本 涉及重 蛋白及其在 領域的 特別是涉及 神人 仟 細胞生 于21 高 血糖 似 1或其美似物的融合蛋白 及其在 各 肥胖、 2 糖尿病和高血脂的 物中的 和制 各方 。

背景 木

仟 細胞生 于 FGF 是 多功能活性多 目前 了 18 哺乳 物成仟 細胞 生 于 GF -FGF FGF FGF2 。 序列同源性不同 它們可 細分力6 不同的立科 A ew Bee e 等 a Rev T g cov200983 235253 。 仟 細胞生 于21 以下你FG 是由 a等 aT等 Boc op y ca 2000 1492 203206 于2000 在小鼠胚 胎中 FGF 9 FGF23 同 立科 不具有 結合的功能 它們均在 市內分祕方面 作 用 可以 、 固醇、 葡萄糖、 生素 等的代謝。

FG 基因 于19 染色休 全 FG 蛋白由 181 氮基酸的成熟FG 蛋白和 于 端的28 氮基酸的 。 成熟的人FGF2 蛋白 末端和C末端都具有生物羊功能 末端 氮基酸 FGF 休的相互作用 C末端氮基酸 bea o o蛋白的相互作用 ca cR等 J Ce 2009 2192 227234 FGF21的 細胞分布的研究主要集中在 R』A水平 內 性 的FGF2 R』A首先在胸腺和 中 接若在 、 脂肪 和肌肉 同伴 了FGF21 的 R』A aga 等 Ce e北 2007 5 6 415425 。 FGF21生物羊功能是在利用葡萄糖 取分析 佈施可能用于 糖尿病的新蛋白 的 ha o e ovA等 J C ve 2005 115 6 16271635 。 FGF21蛋白可以刺激分化的小鼠 3 細胞和人前脂肪細胞的葡萄糖 。 胰島素 早的 利用葡萄糖不同 FGF21在葡萄糖 方面的 可持 小 。 更重 要的是 FGF21作用下的葡萄糖 是非胰島素依救性的 而且在 胰島素共同存在 可以增加 葡萄糖的 Aexe ha o e ov等 Bo g 2008 22 1 3744 。 的 未明 FGF21 增加3T3 細胞和人前脂肪細胞中葡萄糖 休 1 G T- 的 未增加非胰島素依 的葡萄糖 A e 等 FEB e 2008 582 12 17251730 Wo e Te等 We abee 2006 55 24702478 在 萬的小鼠胰島和 E細胞中 FGF21可以增加胰島素的特汞、 和分 阻止 毒性和細胞 于 早的 細胞死亡 胰島 細胞的數量和功能 抑制葡 萄糖 早的 高血糖素的釋放。 在 FGF21 高 特基因小鼠 FGF2 A依度比利 高 50150 倍 的特基因小鼠中 其休內的 固醇、 葡萄糖、 的含量見著降低 空腹胰島素 水平也下降 胰島素敏感度和葡萄糖 得到改善 aga Ce e北 2007 5 6 415425 相反的 在由腺病毒 早的FGF21基因 的小鼠中出現了 重的代謝 包括脂肪肝 高 血症 中游萬脂肪酸和 固醇含量 增高以及血 中 的減少等 B a 等 Ce e北 2007 5 6 426437 。 在非人 糖尿病 模型方面 注射 FGF21可以降低 固醇含量 增加 固醇含量 降低 心血管方面疾病的風險 ha o e ov A等 E doc o ogy 2007 148 774781 。 在目前述 的重 FGF21 休內 羊 強中 現有 低血糖、 水 和肥胖增多等其他糖尿病 出現的 反 出現 了良好的 前景和安全性。

于 FGF21 的潛在 糖尿病的 y公司和A bx公司正在 相夫 物研究 y 公司的重 FGF2 休蛋白 P 152 她在1 FTye CC等 W 2006/028595 A bx 公司和 e c 公司的 PEG 的人 FGF21 蛋白 她在 前研究 T o a 等 2008/025045

FGF2 末端缺失4 氮基酸 仍具有生物羊作用 ca cR等 J Ce y 2009 2192 227234 局部氮基酸 或 和 基化 生物活性的降低 FTye CC 等 W 2006/028595 。 因此 行人 FGF21氮基酸序列的改造 蛋白研究 的 介重要方向。 G P

高血糖 1 G P 作力 高血糖 p og cago 基因的 加工 于 1984 aaovS等 JBo C e 1986 261 1188011889 。 高血糖 基因 于17 染 色休 不 可以在 的 細胞中表 可以在腸道中的 細胞中表 。 在 細胞中 基因的 特汞和 均相同 但基因的 加工 不同。在 的a細胞中 高血糖

高血糖 、 高血糖 相夫性多 和 高血糖 原主要片段。 在腸道的 細胞中 高血糖

高血糖 1 G P 、 高血糖 G P2 和 高血糖 e e 等 Reg ep 2004 117 7788

腸道最初戶生的G P 活性的37 需要切除 末端6 形成具有生物活性的G P 737 C末端 氮 可以作力 化 的 解力G P 736 形式 C末端 化增加了G P 的休內稍定性。 腸道中天然戶生的G P 1有80%左右以后 形式存在 e J等 E doc Rev 1999 25 876913 。 食物在腸道的 化吸收 中 刺激腸道 細胞分 G P 其中 美和 的 刺激作用最強。 正常人 5 30分神內 G P 依 即見著上升。 G P 作力 重要的 血 糖 其主要的生物羊功能包括 1 胰島 細胞上的特 休G P R結合 刺激胰島素的生成 釋放。 葡萄糖依 高低有夫 葡萄糖依 高 胰島素 的作用 葡萄糖依 降 低 G P 胰島素 的作用降低。 2 抑制胰島 細胞中 高血糖素的釋放 而減少 中葡 萄糖 的分解釋放。 3 提高胰島素敏感度 改善胰島中 細胞的功能 促迸 細胞的增殖 減少細胞 。 4 促迸胰島前休細胞分化 成熟的胰島細胞。 5 降低 空的速度、 抑制 Va a B 等 C gTage 2008 9 9 92

足 天然 G P 在 糖尿病上有 多 但在休內 半衰期很 限制了 床上的直接 。 休內 V dpep ep da V P V 可特 G P 末端第二位的Aa 的 末端切除 使G P 在休內很 解力 活性的G P 936 和G P 937 生物半衰期 2分神左右。 了 G P 在休內的生物半衰期 以使其更好 作力治 于 目前的研究 是 G P 改造 尋找 抵抗 PP V 的特 休 AT oz 等 E T a c 2006 28 9610

A y 公司和 y公司在 G P 碰上升 的糖尿病 Exe a de 第 介在 G P 休功能上衍生出未的 。 Exe a de是人工合成的Exe d 4 者是 神在美洲 唾液中 的含有 39 氮基酸的 是 有效的 G P R E g J等 J Bo C e 1992 267 74027405 Exe d 4作力G P 似 G P 具有53%的同源 第二位氮基酸 氮 可以防止 PP V 了 半衰期。 G P 的22 氮 了G P 的 同螺旋 而在Exe d 4中 16 的 氮 稍 螺旋 了重要作用。 另C末端含有g G P 有的氮 基酸 P GAPPP 不易 內 可 G P R的 末端結合 增強占G P 休永 和力 o e a G JC E doc o eab 2003883082308 Exe d 4 G P 的 使得Exe d 4降低血糖的能力比G P 5530倍。 此外 由Exe d 4衍生的G P 似 ZP 同 現出血中半衰期 可 每日給 的 目的。 Z 0是在Exe d 4的 C 增加了 氮 Pe e e J abe o oga 2002 45 A147 的Exe d 4 J 。 的 ovo o 公司 的 化的G P 衍生物 ag de V b T 北e e CaTe 2007 30 16081610 天然的G P 相 4 y Ag 替代 同 含有 16 碳的脂肪酸

氮 連接 G P 的26 y L ag de可 中自蛋白形成非共 連接的衍生物 保留了 G P 的功能 拮抗 PP V的 其半衰期 11 15小 合每天 的 方式Ebo dB 北ee Cae 200225 13981404 。正在 的另 介G P 似 CJC 3 中 C 37 氮 休外 可以 中自蛋白中 34 氮 形成 連接 同 可以 天 的 JG 北ee 2003 52 751759 。 由此可 化羊或基因工程手段 將 G P 和 exe d 4 1 或 氮基酸 、 缺失或添加氮基酸于C 的 G P 似 可以較好地 保留生物活性。

在 多有夫G P 和人FGF2 的公升 和 中 op e o CT 3/26 C agA Ro e 2006/0194735 A Wo ga g Gae e 2007/0036806 Wo ga g Gae e CT 4/16611 T o a C JEC 2008/0255045A G P 或者FGF21分別 蛋白、 gG的Fc片 段、 特 蛋白的融合 G P - A G P G P Ta 6e FGF21- A4 FGF2 Fc 能安 G P 或FGF21在休內的半衰期 到最 周 的功效 的化羊 而形成的PEGG P 和PEGFGF2 同 了兩者在休內半衰期的 。

上 休 G P FGF21是近年 度比較高的 糖尿病的多 前者 和功能的 研究 充分 已有 F 上市的 者 血糖的功效于2004 在劫物安強中 了非常好的 血糖、 血脂的功效。 由于 床上高血糖、高血脂往往 但目前尚未 到綜 合 者生物活性、 克服了 半衰期 的缺陷而 的具有 血糖血脂作用的 。 內容

本 上休領域的空白 提供 神將G P 或 似 Exe d 4和人FGF21融合成

了 血糖血脂的功能 有效 G P 或exe d 4血液半衰期 融合 可用于 各 高血糖和高血脂相夫疾病 糖尿病、 、脂肪肝、高 血症 綜合 或心血管疾病的 。

血糖血脂融合蛋白 其 到C 有如下 連接方式 R R2 R2R R R2 R2 R 其中 R 仟 細胞生 于21蛋白、或 休或活性片段 R2 高血糖 似 1或 似 或 休或活性片段 連接 。

休 到C 的連接方式 R2R 或R2 R

休人 仟 細胞生 于21蛋白的氮基酸序列 E o 1所示 其 休或活性片段 具有如 E o 1所示氮基酸序列中的 介或多 氮基酸 取代、 缺失或添加而 得但不改 生物活性和功能的 。

休 高血糖 似 1的氮基酸序列 EQ o 2所示 其 休或活性片段 具有如 Q o 2所示氮基酸序列中的 介或多 氮基酸 取代、 缺失或添加而 得的但不改 生物活性 和功能的 。

休 高血糖 似 1的 似物力Exe d 4 其氮基酸序列 E o 3所示。

休 高血糖 似 1的 似 xe d 的衍生物 具有如 E o 3所示氮基酸 中的 介或 氮基酸 取代、 缺失或添加得到的且 具有 E o 2所示氮基酸序列的 相同生物活性或功能的蛋白 。

連接 由5 30 氮基酸 。

連接

a GyGyGyGy e e 是 5之同的整數 或1

b GyGyGyGy Gy e 是 5之同的整數 或1

GyGyGyGy e e P o 是 5之同的整數 或 1

d P oG AaP oT Ap 是 5之同的整數

或/和 e- e e- e-Gy e P o 是 5之同的整數 或1。

上述融合蛋白的基因片段。

包含上述基因片段的 休。

宿主細胞 其特 在于 它含有上述 休。

宿主細胞指大腸 細胞、 酵母細胞或C 細胞。

上述融合蛋白的 各方法 包括如下步驟

a 在所 宿主細胞中表 融合蛋白

b 萬、 純化 融合蛋白。

上述融合蛋白在 各 糖尿病、 肥胖、 脂肪肝和高血脂 綜合 的 物中的 。

其活性成分力上述融合蛋白。

在本 的第 方面 提供了 融合蛋白 它包括 人成仟 細胞生 于21 FGF2 的氮 基酸序列、 高血糖 似 G P 或Exe d 的氮基酸序列以及兩者之同的5 30 氮基酸 的連接 序列。 仟 細胞生 于21 FGF21 氮基酸序列可以 于融合蛋白的 末端 也可以 于融合蛋白的C末端。較佳 人FGF21 于融合蛋白的C 。 融合 了G P FGF21 在生物活性方面相 相成的作用 1 抑制 高血糖素的生成 減少 中 的分解釋放 2 改善 胰島中 細胞的功能 促迸 細胞的增殖 3 提高胰島素敏感性 低血糖和休 增加等不良反 的 風險 4 改善 。兩者 迫不同的 細胞上的相 休或相同 細胞上的不同 休而 血 糖的作用。 FGF21 降低血糖不依 于胰島素 同 可 脂肪細胞中的 到 血脂的作用。 而G P 在 腸道 和降低 方面的生物作用可加強FGF21的 血糖血脂的功能。

于連接 FGF2 和G P 或exe d 4的連接 包括多 序列 如 GGGGG GGGG

"

、 GGGG G 等 其中 代表15的整數 形成由5 30 氮基酸 的連接 連接 " "

序列中可以加入 o 的序列 連接 可以是以上 形式序列的任意 合 同伴 本 融合蛋白半衰期的目的。

G P 具有天然人G P 的序列 EQ o 2 外 包含由此 衍生出的 休或衍 生物 以及 EQ o 2具有40%以上同源 、 保留了G P 生物羊功能的 似 。 G P 的 似 物主要 Exe d 4 具有 E o 3的氮基酸序列特 。 Exe d 4具有 于天然G P 的生物特 可抵抗 V和其他內 的 同 增強占G P 休的永和性。

在本 的第二方面 提供了 上述本 上述融合蛋白的 A分子的方法 提供 A分子的 序列 如 EQ o 10所示。 在本 的第三方面 提供了含有上述 A分 子的 休及其制各方法。

在本 的第四方面 提供了包含上述 休的宿主細胞。 在本 的第五方面 提供了 神戶生本 融合蛋白的方法 它包括以下步驟 在合 融合蛋白的 下 上述的宿主細胞 而未 出所 的融合蛋白 及分萬所 的融合蛋白的方 法。

本 的融合蛋白 了G P 或exe d 4和人FGF2 的 血糖血脂的功能 了 有效 G P 或exe d 4血液半衰期的目的 其主要用途是作力治 高血糖 高血脂等代 疾 病的 物的活性成分 可添加 羊上可接受的 休或賦形 或稀釋 。 本文所用 木 FGF2 和G P 的融合蛋白 由 仟 細胞生 于21氮基酸序列和 高血糖 似 G P 或Exe 4 氮基酸序列融合而成的蛋白 其中人 仟 細胞生 于21 氮基酸序列可以 于融合蛋白的 末端 也可以 于融合蛋白的C末端 兩者之同可以有或者 連接 序列。

如本文所用 木 融合蛋白+ 仟 細胞生 于21氮基酸序列 融合蛋白中的 部分 氮基酸序列 可以是序列表中 E o 1的氮基酸 序列 或者是將 E o 1的氮基酸序 列 介或 氮基酸 的取代、 缺失或添加且具有 E o 1的氮基酸 序列相同活性 的由 E o 1衍生的氮基酸序列。

如本文 引用 木 融合蛋白+ 高血糖 似 G P 或Exe d 氮基酸序列 融 合蛋白中的 部分氮基酸序列 可以是序列表中 E o 2或 E o 3的氮基酸 序列 或者是將 o 2或 E o 3的的氮基酸序列 介或 氮基酸 的取代、 缺失或 添加且具有 E o 2相同活性或功能的由 E o 2或 E o 3衍生的氮基酸序列。

如本文 引用 木 連接 于 仟 細胞生 于 21 氮基酸序列和 高血糖 似 G P 或Exe d 氮基酸序列之同的、 連接作用的 。 連接 的 通常 530 氮基酸。 木人員可按照本領域 方法 連接 。 通常 連接 不 或 仟 細胞生 于 21 和 高血糖 似 氮基酸序列形成 的折疊和 同 。

本 融合蛋白的 c A序列 可以全部人工合成。 也可以用 PC 或合成的方法 得 FGF21和或G P 的 A序列 然 將 接在 起 形成 本 融合蛋白的c A序列。

在 得了本 融合蛋白的 A序列之 將 合活的 休 再特 合活的宿主細胞。 最 特化 的宿主細胞 通 分析純化得到本 的融合蛋白。

如本文所用 木 休包括 、 休、 休、 病毒 休。

在本文所用 木 宿主細胞包括 細胞和其 細胞。常用的原 宿主細胞包括大腸 、 常用的 宿主細胞包括酵母細胞、 C O 細胞、 E 293 細胞。 可以 的方法將含 有目的基因的 A序列的 休特移到宿主細胞內 乘用的方法取決于細胞宿主的 。 例如 細胞通常乘用氯化鈣特化法 而 于其他宿主細胞可以乘用 穿孔 。

在本文所用 木 純化方法包括常用的力本領域 的純化方法 包括萬于交換 、 水作用 、 反相 、 透析、 、 分子排 PAGE和R P C 得純度大于95%的 融合蛋白。

至此 本 了 的描述 通 參考下列 本 有更清楚地理解

明目的而 不旨在 本 限制。 1 FGF21氮基酸序列 E o 1 2 G P 737 氮基酸序列 E Exe d 4氮基酸序列 E 比 3 Ex d 4GGGGG FGF21融合蛋白 Ex4 6-F2 氮基酸序列和相 的c A EQ o 0

4 pET3C Ex4 F21 示意囤

5 pGAPZ A Ex4 F21 示意囤

6 pET3CEx4 F21 AGE冉冰 倍

左 1 4 2 3小 3 早前 4 a e 7 化 Ex4 F21反相 P C 倍 A 和 AGE冉冰 倍 B 左 1 a e 2 Exe d 4FGF21 化 蛋白

8 Ex4F2 、 Ex4 F2 、 Ex4 F2 、 GEx4F2 、 GEx4 6-F2 GEx4 F2 和 Exe d 4在小鼠休內 血糖

休 方式

1融合蛋白 e Exe d 4 GGGGG FGF2 Ex4 F2 在大腸 中的重 和制 各

在本 中 涉及的 G P 和 FGF2 融合蛋白具有 e Exe d 4 GGGGG FGF 。 Exe d 4和 FGF21 的氮基酸序列 按照大腸 和酵母 的 于 宅生物 大連 有 限公司 全基因合成Fg-2 的c A序列 E O4所示 Exe d 4的c A序列 EQ O5所示

要求合成 合成4 P 、 4

5 GCCATATGCATGGTGAAGGTACC- EQ O6

P2 5 GAGAACCACCGCCGCCACCAGATGGAGGTGGGGCACCAG3 EQ O7

P3 5 CTGGTGGCGGCGGTGGTTCTCACCCAATCCCAGATTCTA3 E 8

P4 5 -GCGGATCCTTATCATGATGCATAA-3 EQ O9

P 中GC 物保 CATATG d P4中GC 物保 GGATCC Ba 。

以Exe d 4C A序列 P 和P2 Exe d 4基因 P 含有 d

P2尾部含有 接 GGGGG 的 以FGF2 A序列 P3和P4 FGF21基因 P3 含有 接 GGGGG 的 序列 P4尾部含有 于和Ba

再以上部 的 Exe d 4 FGF21 片段 P 和 P4 e Exe d 4GGGGG FGF 基因。 的 Exe d 4GGGGG FGF 基因首尾分別加入 de 和 Ba 插入 休pET

重疊延伸 PC e Exe d 4GGGGG FGF 基因的反 休 PCR反

TA A4R 大連 商家的 。 PCR反 94C 56C 72C 共 。

30介 第 介 94C 最 介 72C延伸 示分別 得了 12 bp Exe d 4 56 bp FGF21 70 bp e Exe d 4 GGGGG FGF EQ O 0的 。

PCR 低 化 de 和Ba 回收目的片段 T4 A連 接 同 de 和Ba 回收的 pET3C 于 v Toge 連接 特化大腸 宿主 5 和PCR 的 pET3CExe d 4 GGGGG FGF2 4 A TA A4R4 大連 未明 的Exe d 4GGGGG FGF 基因 全 致 EQ O 0 。 將上休 的 特化大腸 休宿主 B 2 SaT E3 py ovage 成功 pET3CExe d 4GGGGG FGF2 B 2 Sa E3 py 工程 。

。

將 休最佳工程 哉接神于 A 平板 37C 。 的 A平板上

。 接神于 B 休 蛋白 1 9 酵母提取物59 aC 9 水 至 10 12 C 高 。

3 即可 中 37C 12小 1%的比例特接到 2 m B 液的 10 。

三角 中 37C 即成 上 于 。 將上 于 5%的比例接神于 YT 液的

。

中 37C 中 特 、 、 氧量 保持 氧在 30%以上 28%的氮水 p 保持在70。至 600 10 14吋 加入 依 05 o/ PTG 。 4 停止 6 收集 800 p 萬 10分神 上 收集 休放入2 C冰箱 保存各 。

。

2 C冰箱中取出 休 放入細菌裂解液 5 o/ T C o/ TA 02 g/m 。

37C下 1小 即 400W 工作 同5 同 5 40 120 P 萬 10分神 上 A 2 o/ T C 0 m o/ TA 2 o/ ea 。

%T o 0 37C 3 120 p 萬 10分神 上 B 2 o/ T C 。

p 0 4 o/ ea 0 o/ aC 3 C 再 120 P 萬 10分神 收集包涵休 。

包涵休的 和 化 加入包涵休 解液 8 尿素 乙醇 p 5 /100 p E 2 o/ E TA 包涵休 萬 去除不 解液 Q ep ao eFF 萬。 Q ep ao eFF平衡 8 尿素 5 乙醇 p 5 / E 2 o/ E TA 平衡 上 解液 平衡。 05 o/ 的 aC 哉 收集 融合蛋白的 。

。

Q ep ao e 化的融合蛋白 于4C 2 o/ T C p g0 中越 透析 或者 1 8加入 稀釋 12小 。

化 再 R P CWae 公司 C18 相A 01% 、 5% 相B 01% 、 95% 0 %B哉 越 化。 R P C 化的目的 再 pedex 75 A e a Bo ce ce PB p 74 得 e Exe d 4GGGGG FGF 融合蛋白 大于950% 7. 2融合蛋白 e Exe d 4 GGGG -FGF2 Ex4 F2 在大腸 中的重 休 和制各

在本 中 涉及的G P 和FGF 融合蛋白具有 e Exe d 4 GGGG -FGF21 。 將 1中 序列 的重 pET3CExe d 4 GGGG FGF 作力 PC 融合蛋白具有 e Exe d 4 GGGG -FGF21 要求合成4 P 、 5 6 4

5 GCCATATGCATGGTGAA4GGTACC-3 E O6

P5 5 GC G C C C C CTAC C C C GGAG G -3 E O 1 P6 5 AGCGGTGGCGGTGGCTCTGGCGGCGGTGGTTCTCACCCA-3 EQ O 12

P4 5 -GCGGATCCTTATCATGATGCATAA-3 EQ O9

P 和P5 Exe d 4基因[P 含有 d P5尾部含有 接 GGGG 的 序列] P6和P4 FGF21基因 P6 含有 接 GGGG 的 序列 P4尾部含有 于和 Ba 再以上部 的 Exe d 4 FGF21片段 P 和 P4 e Exe d 4 GGGGG FGF21基因。 的 Exe d 4 GGGGG -FGF2 基因首尾分別加入 d 和Ba 插入 休pET

、 化同安 1 得到 大于95.0%的Ex4 F21融合蛋白。

3融合蛋白 e Exe 4 FGF2 Ex4 F2 在大腸 中的重 和制各 在本 中 涉及的G P 和FGF2 融合蛋白具有 e Exe d 4 -FGF21 要求合 成4 P 、 4

5 -GCCATATGCATGGTGAA4GGTACC-3 E 6

P7 5 AGAATCTGGGATTGGGTGTGGAGGTGGTGCACCAGA3 E O 3

P8 5 CA CAAT C A CTAG C T T A4 TC -3 E O 4

P4 5 -GCGG CCTTATCATG GCAT 3 EQ 9

以Ex d 4C A序列 P 和P7 Exe d 4基因 P 含有 d

P2尾部含有 FGF21的 以FGF2 A序列 P8和P4 FGF21 基因 P8 含有 Exe d 4的 序列 P4尾部含有 于和Ba 再以 上部 的Exe d 4 FGF21片段 P 和P4 e Exe d 4 FGF21基因。 的 Exe d 4 FGF21基因首尾分別加入 d 和Ba 插入 休pET- 、 化同安 1 得到 大于95.0%的Ex4F21融合蛋白。

4融合蛋白 e Exe d 4GGGGG FGF2 GEx4 F2 在酵母中的重 和 制各

在本 中 涉及的G P 和FGF21融合蛋白具有Exe d 4GGGGG -FGF21 要求合成4

Pg 5 CTCGAGAA GACATGGTGAAGGTACTTTTACCTCTGAT3 EQ O 5

P2 5 GAGA CCACCGCCGCCACCAGATGGAGGTGGGGCACCAG3 EQ 7

P3 5CTGGTGGCGGCGGTGGTTCTCACCCAATCCCAGATTCTA3 E - 8

P 5 GCGG GCTTATCATG GCATAAGAAGGACTACGACC -3 E 16

以Exe d 4C A序列 Pg和P2 Exe d 4基因 Pg 含有X

P2尾部含有 接 GGGGG 的 以FGF2 A序列 P3和P FGF21基因 P3 含有 接 GGGGG 的 序列 P 尾部含有 于和 o 再以上部 的 Exe d 4 FGF21 片段 Pg 和 P Exe d 4 GGGGG FGF 基因。 X o 和 o 的PC 片段 X o 和 o pGAPZ A v Toge 接 得到 pGAPZ AExe d 4 GGGGG FGF2 5. 將 Av 哉性化 特 將哉性化的重 pGAPZaA Exe d 4 GGGGG FGF2 早入G 15 酵母 v Toge 中 +和Zeoc 得 Ze g/ 的高

。

。 接神于5 YP 中 30C 特接 250 YP 中 96小 。 收集上 o FF C18 和 edex 75 化 各 融合蛋白 大于95.0% 融合蛋白Ex4 GGGG 3F2 GEx4 F2 在酵母中的重 和制各

在本 中 涉及的G P 和FGF21融合蛋白具有Exe d 4 GGGG 3-FGF21

要求合成 。

合成4 6 Pg 5 CTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTTACCTCTGAT3 E O 15

P5 5 GCCAGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCGCCACCTGGAGGTG -3 E O P6 5 AGCGGTGGCGGTGGCTCTGGCGGCGGTGGTTCTCACCCA-3 E O 12

P 5 G GC TATCATGATG T G G C C CC 3 EQ O 6

以 1中 序列 的重 pET3CExe d 4 GGGG - G 21作力 PC 融合 蛋白具有 e Exe d 4 GGGG -FGF21 。 Pg和P5 Exe d 4基因 [Pg 含 有X o1 P5尾部含有 接 GGGG 的 序列] P6和 P FGF 基因 P6 含有 接 GGGG 的 序列 P 尾部含有 于和 o

再以上部 的Exe FGF21片段 Pg和P Exe d 4 GGGGG FGF 基因。 的 Exe d 4 FGF21 基因首尾分別加入 X o 和 o 插入 休 pGAPZ A

將 Av 哉性化 特 將哉性化的重 pGAPZ A Exe d 4FGF21 早入 G 15 酵母 V oge 中 +和Zeoc 得 Zeoc g/ 的高 。

。

接神于5 YP 中 30C 特接 250 YP 中 96小 。 收集 上 ep ao eQFF C18 和 pedex 75 化 各 融合蛋白 大于950% 6融合蛋白Ex4F2 GEx4F2 在酵母中的重 和制各

在本 中 涉及的G P 和FGF21融合蛋白具有Exe d 4FGF21 要求合 成 。

合成4 Pg 7 8

Pg 5 T T T T T TTT C T T T 3 ( E N 5)

P7 5 TTT T T T TT T T T T ( E N 3) P8 5 T T T T T T T T T T T T T T T TTT ( E

N 4)

P 5 C TT T T T T T T 3 E N 6)

以Exe d 4C A序列 Pg和P7 Exe d 4基因 Pg 含有X o P7尾部含有 FGF21的 以FGF2 A序列 P8和P FGF21 基因 P8 含有 Exe d 4的 序列 P 尾部含有 于和 o 再以上 部 的Exe d 4 FGF21片段 Pg和P Exe d 4 FGF21基因。 的Exe d 4 FGF21基因首尾分別加入X o 和 o 插入 休pGAPZaA

將 Av 哉性化 特 將哉性化的重 pGAPZaA Exe d 4FGF21早入G 15 酵母 v oge 中 +和Zeoc 得 Zeoc g/ 的高 。

。

接神于5 YP 中 30C 特接 250 YP + 96小 。 收集上 ep aTo eQF C18 和 pedex 75 化 各 融合蛋白 大于950%

7大腸 的融合蛋白 分別 Ex4F2 、 Ex4 F2 和 Ex4 F2 以 及酵母 的融合蛋白 分別 GEx4F2 、 GEx4 F2 和 GEx4 F2 G P 休 合功能

口服葡萄糖 81 Bab/c小鼠 大羊 物中心 分力 15 只 空白 、 Exe d 4 由成都 生物技木公司合成 以下同 、 融合蛋白 Ex4F2 、 Ex4 F2 、 Ex4 F2 和GEx4F2 、 GEx4 F2 、 GEx4 F21 。 前1 禁食 不禁水 1618小 腹腔分別注射25 g/ g 的 Ex4F2 、 Ex4 6-F2 、 Ex4 F2 、 GEx4F2 、 GEx4 F2 、 GEx4 F2 5 g/ gExe d 4具有相同 0.5小 1．5 g/ g休重的葡萄糖 在 3 2 4 6 血糖 。

給 Exe d 4和各 融合蛋白均勻有較好的 血糖作用。 相同 不同 系統 酵母 的融 合蛋白 作用 于大腸 。GEx4 F21的 作用 Exe d 4元明 。GEx4F2 的 作用 GEx4 F21 的 60% GEx4 F21 的 作用 b GEx4 F21 10%。 GEx4 F2和 GEx4 F21在休內 作用 同最 在 2小 仍具有明 的 血糖效 果 8.

cA P 將 細胞以 5x1 4 細胞的密度在24 細胞 中 先 細胞在 有 00 X 的 450 的元血清 FR 內 5 。 然 加入 不同 度的 Exe d 4 或 Ex4F2 或 Ex4 6-F2 或 Ex4 F2 或 GEx4F2 或 GEx4 6-F2 或 GEx4 F2 的 FR 3 10分神 加入 乙醇 反 。 細胞 上 1/8休 的醋酸 再用cA AR 公 司 。 未明 以葡萄糖含量力 Ex4 F21她理的 1細胞內 cA P7K 作力 哉水平 cA P。 在 5 葡萄糖存在的 況下 Exe d 4或各 融合蛋白她理的 1細胞 cA P7 著增加 相同 不同 系統 酵母 的融合蛋白 作用 于大腸 的蛋白。 GEx4 F21 相同 度的Exe d 4她理的細胞中cA P水平 乎相同。 GEx4F2 30% GEx4 F21 。

大腸 的融合蛋白以及酵母 的融合蛋白 FGF2 休 合功能

細胞 及 分化 在3 5%C 2 的 下 3T3 1前脂肪細胞在 1 %FB 的高 E 中 2天 后加入 0．5 o/ B X、 / 、 g/ 胰島素的高 E 48 再 g/ 胰島素的高 E 48 分化8 12 的3T3 1細胞90%左右 脂 肪細胞 于以下 。

葡萄糖特 分析 24 中 3T3 1脂肪細胞 同 分別加入 FGF21 生物 有限公司提供 以下同 或 Ex4F2 或 Ex4 F2 或 Ex4 F2 或GEx4F2 或GEx4 6-F2 或GEx4 F21 的 0.2%B A的高 E 使 分別 0、 0．03、 0．15、 0．8、 4、 20 和 3 37C 24小 。

葡萄糖 37°C 的 R aC .2 o/ C 4.7 o/ g 4 1.2 o/ CaC22.5 o/ a 2P 42.5 o/ p .4 37°C 在含有 1%B A 0．2 c/ 2 氧 [14C -葡萄糖 1 的 R 孵育 加入 o/ 細胞 B 葡萄糖的 。 另 o/ 細胞 B yoc aa B 作力2 氧 14C -葡萄糖的非 特 所有數 減去此 作力各 細胞的葡萄糖 。

1不同蛋白 下的葡萄糖 CP

不同蛋白 下的葡萄糖 CP

0.03 0.5 0.8 4 2

FGF21 1875 215 1801 247 2107 167 2203 233 3300 251 32 280 5325 263 Ex4F2 1903 222 1989 249 2032 198 2103 218 2686 24 3542 218* 3903 229* GEx4F2 1945 227 2199 193 2188 172 2206 185 3 08 234 4006 233* 4 9 241* Ex4 6-F2 2083 204 1990 188 2157 183 2252 170 3685 266 4579 257 4874 273

0 GEx4 F2 2028 187 2087 229 2274 218 2411 170 4193 276 5237 268 5239 269 Ex4 F2 1849 173 1896 202 2209 198 2315 207 3838 252 4796 246 4882 256 GEx4 F2 2126 190 2 24 2244 191 2396 236 4332 281 5390 262 55 6 275 FGF2 b "P 05 "P 01 08 依度比牧女P 05 P 01

未明各 融合蛋白 FGF21在依 在08 以上 均可 越脂肪細胞 葡萄糖。 相同 不同 休系統 酵母 休的融合蛋白作用 于大腸 休的蛋白。 GEx4 6-F2 FGF21元明 GEx4F21的作用 于GEx4 6-F GEx4 F 的作用 b GEx4 6-F2 。

。 小鼠

使用雄性 ob/ob 小鼠 FGF 、 Exe d 4 和融合蛋白 GEx4 6-F2 和 GEx4 F21 ob/ob小鼠的血糖水平和 水平。

8周大的ob/ob小鼠 都休 物中心 分成五 16只。 、 FGF21 、Exe d 4 、GEx4 F2 和GEx4 F21 。 皮下 生理監水 連 7 FGF21 5 g/ g/day 7 Exe d 4 1 g/ g/day 7 GEx4 F2 和 GEx4 F21 5 g/ g/day 連 7 。 1小 小鼠尾部 血糖或血脂依 。

2 7 的血糖 化 8

ob/ob小鼠的血糖依 o/

0 2 4 6 7

159 21 156 19 157 25 161 22 165 19

FGF2 158 20 151 20 149 17 140 134 14*

Ex d 4 162 23 152 20 137 21 123 * 121 17*

GEx4 F2 165 144 13 08 12* 972 13* 90 10*

GEx4 F2 160 19 140 18 01 14* 938 * 91 10*

比牧女P 05 "P 01

3 7 的血脂 化 8

ob/ob小鼠的 依 g/d

4 7

124 131 132 152

FGF2 93 144* 82 *

Ex d 4 6 3 1 4 8

GEx4 F21 87 155* 65 100*

GEx4 F21 78 133* 57 96*

比 "P 01

未明GEx4 F2 和GEx4 F21在 7 的 中 可有效地降低ob/ob小鼠 的血糖和血脂水平。

10 融合蛋白 GEx4 F2 和GEx4 F2 高 引起C57B //6J小鼠脂肪肝 型的 影 C57B /6J小鼠 休 2 g 料力 ea e c de 公司 60%脂肪 的

2492 配 成分力 蛋白20 g、 氮 39、 1259 、 6889 、 仟 5 g 259、 2459、 合屬物 1 g、 磷酸氧 9、 碳酸鈣559 、 1659、 合 生 素 g、 氧 29。 8 你 休 正常休重的20 小鼠 分成 5 10只。 、 FGF2 、 Exe 4 、 GEx4 F2 和GEx4 F21 同 正常 C57B /6J 小鼠力空白 。 和空白 皮下 生理監水 FGF21 5 g/ /day皮下 Exe d 4 1 g/ g/day皮下 GEx4 F2 GEx4 F21 5 g/ y 皮下 30 。 高 正常 水。 最 1 1小

TG 、 固醇 T 密度 蛋白 、 高密度 蛋白 。 屬行病理 。

病理 正常 大 小 正常以中央靜脈 中心 放射 排列 細胞 排列正 常胞核 則 細胞內 。 和Exe d 4 小 不 部分 細胞 細胞排列 細胞你慢性脂肪 井有 、 多慢性炎症細胞 和少數中性 細胞 。 GEx4 6-F2 、 GEx4 F2 和FGF21 脂肪肝的 程度 小 尚存 大致正常 部分 細胞 排列 固少數 細胞 水 和脂肪 。

4 30 的血脂 化 0

TG o/ TC o/ o/ o/ 空白 063 015* 1 6 028* 030 0 1* 12 036*

938 224 311 3 245 061 056 018

FGF21 353 1* 195 0627 126 038 092 02

Exe d 4 903 245 33 125 21 078 043 0

GEx4 F21 295 083* 212 07 097 025* 123 040*

GEx4 F21 265 078* 176 068* 090 028* 128 039*

比牧女P 5 *P< 01

以上 未明GEx4 F2 、 GEx4 F2 和FGF21在 30天后 可有效的降低 物的 、 固醇和低密度 蛋白 升高高密度 蛋白 脂肪肝有很好的 作用。 Exe d 4 元明 。