【발명의 명칭】

D03A-트라넥스아믹산 콘쥬게이트를 포함하는 가돌리늄 착물 【기술분야]

본 발명은 가돌리늄 착물을 함유하는 MRI 조영제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 화학식 1의 구조를 갖는 신규의 D03A-트라넥스아믹산 또는 그 에스테르 화합물과 그들의 가돌리늄 착물에 관한 것이다.

【배경기술】

본 발명은 대한민국 미래창조과학부 지원하에 과제번호 2013029618에 의해 이루어진 것으로세 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "핵심연구지원사업" ， 연구과제명은 "다중에너지 대역폭을 갖는 고민감도 CT 분자영상 나노복합체 연구" ， 주관기관은 경북대학교 산학협력단， 연구기간은 2013.05.01 - 2014.04.30이다.

또한 , 본 발명은 대한민국 미래창조과학부 지원하에 과제번호 2013069507에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단， 연구사업명은 "기초연구사업" ， 연구과제명은 "중성자 포획 치료용 가돌리늄 나노구조체 기초연구실" ， 주관기관은 경북대학교 산학협력단， 연구기간은 2013.12.01 - 2014.10.31이다. 자기공명영상 (MRI )은 우수한 공간적 해상도 (resolut ion) 및 대조도 (contrast )에 기초하여 인체 해부학， 생리학 및 병태생리학의 비침습적 진단을 위한 가장 강력한 기술들중 하나이다.현재， 다수의 MRI 기술들은 인체내에서 수 양성자 이완율 (relaxat ion rate)을 증가시켜 영상 대조도를 향상시키기 위해 Gd( I I I ) 착물들을 이용하여 실시되었다. Gd( I I I ) 이온을 이용한 대표적인 이점들은 높은 자성 모멘트 및 긴 전자 스핀 이완 시간과 같은 독특한 특성에서 온다. 그러나 그들의 광범위하고 성공적인 임상적 웅용에도 불구하고, 종래의 Gd(III)-기초된 조영제들 (GBCAs)은 대부분 빠른 신장 (renal) 배출을 나타내는 세포외액 (extracellular fluid ECF) 조영제들이었다. 그래서 향상된 성능 및 특이적 기능성을 동시에 갖는 새로운 MRI 조영제에 대한 필요성이 생겨났다. 기관 (organ) 표적 MRI 조영제로서 사용하기 위한 새로운 클래스의 MRI 조영제들을 개발하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다.

간 (Liver)-특이적 MRI 조영제는 두개의 카테고리로 나누어질 수 있다: (i) 간담즙 (hepatobiliary)-특이적 (또는 간담즙성) 조영제 (ii) 망상내피세포 (reticuloendothelial cell)-특이적 (or 나노입자성) 조영거 1. 전자 (the former) 클래스의 조영제는 기능적 간세포에 의해 흡수되어 담즙 (bile)으로 배출되며, 그들의 상자성 (paramagnetic) 성질은 간 및 담 트리의 종축 (longitudinal) 이완 시간 (71)의 단축을 초래한다. 이 클래스의 현재 사용가능한 조영제들은 Gd-EOB-DTPA (Primovist ^® ) 및 Gd-BOPTA (Multihance ^® )와 같은 Gd-킬레이트에 기초한다. 주사시， 그들은 초기에 ECF CAs 구획에 분포 (distribute)되고 후속적으로 간세포 (hepatocytes)에 의해 흡수된다. 한편, 후자 (the latter) 클래스는 망상내피계 시스템의 쿠퍼 (Kupifer) 세포를 표적화하여， 거기서 조영제들의 포식작용 (phagocytosis)이 일어나고， 철 (iron) 이온의 효과에 의해 간 신호 강도가 감소하여 간세포-특이적 조영제들에서 전형적으로 관찰되는 "백색 (white)" 간 대신에 "혹색 (black)" 간을 나타낸다. 트 1]

a: R = C0 ₂ C ₃ H ₅

b; R = C0 ₂ H

c: R = COMI(CU ₂ ) ₂ H

d: R-NH _j

e: R = H 본 발명자들은 최근에 몇몇 D03A-트라넥사메이트 (2a-b, 차트 1)의 가돌리늄 착물을 합성하여 그들이 간담즙-특이적 성질을 나타낸다는 것을 보고했다 (Gu, S.； Kim, H. K.； Lee, G. H.； Kang, B. S.； Chang, Y.； Kim, T. J. J. Med. Chem. 2011， 54, 143.). 이들 관찰과 최근의 다기능성 (mult i funct ional ) 조영제들을 개발할려는 연구활동에 동기를 받아, 본 발명자들은 새로운 클래스의 간-특이적 조영제로서 사용하기 위하여 몇 개의 추가적인 D03A- 트라넥사메이트 (lc- _e )와 그 대웅하는 Gd-착물들 (2c-e)을 제조하였다. 또한 본 발명자들은 간-특이성에 대한 구조 활성 연관 (SAR) 분석올 실시하였다.

【발명의 상세한설명】

[기술적 과제】

따라서 본 발명의 주된 목적은 화학식 1의 구조를 갖는 D03A- 트라넥스아믹산 또는 그 에르테르 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 착물 리간드 (L)용 조성물 및 상기 화합물을 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 높은 이완율과 열역학 및 속도론적 안정성 및 pH 안정성을 갖는 가돌리늄 착물을 함유하는 MR I조영제를 제공하는 데 있다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 D03A-트라넥스아믹산 또는 그 에스테르 화합물을 제공한다:

1]

상기 화학식에서 R은 H, NH ₂ 또는 C0NH(C¾) ₂ NH ₂ 이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기

D03A-트라넥사믹산 또는 그 에스테르 화합물 (화학식에서 R=C0NH(CH ₂ ) ₂ NH ₂ ; 화합물 lc)의 제조방법을 제공한다:

a) 트랜스 -4(아미노메틸)사이클로핵산에틸카복실레이� � 하이드로클로라이드 (trans-4(ami nome thyl ) eye 1 ohexaneet hy 1 carboxy late hydroch 1 or i de )에 브로모아세틸 브로마이드 (bromoacetyl bromide)를 첨가하여 교반하는 단계;

b) 상기 흔합물에 D03A-(¾u0) ₃ 를 첨가하여 교반하여 D03A(^u0) ₃ - 트라넥사믹 에틸 에스테르 콘쥬게이트를 만드는 단계;

c) 상기 D03A(¾uO) ₃ -트라넥사믹 에틸 에스테르 콘쥬게이트에 1，2- 디아미노에탄을 첨가하는 단계;

d) 상기 흔합물을 저압에서 용매를 모두 제거한 후 메탄을을 넣어 녹인 후， 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계;

e) 상기 크로마토그래피로 얻은 물질에 TFA를 첨가하여 e -butyl 그룹을 탈보호시키는 단계;

f) 상기 물질을 진공상태에서 건조하여 D03A-트라넥사믹산 또는 그 에스테르 화합물을 얻는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 D03A-트라넥사믹산 또는 그 에스테르 화합물 (화학식에서 R=N¾; 화합물 Id)의 제조방법을 제공한다:

a) 트랜스-1,4-디아민사이클로핵산( 3 5-1，4- 11100 (：10116 31 )에 다이터셔리부틸 다이카보네이트 (Di-ier -butyl dicarbonate)를 첨가하여 교반하는 단계 ;

b) 상기 흔합물에 브로모아세틸 브로마이드 (bromoacetyl bromide)를 첨가하여 교반하는 단계 ;

c) 상기 흔합물에 D03A-(¾uO) ₃ 를 첨가하여 교반하여 D03A(¾uO) ₃ - 트라넥사믹 아민 콘쥬게이트를 만드는 단계; f) 상기 흔합물올 진공에서 용매를 모두 제거한 후 메탄을을 넣어 녹인 후， 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 e) 상기 크로마토그래피로 얻은 물질에 TFA를 첨가하여 ier -butyl 그룹을 탈보호시키는 단계 ;

e) 상기 진공상태에서 건조하여 D03A-트라넥사믹아민 화합물을 얻는 단계. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 D03A-트라넥사믹산 또는 그 에스테르 화합물 (화학식에서 R=H ; 화합물 le)의 제조방법을 제공한다:

a) 아미노메틸사이클로헥산 ( (aminomethyl )cyclohexane)에 브로모아세틸 브로마이드 (bromoacetyl bromide)를 첨가하여 교반하는 단계;

b) 상기 흔합물에 D03A-( ¾uO) ₃ 를 첨가하여 교반하여 D03A-( uO)r 트라넥사믹 콘쥬게이트를 만드는 단계; .

c) 상기 흔합물을 저압에서 용매를 모두 제거한 후 메탄을을 넣어 녹인 후， 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및

d) 상기 크로마토그래피로 얻은 물질에 TFA를 첨가하여 er -butyl 그룹을 탈보호시키는 단계;

e)진공상태에서 건조하여 D03A-트라넥사믹산 또는 그 에스테르 화합물을 얻는 단계. 본 발명의 다른 양태에 따르면 , 본 발명은상기 D03A-트라넥스아믹산 또는 그 에스테르 화합물을 포함하는 착물 리간드 (L)용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 D03Aᅳ트라넥스아믹산 또는 그 에스테르 화합물을 리간드 (L)로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물을 제공한다.

본 발명에 있어서， 상기 금속원자는 가돌리늄 (Gd)인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물은 [Gd(L) (¾0) ]의 화학식을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 금속원자를 포함하는 착물은 상기 서술한 바와 같이 합성된 D03A—트라넥스아믹산 또는 그 에스테르 화합물 ( lc ~ le 화합물)을 이용하여 제조한다. 각각의 lc 내지 le 화합물과 GdCl ₃ '6H ₂ 0(gadolinium chloride hexahydrate)를 반웅시켜 가돌리늄 착물을 제조한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 상기 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명영상 (MRI) 조영제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조영제는 ECF(Extracelluar fluid) 조영제 기능을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 5개의 착물 (2a-e)에 대해 구조 활성 연관성 분석올 실시한 결과 오직 2a만이 간-특이성을 나타냈다. 비특 2b 및 2c가 간에서 강한 향상을 보여주지만, 간-특이적 조영제라 불릴만한 담즙- 배출이 관찰되지 않았다. 나머지들은 Dotarem®과 같은 통상의 ECF 조영제와 매우 유사하게 행동하였다. 또한 본원의 신규 시리즈는 생체내에서 사용되기에 아무런 독성을 가지지 않았다.

본 발명에 있어서， 상기 조영제는 높은 이완율， 향상된 열역학 및 속도론적 안정성， 및 pH 안정성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예를 통해 본원 시리즈가 pH 3 내지 11의 넓은 범위에 걸쳐 높은 속도론적 안정성을 나타낸다는 것을 증명하였다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서는 시리즈의 D03A- 트라넥사메이트 (tranexamates) 콘쥬게이트 (lc— e) 및 간-특이적 MRI 조영제로 사용되기 위한 그들의 Gd 착물 (2c— e)을 합성하였다. 모든 이들 착물은 Dotarem®과 같은 구조적으로 연관된 임상적 조영제에 필적하는 열역학적 (thermodynamic) 및 속도론적 (kinetic) 안전성을 보여주었다. 또한 그들의 y¾ 이완율 (relaxivities)은 3.68-4.84 mM-ls-1 범위로서 상업적 조영제에 필적하였다. 2a-e 로의 생쥐 생체내 (J? vivo) MR 이미지들은 2a 만이 간 ( 1 iver)-특이성을 나타냄을 보여준다. 비록 2b 및 2c 가 간 (liver)에서 강한 증강 (enhancement )을 나타나지만, 간-특이적 조영제라고 할만한 담즙 (bile)-배출은 관찰되지 않는다. 나머지들은 Dotarem®과 같은 일반적인 ECF 조경제들과 매우 유사한 행태를 보였다. 이들 신규 시리즈는 생체내 (/ ; 0)에서 사용되기에 독성을가지지 않았다.

상술한 바와 같이， 새로운 시리즈의 간-특이적 MRI 조영제에 대한 조사는 2a가 HSA 표적뿐만 아니라 어느 정도의 간-특이성을 나타내는 Gd 착물의 속도론적 불활성 ( inert ) 생체적합성 킬레이트로서 작용한다는 본 발명자의 선행 발견에 기초하였다. 새로운 시리즈의 D03A-트라넥사메이트 콘쥬게이트들은 2c- e를 포함하며, 그들의 합성은 전형적으로 2a의 합성에 기초하여 약간의 변형으로 제조되었다. 즉, 상기 합성은 초기에 D03A( BuO) ₃ 트라넥사메이트 콘쥬게이트의 형성으로 시작되고， 이어서 TFA에 의해 ^r -부틸기를 탈보호하여 시리즈 1을 형성하고， 가돌리늄 클로라이드로 착물화 한 후 시리즈 2를 수득하였다 (도 1 내지 3 참조) . 그들의 합성은 마이크로분석 및 다양한 분광 (spectroscopi c) 기술들에 의해 확인되었다.

【유리한 효과】

이상 설명한 바와 같이， 본 발명의 새로운 시리즈의 D03A 트라넥사메이트 콘쥬게이트들 ( lc-e) 과 그들의 Gd 착물들 (2c-e)이 간-특이적 MRI 조영제로 사용되기 위해 제조되었다. 모든 이들 착물들은 열역학적 및 속도론적 안정성을 보여주고， Dotarem ^® 와 같은 구조적으로 연관된 임상적 조영제와 필적할만한 이완율을 나타냈다. 5개의 착물 (2a-e)에 대해 구조 활성 연관성 분석을 실시한 결과 오직 2a만이 간-특이성을 나타냈다. 비록 2b 및 2c가 간에서 강한 향상을 보여주지만 간-특이적 조영제라 불릴만한 담즙-배출이 관찰되지 않았다. 나머지들은 Dotarem®과 같은 통상의 ECF 조영제와 매우 유사하게 행동하였다. 신규 시리즈는 생체내에서 사용되기에 아무런 독성을 가지지 않았다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명에 따른 D03A-트라넥사믹산 ( lc) 및 그의 가돌리늄 착물 (2c)의 합성 모식도를 나타낸 ^' 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 D03A-트라넥사믹산 (Id) ¾ 그의 가돌리늄 착물 (2d)의 합성 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 D03A-트라넥사믹산 ( le) 및 그의 가돌리늄 착물 (2e)의 합성 모식도를 나타낸 것이다.

도 4는 다양한 MRI 조영제들에 대한 시간에 대한 함수로서 A P( t )/ Λ Ρ(0)의 진화 (Evolut ion)를 나타낸다. 도 5A는 조영제 주사후 5분후 ICR 생쥐들의 관상 (coronal ) 및 축성 (axial ) 71-가증 (weighted) 이미지들을 보여준다. K, 신장; A, 복부대동맥. 도 5B는 조영제 주사 후 1 h 후 관상 및 축성 71—가중 이미지들을 보여준다. H, 심장; L, 간; B, 방광; G, 담낭.

도 6은 Gd-DOTA 및 2b-e에 의해 얻어진 정상 결막 섬유아세포의 상대적 세포 독성 (%)을 나타낸다. 표준 편차 (士 SD)는 3중 분석 (n = 3)으로 얻어졌다. 도 7a 내지 도 7e는 리간드에 대한 Gd ³⁺ 의 결합 열역학의 ITC 결정을 나타낸다. 결합 등온은 Gd ³ 7la— e의 몰비의 함수로서 적분 열 (heats)의 플롯에 해당한다. 실선은 수학적으로 결정된 한 세트의 사이트 모델내로 데이터의 최상- 피트 커브에 해당하며， 각 리간드에 한 분자 (Gd ³⁺ ) 결합을 가리킨다. 해리 상수 UQ , 연합 상수 UQ , 리간드당 결합된 Gd ³⁺ 갯수 00 , 및 연합 엔탈피 변화 ( Δ ^는 데이터 분삭으로 얻어졌다. 해리 및 연합 상수는 리간드 ( la-e)에 비교한 상대적 안정성을 결정하는데 증요한 접근방법이다.

도 8은 간 및 신장에 대한 다양한 조영제들에 의해 얻어진 CNR 프로파일들을 나타낸다.

도 9는 서로 다른 pH 조건하에서 인큐베이션 시간의 함수로서 PBS에서 2 ( [Gd] = 1.0 niM)에 대한 ^의 진화 (Evokit ion)을 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

본 실시예들에서, 모든 반웅들은 표준 Schlenk 기술들을 이용하여 이질소 (dini trogen)의 환경하에서 실시하였다. 용매들은 표준 절차를 이용하여 정제되고 건조되었다. 1，4，7，10-테트라아자사이클로도데칸 (D0TA)은 Strem (U. S. )에서 구입하고, 트랜스 -4- (아미노메틸) -사이클로액산카르복실산

(트라넥사믹산) 및 트랜스 -1，4-디아미노사이클로헥산은 Aldr ich에서 구입하고， 아미노메틸사이클로핵산은 TCI에서 구입하였다. 모든 다른 상업적 시약들은 Aldrich에서 구입하여 다른 표시가 없는한 받은대로 사용하였다. 탈이온수 (DI water)는 모든 실험에 사용되었다. 1H 실험은 BSI에 있는 Bruker Advance 400 또는 500 spectrometer 상에서 실시하였다. 화학적 시프트 (Chemical shifts)는 내부 표준으로서 테트라메틸실란 (TMS)에 대한 비교치로 δ 값으로 주어졌다. 커플링 상수는 Hz로 나타내고, FAB 매스 스펙트럼은 JMS-700 model (Jeol, Japan) mass spectrophotometer를 이용하여 얻었다. MALDI-T0F 매스 스펙트럼은 Voyager DE-STR (Applied biosystems, U.S.)를 이용하여 얻었다. 성분 (elemental) 분석은 KNU의 Center for Scientific Instruments에서 실시되었다. 차트 1]

실시예 1. 리간드 (Ligand) 합성:

1) la 및 lb의 합성

la 및 lb 는 종래 문헌 (Gu, S.； Kim, H. .； Lee, G. H.; Rang, B. S.; Chang, Y.； Kim, T. J. J. Med. Chem. 2011, 54, 143)에 따라 제조되었다.

2) lc의 합성

종래 문헌 방법 (Gu, S.； Kim, H. K.； Lee, G. H.； Kang, B. S.； Chang, Y.； Kim, T. J. J. Med. Chem. 2011, 54, 143)에 따라 제조된 D03A(¾uO) ₃ - 트라넥사믹 에틸 에스테르 콘쥬게이트 (6.8 mmol) (cf , R = C0 ₂ Et , Chart 1)를 니트 (neat) 1，2—디아미노에탄 (2.3 itiL, 33.8瞧 ol)에 첨가하였다. 상기 흔합물을 실온 (RT)에서 72 h 동안 교반한 후， 클로로포름을 첨가하고 물로 추출하였다 (30 mL 3 times). 유기 (organic) 추출물을 MgS0 ₄ 상에서 건조하고， 여과하고， 증발시켜 조 (crude) 산물을 얻었고， 그것을 실리카상의 크로마토그래피 (gradient elution CH ₂ C1 ₂ to 10% MeOH-C¾Cl ₂ , R _f = 0.6 (MeOH/CH ₂ Cl ₂ = 2:8))에 의해 더 정제하여 황색 고체를 얻었다. 이것을 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시키고， 트리폴루오로아세트산을 첨가하여 기틸기를 탈보호시켰다. 상기 흔합물을 하룻밤 실은에서 교반하고， 용매를 진공 하에 제거하여 오일상 잔기 (oily residue)만을 남겨 이것을 물에 흡수시켰다. 아세톤을 첨가하여 생성물을 백색 고체로 침전시키고， 이를 몇 번 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켰다: 수율: 0.36 g (92%) . 1H 匪 R (D ₂ 0)： δ = 3.82 (s , 4H, -NCH ₂ C0 ₂ -) , 3.62 (2Η, - NCH ₂ C0 ₂ -), 3.67 (s, 2H, -CH ₂ C0N) , 3.44 (m, 10H, overlapped -NCH ₂ CH ₂ N- in the ring (8H) & -C0NHCH ₂ - (2H)), 3.08 (d, 2H, -C0NHCH-2C-) , 2.24/1.52 (m, 2H, - C0NH) , 1.85/1.41 (m, 8H, -CH ₂ - , cyclohexyl ), 1.03 (m, 2H, -CH ₂ ᅳ, cyclohexyl). Anal. Calcd for C26H ₄₇ N ₇ 0 ₈ · 2¾0 : C, 50.23； H, 8.27； N, 15.77. Found: C, 50.66； H, 8.24； N, 16.01. MALDI-T0F MS (m/z): Calcd for C ₂₆ H ₄₇ N ₇ 0 ₈ : 585.35, Found: 586.74 ([MH] +), 608.70([MNa] +).

3) Id의 합성

종래 문헌 방법 (Lee, D. W.； Ha, H. J. Synthetic Cowmun 2007, 37, 737 Roth, G. J.; Heckel , A.; Colbatzky, F.； Hands chuh, S.； Kley, J.； Lehmann- Lintz, T.； Lotz, R. ; Tontsch-Grunt, U.； Walter, R.； Hilberg, F. J. Med. Chem. 2m, 52, 4466)에 따라 트랜스 -1,4-사이클로핵산으로부터 제조된 클로로포름 (100 mL)중의 트랜스 -[4-(2-클로로아세틸아미노)사이클로핵실]카르 바믹 -부틸 에스테르 (1.0 g, 3.4隱 ol) 용액에 ΙΧ)3Α-( ^ι ΒιιΟ) ₃ (1.6 g, 3.1 mmol)를 첨가하였다. 상기 흔합물을 실온에서 24 h 동안 교반하고， 모든 고체를 여과로 제거하고， 여과액을 진공하에 증발시켜 황색 오일상 잔기를 남겼다. 이어서 실리카상의 칼럼 크로마토그래피 (gradient elution: CH ₂ C1 ₂ to 10% Me0H-CH ₂ Cl ₂ , _f = 0.4 (Me0H/CH ₂ Cl ₂ = 1:9))를 실시하여 황백색 (oif-white) 고체를 얻었다. 이것을 디클로로메탄에 재용해시키고 과량의 TFA를 첨가하였다. 하룻밤 교반을 계속한 후, 메탄올을 첨가하여 백색 고체를 침전시키고, 상용법으로 더 정제하였다. 수율: 0.62 g (87%). 1H NMR (D ₂ 0)： δ = 3.72 (m, 10H, overlapped -NCH ₂ C0 ₂ - (8H) , ― C0NHCH- & ¾NCH- (2H)), 3.40/3.21 (m, 16H, -NCH ₂ CH ₂ N-), 2.06/1/55/1.38 (m, 8H, -(¾-, cyclohexyl). Anal. Calcd for C ₂₂ H ₄₀ N ₆ 0 ₇ · 2CF ₃ C00H ^■ 2¾0 : C, 39.00； H, 6.29； N, 10.50. Found C, 39.13； H, 6.05； N, 9.35. MALDI-T0F MS (m/z): Calcd for C ₂₂ H ₄₀ N ₆ 0 ₇ : 500.30, Found: 501.33 [MH] +, 523.33[MNa] +.

4) le의 합성 .

종래 문헌 방법 (Cho, S. D.； Song, S. Y.； Kim, . H.； Zhao, B. X.； Ahn, C; J oo, W. H.； Yoon, Y. J.; Falck, J. R.； Shin, D. S. B /(or. Chem. St. 2004 , 25, 415)에 따라 제조된 아세트니트릴 (30 mL)중의 2-클로로 사이클로핵실메틸아세타미드 (1.2 g, 6.4 mmol) 용액에 DG3A-( ^f BuO) ₃ (3.0 g, 5.8 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 24 h 동안 교반하였다. 고체 불순물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 진공하에 증발시켜 오일상 잔기를 얻었다. 이어서 실리카상의 칼럼 크로마토그래피 (gradient elution: CH ₂ C1 ₂ to 10% Me0H-CH ₂ Cl ₂ , R _f = 0.4 (Me0H/CH ₂ Cl ₂ = 1:9))를 실시하고 감압하에 증발시켜 황백색 고체를 얻었다. 상기 Id의 제조에 기술한대로 TFA에 의한 탈보호를 실시하여 황백색 고체를 생성물로 얻.었다. 수율: 2.4 g (82%). 1H讓 R ( 0)： δ = 3.74/3.57 (m, 8H, -NCH ₂ C0 ₂ -), 3.30 (m, 10H, overlapped -NCH ₂ CH ₂ N- (8H) & - C0NHCH ₂ - (2H)), 3.10 (m, 8H, -NCH ₂ CH ₂ N-), 1.98/1.44/1.27 (in, 4H, — CH ₂ -, cyclohexyl), 1.88 (m, 1H, -NHCH ₂ CH-). Anal. Calcd for C ₂₂ H ₃₉ N ₅ 0 ₇ · 3CF ₃ C00H ^■ 3H ₂ 0 : C, 38.14； H, 5.49； N, 7.94. Found: C, 37.83； H, 5.76； N, 8.44. MALDI-T0F MS (m/z): Calcd for C22H39N5O7,： 485.28, Found: 486.42 ([MH] + )， 508.44 ([MNa] + ). 실시예 2. Gd 착물 (complex)의 합성:

1) 2a 및 2b의 합성

2a 및 2b는 종래 문헌 (Gu, S.； Kim, H. K.； Lee, G. H.； Kang, B. S.；

Chang, Y.； Kim, T. J. J. Med. Chem. 2011， 54, 143)에 따라 제조되었다. 2) 2c의 합성

수중 (50 mL) lc (1.0 g, 1.7 mmol) 용액에 가돌리늄 클로라이드 (0.64 g, 1.7隱 ol)를 첨가하고 흔합물을 50 ^° C에서 48 h동안 교반하였다. pH는 주기적으로 체크하여 1 N NaOH를 사용하여 7.0—7.5 로 조정하였다. 상기 반응 흔합물을 진공하에 건조시켜 오일상 잔기를 남기고 이것올 물에 흡수시켰다. 상기 용액에 아세톤을 첨가하여 백색 고체를 침전시키고 여과에 의해 분리시키고 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 그 생성물은 흡습성 (hygroscopic)의 아이보리색 고체로 얻었다. 수율: 0.75 g (86%). Anal. Calcd for C ₂₆ H ₄₄ GdN ₇ 0 ₈ · 2CF ₃ C00H · 8¾0： C, 32.40； H, 5.62； N, 8.82. Found: C, 31.99； H, 5.22； N, 9.00. HR-FABMS (m/z): Calcd for C ₂₆ H ₄₅ GdN ₇ 0 ₈ ， 741.26 ([MH - H ₂ 0]+). Found: 741.2567； Calcd for C ₂₆ H ₄₄ GdN ₇ 0 ₈ Na, 763.24 ([MNa - H20]+). Found: 763.2397.

3) 2d의 합성

표제 화합물은 lc를 Id로 대체한것만 제외하고 상기 제조방법과 동일하게 제조되었다. 그 생성물은 흡습성의 황백색 고체로 얻었다 .,.수율: 1.15 g (.88%). Anal. Calcd for C ₂ 2¾ ₇ GclN ₆ 0 ₇ · 2CF ₃ C00H · 5¾0 : C, 32.10； H, 5.08； N, 8.64. Found: C, 31.55； H, 5.09； N, 9.06. HR-FABMS (m/z): Calcd for 2H ₃₈ GdN ₆ 0 ₇ ， 656.21 ([MH - H20] + ). Found: 656.2045； Calcd for C ₂₆ H ₄₄ GdN ₇ 0 ₈ Na， 678.19 ([MNa - H20]+). Found: 678.1867.

4) 2e의 합성

표제 화합물은 lc를 le로 대체한것만 제외하고 상기 제조방법과 동일하게 제조되었다. 그 생성물은 흡습성의 황백색 고체로 얻었다. 수율: 0.75 g (86%). Anal. Calcd for C ₂₃ ¾ ₈ GdN ₅ 0 ₇ · 4¾0 : C, 38.06； H, 6.39； N, 9.65. Found: C, 38.59； H, 6.09； N, 9.69. HR-FAB MS (m/z): Calcd for C ₂₃ H ₃₉ GdN ₅ 0 ₇ , 655.21 ([MH ― H ₂ 0]+). Found: 655.2093. 실시예 3. 이완율 (Relaxivity)의 측정

71 측정은 1.5 T (64 MHz)에서 변동 역전 시간 (TI)으로 역전 회수법 ( invers i on recovery method)을 이용하여 ^' 실시하였다. MR 이미지들은 50 내지 1750 ms 범위의 35개 서로다른 TI 값들에서 얻었다. 71 이완 시간은 각 TI 값에서 측정된 신호 강도의 비선형 최소좌승법 피트 (nonl inear l east-squares f i t )로부터 얻었다. 72 CPMG (Carr-Purce l 1 -Meiboon-Gi 1 1 ) 펄스 시뭔스 측정을 위해 다중 스핀 -에코 측정에 적웅되었다. 34개 이미지들을 10 내지 1900 ms 범위의 34개 서로다른 에코 시간 (TE) 값으로 얻었다. 72 이완 시간은 각 에코 시간에서 다증 스핀 -에코 측정을 위한 평균 (mean) 픽셀 값들의 비선형 최소좌승법 피트로부터 얻었다. 그 다음 이완율 (7 및 y¾)을 mM당 이완 시간의 역수로 계산하였다. 결정된 이완 시간 (기 및 72) 과 이완율 (ν¾ 및 /¾)을 최종적으로 이미지 프로세싱하여 이완 시간 맵과 이완율을 각각 얻었다.

¾-e는 Gd-D0TA (Dotarem® ) 및 Gd_BT-D03A (Gadovi st ® )와 같은 임상적으로 이용가능한 MRI 조영제들에 필적하거나 이들보다 더 나은 PBS에서와 Ri 이완율을 보여주었다 (표 1) . 시리즈안에서 비교하였을 때, s의 관찰할만한 차이는 발견되지 않았다. 측정은 그들이 어떤 혈액—푸울 (b l ood-pool ) 효과를 나타내는지를 보기 위하여 두개의 서로다른 매체， PBS (pH = 7.4) 및 HSA의 PBS 용액에서 실시하였다. PBS에서의 ?ι' s 에 비교하여 _. HSA에서 ^의 어떤 유의적인 증가가 관찰되었으며， 이는 우리의 신규 시리즈와 HSA사이에 약간의 상호작용이 있다는 것을 가리칸다.

[표 1] PBS 및 0.67 mM HSA에서 2a-e , Gd-D0TA 및 Gd-BT-D03A의 이완율 데이타 (64MHz , 293K) in 0.67 mM HSA

2a 4.84 ± 0.18 4.91 + 0.25 5.11 ± 0.10 6.04 ± 0.13

2b 3.87 + 0.11 3.98 ± 0.26 3.98 ± 0.14 5.43 ± 0.28

2c 3.6S ± 0,13 3,62 ± 0.26 3.74 + 0,07 4.10 ± 0,07

2d 3.94 ± 0.13 3.68 + 0.29 3.91 ± 0.09 4,07土 0.09

2e 4.49 ± 0.18 4.52 ± 0.2S 5.21 ± 0.23 6.22 ± 0.2S

Dotarem* 3.59 ± 0.17 3.87 + 0.20 4.05 ± 0.13 4.30 ± 0.25

Gadovist* 4.38 + 0.15 4,27 ± 0.30 4.81 + 0.17 5.54 ± 0.24 실시예 4. 금속교환속도론 (Transmetalat ion Kinetics)

이 실험은 종래 문헌 방법 (Laurent, S. Elst, L. V.； Copoi , F.； Muller, R. N. Investigative radiology 2001, 36, 115)에 따라 준비되었다. 그것은 2.5 隱 ol/L 가돌리늄 착물 및 2.5 mmol/L ZnCl ₂ 를 함유하는 완층 용액 (phosphate buffer, pH 7.4)의 물 양성자 종축 이완율 ( P)의 진화 (evolut ion)의 측정에 기초한다. 그다음 10 의 ZnCl ₂ 250 麵 ol/L 용액을 Ink의 상자성 (paramagnet ic) 착물 완충 용액에 첨가하였다. 그 흔합물올 강하게 교반하고， 300 를 취하여 이완측정 (relaxometric) 연구에 사용하였다. Gd-D0TA, Gd-B0PTA, Gd-DTPA-BMA, 및 Gd-E0B-DTPA에 대해 실시한 대조군 연구는 ZnCl ₂ .의 존재하에 얻어진 것들과 동일한 결과를 나타냈다. 관찰된 이완율 R = (1/71)에서 물 양성자 이완의 반자성 (diamagnetic) 기여를 공제한후 ν¾Ρ 이완율을 얻었다. 측정은 실온에서 3Τ whole body system (Magnet om Tim Trio, Si mens, Korea Institute of Radiological & Medical Science)상에서 실시하였다.

도 4는 다양한 MRI 조영제들에 대한 시간에 대한 함수로서 AP(t)/ ^P(0)의 진화 (Evolut ion)를 나타낸다.

정상 상자성 종축 이완율 AP(t)/ i¾P(0)의 평가는 본 시리즈 2a-e 및 비교 목적의 Dotarem®, -Pr imovist® , Multihance®, Omni scan® 에서 관찰되었다 (도 4). 시험에 사용된 착물은 진화 패턴에 따라 두개의 그룹으로 나뉘어질 수 있다: (0 거대고리 (macrocytic) 킬레이트를 채용하는 것들 (Π) 비고리 (acyclic) 킬레이트를 갖는 것들. 본 시리즈는 거대고리 링을 채용하고 매우 높은 속도론적 비활성 (inertness)을 가질 확률이 높아서 72 h 동안 초기 측정동안 90%이상의 상자성 이완율올 유지하였다. 그러나 대조적으로， 후자 그룹에 속하는 것들은 현저히 감소된 이완율이 관찰되었다. 예컨대， Pr imovist® 및 Multihance®는 기을기 (slope)가 훨씬 급격하여 동일한 측정 기간동안 겨우 50%의 초기 이완율을 유지하였다. 실시예 5. 등온 적정 칼로리미터 (Isothermal titration calorimeter: ITC) 리간드 용액에 대한 상자성 금속 이온 Gd ³⁺ 의 결합 등은 (binding isotherms)을 정량하기 위해 VP-ITC isothermal titration microcalorimeter (Microcal, USA)에서 ITC 실험을 실시하였다. 데이터 수집， 분석 및 플로팅 (plotting) Microcal에서 공급된 software package Origin, version 8.0의 도움으로 실시하였다. 시료 셀 (cell)은 1.43 mL의 부피를 가졌다. 거기에 la-e 리간드 (0.2 mM)의 수성 완층용액으로 채웠다. Gd ³⁺ (1.0 mM)의 수성 완충용액을 300 연속 교반된 (300 rpm) 시린지에 넣고 10 yL 분액 (al iquots)으로 셀내에 주사하고, 3분 간격으로 20 s에 걸쳐 전달하였다. 데이터 포인트들은 매 2 s마다 수집하였다. 측정은 25 ^° C에서 실시하였다. 모든 적정 (titrations)은 3회 실시하여 데이터의 일관성과 용액의 안정성을 확보하였다. 이들 적정 등온 (titration isotherms)을 적분하여 각 주사시 엔탈피 (enthalpy) 변화를 구했다. 두가지 수학적으로 서로 다른 세트의 사이트 모델에 잘 피팅하기 위하여 등온을분석하였다. 칼로리측정 분석을 통해， 결합 상수 엔탈피 변화 (ΔΗ), 및 결합의 ^■ 화학량론 (N)을 포함하는 파라미터들을 계산하였다. 다음에 자유에너지 (AG) 및 엔트로피 (ᅀ S)의 변화를 다음 착물화 (complexation) 등식을 이용하여 결정하였다: Mn+ + nL MLn: AG = -RT · ln _a - AH-TAS, 상기 식에서， R은 보편적 (universal) 가스 상수이고 T는 켈빈 (Kelvin) 온도이다.

본 시리즈는 등온 적정 칼로리메트리에 의해 측정했을 때 4 차수 (order)의 높은 형성 상수 (/)를 갖는다는 점에서 본 시리즈의 높은 열역학적 안정성에 유의할 ¾요가 있다 (표 2. 및 도 7 참조). 시리즈내에서 비교했을 때， lb는 미지의 이유에서 Gd ³⁺ 이온에 대한 최고 선호도 (preference)를 보여준다. 도 7은 리간드에 대한 Gd ³⁺ 의 결합 열역학의 ITC 결정을 나타낸다. 결합 등온은 Gd ³ 7la- e의 몰비의 함수로서 적분 열 (heats)의 플롯에 해당한다. 실선은 수학적으로 결정된 한 세트의 사이트 모델내로 데이터의 최상 -피트 커브에 해당하며, 각 리간드에 한 분자 (Gd ³⁺ ) 결합을 가리킨다. 해리 상수 (¾)， 연합 상수 (K _a ), 리간드당 결합된 Gd ³⁺ 갯수 (N), 및 연합 엔탈피 변화 (ΔΗ)는 데이터 분석으로 얻어졌다. 해리 및 연합 상수는 리간드 (la-e)에 비교한 상대적 안정성을 결정하는데 중요한 접근방법이다. [표 2] 25 ^° C 및 pH = 4.5에서 물 및 수성 la-e (1.0 mM)내로의 Gd ³⁺ (0.2 mM)의 적정 (Titration) lb*' lc^

A: _ff (10 M- ^l > 5.19^ 25,10*= 5.9 ' 3.4 - 8.7

A (1으 ^6' M> 3.9S.- ¹ Ιδ,Τ. 11.48^ o.s 0.37*' 0,2^ 0.1 ^ 0.4 ^

Ml(kcahnoH> 4.1.9' 7.13> 5.94 _* ·， 4,3 3.84 _* ·'

AS"(calinol -K- ^! 48.60,' 41.80^ . 35.30«^ 35.50 _* '

AG-(kcal'mol- ^! ^ ^■ 6A2^ ^• 6.52^ -6.1 -6.74.'

실시예 6. 생체내 ( vivo) MR실험

생체내 (//2 Vivo) 연구는 경북대학교 동물 연구 위원회의 규칙에 따라 실시하였다. 29-31 g 체중의 6주령 숫컷 ICR 생쥐들을 생체내 연구에 사용하였다. 생쥐들 (n = 3)을 산소중 1.5% 이소플루란으로 마취하였다. 측정은 꼬리 정맥을 통한 2a-e의 주사 전후에 실시하였다. 각 주사당 조영제의 양은 다음과 같다: MR 이미지를 위해 0.1 瞧 의 Gd/kg. 각 측정후에 생쥐를 마취에서 깨어나게 한 후 사료 및 음식의 자유 접근이 가능한 케이지에 넣었다. 이들 측느정동안， 동물들은 따뜻한 물 담요를 이용하여 약 37 ^° C에 유지시켰다. MR 이미지들은 수제 소형 동물 RF 코일이 _장착된 1.5 T MR unit (GE Healthcare, Milwaukee, WI)로 촬영하였다. 상기 코일은 50 画의 내경을 갖는 리시버 타입이었다. 스핀 에코 (SE)의 이미징 파라미터는 다음과 같다: 반복 시간 (TR) = 300 msec; 에코 시간 (TE) = 13 msec; 8 mm 필드의 뷰 (F0V); 192 X 128 매트릭스 크기 1.2 隱 슬라이스 두께 습득 갯수 (NEX) = 8. MR 이미지들은 주사후 24h동안 얻었다. 향상된 대조도 (contrast)를 갖는 해부학적 위치는 포스트 콘트라스트 (post contrast) MR 이미지들상에서 간 (liver), 담도 (bile duct), 및 신장 (kidney)에 대해 동정되었다. 정량적 측정을 위해， 특정 관심 영역 (R0I)에서의 신호 강도를 Advantage Window software (GE medical, U.S.)를 이용하여 측정하였다. CNR은 다음 등식 (1)을 이용하여 계산하였다. 하기 식에서 SNR은 신호 -대-노이즈 비율이다.

CNR = SNRp _0st - SNRpre (1) 도 5A는 조영제 주사후 5분후 ICR 생쥐들의 관상 (coronal) 및 축성 (axial) 71-가중 (weighted) 이미지들을 보여준다. K, 신장; A, 복부대동맥. 도 5B는 조영제 주사후 1 h 후 관상 및 축성 71-가중 이미지들올 보여준다. H, 심장; L, 간; B, 방광; G, 담낭.

도 8은 간 및 신장에 대한 다양한 조영제들에 의해 얻어진 CNR 프로파일들을 나타낸다.

심장 및 복부대동맥 (abdominal aorta)의 둘다에서 강한 신호 향상 (enhancement)이 2a-e로 5분내에 관찰되었다 (도 5A). 5개중에서， 처음 3개 (2a-c)는 초기 1시간동안 간에서 향상을 나타낸다는 점에서 전형적인 간ᅳ 특이적 조영제들인 Primovist ^® 및 Multihance ^® 에 필적하였다. 그러나， Primovist ^® 및 Multihance®에 비교해보면 오직 2a만이 담즙 (bile)을 통해 배출된다는 점에서 진정한 간-특이적 조영제로 분류될 수 있다 (도 5B). 비록 2e도 또한 담즙-배출을 보여주지만, 간-특이적 조영제라고 명명하기에는 신호 향상이 너무 약하다. 2e의 신호 강도는 전형적 ECF 조영제인 Gadovist®만큼 약하다 (도 5A). 비록 2d가 신장 및 복부대동맥 둘다에서 초기에 강한 향상을 나타내자만， Gadovist ^® 과 같이 1시간내에 배출이 거의 완료된다는 점에서 ECF 조영제로 분류될 수 있다. 2b 및 2c에 대해서도 간에서의 강한 향상이 발견되지만 (도 5A 및 도 8), 담즙—배출은 관찰되지 않는다. 2b 및 2c에서 관찰되는 그러한 이상 행태를 설명하기 위해 두가지 가정이 설정될 수 있다: 유기 음이온 수송 폴리펩타이드 (0ATP)를 통해 간세포에 들어간후 세포의 세관막에 존재하는 수송분자인 멀티드럭 내성 단백질 2 (MRP2)가 2b 및 2c를 수송 (transport)할 능력이 없거나 또는 MRP3 또는 양방향 0ATP를 통한 2b 및 2c 와굴맥관 (sinusoids)으로의 복귀 (return) 때문일 것이다. 전형적인 간-특이적 조영제인 Primovist ^® 및 Mult ihance ^® 의 경우 수동적 확산이 정상 간세포의 기저축막상에 존재하는 0ATP1를 통해 일어난다는 것을 주의할 필요가 있다. 이어서 담즙으로의 배출이 MRP2의 작용에 의해 일어난다. Primovist ^® 및 Multihance® 에서 친지질성 에톡시벤질의 존재가 모든 이러한 프로세스에서 중요한 역할을 할것이라고 믿어진다. 이러한 점에서， 2a에서 친지질성 사이클로핵실 부분의 존재가 또한 유사한 역할을 할 수 있다. 이러한 문제는 추가적인 연구가 필요하다. 실시예 7. 세포 생존율 (Cell viability) 측정

정상 결막 섬유아 세포를 사용하였다. 세포들을 열 -불활성화된 FCS (10%), 페니실린 (100 IU/mL) , 스트렙토마이신 (100 mg/mL), 및 겐타마이신 (200 mg/mL) (모두 Gibco ^® 에서 구입)이 보층된 DMEM (Gibco ^® )에서 유지하였다. 배지는 매 2일마다 갈아주고, 세포들을 96-웰 플레이트 (IX 104 cells/we 11/200 nL)에 분주하였다. 다양한 Gd(III) 농도 (50 - 500 μΜ)의 조영제를배양 무혈청 배지에 첨가하고 24 h동안 인큐베이팅하였다. 다음 CCK-8 (10 IJL)를 각 웰에 첨가하여 세포 생존율을 평가하였다. 용액은 37 ^° C에서 4 h 후에 제거하였다. 마이크로플레이트 리더 (Molecular Device, USA Bio-rad 550 Reader)를 사용하여 450 nm에서의 O.D. (Optical Density) 값을 읽어서 세포 생존율 /독성을 결정하였다. 도 6은 Gd-D0TA 및 2b-e에 의해 얻어진 정상 결막 섬유아세포의 상대적 세포 독성 (%)을 나타낸다. 표준 편차 (士 SD)는 3중 분석 (n = 3)으로 얻어졌다.

2b—e의 세포 생존율은 Dotarem ^® 에 필적한다 (도 6). 즉， 24 h 동안 인큐베이팅하였을 때 아무런 세포 증식 및 생존율에 영향이 없었다. MR 이미지들에서 강도 향상을 얻는데 필요한 농도 범위에서 어떠한 세포독성도 나나내지 않는다는 점에서 본 시리즈 내에 거의 차이가 발견되지 않았다. 실시예 8. 다양한 pH 영역에서의 속도론적 (Kinetic) 안정성

안정성은 실온에서 인큐베이션 시간에 대한 함수로서 다양한 pH 조건 (pH: 1， 3， 5， 7， 9 및 11)에서 PBS에서 2 ([Gd] = 1.0 mM)에 대한 수 양성자 이완율 의 진화 (evolution)로 주어졌다. 측정은 1.5 T whole body system (GE Healthcare, Milwaukee, WI , USA)상에 실시하였다.

도 9는 서로 다른 pH 조건하에서 인큐베이션 시간의 함수로서 PBS에서 2 ([Gd] = 1.0 mM)에 대한 ^의 진화 (Evolution)을 나타낸다.

본 시리즈는 pH 3 내지 11의 넓은 범위에 걸쳐 높은 속도론적 안정성을 나타내었다 (도 9). 2a는 pH 1에서조차도 충분히 안정하다는 것을 알 수 있다. 실시예 9. HgO에서 가수분해에 대한 안정성

조영제 100 mg을 증류수 10 mL에 녹인 뒤 50 ^° C에서 72시간 동안 방치하였다. 이후 HPLC를 사용해서 197nm에서 O.D. (Optical Density) 값을 읽어서 물질의 안정성을 결정하였다. 또한 분해 산물들의 정확한 동정을 위해서 각 retention time에서의 물질을 IX Mass Spectroscopy를 이용하여 확인하였다. 하기 표 3은 2a 화합물의 72시간후 가수분해 안전성을 나타낸 표이다. 2a는 0에서 72시간 방치한 결과 2b(Gd-acid)로 가수분해가 일어나서 안정성이 떨어졌다. 2a 화합물은 trans 및 cis 두 가지 이성질체가 존재하는 것을 확인하였다.

[표 3]

하기 표 4는 2b 화합물의 72시간후 가수분해 안전성을 나타낸 표이다. 2b는 ¾0에서 72시간 방치한 결과 unknown impurity가 증가하였다. 2b 화합물은 trans 및 cis 두 가지 이성질체가 존재하는 것을 확인하였다.

[표 4]

24.42min 0.06% 0.19%

28.12min 0.56% 0.64%

29.92min 0.09% 0.10%

34.46min

0.34% 0.03%

Acid

49.58min 0.19% 0.21% 하기 표 5는 2c 화합물의 72시간후 가수분해 안전성을 나타낸 표이다. 2c는 0에서 72시간 방치한 결과 unknown impurity가 미량 증가하였으나 비교적 안정한 것으로 나타났다. 2c 화합물은 trans 및 cis 두 가지 이성질체가 존재하는 것을 확인하였다.

[표 5]

하기 표 6은 2d 화합물의 72시간후 가수분해 안전성을 나타낸 표이다. 2d는 ¾0에서 72시간 방치한 결과 unknown impurity가 미량 증가하였으나 비교적 안정한 것으로 나타났다. [표 6]