. Die vorliegend umfassten Protein- oder Polypeptidvarianten oder Fragmente davon umfassen GPVI-, oder SDF-1 -Proteine, die jeweils entweder die GPVI- oder die SDF-1 -Bindungseigenschaft besitzen, und zwar die identische oder eine im Wesentlichen äquivalente. Ob ein modifiziertes GPVI- oder SDF-1 Polypeptid die Bindungseigenschaften der unmodifizierten GPVI- oder SDF-1 -Polypeptide besitzt, kann bspw. in in v/fro-Assays untersucht werden, wie sie in der vorliegenden Anmeldung nachstehend noch beschrieben werden. Daher umfassen Varianten auch Polypeptide mit jeweils etwas 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit dem jeweiligen Wildtyp-Polypeptid/-Protein. Um den Prozentsatz de Sequenzidentität zweier Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen zu bestimmten, kann gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren vorgegangen werden, bspw. mittels eines Alignments und Berechnung über einen mathematischen Algorithmus.

[0016] Unter "Linker" oder "Spacer" oder "Linkermolekül", die vorliegend synonym verwendet werden, wird in der vorliegenden Erfindung eine Aminosäurenoder eine diese kodierende Nukleinsäuresequenz mit bis zu 100 Aminosäuren/Basen verstanden, die der Verknüpfung zweier funktionellen Polypeptide dient, und die ggf. einen Abstand zwischen den beiden funktionellen Polypeptiden generiert, ohne dabei eine Bioaktivität oder Bindungseigenschaft an andere Moleküle zu besitzen. Es handelt sich hierbei also um eine "neutrale" Sequenz, die außer den eben beschriebenen Funktionen keine anderen erfüllt oder erfüllen kann.

[0017] Insbesondere ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, wenn bei dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein eine Peptidase-/Protease, insbesondere eine Dipeptidylpeptidase IV resistente Variante von SDF-1 als erstes Polypeptid eingesetzt wird, insbesondere auch eine Matrix-Metalloproteinase resistente Variante. [0018] SDF-1 kann u.a. von der Matrix-Metalloproteinase (MMP)-2 gespalten werden, wodurch es seine chemotaktische Bioaktivität verliert. Diese kann verhindert werden, indem eine modifizierte SDF-1 -Variante eingesetzt wird, die resistent gegenüber MMP-2 ist, die jedoch ihre chemotaktische Bioaktivität beibehält. Ein Beispiel für diese SDF-1 -Variante ist bspw. von Segers et al., ("Local Delivery of Protease-Resistant Stromal Cell Derived Factor- 1 for Stern Cell Recruitment After Myocardial Infarction", Circulation, 2007, 116:1683-1692) beschrieben; diese wird dort mit S-SDF-1 bezeichnet, und auf diese wird hiermit explizit Bezug genommen.

[0019] Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass das erfindungsgemäße Fusionsproteinen an lösliches Kollagen und an den CXCR4-Rezeptor von bestimmten Zellen binden konnte. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein die Chemotaxis von hämatopoietischen Stammzellen angeregt werden konnte. Dies zeigt, dass durch das Fusionsprotein CXCR4 ⁺ - Vorläuferzellen rekrutiert werden können, und dass der SDF-1 -Anteil des Fusionsproteins noch funktionsfähig ist. Mit den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen ist es danach möglich, auf einfache und gezielte Weise die Re- Endothelialisierung und die Wiederherstellung von verletzten Gefäßen bzw. von jeglichem Gewebe, das durch eine Verletzung oder sonstige Einflüsse auf seiner Oberfläche Kollagen freigibt bzw. exponiert, durch die Besiedelung mit Stammzellen und deren Reifung zu therapieren.

[0020] Ferner ist es auch möglich, mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein die Hämatopoese zu verbessern, was insbesondere bei Knochenmarksablationen oder -transplantationen erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können dabei an Kollagenbindungsstellen für GPVI, die bei den genannten Eingriffen nach einer Chemo- oder Strahlentherapie zugänglich sind, binden, im Knochenmark akkumulieren und durch Rekrutierung von Vorläuferzellen von Stammzellen die Repopulation des Knochenmarks und die Blutzellbildung an diesen Stellen fördern und unterstützen. [0021] Endothel-Vorläuferzellen stellen eine zirkulierende, Knochenmarksabgeleitete Zellpopulation großer nicht-leukozytärer Zellen dar, die bei der Gefäßreparatur und bei der Hämostase beteiligt sind.

[0022] Der Rezeptor GPVI ist der wichtigste Rezeptor der Thrombozyten für Kollagen. GPVI ermöglicht die Aggregation, Sekretion, Formveränderung und Aktivierung der Blutplättchen. Humanes GPVI enthält eine Signalsequenz mit 20 Aminosäuren, eine extrazelluläre Domäne von 247 Aminosäuren, sowie eine 21 Aminosäuren lange Transmembran-Domäne und einen 51 Aminosäure langen cytoplasmati- schen Schwanz.

[0023] Da die Bindung an Kollagen über die extrazelluläre Domäne vermittelt wird, ist in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionsproteins bevorzugt, wenn das erste Polypeptid den extrazellulären Anteil von GPVI, oder Fragmente oder Variante der extrazellulären Domäne von GPVI aufweist, die die Kollagen-Bindungsfunktion von GPVI besitzen, verbunden mit einem dimerisieren- den Peptid.

[0024] Hierbei ist von Vorteil, dass bspw. auf bereits lösliches GPVI zurückgegriffen werden kann, das zuvor im Stand der Technik beschrieben wurde (siehe Massberg et al., "Soluble glycoprotein VI dimer inhibits platelet adhesion and aggre- gation to the injured vessel wall in vivo", FASEB J. 2004; 18: 397-399, wobei bezüglich der Herstellung von löslichem humanem GPVI auf diese Veröffentlichung explizit Bezug genommen wird.

[0025] Lösliches GPVI zeigt nur als dimere Form, bspw. in Verbund mit der Immunglobulin-Fc-Domäne, Affinität zu Kollagen. Zur Generierung dieses löslichen GPVI kann der extrazelluläre Anteil des humanen GPVI kloniert und mit der humanen Immunglobulin-Fc-Domäne verbunden werden. Dieses GPVI-Fc-Protein (im Folgenden auch lösliches GPVI-Fc genannt) kann bspw. mit Hilfe von Adenoviren über eine humane HeLa-Zelllinie exprimiert werden. Mit einem solchen löslichen GPVI-Fc konnte sowohl in vitro als auch in vivo die Adhäsion an Kollagen nachgewiesen werden.

[0026] Es versteht sich für einen Fachmann, dass zur Erfüllung der erfindungsgemäßen Funktion, nämlich in Bezug auf das GPVI die Bindung an Kollagen, das Fusionsprotein nicht zwingend die vollständige bzw. identische Aminosäuresequenz des löslichen GPVI eingesetzt werden muss. Vielmehr wird die erfindungsgemäße Funktion des Fusionsproteins auch dann erfüllt, wenn das zweite Polypeptid einen Abschnitt oder eine Sequenzvariante des löslichen GPVI aufweist, der bzw. die jedoch noch die Kollagen-Bindungsfunktion von GPVI in ggf. abgeschwächter Form ausübt. Bekanntermaßen werden die proteinogenen Aminosäuren in vier Gruppen unterteilt, nämlich in polare, nicht-polare, saure und basische Aminosäuren. Der Austausch einer polaren Aminosäure gegen eine andere polare Aminosäure, bspw. Glycin gegen Serin, führt in der Regel zu keiner oder nur einer geringfügigen Änderung der biologischen Aktivität des entsprechenden Proteins, so dass ein solcher Aminosäureaustausch das erfindungsgemäße Fusionsprotein in seiner Funktion weitgehend unberührt lässt. Vor diesem Hintergrund erfasst die vorliegende Erfindung auch ein solches Fusionsprotein, das als erstes Polypeptid eine Variante von löslichem GPVI, bei der eine oder mehrere Aminosäuren einer der genannten Aminosäure-Klassen gegen eine andere Aminosäure der selben Klasse ausgetauscht ist. Eine solche Sequenzvariante ist dabei vorzugsweise zu ca. 70 %, weiter vorzugsweise zu ca. 80 % und höchst vorzugsweise zu ca. 90 bis 95 % homolog zu der Aminosäuresequenz von löslichem GPVI.

[0027] "Fe" steht für "fragment crystallizable"; dieses Fragment entsteht durch Papain-Spaltung des IgG-Moleküls neben den beiden Fab-Fragmenten. Die Fc- Domäne besteht aus den gepaarten C _H 2- und C _H 3-Domänen einschließlich der Gelenkregion (engl, "hinge region") und enthält den Teil des Immunglobulins, der für die Dimerisierungsfunktion verantwortlich ist. Vorteilhafterweise kann hierbei auf käuflich erhältliche humane - oder Maus - Fc-DNA zurückgegriffen werden, die entweder aus käuflich erhältlichen cDNA-Bibliotheken durch PCR isoliert werden kann, oder die bereits in Plasmide kloniert vorliegt, welche wiederum käuflich erworben werden können (bspw. erhältlich von der Firma Invitrogen, San Diego, USA).

[0028] Es versteht sich, dass auch ein Fragment oder eine Variante der Fc- Domäne verwendet werden kann, ohne dass die erfindungsgemäße Funktion des zweiten Polypeptids beeinträchtigt wird, solange das Fragment bzw. die Variante noch die ggf. abgeschwächte Dimerisierungsfunktion eines Antikörpers aufweist; vgl. vorstehende Ausführungen zu Fragmenten oder Varianten von GPVI, die für das Fragment oder die Variante von Fe gleichermaßen gelten.

[0029] Im Übrigen ist auch jedes andere Molekül mit Dimerisierungsfunktion geeignet, in das vorliegende Fusionsprotein aufgenommen zu werden, solange dadurch die Dimerisierung von GPVI gesichert ist. Dem Fachmann wird klar sein, dass die entsprechende Sequenz eines anderen Dimerisierungsmolekül anstelle des Fc-Anteils in das Fusionsprotein eingebaut werden kann.

[0030] Das Dimerisierungsmolekül ist hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz derart gestaltet, dass dieses einen Abschnitt eines Proteins aufweist, der in die Vermittlung einer Dimerisierung von zwei separaten Proteinen oder Proteinuntereinheiten involviert ist. Auch diese Maßnahme ist für den Fachmann ein Leichtes, da die Feinstrukturen, einschließlich der Aminosäuresequenzen von peptidischen Dimer- komplexen, für eine Vielzahl von Proteinen im Stand der Technik ausführlich beschrieben sind. Bekannte dimerbildende in ihrer Sequenz und Struktur bekannte Proteine umfassen G-Proteine, Histone, Interferon γ, Interleukin-2- Rezeptor, Hsp90, Tyrosin-Kinasen, IgG-Moleküle etc. Die jeweiligen die Dimerisierung vermittelnden Domänen der genannten Proteine können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins direkt übernommen werden. Allerdings kann es durchaus gewünscht sein, diese Domänen durch gezielte Mutagenese oder auch durch C- und/oder N- terminales Hinzufügen einzelner Aminosäuren zu modifizieren, so dass bspw. die immunologische Wirkung des Fusionsproteins reduziert wird, die besseren Herstel- lung des Fusionsproteins ermöglicht wird, die Dimerisierungsfunktion jedoch weitgehend erhalten bleibt.

[0031] In einem Ausführungsbeispiel ist bevorzugt, wenn eine Variante der Fc-Domäne oder ein synthetisches Fc-Fragment eingesetzt wird, welches im Komplement- und Fc-Rezeptorbindungsbereich derart mutiert ist, dass eine Aktivierung des Immunsystems weitgehend reduziert wird und ggf. sogar ausbleibt. So kann bspw. ein Fc-Fragment eingesetzt werden, bei dem durch gezielte Mutagenese an der Position 331 ein Prolin gegen ein Serin und an den Aminosäurepositionen 234 bis 237 das Tetrapeptid Leu-Leu-Gly-Gly gegen Ala-Ala-Ala-Ala ausgetauscht wird.

[0032] In einer ersten Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das erste Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist.

[0033] Die mit der SEQ ID Nr. 1 bezeichnete Aminosäuresequenz zeigt die Sequenz von humanem SDF-1, die mit der SEQ ID Nr. 2 bezeichnete Aminosäuresequenz zeigt die Isoform SDF-1 alpha (ohne Leader Sequenz), die mit der SEQ ID Nr. 3 bezeichnete Aminosäuresequenz die Isoform SDF-1 beta (ohne Leader Sequenz). SDF- 1 wird post-translationell modifiziert, insbesondere die Leader-Sequenz, dargestellt in der SEQ ID Nr. 8, abgespalten. SDF-1 ist ein körpereigenes Chemokin aus der Gruppe der CXC-Motiv-Chemokine, und wird auch als CXCL12 bezeichnet. SDF-1 bindet an die Chemokin-Rezeptoren CXCR4 und CXCR7, die zur Familie der G-Protein- gekoppelten Rezeptoren gehören und die durch die Bindung von SDF-1 aktiviert werden.

[0034] In einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das zweite Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 4 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist. [0035] Die Aminosäuresequenz SEQ ID-Nr. 4 stellt die extrazelluläre Domäne des humanen GPVI dar, inklusive zweier weiterer Aminosäuren der Trnas- membrandomäne. Es versteht sich, dass auch Varianten oder Fragmente davon, die die Kollagen-Bindungsfunktion von GOVI besitzen, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Der Fachmann kann dabei bspw. auf die im Stand der Technik bereits bekannten Varianten zurückgreifen (wie sie bspw. in den UniProt/SwissProt- Dantenbanken (www .uniprot.org) zu finden sind), oder aber über eigene naheliegenden Versuche solche Fragmente/Varianten generieren, bspw. über Aminoäsurenaustausche, -deletionen, -isertionen.

[0036] Wie weiter oben erwähnt, ist insbesondere bevorzugt, wenn das zweite Polypeptid die extrazelluläre Domäne von GPVI, oder ein Fragment oder eine Variante der extrazellulären Domäne von GPVI ist, das/die die Kollagen- Bindungsfunktion von GPVI besitzt, und dass das zweite Polypeptid mit einem dimerisierenden Polypeptid verknüpft ist, insbesondere mit einer Fc-Domäne eines Immunglobulins oder ein Fragment oder eine Variante davon, das bzw. die die Dimerisierungsfunktion der Fc-Domäne aufweist.

[0037] Dabei ist in einer bevorzugten Ausführungsform die Fe Domäne eine humane IgG Fc-Domäne.

[0038] In weiteren Ausführungsformen ist bevorzugt, wenn das dimerisie- rende Peptid direkt oder über einen zweites Linkermolekül/Spacer mit dem zweiten Polypeptid verknüpft ist. Dabei ist in einer Ausführungsform bevorzugt, wenn das zweite Linkermolekül die Sequenz Glycin-Glycin-Arginin aufweist. Es versteht sich, dass auch eine andere Sequenz eingesetzt werden kann, vorzugsweise eine Sequenz, die hinsichtlich ihrer Polarität der vorgenannten ähnlich ist. Es liegt hierbei im Können und Wissen des Fachmanns, geeignete Sequenzen zu identifizieren und entsprechend in das Fusionsprotein einzubauen, um das dimerisierende Peptid mit dem zweiten Polypeptid zu verknüpfen. [0039] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Linkermolekül, über welches das erste Polypeptid mit dem zweiten Polypeptid in einer bevorzugten Ausführungsform miteinander verknüpft ist, die Sequenz SEQ ID Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll auf. Es versteht sich, dass auch andere Linkermoleküle zum Verknüpfen der beiden Polypeptide eingesetzt werden können, insbesondere solche, die im Vergleich zu dem angegebenen Linkermolekül zu keiner oder nur einer geringfügigen Änderung der biologischen Aktivität des entsprechenden Fusionsproteins führen, so dass ein solcher Aminosäureaustausch das erfindungsgemäße Fusionsprotein in seiner Funktion weitgehend unberührt lässt.

[0040] Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist bevorzugt, wenn es die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 6 oder 7 aufweist. Die beiden Sequenzen unterscheiden sich dadurch, dass die mit der SEQ ID Nr. 6 bezeichnete Sequenz eine Sequenz für das Sekretionssignal aufweist, wohingegen die Sequenz mit der SEQ ID Nr. 7 diese Sequenz nicht umfasst.

[0041] Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe: a) die Nukleinsäuresequenz, die für das Fusionsprotein mit der SEQ ID Nr.

6 oder 7 kodiert, oder eine Variante davon, welche für das gleiche Polypeptid gemäß der Degeneration des genetischen Codes kodiert; b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch die SEQ- ID Nr. 6 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, umfassend von seinem N-Terminus zu seinem C-Terminus SDF-1, eine für ein erstes Linkermolekül codierende Nukleinsäuresequenz, die extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, die dazu in der Lage ist, an Kollagen zu binden, eine für ein zweites Linkermolekül codierende Nukleinsäuresequenz und eine für ein dimerisierendes Po- lypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, die dahingehend funktionsfähig ist, dass sie einem durch die Nukleinsäure kodierten Protein ermöglicht, in einer Zelle in einer Form exprimiert zu werden, die dazu in der Lage ist, an Kollagen und/oder CXCR4 oder CXCR7 zu binden; c) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid, die in 5'-3'-Richtung einen ersten Abschnitt aufweist, der für SDF-1 kodiert oder für Peptida- se-/Protease resistente Varianten oder Fragmente davon, die die CXCR4-/CXCR7-Bindungsfunktion von SDF-1 besitzen, einen zweiten Abschnitt, der für die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-GlyGly-Gly-Ser kodiert, einen dritten Abschnitt, der für eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder ein Fragment oder eine Variante der extrazellulären Domäne von GPVI, das bzw. die die Kollagen-Bindungsfunktion von GPVI besitzt, kodiert, einen Abschnitt, der für ein Linkermolekül mit der Sequenz Gly-Gly-Arg kodiert, und einen vierten Abschnitt, der für eine Fc-Domäne kodiert oder für eine funktionsfähige konservative Variante davon, die dahingehend funktionsfähig ist, dass sie einem durch die Nukleinsäure kodierten Protein ermöglicht, in einer Zelle in einer Form exprimiert zu werden, die dazu in der Lage ist, an Kollagen und/oder CXCR4 oder CXCR7 zu binden.

[0042] Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure; ferner betrifft die Erfindung ein Fusionsprotein, kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, sowie eine Zelle, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein exprimiert.

[0043] Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten rekombinanten Expressionsvektoren hergestellt werden. Vorliegend wird dabei unter einem "Vektor"/"Expressionsvektor" ein replizierbares DNA-Konstrukt verstanden, das zur Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kodierender DNA verwendet wird; es umfasst eine Transkriptionseinheit, die eine Anordnung von einem oder mehreren genetischen Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, zum Beispiel Promotoren, Operatoren oder Enhancer, umfasst, die funktionell verbunden sind mit einer für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierenden DNA-Sequenz, die in mRNA transkribiert und in das Protein translatiert wird, und einem geeigneten Transkriptions- sowie Translationsstart- und Translationsstoppsequenzen. Die Wahl des Promotors und anderer regulatorischer Elemente variiert im Allgemeinen je nach der eingesetzten (Wirts- )zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken in eine Wirtszelle transfiziert; geeignete Wirtszellen umfassen prokaryotische, Hefe- oder eukaryotische Zellen, und sind dem Fachmann leicht aufgrund seines Fachwissens in Verbindung mit der vorliegenden Beschreibung zugänglich.

[0044] Zur Herstellung des rekombinanten Fusionsproteins, werden die Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor, der die das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure trägt, transfiziert bzw. transformiert wurden, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des erfindungsgemäßen Fusionsprotein fördern. Das Fusionsprotein kann dann aus dem Kulturmedium oder den Wirtszellen mit im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt und isoliert werden (siehe hierzu bspw. Sambrook und Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3. Auflage).

[0045] Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein in einer pharmazeutisch wirksamen Menge enthält, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutische akzeptierbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff, und/oder ggf. mit weiteren pharmazeutisch wirksamen Stoffen.

[0046] Pharmazeutisch akzeptable Träger mit ggf. weiteren Zusätzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen erfindungsgemäß jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für eine therapeutische Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, und weitere im Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimitteln üblicherweise verwendete Stoffe fallen.

[0047] Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann dabei in eine für die jeweilige Therapie geeignete Verabreichung integriert werden. Beispiele für eine Verabreichung umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, transdermale, transmukosale Verabreichungen. Mit einer erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthält, und die dem zu behandelnden Patienten verabreicht, bspw. injiziert wird, akkumuliert das Fusionsprotein über die GPVI-Domäne im Bereich der Endothelläsionen, wodurch sich ein SDF-l-Gradient ergibt und Stammzellen rekrutiert werden. Dadurch wird ein äußerst wirksames Werkzeug zur Behandlung von Krankheiten bereitgestellt, deren Ursache die Läsion von Gefäßen, Organen bzw. Geweben ist, bei welchen als Folge thrombogenes Subendothel freiliegt.

[0048] In einer Ausführungsform ist dabei bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung über einen Stent oder Ballon-Katheter hergestellt wird.

[0049] Alternativ ist bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das Fusionsprotein mit einer Stammzelllösung coinkubiert wird - und so die Stammzellen an das Fusionsprotein binden können - und die so gewonnenen Fusionsprotein- Vorläuferzellen-Konjugate verabreicht werden.

[0050] Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein in Kombination mit einem Wirkstoff enthält, der ausgewählt ist aus mindestens einem von G- CSF (Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor) oder Dipeptidylpeptidase IV- Inhibitoren.

[0051] Es ist bekannt, dass Dipeptidylpeptidasen IV SDF-1 inaktivieren, so dass ein Kombinationspräparat aus Fusionsprotein und Dipeptidylpeptidase IV- Inhibitoren die Halbwertszeit von SDF-1 verlängert. Auf der anderen Seite ist bekannt, dass G-CSF die Mobilisierung von Stammzellen bewirkt. Daher kann mit einer Kombination des Fusionsproteins und G-CSF die Bindungsrate von Vorläuferzellen an das Fusionsprotein erhöht werden.

[0052] Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder zur Regeneration, insbesondere von Gefäßen oder Geweben, oder zur Verbesserung der Hämatopoese und Angiogenese.

[0053] Wie bereits weiter oben ausgeführt, können mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein bzw. eine dieses enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung Gewebe, Gefäße oder Organe behandelt werden, bei denen bspw. aufgrund einer Verletzung oder Erkrankung Subendothel frei liegt, so dass zum einen das Fusionsprotein über sein GPVI-Anteil an das dadurch exponierte Kollagen binden kann, und zum anderen über den SDF-1 -Anteil CXCR4+-Zellen, also insbesondere Vorläuferzellen von Stammzellen an die verletzten Stellen rekrutiert werden können. Dort differenzieren die Vorläuferzellen in Endothelzellen und tragen so zur Re- Endothelialisierung bzw. zur Heilung des erkrankten Gewebes/Organs/Gefäßes bei.

[0054] Insbesondere können dabei Erkrankungen behandelt werden, die ausgewählt sind aus kardiovaskulären Erkrankungen, Arteriosklerose, Myokarditis, Myokard-lnfarkt; ferner kann das erfindungsgemäße Fusionsprotein zur Regeneration des Myokards, der Blut-Hirn-Schranke bei chronisch progredienter Multipler Sklerose, zur Behandlung fibrotischer Leberabschnitte, von Gefäßepithel, insbesondere nach Stent-Implantationen oder bei endothelialen Infektionen, nach Knochenmarksabla- tionen, oder von Gewebe- und Gefäßwunden bei Diabetes, eingesetzt werden. Damit können u.a. erfolgreich Läsionen von Gefäßen behandelt werden, wie bspw. Herzkranzgefäße, hirnversorgende Gefäße, extremitätenversorgende Gefäße, Bindegewebe, Knochen, sowie jedes Gefäß oder Gewebe, das Kollagen aufweist.

[0055] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch weiter zu spezifizierenden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Variationen oder in Alleinstellung möglich sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

[0056] Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel und in den Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt den schematischen Aufbau einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen SDF-l-GPVI-Fusionsproteins (A); und die Proteinexpression dieser Ausführungsform (B), wobei die drei Domänen der Ausführungsform des Fusionsproteins durch Immunoblot-Analysen mit entsprechenden Antikörpern (Anti-SDF-l; Anti-GPVI; Anti-IgG) nachgewiesen werden konnten; die Aminosäuresequenz der in Fig. 1A schematisch gezeigten Ausführungsform ist in (C) gezeigt, inklusive einer Sekretionssignalsequenz;

Fig. 2 zeigt den Nachweis der Kollagenbindung im ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoadsorptionstest) (A); wobei diese Bindung durch Inkubation mit löslichem Kollagen kompetierbar war (B);

Fig. 3 zeigt die Bindung der Ausführungsform des Fusionsproteins an CXCR4 auf CD 14+ Monozyten, dargestellt mittels FACS (Durchflusszyto- metrie)-Kompetitionsanalysen; und Fig. 4 zeigt die konzentrationsabhängige Anregung der Chemotaxis von humanen hämatopoetischen Stammzellen durch das erfindungsgemäße Fusionsprotein in einem Transwell-System.

[0057] In Fig. 1 ist in 1A ein Schema einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionsproteins gezeigt, wobei vom N-Terminus zum C-Terminus nacheinander auf das humane SDF-1 ein Linkermolekül folgt, über welchen SDF-1 mit GPVI verknüpft ist. Das Linkermolekül besteht bei dieser Ausführungsform aus der Aminosäurenfolge (Glycin ₄ Serin) ₃ . An den GPVI- Anteil ist der humane IgG2-Fc- Anteil gekoppelt, der eine Dimerisierung bewirkt.

[0058] In Fig. 1B sind Immunoblots gezeigt, über welche die Expression der einzelnen Komponenten im Fusionsprotein, wie in Fig. 1A schematisch dargestellt, nachgewiesen wurde. Links wurde mittels eines Anti-SDF-1 -Antikörpers (monoklonaler anti-human/-Maus CXCL12/SDFlalpha Antikörper; R&D Systems; Minneapolis, USA) der SDF-1 -Anteil im Fusionsprotein nachgewiesen, mittig mittels eines Anti- GPVI-Antikörpers der Anti-GPVI-Anteil und rechts mittels eines Anti-IgG-Antikörpers der IgG2-Fc- Anteil im Fusionsprotein (jeweils erste Spur). Zu erkennen ist, dass das Fusionsprotein eine Größe von ca. 85 kDa aufweist. Als Positiv-Kontrollen wurde für den Nachweis von SDF-1 das unfusionierte Polypeptid hSDF-1 eingesetzt (dritte Spur), bzw. das GPVI-FcIgG2-Konstrukt (für GPVI; dritte Spur) oder FcIgG2 alleine (für FcIgG2; dritte Spur).

[0059] In Fig. IC ist oben die Sequenz des Fusionsprotein gezeigt, das darüber hinaus an seinem 5'-Ende noch eine 20 Aminosäuren lange Sekretionssignalsequenz (IgK Leader-Sequenz) aufweist (SEQ ID-Nr. 6); SEQ ID-Nr. 7, in Fig. IC unten dargestellt, zeigt das Fusionsprotein ohne diese Sekretionssignalsequenz. Diese Sekretionssignalsequenz ist für den Export des Fusionsproteins in den Zellkulturüber- stand verantwortlich. Im Anschluss an diese Sekretionssignalsequenz folgt von Aminosäureposition 21 bis 88 eine SDF-1 Sequenz (ohne Leader), die 68 Aminosäuren lang ist. Die Leader-Sequenz von SDF-1 (MNAKVVVVLV LVLTALCLSDG; SEQ ID- Nr. 8) ist dabei, wie oben erwähnt, nicht enthalten. Darauf (Position 89 bis 103 in SEQ ID-Nr. 6) folgt ein 15 Aminosäure langer Linker/Linkersequenz, über welchen die extrazelluläre GPVI-Domäne (Position 104 bis 352) mit dem Fusionsprotein verknüpft ist. Daran wiederum schließt sich ein kurzer (3 Aminosäuren) Linker an (Position 353 bis 355), über welchen das Fusionsprotein noch mit dem IgG2-Fc-Anteil (Position 356 bis 578) verknüpft ist.

[0060] Die in Fig. 1 gezeigte Ausführungsform wurde mittels PCR und jeweils für die einzelnen Abschnitte geeigneten Primern generiert. Das synthetisierte Gen wurde dann in den Vektor pCDNA5/FRT (Invitrogen) kloniert. Anschließend wurden CHO (Zellen aus Ovarien chinesischer Hamster) Flp-In Zellen (Invitrogen) mit dem Konstrukt stabil transfiziert. Die Zellen exprimierten das Fusionsprotein in den Überstand, aus welchem dieses auf gereinigt wurde.

[0061] Zur Gewinnung der in Fig. 2 dargestellten Daten wurde ein Kollagen- GPVI-ELISA durchgeführt. Hierfür wurde eine 96-well Platte mit 10pg/ml Kollagen beschichtet, mit Blockierlösung blockiert und im Anschluss mit dem Fusionsprotein oder den entsprechenden Kontrollproteinen inkubiert. Anschließend wurde mit dem Peroxidase-konjungierten anti-human IgG Antikörper detektiert. Im Folgenden wurden die Werte der Bindungskurven durch Messen der Wellenlänge bei 450nm ermittelt. Zu erkennen ist in Fig. 2A, das sowohl das Fusionsprotein SDF1-GPVI als auch das Kontrollkonstrukt GPVI-FcIgG2 konzentrationsabhängig an Kollagen bindet, während FcIgG2 keine Bindung aufweist.

[0062] In Fig. 2B konnte gezeigt werden, dass durch Vorinkubation des Fusionsproteins mit löslichem Kollagen als kompetitiver Hemmstoff die Bindung nahezu vollständig geblockt wurde.

[0063] In Fig. 3 wurde die Bindung von SDF1-GPVI an CXCR4 mittels eines FACS-Kompetitionsassays gezeigt. Hierzu wurden Monozyten isoliert, da Monozyten auf ihrer Oberfläche CXCR4 exprimieren. Diese Monozyten wurden mit dem Fusi- onsprotein oder den entsprechenden Kontrollproteinen inkubiert und im Anschluss mit dem aCXCR4-PE gelabelten Antikörper (BD Biosciences; Katalog-Nummer 555974; USA) angefärbt. Durch die Bindung des Fusionproteins SDF1-GPVI an CXCR4 wird der Antikörper kompetiert und somit nahmen in der anschließenden FACS Analyse die aCXCR4-PE positiv gefärbten Zellen ab. Dadurch steigt die Anzahl der analysierten Zellen in dem unteren rechten Quadrant an. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein SDF1-GPVI an CXCR4 bindet.

[0064] In Fig. 4 wurde das Fusionsprotein auf seine chemotaktische Funktion untersucht. Hierzu wurde in die untere Kammer einer Transwell Platte das Fusionsprotein SDF1-GPVI in unterschiedlichen Konzentrationen (2 pg/ml; 10 pg/ml; 20 pg/ml), hSDFl als Positivkontrolle und Medium als Negativkontrolle vorgelegt. CD34 ⁺ hämatopoetische Stammzellen wurden isoliert und je 150.000 Zellen in die obere Kammer gegeben. Nach 6h Inkubation bei 37°C im Inkubator wurde die obere Kammer verworfen. Die in die untere Kammer gewanderten Zellen wurden fotografiert und anschließend die Zellzahl in der unteren Kammer bestimmt. Hierfür wurden die Zellen aus der unteren Kammer jeweils 1 min mit Hilfe des FACS gezählt. Durch dieses Experiment konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein SDF1-GPVI chemotaktisch wirksam ist.