NO ALFA DE INTERLEUCINA 2

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología y la Inmuno- oncología. Particularmente, describe proteínas de fusión compuestas por muteínas no alfa agonistas de la interleucina 2 (IL-2) fusionadas a anticuerpos específicos por antígenos expresados en el tumor y con capacidad de reclutar funciones efectoras.

ANTECEDENTES

Las inmunocitocinas (ICs), son productos biofarmacéuticos formados por una citocina fusionada a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, son atractivas herramientas inmunoterapéuticas para el tratamiento del cáncer, aunque su uso se ha extendido a otras enfermedades.

La IL-2 es un potente activador de los linfocitos T y estimulador de las células NK y su ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) (Hank y cois. (1990) J Biol Response Mod. 9:5-14). Por esta razón, se ha convertido en una de las citocinas más utilizadas en la obtención de este tipo de proteínas de fusión. De hecho, la mayoría de los progresos clínicos realizados con ICs se ha obtenido con aquellas que fusionan la IL-2 a anticuerpos específicos por antígenos tumorales (Sondel, P. M. y S. D. Gillies. (2012) Antibodies. 1 (2): 149-171 ). A pesar de que estas moléculas han mostrado resultados prometedores en los ensayos clínicos fase II (Albertini, M. R. y cois. (2012) Cancer Immunollmmunother. 61 (12): 2261 -2271 ; Danielli, R., y cois. (2015) Cancer Immunollmmunother. 64(8): 999-1009; Kaufman, L. (2014) Journal of ClinicalOncology. 32(15); Lansigan, F. y cois. (2016) Blood. 128 (22): 620), mantienen efectos adversos similares a los de la IL-2 recombinante, como su perfil de alta toxicidad (Panelli, M. C. y cois. (2004) J Transí Med. 2(1 ): 17; Skrombolas, D. y J. G. Frelinger. (2014) Expert Rev Clinlmmunol. 10(2): 207-217; Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306) y la expansión mayoritaria de células T reguladoras, potencialmente capaces de inhibir la capacidad antitumoral (Ahmadzadeh, M. y S. A. Rosenberg. (2006) Blood. 107(6): 2409- 2414; Jensen, H. K., y cois. (2009) Clin Cancer Res. 15(3): 1052-1058; Fournier, P., y cois. (201 1 ) Int J Oncol. 38(6): 1719-1729; Gubbels, J. A., y cois. (201 1 ) Cancer Immunollmmunother. 60(12): 1789-1800; Pretto, F., y cois. (2014) Cancer Immunollmmunother. 63(9): 901 -910; Sim, G. C., y cois. (2014) J Clin Invest. 124(1 ): 99- 110; Lansigan, F. y cois. (2016) Blood. 128 (22):620). A esta limitación se suma una subóptima biodistribución y direccionalización al tumor por la interacción con los receptores IL-2 de alta afinidad (Klein, C., y cols. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306; Waldhauer, I., y cols. (2021 ) Mabs. 13(1 ): 1913791 ). Este escenario ha estimulado el desarrollo de ICs basadas en vahantes mutadas de IL-2 (muteínas no alfa) racionalmente diseñadas con capacidad reducida de unión o para no unirse a la cadena alfa del receptor, y con esto estimular subsets específicos de células inmunes, así como reducir toxicidad (Runbeck, E., y cois. (2021 ) Antibodies. (Basel) 10(1 )).

Entre estas ICs se puede distinguir un grupo que abarca aquellas basadas en la muteína IL-2v, caracterizada por la presencia de las mutaciones F42A, Y45A, L72G, lo que determina la no unión a la cadena alfa del receptor. Esto favorece la expansión de células efectoras TCD8 ⁺ y NK, y propicia la no expansión preferencial de células T reguladoras. Estas proteínas de fusión tienen un formato de IgG completa ( IgG 1 ), no poseen funciones efectoras clásicas de los anticuerpos como la CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo), a la vez que son monovalentes o monofuncionales respecto a la citocina. Dentro de este grupo figura la IC cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v), que consiste en un anticuerpo específico por el antígeno carcinoembhogénico (CEA) fusionado por el C-terminal de una de sus cadenas pesadas a una molécula de la mutante IL-2v (Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306). Se incluyen también en este conjunto las ICs Simlukafusp alfa (FAP-IL2v), específica por la proteína a de activación de fibroblastos (Waldhauer, I., y cois. (2021 ) Mabs. 13(1 ): 1913791 ) y la IC anti-PD1 -IL2v (Klein, C., y cois. (2019) Cancer Res. 79(13 Suppl): Abstractnr 1552), que reconoce la molécula de muerte programada 1 (PD-1 ) (Klein, C., y cois. (2019) Cancer Res. 79(13 Suppl): Abstractnr 1552).

Por otra parte, aparece la IC Erb-Sum-IL2, específica por el EGFR (siglas del inglés, epidermal growth factor receptor), la cual contiene una vahante de IL-2 (sum-IL-2) caracterizada por las mutaciones L80F, R81 D, L85V, I86Y, I92F. Este juego de cambios respecto a la citocina salvaje determina una unión reducida y mayor interacción de la muteína con las cadenas alfa y beta del receptor, respectivamente. Esto condiciona la unión favorable a células T CD8 ⁺ activadas y no a las células T reguladoras. Se presenta como una proteína de fusión a Fe heterodimérica, que contiene en un brazo un monómero de sum-IL2, y en el otro, un Fab anti-EGFR. Para esta IC monovalente respecto al sitio de unión al antígeno y respecto a la citocina, se ha descrito una expansión preferencial de células T CD8+ respecto a las T reguladoras en el microambiente tumoral, mientras no se ha informado de capacidad de reclutar funciones efectoras clásicas de los anticuerpos como la ADCC y la CDC (Sun, Z., y cois. (2019) Nat Commun. 10(1 ): 3874). Teniendo en cuenta el conjunto de antecedentes anteriormente descritos, los inventores de la presente solicitud generaron un tipo de IC para la terapia del cáncer, cuyo diseño se sustenta en la fusión de una muteína agonista de IL-2 (IL2no-alfa) al extremo carboxilo de las cadenas pesadas de un anticuerpo IgG con capacidad de reclutar funciones efectoras de los anticuerpos, para rendir una molécula bifuncional respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina. Este tipo de molécula tiene sorprendentemente, propiedades superiores a otras similares basadas en muteínas no alfa, al conservar o mejorar simultáneamente la capacidad de los anticuerpos de hacer lisis directa, ADCC y/o CDC y, además activar células NK y T CD8 ⁺ , sin expandir células T reguladoras. La convergencia de estas propiedades resulta en proteínas de fusión con propiedades antitumorales superiores a los anticuerpos parentales, e incluso, a la combinación de estos con la IL2no-alfa. Finalmente, el formato y composición de las proteínas de fusión relacionadas en la presente invención no interfieren con las actividades biológicas asociadas a la región variable de la porción de anticuerpo. Tal es el caso de la capacidad de inducción de apoptosis o de inducción de citotoxicidad independiente de funciones efectoras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En una realización la presente invención se relaciona con una proteína de fusión caracterizada porque comprende una muteína agonista de IL-2 (muteína no alfa) unida a una inmunoglobulina del ¡sotipo lgG1 o lgG3 y dicha inmunoglobulina reconoce a los receptores Fe ganma y a las moléculas del complemento. Esta inmunocitocina se caracteriza por ser una molécula bivalente respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina. Dicha muteína y dicha inmunoglobulina se unen a través de un enlazador. Particularmente, la muteína tiene afectada en al menos dos órdenes de magnitud, su capacidad de unión a la cadena alfa del receptor de IL-2 y se une a la inmunoglobulina por el extremo carboxilo de cada cadena pesada de dicha inmunoglobulina. En particular, la muteína no alfa tiene una secuencia que se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO. 16-43.

En una realización particular el enlazador está compuesto por la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que comprende: (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) y (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), donde n es la cantidad de repeticiones del fragmento Gly4Ser y tiene un valor de 1 a 5.

En una realización particular la cadena pesada de la inmunoglobulina pertenece a la subclase lgG1 o lgG3 humana y comprende las secuencias SEQ ID NO. 11 o 12 o tiene más de un 97% de identidad con dichas secuencias 11 o 12.

En una realización particular la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo kappa humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 9. En una realización particular la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo lambda humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 10.

La inmunocitocina de la presente invención adicionalmente se caracteriza por reconocer antígenos tumorales entre los que se encuentran: CD20, CD19, NGcGM3, PDL1 , Herí , Her2 y Epcam.

En una realización adicional la presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión aquí descritas en un rango de concentración de 0.5 mg/ml a 20 mg/ml y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Adicionalmente, la presente invención se relaciona con el uso de las proteínas de fusión divulgadas en la presente invención en el tratamiento del cáncer. En particular con el uso de las moléculas de ácido nucleico, que codifican las proteínas de fusión de la presente invención, para la inyección subcutánea, intramuscular o intratumoral.

En una realización adicional la presente invención se relaciona con un método de tratamiento a un sujeto que lo necesite que comprende la administración por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal de las composiciones farmacéuticas de la presente invención en un rango de dosis entre 0.01 mg/Kg - 0.6 mg/Kg de peso. Particularmente, la administración de dichas composiciones farmacéuticas se realiza de uno a 30 ciclos entre una a tres veces por semana y el tiempo entre los ciclos es entre siete días y ocho semanas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Descripción de las ICs

En una realización son objeto de la presente invención proteínas de fusión o ICs basadas en una muteína no alfa agonista de IL-2 (muteína no alfa), que tiene al menos dos órdenes de reducción de la afinidad de unión a la cadena alfa del receptor (León y cois. (2018) Semin Oncol. 45(1 -2): 95-104), unida a las cadenas pesadas de una inmunoglobulina con capacidad de reclutar funciones efectoras clásicas de los anticuerpos, para rendir una molécula bifuncional respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina.

El término proteína de fusión que se emplea en la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína heteróloga, es decir, un polipéptido o proteína que normalmente no es parte del anticuerpo, unidas a través de un péptido enlazador.

El término inmunocitocina (IC) que se emplea en la presente invención se refiere a un formato de anticuerpo el cual está unido a una citocina. Dicha citocina está fusionada al anticuerpo por medio de un enlazador por el extremo carboxilo de la cadena pesada. Los términos proteína de fusión e IC se utilizan intercambiablemente en la presente invención.

La muteína que forma parte de las ICs descritas en la presente invención tiene afectada en al menos dos órdenes de magnitud, su capacidad de unión al receptor de alta afinidad expresado constitutivamente en células T reguladoras, específicamente, a la cadena alfa. La proteína de fusión de la presente invención exhibe una propiedad que no tienen otras ICs basadas muteínas no alfa: la capacidad de activar NK y T CD8 ⁺ sin expandir T reguladoras, y a la vez, reclutar funciones efectoras como la lisis directa, ADCC y/o CDC. Estas muteínas se referirán en la presente invención como muteína no alfa.

Particularmente, la porción de anticuerpo de la IC es una inmunoglobulina de subclase IgG 1 o lgG3 humana cuya secuencia aminoacídica se corresponde con variantes alélicas naturales o modificadas de lgG1 o lgG3 que tienen más de un 97% de identidad con las identificadas como SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 13, respectivamente, y que se unen a receptores Fcy y a moléculas del complemento. Por lo tanto, son compatibles con las actividades de ADCC y CDC. La región constante de la cadena ligera de los anticuerpos que forman parte de las proteínas de fusión de la presente invención es de ¡sotipo kappa o lambda humanas y sus secuencias se describen en SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 10. Por su parte, las regiones variables de la porción de anticuerpo pueden ser de ratón, humanizadas o completamente humanas y provienen de inmunoglobulinas con capacidad de hacer ADCC y CDC. Las regiones variables de la porción de anticuerpo de las ICs de la presente invención reconocen antígenos expresados en tumores humanos, tales como: CD20, CD19, gangliósido NGcGM3, PDL1 , Herí , Her2 y Epcam.

Las muteínas no alfa que se describen en la presente invención, se unen al extremo carboxilo de cada cadena pesada de anticuerpo a través de un péptido conector flexible (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) o (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), donde n es la cantidad de repeticiones del fragmento Gly4Ser, y tiene la capacidad de expandir preferencialmente células efectoras T CD8 ⁺ y NK, en detrimento de la expansión de células T reguladoras. Las muteínas no alfa pueden ser cualquiera de las descritas en SEQ ID NO. 16-43 previamente divulgadas en US 9,206,243 B2 y la patente US 2019/0315826 A1 , o la IL- 2v, previamente divulgada en la patente WQ2012107417 (SEQ ID NO. 40) y sus variantes descritas en SEQ ID NO 41 -43. Las muteínas descritas en la SEQ ID NO. 16-21 , generadas en el Centro de Inmunología Molecular, son agonistas de IL-2 y presentan afectada en al menos dos órdenes su capacidad de unión al receptor de alta afinidad expresado constitutivamente en células T reguladoras. Como resultado de sus modificaciones respecto a la IL-2 salvaje, son capaces de expandir preferencialmente poblaciones efectoras de células T CD8 ⁺ de memoria y NK, tienen acción agonista de la IL-2 nativa y mayor efecto antitumoral que esta en modelos animales. (US 9,206,24309). Las muteínas IL2no-alfa K35E, IL2no-alfa K35Q y IL2no-alfa K35D (SEQ ID NO. 22-39) son variantes de las IL2no-alfa obtenidas con el método descrito en la patente US 9,206,243, que contienen una mutación puntual que favorece la expresión en diferentes sistemas hospederos y es compatible con el perfil de interacción de la muteína no alfa con las diferentes cadenas del receptor de IL-2 (Rojas, G., y cois. (2015) J Mol Recognit. 28(4): 261 -268). La mutante IL-2v y sus vahantes (SEQ ID NO. 40-43) contienen mutaciones respecto a la IL-2 salvaje que impiden la unión a la cadena alfa del receptor, lo que evita la expansión preferencial de células T reguladoras y favorece la expansión de células efectoras TCD8 ⁺ y NK (Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306).

En resumen, el formato de las proteínas de fusión de la presente invención garantiza el mantenimiento o mejoramiento de las funciones efectoras clásicas de los anticuerpos (lisis directa, ADCC y CDC), que concurren con las propiedades inmunomoduladoras particulares de muteínas no alfa, consistentes en inducción de proliferación mayohtaha de células efectoras respecto a células T reguladoras.

Composiciones farmacéuticas

Las ICs objeto de la presente invención se pueden encontrar como ingrediente activo, formando parte de diferentes composiciones farmacéuticas apropiadas para las mismas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las concentraciones del ingrediente activo en dichas composiciones farmacéuticas se encuentran en el rango de 0.5 mg/ml a 20 mg/ml, preferiblemente de 1 mg/ml a 10 mg/ml, o liofilizado.

Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a: solución salina, salina amortiguada con fosfato pH neutro, y otros parecidos. Otros agentes de amortiguación, agentes dispersos, y sustancias inertes no tóxicas apropiadas para entregar a un paciente podrán ser incluidas en las composiciones de la presente invención. Las composiciones podrán ser soluciones apropiadas para la administración, y son normalmente estériles y libres de partículas indeseables.

Aplicación terapéutica y métodos de tratamiento

La novedad de las ICs que se describen en la presente invención consiste en la convergencia en una proteína de fusión bifuncional basada en una inmunoglobulina IgG 1 o lgG3 y una muteína no alfa, de la capacidad de expandir y activar preferencialmente células efectoras como las TCD8 ⁺ de memoria y las NK sobre las células T reguladoras, y de mantener o mejorar funciones efectoras típicas de los anticuerpos, como lisis directa, ADCC y CDC. Esta concurrencia no se ha descrito para ninguna de las ICs basadas en muteínas no alfa descritas hasta la fecha. Además, la presencia de dos moléculas de muteína IL-2 no alfa por molécula de IC permite aumentar la actividad inmunomoduladora intrínseca de la proteína de fusión. Esto contribuye adicionalmente a una disminución potencial de la toxicidad por la no interacción con receptores de alta afinidad en células endoteliales. La región Fe brinda la posibilidad de obtenerla altamente purificada por cromatografía de afinidad por proteína A, entre otras, lo cual permite administrarla como proteína soluble por diferentes vías (subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal), a la vez que aumenta los tiempos de vida media de este agente en circulación y con ello, la efectividad terapéutica.

Las ICs de la presente invención se aplicarán a los sujetos (dichos sujetos son vertebrados, tales como los humanos), preferentemente por vía subcutánea, o intravenosa, en un rango de dosis entre 0.01 mg/Kg de peso y 0.6 mg/Kg de peso, que se corresponden entre 0.7 y 42 mg totales, respectivamente. La IC se administrará entre uno a 30 ciclos con una frecuencia de una a tres veces por semana al paciente. El tiempo entre los ciclos de administración estará entre siete días y ocho semanas.

Adicionalmente, las estrategias de administración empleadas en la presente invención para estas ICs pueden incluir también la inyección del producto, mediante enfoques de terapia génica tales como la inyección de ARNm y partículas transductoras codificantes de las mismas.

Dadas las propiedades inmunomoduladoras de estas moléculas, además de la potenciación de la respuesta antitumoral antígeno específica, la capacidad de inmunoestimulación sistémica sustenta la posible combinación con terapias blanco en pacientes con diversos tipos de cáncer. De igual manera, es posible su combinación con otros inmunomoduladores y con oncoterapias clásicas como quimioterapia y radioterapia. En particular, este tipo de biofarmacéutico podría ser utilizado en el tratamiento de desórdenes linfoproliferativos de células B, como el linfoma no Hodgkin (LNH) , la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma Burkitt (BL), linfoma de células de manto (MCL), linfoma folicular, linfomas indolentes, linfoma de zona marginal (MZL), linfoma linfoplasmocítico crítico (PL), síndrome linfoproliferativo de células B, tumores sólidos de estadio avanzado, tumores de cabeza y cuello, tumores cerebrales, gliomas adulto y pediátrico, cáncer de páncreas, esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas y tumores nasofaríngeos.

De este modo, las ICs mencionadas pretenden constituir un frente terapéutico que potencia la acción terapéutica de los anticuerpos y la IL-2, actualmente empleados en el tratamiento del cáncer. Este efecto estaría asociado a la generación de proteínas de fusión que pueden simultáneamente tener actividad de ADCC y CDC, importantes mecanismos antitumorales, y expandir preferencialmente células T citotóxicas y NK, y no células T reguladoras, lo cual conlleva a una respuesta inmune antitumoral más eficiente, y por tanto, a un retardo en el crecimiento tumoral y una mayor supervivencia de los individuos tratados. A esto se suman los menores niveles de toxicidad que garantizan las muteínas de IL-2 empleadas, lo cual aumenta la probabilidad de éxito respecto a las terapias con las citocinas salvajes. Todo esto se traduce en una mayor esperanza y calidad de vida en los pacientes tratados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación de las ICs lgG-IL2no-alfa (A) Esquema (B) Formato

Figura 2. Evaluación de la expresión de las ICs en el sobrenadante de células CHO transducidas (A, E, F) y en células HEK en suspensión transfectadas de manera transitoria (B, C, D).

Figura 3. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) de la IC anti-CD20-lgG1 h-IL2no-alfa (IC1 ) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).

Figura 4. Inmunoidentificación mediante Western blot, de la IC1 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IgG humanas en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B) y con un anticuerpo específico por IL-2 en condiciones no reductoras (C). Figura 5. Análisis por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC de IC1 (A) y el rituximab (B) en una columna TSK gel 3000.

Figura 6. SDS-PAGE de la IC anti-CD20-lgG2a-IL2no-alfa (IC7) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).

Figura 7. Inmunoidentificación mediante Western blot de la IC7 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IL-2 en condiciones no reductoras.

Figura 8. Análisis de IC7 por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC en una columna TSKgel 3000.

Figura 9. SDS-PAGE de la IC anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).

Figura 10. Inmunoidentificación mediante Western blot, de IC8 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IL-2, en condiciones no reductoras.

Figura 11. Análisis por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC de IC8 (1 ) y 14F7m (2) en una columna TSKgel 3000.

Figura 12. Inmunoidentificación mediante Western blot de IC4 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IgG humanas en condiciones no reductoras

Figura 13. Reconocimiento de la línea EL4-huCD20+ (A) por el anticuerpo RTX y la IC1 y (B) por el anticuerpo de ratón RTX-lgG2a y la IC7.

Figura 14. Reconocimiento de la molécula CD20 sobre células tumorales (A) por la IC1 , (B) relación de intensidad media de fluorescencia (IMF) de RTX y la IC1 sobre la IMF del conjugado. Figura 15. Inducción de CDC por la IC1 .

Figura 16. Inducción de apoptosis por la IC1 (A) Apoptosis temprana, (B) Apoptosis (suma de todas las células Anexina V+) y (C) activación de caspasa 3 en las células Ramos tratadas con la IC1 .

Figura 17. Inducción de ADCC por la IC1 (A). Depleción in vitro de células B (CD19+) de donante sano (B) y paciente de Linfoma Difuso de Células B grandes (C) por la IC1 .

Figura 18. Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por la IC8 mediante (A) ELISA y (B) Citometría de flujo.

Figura 19. Inducción de citotoxicidad independiente de complemento por la IC8.

Figura 20. Actividad tipo IL-2no-alfa mediante ensayo de proliferación de la línea CTLL- 2 de (A) IC1 y (B) IC7 e IC8.

Figura 21. Medición de los marcadores de superficie de activación de células NK por la IC1 , (A) CD16, (B) CD69 y (C) CD107a.

Figura 22. Efecto antitumoral de IC7 en el modelo EL4-huCD20+ (A) comparación con el anticuerpo parental a altas dosis (B) comparación con la combinación del anticuerpo parental y la muteina IL2no-alfa. (en cantidades equimolares).

Figura 23. Efecto antitumoral de IC1 en el modelo EL4-huCD20+ (A) comparación con el rituximab a altas dosis, (B) comparación con cantidades equimolares del rituximab, (C) efecto protector de larga duración de la IC1 en animales supervivientes retados nuevamente con células tumorales y (D) efecto antitumoral de la IC8 con respecto a cantidades equimolares del anticuerpo y la muteina IL2no-alfa en el modelo 3LL-D122 Figura 24. Inmunomodulación ¡n vivo por la IC1 en ratones C57BI6 portadores de tumor EL4-hCD20. (A-B) Números absolutos de células (A) T CD8+, (B) NK1.1+CD3-, (C-D) proporción de células (C) FOXP3+CD4+/CD8+, (D) FOXP3+CD4+/NK1 .1 + CD3+ y (E) números absolutos de células T FOXP3+CD4+.

La presente invención queda aún más elaborada con los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como una limitación del ámbito de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Diseño y obtención de las ICs.

Se diseñaron ICs humanas que consisten en moléculas bivalentes en cuanto al sitio de unión al antígeno, bifuncionales respecto a la porción de IL-2 mutada y basadas en un formato de IgG completa. Específicamente, la IC1 , IC2, IC3, IC4, IC5 e IC6 se corresponden con un formato como el que se representa en la Figura 1 (A-B).

La IC1 y la IC2 son específicas por la molécula CD20 humana y las secuencias de sus regiones variables son las del rituximab, anticuerpo monoclonal líder en la terapia pasiva contra desórdenes linfoproliferativos de células B (Pierpont, T. M., y cois. (2018) Front Oncol. 8: 163; Sehn, L. H. y G. Salles. (2021 ) N Engl J Med. 384(9): 842-858). La cadena ligera de cada una de estas ICs está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 1 ) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ NO. 2, seguida de una región constante de lgG1 humana (SEQ ID NO. 11 ), que tiene fusionado en el carboxi terminal un péptido conector (Gly4Ser) ₃ ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 para IC1 , y SEQ ID NO. 37 para IC2). No se han descrito hasta la fecha ICs de esta especificidad que contengan vahantes mutadas de IL-2.

La IC3 y la IC4 son específicas por el gangliósido NGcGM3, que está ausente o se detecta solo en pequeñas cantidades en los tejidos normales (Varki, A. (2009) Glycoconj J 26(3): 231 -245). Las secuencias de sus regiones variables son las del anticuerpo 14F7hT, actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de tumores sólidos en estadio avanzado (EC-IICRDEC168.). La cadena ligera de ambas ICs está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 3) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 4, seguida de una región constante de lgG1 humana (SEQ ID NO. 1 1 ) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser) ₃ ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 para IC3, y SEQ ID NO. 37 para IC4). Hasta la fecha no se ha obtenido ninguna IC basada en este anticuerpo, ni otro específico por el gangliósido NGcGM3.

La IC5 y la IC6 reconocen el receptor EGFR y las secuencias de sus regiones variables se corresponden con las del anticuerpo nimotuzumab (US 5,891 ,996 B2), ampliamente utilizado en la terapia de tumores de origen epitelial (Crombet T, y cois. (2002) Int J Cancer. 101 (6) :567-75; Ramos-Suzarte M y cois. (2012) Cancer BiolTher.; 13(8):600-5; Suarez Martinez G y BencomoYanes A. (2014) Biotecnol APL [Internet]. 31 (2):159-167, Crombet T. (2014) Handbook of therapeutic antibodies. 1679-94.). La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 5) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 6, seguida de una región constante de IgG 1 humana (SEQ ID NO. 11 ) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser) ₃ ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 , para la IC5; SEQ ID NO. 37 para la IC6).

Se diseñaron en paralelo otras dos ICs bivalentes en cuanto al sitio de unión al antígeno, y bifuncionales respecto a la porción de IL-2 mutada, basadas en un formato de IgG completa de ratón (Figura 1 A-B). La IC7 es específica por la molécula CD20 humana y las secuencias de sus regiones variables son las del rituximab. La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 1 ) y una región constante de ratón C kappa (SEQ ID NO. 13). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 2, seguida de una región constante de lgG2a de ratón (SEQ ID NO. 15) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, la molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ).

La IC8 es específica por el gangliósido NGcGM3. Las secuencias de sus regiones variables son las del anticuerpo 14F7 (US 6,429,295 B1 ), antecesor múrido del 14F7hT. La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 7) y una región constante de ratón C kappa (SEQ ID NO. 13). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 8., seguida de una región constante de IgG 1 de ratón (SEQ ID NO. 14) que tiene fusionado en el carboxi terminal un péptido conector (Gly4Ser) ₃ ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ).

Para la obtención de las ICs humanas, los genes codificantes de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos rituximab, nimotuzumab o 14F7hT se clonaron en el vector pFUSE (Ckh) contentivo del gen de la región constante C kappa humana, y así se obtuvieron los genes codificantes de las respectivas cadenas ligeras.

Posteriormente, se amplificó mediante Reacción en cadena de la Polimerasa (RCP) el segmento génico codificante de la muteína IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 37) fusionada por su N terminal al péptido enlazador (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44), y se clonó EcoRV/Xbal en el vector pFUSE (lgG1 h) previamente modificado para la inserción de un sitio EcoRV. Según la IC, sobre las construcciones genéticas resultantes se clonó EcoRI/Nhel, el gen VH correspondiente previamente amplificado por RCP.

Los genes de las cadenas ligera y pesada de la IC1 (anti-CD20) se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV-IRES-Neo, para generar los respectivos vectores de transferencia con los que se procedió a obtener las partículas transductoras lentivirales. Se realizó la transducción de células CHO-K1 con las partículas lentivirales previamente obtenidas para la generación de clones estables recombinantes. Mediante un ELISA específico por la región Fe humana se detectó la proteína de fusión IC1 (anti-CD20) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2A).

La IC2 (anti-CD20) se obtuvo por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE (Figura 2B).

La IC3 y la IC4 (anti-NGcGM3) se obtuvieron por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE. Con estas construcciones genéticas se transfectaron de manera transiente células HEK293 y se verificó a los 7 días la expresión de la IC, mediante un ELISA específico por la región Fe humana (Figura 2C).

La IC5 y la IC6 (anti-EGFR) se obtuvieron por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE. Los sobrenadantes de células HEK293 en suspensión transfectadas con PEI, se evaluaron mediante un ELISA específico por la región Fe humana y se comprobó la presencia de las proteínas de fusión (Figura 2D).

Para la obtención de las ICs de ratón, los genes codificantes de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos rituximab, o 14F7 se clonaron en el vector pFUSE (Ckh) contentivo del gen de la región constante C kappa de ratón y así se construyeron los genes codificantes de las respectivas cadenas ligeras.

En el caso de la IC7 (anti-CD20) se obtuvo el gen de la cadena pesada a partir del ensamblaje por RCP de los segmentos génicos codificantes de la región VH de rituximab (SEQ ID NO. 2.), de la región CH de ratón lgG2a (SEQ ID NO.15), del péptido conector (Gly ₄ Ser) ₃ ThrGly (SEQ ID NO. 44) y de la molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ). El gen resultante de cadena pesada y el gen de cadena ligera contenido en el vector pFUSE se amplificaron por RCP y se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV- IRES-Neo. Se generaron así los vectores de transferencia con los que se hicieron las partículas lentivirales usadas posteriormente para la transducción de células CHO-K1. Mediante un ELISA específico por la región Fe de ratón se detectó la proteína de fusión IC7 (anti-CD20) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2E).

Para la IC8 (anti-NGcGM3), se amplificó mediante RCP el segmento génico codificante de la muteína IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ) fusionada por su N terminal al péptido enlazador (Gly4Ser) ₃ ThrGly, y se clonó EcoRV/Xbal en el vector pFUSE (lgG1 r) previamente modificado para la inserción de un sitio EcoRV. Sobre la construcción genética resultante se clonó EcoRI/Nhel el gen VH14F7 previamente amplificado por RCP. Los genes de cadena pesada y cadena ligera contenidos en los vectores pFUSE, se amplificaron por RCP y se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV- IRES-Neo. Se generaron así los vectores de transferencia con los que se hicieron las partículas lentivirales usadas posteriormente en la co-transducción de células CHO-K1. Mediante un ELISA específico por la región Fe de ratón se detectó la proteína de fusión IC8 (anti-NGcGM3) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2E).

Ejemplo 2. Las ICs se expresan como proteínas íntegras y funcionales.

A partir de los sobrenadantes del cultivo de los clones CHO-K1 recombinantes se procedió a la purificación de las ICs anti-CD20-IL2no-alfa (lgG1 h) (IC1 ), anti-CD20-IL2 no-alfa (lgG2a ratón) (IC7) y anti NGcGM3-IL2no-alfa (lgG1 r) (IC8). Una vez realizado el paso de captura por proteína A y posterior cromatografía de exclusión molecular a escala preparativa, mediante filtración en gel, se procedió a evaluar la talla e identidad inmunoquímica de cada una de las proteínas purificadas. Se verificó que las ICs se expresaron como una proteína cuya migración electroforética corresponde con la talla teórica aproximada de 180 kDa, para condiciones no reductoras (Figura 3A, Figura 6A y Figura 9A), y en condiciones reductoras se observó la presencia de ambas cadenas de la molécula recombinante, con una migración correspondiente a las tallas teóricas: aproximadamente 65 kDa para la cadena pesada, debido a la presencia de la muteína IL2no-alfa (15kDa), y 25 kDa para la cadena ligera (Figura 3B, Figura 6B y Figura 9B). Al realizar un ensayo de Western blot específico por IgG humanas (Figura 4A-B y Figura 12), se comprobó la identidad de las porciones de anticuerpo y mediante un anticuerpo específico por la IL-2 humana (Figura 4C, Figura 7 y Figura 10), se verificó la presencia de la citocina en la estructura de las ICs. Se analizó el grado de pureza de las proteínas de fusión por una cromatografía de exclusión molecular a escala analítica, mediante HPLC, con una columna TSK3000 (Figura 5A, Figura 8 y Figura 1 1 ). Debido a que tienen un peso molecular mayor respecto a un anticuerpo IgG (150kDa), mostraron un tiempo de retención menor que el de AcMs de referencia (Figura 5A-B, y Figura 11 ). Se observó además un alto porciento de especies monoméricas (>95%), indicativo de su alta pureza (Figura 5A, Figura 8 y Figura 11 ).

Ejemplo 3. Las ICs conservan y mejoran in vitro las actividades biológicas correspondientes a la porción de anticuerpo.

Para determinar si la porción de anticuerpo era activa en la estructura de las ICs anti- CD20 obtenidas, se realizaron experimentos in vitro en cantidades equimolares respecto a la molécula parental o de referencia. El reconocimiento de la molécula CD20 humana por las ICs anti-CD20-IL2no-alfa ( IgG 1 h) (IC1 ) y anti-CD20-IL2no-alfa (lgG2a ratón) (IC7) se determinó mediante citometría de flujo, empleando la línea tumoral murina EL4- huCD20 ⁺ , que expresa altos niveles de CD20 humano en su membrana (Di Gaetano, N., y cois. (2003) J Immunol. 171 (3): 1581 -1587). Los niveles de reconocimiento de la línea EL4-huCD20+ por la IC1 y el rituximab (control positivo) así como de la IC7 y su anticuerpo parental (Rtx-lgG2a) fueron similares (Figura 13A-B). Los resultados anteriores demuestran la capacidad de ambas ICs de unirse y reconocer a la molécula CD20 humana. El reconocimiento de la línea parental EL4 con los tratamientos fue negativo, lo que avala la especificidad del mareaje observado sobre la línea EL4-huCD20 ⁺ de linfoma de ratón (Figura 13A-B). Se evaluaron además, dos líneas celulares humanas de Linforma de Burkitt, que expresan el CD20. Como indican las figuras 14A y B, no se apreciaron diferencias en el patrón de reconocimiento de IC1 en comparación con el rituximab para cada una de estas líneas. La especificidad del mareaje está sustentada por el no reconocimiento de una IC irrelevante y la incapacidad de IC1 de unirse a células Jurkat, linfoma T que no expresa el CD20 (Figura 14A-B).

La activación de la cascada del complemento es uno de los mecanismos propuestos para la actividad terapéutica in v/vo del rituximab (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359- 7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Grit Rev Oncol Hematol. 97: 275-290). Por tal motivo, se evaluó por citometría de flujo mediante la incorporación de loduro de Propidio (IP), la capacidad de las IC1 de ejercer CDC sobre la línea tumoral Ramos. Como fuente de complemento se empleó suero AB humano a una dilución final 1 :5. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras independientes del promedio del porcentaje (%) de células IP positivas (Figura 15). La IC1 a 6nM retuvo el efecto citotóxico observado con el rituximab. La IC irrelevante no indujo citotoxicidad a la concentración evaluada (Figura 15). Este resultado evidencia la no afectación de esta actividad para esta molécula, como sí ha ocurrido para otras ICs de similar formato (Gillies, S. D., y cois. (2005) Blood. 105(10): 3972-3978; Gillies, S. D., y cois. (1999) Cancer Res. 59(9): 2159-2166).

La apoptosis sobre células tumorales es otro de los mecanismos propuestos para explicar la acción terapéutica del rituximab en la clínica (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Crit Rev OncolHematoL 97: 275-290). La exposición de fosfatidilserina es un evento que caracteriza etapas tempranas de la apoptosis (Koopman, G., y cois. (1994) Blood. 84(5): 1415-1420). Se evaluó en células Ramos tratadas con la IC1 la exposición de este fosfolípido en la monocapa externa de la membrana plasmática. El nivel de fosfatidilserina se midió mediante citometría de flujo por mareaje con Anexina V. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras. Se consideraron como células en apoptosis temprana aquellas que presentaron el mareaje AnexinaV+/IP-(Figura 16A), células en apoptosis tardía cuando son AnexinaV ⁺ /IP ⁺ , y se definió como apoptosis, la suma de las dos poblaciones (Figura 16B). Sorprendentemente, la IC1 tuvo un efecto superior al rituximab (Figura 16A-B). Debido a que la exposición de fosfatidilserina puede ocurrir en eventos no apopléticos, se evaluó a continuación la activación de la caspasa 3, como un marcador de apoptosis tardía. El fragmento activo de 17/19 kDa se determinó por citometría de flujo con un antisuero de conejo conjugado a Alexa Fluor-488. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras independientes del promedio del porciento de células caspasa 3 activa. La incubación de las células Ramos con la IC1 a 6nM durante 48 h indujo activación de esta enzima (Figura 16C). La ADCC es otro de los mecanismos responsables de la acción antitumoral del rituximab (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Crit Rev OncolHematol. 97: 275-290). Se determinó la capacidad de la IC1 de mediar ADCC, para lo cual se midió la actividad de la enzima LDH liberada por las células diana (Ramos), como una medida del daño provocado. Este experimento se hizo en un escenario subóptimo para el rituximab en cuanto a la razón células efectoras: células diana (10:1 ), y el uso de células efectoras no activadas. Como células efectoras se usaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y como células diana, las Ramos. Como se muestra en la figura 17A, la IC1 indujo mayor porcentaje de lisis específica con respecto al rituximab y la combinación de rituximab e IL2no-alfa. La citotoxicidad inducida fue dependiente de la concentración.

Considerando la superioridad de la IC1 en la inducción de ADCC, se estudió su capacidad de eliminar, in vitro, células malignas (CD19+) de un paciente de Linfoma No Hodgkin, siendo las CMSP la fuente de células diana y células efectoras. En este experimento las CMSP se incubaron con las ICs y el rituximab (18nM) durante 24 horas y el porcentaje de células B dentro de las CMSP se midió por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 17B, la IC1 y el rituximab fueron capaces de eliminar células B normales de un donante sano. De manera notable, solo la IC1 redujo significativamente los porcentajes de células CD19+ dentro las CMSP de un paciente de Linfoma difuso de células B grandes (figura 17B). Esto indica la posibilidad de uso de esta IC1 en pacientes cuya resistencia a rituximab esté relacionada con un fallo o no óptima ADCC.

La inmunocitocina de ratón anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) reconoció el gangliósido NGcGM3, mediante ELISA, de manera similar al anticuerpo parental 14F7. La especificidad de la unión está avalada por la no reactividad del AcM irrelevante usado como control de ¡sotipo (Figura18A). Como complemento al ensayo inmunoenzimático en fase sólida, se procedió a realizar un experimento de citometría de flujo. Se emplearon las células tumorales de ratón L1210, que expresan altos niveles del gangliósido NGcGM3 (Roque-Navarro, L., y cois. (2008) Mol Cancer Ther. 7(7): 2033-2041 ). La IC8 fue capaz de unirse a la línea tumoral, como lo hace el anticuerpo 14F7 (Figura 18B).

Seguidamente se procedió a evaluar la actividad citotóxica independiente de funciones efectoras en las células L1210, descrita previamente para el 14F7 (Roque-Navarro, L., y cois. (2008) Mol Cancer Ther. 7(7): 2033-2041 ). Para ello se analizó el aumento de la permeabilidad de la membrana al mareaje del ADN nuclear con IP como índice de la muerte celular. Sorprendentemente, el porcentaje de células no viables fue mayor para la IC anti-NeuGcGM3-IL2no-alfa con respecto a las células sin tratamiento y el anticuerpo parental (Figura 19). Ejemplo 4. Las ICs conservan la funcionalidad de la porción IL-2 no alfa.

La actividad biológica in vitro correspondiente a la porción IL2no-alfa de las ICs se evaluó en ensayos de proliferación de la línea celular murina CTLL-2, dependiente de IL-2, que expresa la vahante de alta afinidad del IL-2R (Figura 20A-B). Se emplearon concentraciones de cada molécula que garantizaran cantidades equimolares de muteína. Los valores de concentración que aparecen en la Figura 19, se refieren a la porción IL- 2no alfa, contenida en cada muestra.

La incubación de las células CTLL-2 con la muteína y cada una de las ICs, resultó en la estimulación de su proliferación. En todos los casos, la magnitud de la proliferación presentó un comportamiento dependiente de la concentración. Este resultado demuestra que la porción IL2no-alfa mantiene su funcionalidad en el contexto de la proteína de fusión (Figura 20A-B).

Ejemplo 5. Las ICs promueven la activación de células NK

La activación de células NK es un paso crítico para la ADCC y además, se ha demostrado que estas células son mediadores importantes de la función antitumoral de la muteína IL2no-alfa (Carménate, T., y cois. (2013) J Immunol. 190(12): 6230-6238). A las 20 horas de montado el ensayo, se determinó la capacidad de la IC1 de activar las NK, a 6.6nM, en presencia de células diana (Ramos) y efectoras (CMSP) en una razón 1 :10. En la población de células NK de las muestras tratadas con la IC se observó una mayor disminución de la expresión del marcador de superficie CD16 respecto al rituximab (Figura 21 A), lo cual es indicativo de una mayor activación de este tipo de células a partir de su interacción con la molécula diana a través de un anticuerpo (Bowles, J. A. and G. J. Weiner. (2005) J Immunol Methods. 304(1 -2): 88-99). Igualmente, se verificó el aumento de la expresión de CD69 como muestra de activación de las NK, efecto también observado en presencia del rituximab (Figura 21 B). La expresión del CD107a, marcador de superficie asociado a la desgranulación lisosomal, aumentó tres veces en las células incubadas con la inmunocitocina respecto a los demás tratamientos (Figura 21 C). De conjunto, estos resultados demuestran una mayor activación de las células NK asociada a la actividad ADCC en las células tratadas con la proteína de fusión, respecto al anticuerpo rituximab, lo que puede deberse probablemente a un efecto potenciador aportado por la IL2no-alfa.

Ejemplo 6. Las ICs tienen un efecto antitumoral superior.

Para demostrar el concepto de que la fusión de muteínas no alfa a un anticuerpo puede resultar en un efecto antitumoral superior, se comparó la actividad antitumoral de una versión lgG2a de rituximab y la correspondiente IC basada en IL2no-alfa (IC7). Para ello, ratones C57BL/6 se inocularon por vía intravenosa con 2.5x10 ⁵ de células EL4-huCD20 ⁺ y posteriormente se trataron vía intraperitoneal con tres inyecciones de 20pg de IC7 (días 1 ,4 y 7) o cinco dosis de 200 ug del anticuerpo parental anti-CD20 lgG2a (días 1 , 4, 7,10 y 13), de demostrado efecto terapéutico en investigaciones anteriores (Abes, R., y cois. (2010) Blood. 1 16(6): 926-934; Casadesus, A. V., y cois. (2020) Oncoimmunology. 9(1 ): 1770565.). De manera interesante, el tratamiento con IC7 a bajas dosis (20ug), permitió igual supervivencia que la obtenida en ratones que recibieron altas dosis de la versión lgG2a de rituximab. (Figura 22A). Sin embargo, dosis equimolares de anticuerpo respecto a los 20ug de la IC7 y su combinación con cantidades equimolares de la muteína IL2no- alfa, no tuvieron efecto antitumoral (Figura 22B).

Debido a la reactividad cruzada entre los anticuerpos humanos y las células efectoras de ratón, así como de la IL-2 humana y los receptores de IL-2 de ratón (Arenas-Ramirez, N., y cois. (2015) Trendslmmunol. 36(12): 763-777), evaluamos la eficacia de la IC1 en ratones inmunocompetentes. Ratones C57BL/6 se inocularon por vía intravenosa con 5x10 ⁵ células EL4-huCD20 ⁺ y posteriormente se trataron por vía intraperitoneal los días 1 ,4 y 7 con 20pg de la IC1 y 150 ug de rituximab, de probado efecto terapéutico en estudios anteriores (Di Gaetano, N., y cois. (2003) J Immunol. 171 (3): 1581 -1587) (Figura 23A.). Se observó que una dosis 7,5 veces más baja de IC1 respecto al rituximab, tuvo igual efecto antitumoral que el anticuerpo (Figura 23A). Incluso, el rituximab en cantidades equimolares a la IC1 (20ug) no tuvo efecto antitumoral, a diferencia de la IC (Figura 23B). Además, después de retar a los 65 días con las células tumorales EL4-huCD20 ⁺ los ratones supervivientes al tratamiento anterior con IC1 , se comprobó que la IC a bajas dosis mantiene el efecto protector de larga duración descrito para una vahante lgG2a de rituximab a altas dosis (Abes, R., y cois. (2010) Blood. 1 16(6): 926-934) (Figura 23C).

Para la comparación del efecto antitumoral de la anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) respecto a los controles, ratones C57BL/6 se inocularon el día 0 con 2x10 ⁵ células de 3LL-D122, en un volumen de 200 pL por vía subcutánea (SC). Seis días después, y previa comprobación de su prendimiento, se administraron cantidades equimolares de anticuerpo, citocina e IC (85 pg para los anticuerpos, 16.6 pg de IL2no-alfa y 100 pg de IC8), por vía intraperitoneal. Los tratamientos se repitieron los días 8 y 10. La IC8 fue capaz de reducir el volumen tumoral en los animales tratados, a diferencia del anticuerpo de referencia 14F7 (Figura 23D).

Ejemplo 7. Las ICs expanden preferencialmente las células NK y CD8 ⁺ sobre las T reguladoras. Con el objetivo de evaluar el efecto de las ICs basadas muteínas no alfa sobre determinadas poblaciones de células inmunes en el escenario tumoral, se estudiaron ratones C57BL/6 portadores de tumor EL4hu-CD20 ⁺ y tratados con la anti-CD20-IL2no- alfa (IC1 ), según se describe en el ejemplo 6. A los 10 días del reto tumoral, se extrajo el bazo y se analizaron diferentes poblaciones celulares por citometría de flujo. Para la IC1 , se observó un significativo incremento de células TCD8 ⁺ (Figura 24A) y NK1 ,1 ⁺ (Figura 24B), que no se verificó para el tratamiento con el rituximab ni el PBS. Vale destacar que la IC1 favoreció la expansión de células efectoras sobre células T reguladoras, según indica la razón FOXP3+CD4+/ TCD8 ⁺ y FOXP3 ⁺ CD4 ⁺ / NK1.1 + (Figura 24C-D). Es destacable que no solo se expandieron más las células efectoras, sino que no se observó incremento de células T reguladoras (Figura 24E). Este resultado demuestra que la IC1 logra una inmunomodulación a favor de células efectoras, en detrimento de células T reguladoras, lo que pudiera contribuir al efecto antitumoral superior observado.

De conjunto, los resultados anteriores apuntan a la superioridad terapéutica de una IC basada en muteínas no alfa con el formato previamente descrito, e indican que la unión de anticuerpos anti-CD20 de probado efecto de lisis directa, ADCC y/o CDC a muteínas de IL-2 no alfa, conlleva a la activación de mecanismos moleculares y celulares cualitativa o cuantitativamente diferentes, que provocan una respuesta antitumoral potenciada, de mayor magnitud que la obtenida con los controles de anticuerpo e muteínas no alfa.