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Patent Searching and Data


Title:
GANGLIOSIDE DERIVATIVES AND USE THEREOF AS INHIBITORS OF TUMOUR CELL DIVISION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2012/052596
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to novel inhibitors of tumour cell division. These inhibitors are semi-synthetic derivatives of neurostatin. The invention also relates to a novel method for the synthesis of the inhibitors and neurostatin. In addition, the invention relates to the use of said inhibitors for the production of a drug for the treatment of brain tumours.

Inventors:
NIETO SAMPEDRO, Manuel (Instituto Cajal, Doctor Arce 37, Madrid, E-28002, ES)
ROMERO RAMÍREZ, Lorenzo (Fundación del Hospital Nacional de Parapléjicos para la Investigación y la Integración, Finca La Peraleda, Toledo, E-45071, ES)
Application Number:
ES2011/070732
Publication Date:
April 26, 2012
Filing Date:
October 21, 2011
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) (Serrano, 117, Madrid, E-28006, ES)
FUNDACIÓN DEL HOSPITAL NACIONAL DE PARAPLÉJICOS PARA LA INVESTIGACIÓN Y LA INTEGRACIÓN (FUHNPAIIN) (Finca La Peraleda, Toledo, E-45071, ES)
NIETO SAMPEDRO, Manuel (Instituto Cajal, Doctor Arce 37, Madrid, E-28002, ES)
ROMERO RAMÍREZ, Lorenzo (Fundación del Hospital Nacional de Parapléjicos para la Investigación y la Integración, Finca La Peraleda, Toledo, E-45071, ES)
International Classes:
C07H15/10; A61P25/00; C12N9/10; C12P19/26
Domestic Patent References:
WO1994014825A11994-07-07
Foreign References:
US5766887A1998-06-16
US5102663A1992-04-07
FR2662697A11991-12-06
Other References:
ROMERO-RAMIREZ, L. ET AL.: "Inhibiting Human Astrocytoma Growth: Structure -Activity Relationships in Neurostatin Related Glycolipids.", J. MED. CHEM., vol. 47, no. 21, 2004, pages 4983 - 4984
IGARASHI, M. ET AL.: "Characteristics of gangliosides including O-acetylated species in growth cone membranes at several developmental stages in rat forebrain.", DEVELOPMENTAL BRAIN RESEARCH., vol. 78, no. 1, 1994, pages 17 - 24, XP024334455, DOI: doi:10.1016/0165-3806(94)90004-3
ABAD-RODRIGUEZ, J. ET AL.: "Purification and structure of neurostatin, an inhibitor of astrocyte division of mammalian brain.", JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY., vol. 74, no. 6, 2000, pages 2547 - 2556
VALLE-ARGOS. B ET AL.: "Synthesis and characterization of neurostatin-related compounds with high inhibitory activity of glioma growth.", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 45, no. 5, May 2010 (2010-05-01), pages 2034 - 43, XP026976527
HOULISTON, R.S. ET AL.: "Identification of a Sialate O-Acetyltransferase from Campylobacter jejuni. Demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminal -2, 8-linked sialic acid.", J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 17, 2006, pages 11480 - 11486, XP003008560, DOI: doi:10.1074/jbc.M512183200
NIETO-SAMPEDRO, M. ET AL.: "Inhibitors of Glioma Growth that Reveal the Tumour to the Immune System.", CLINICAL MEDICINE INSIGHTS ONCOLOGY., vol. 5, 21 September 2011 (2011-09-21), pages 265 - 314
Attorney, Agent or Firm:
UNGRIA LÓPEZ, Javier (Avenida Ramón y Cajal 78, Madrid, E-28043, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de síntesis de un compuesto de fórmula general (I):

(I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde:

Y es una ceramida;

Ac es un grupo acetilo;

Z se selecciona entre un grupo de fórmula (Zi):

(Zl)

de manera que la fórmula general (I) corresponde a la fórmula (la):

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23) o Z es un grupo de fórmula (Z2):

(Z2)

de manera que la fórmula general (I) corresponde a la fórmula (Ib):

(Ib)

donde tanto para la fórmula (la) como para la formula (Ib):

Xi se selecciona entre -CH2-O-CO-X2 y -CH2OH;

X2 se selecciona entre un grupo alquilo Ci-C2 y-CH2COOH;

X3 se selecciona entre H, OH, un grupo de fórmula (II) o un grupo de fórmula

(III):

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23}

donde en la fórmula III, X4 se selecciona entre H, un grupo de fórmula (IV) o un grupo de fórmula (V):

(V)

donde tanto para la fórmula IV como para la fórmula V:

X5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -0-COXe;

Χβββ selecciona entre un grupo alquilo C1-C2 o -CH2COOH; excepto cuando:

- Z es un grupo de fórmula (Z^ o (Z2), X1 es -CH2-OH y X3 es H;

- Z es un grupo de fórmula (ΖΊ) o (Z2), X1 es -CH2-OH y X3 es OH;

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23) - Z es un grupo de fórmula (Zi) o (Z2), Xi es -CH2-OH y X3 es el grupo de fórmula (II);

- Z es un grupo de fórmula (Z-i) o (Z2), X1 es -CH2-OH, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- Z es un grupo de fórmula (Z1) o (Z2), X1 es -CH2-OH, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es el grupo de fórmula (IV) y X5 es OH;

- Z es un grupo de fórmula (Z1) o (Z2), X1 es -CH2-OH, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es el grupo de fórmula (V) y X5 es OH; que comprende las etapas de: a) disolver un gangliósido en una solución tampón; b) adicionar un emulgente a la mezcla de la etapa a) c) adicionar a la mezcla de la etapa b) la enzima o-acetiltransferasa; y d) parar la reacción por adición de metanol a la mezcla obtenida en la etapa c).

HOJA DE REEMPLAZO Re ia 23 o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde:

Y es una ceramida;

Ac es un grupo acetilo;

X2 es un grupo alquilo C1-C2;

X3 se selecciona entre H, OH, un grupo de fórmula (II) o un grupo de fórmula (III):

(II) (III) donde en la fórmula III, X4 se selecciona entre H o un grupo de fórmula (IV):

donde: X5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -Ο-COXe; y ΧΘ es un grupo alquilo C1-C2;

excepto cuando:

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- X! es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (II);

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23) - Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CHU, X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (IV) y X5 es OH; que comprende las etapas de: a) disolver un gangliósido en una solución tampón; b) adicionar un emulgente a la mezcla de la etapa a) c) adicionar a la mezcla de la etapa b) la enzima o-acetiltransferasa; y d) parar la reacción por adición de metanol a la mezcla obtenida en la etapa c). 3. El procedimiento según la reivindicación 1 , donde en la etapa a) el gangliósido se selecciona del grupo formado por GD1 b, GD3, GD2, GT1 b, GQ1b, G 3, GM2, GM1a y GD1a.

4. El procedimiento según la reivindicación 2, donde en la etapa a) el gangliósido se selecciona del grupo formado por GD1b, GD3, GD2 y GT1 b.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde en la etapa a) se añade una concentración de gangliósido entre 50 a 600 Mmoles/L reacción.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, donde en la etapa a) se añade una concentración de gangliósido entre 300 y 600 moles/L de reacción..

7. El procedimiento según la reivindicación 6, donde en la etapa a) se añade una concentración de gangliósido de 500 Mmoles(L de reacción.

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23}

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la solución tampón está en una concentración desde 1 hasta 250 mmoles/L de reacción. 9. El procedimiento según la reivindicación 8, donde la solución tampón está en una concentración desdelO hasta 100 mmoles/L de reacción.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde la solución tampón está en una concentración de 50 mmoles/L de reacción..

1 1. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la solución tampón se selecciona del grupo formado por TRIS, MES, o fosfato. 12. El procedimiento según la reivindicación 11 , donde la solución tampón es MES.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la solución tampón tiene un pH desde 6 a 9.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, donde el pH de la solución tampón está entre 7 y 8.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, donde el pH de la solución tampón es de 7.0.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde se añade a la solución tampón MgC 10 mM y DTT 1mM, y además un derivado de la coenzimaA seleccionado entre Acetil-Coenzima A, Propionil- Coenzima A y Malonil-CoenzimaA, a una concentración entre 0.1 a 10 mmoles/L de reacción..

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23)

17. El procedimiento según la reivindicación 16, donde el derivado de Coenzima A se selecciona entre Acetil-Coenzima A ó Propionil-Coenzima A.

18. El procedimiento según una de las reivindicaciones 16 ó 17, donde el derivado de Coenzima A está a una concentración entre 0.5 y 2 mmoles/L de reacción.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, donde el derivado de Coenzima A está a una concentración de 1 mmoles/L de reacción.

20. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 19, donde el emulgente es un ácido biliar o sal biliar a una concentración entre 0.05% y 0.2% peso/volumen total de reacción. 21. El procedimiento según la reivindicación 20, donde el emulgente tiene una concentración del 0.1 % en peso/volumen total de reacción.

22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 , donde el ácido biliar se selecciona del grupo formado por el ácido cólico, ácido deoxicólico, taurocólico, glicocólico, ursodeosicólico, litocólico, o sus sales sódicas y potásicas, dentro del grupo formado porcolatos, taurocolatos, deoxicolatos, ursodeoxicolatos o glicocolatos.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, donde el emulgente es la sal biliar colato sódico.

24. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 23, donde en la etapa c), se añade la enzima O-acetiltransferasa una concentración de entre 2 y 30 pg/μΙ de reacción.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, donde la enzima se añade a una concentración entre 15 y 25 pg/μΙ de reacción.

HOJA DE REEMPLAZO (Regía 23)

26. El procedimiento según la reivindicación 25, donde la enzima se añade a una concentración de 20 [ig/ i\ de reacción.

27. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 26, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura entre 30- 40°C.

28. El procedimiento según la reivindicación 27, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura entre 35-38 °C.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura de 37 °C.

30. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 29, donde adicionalmente tras la etapa d) se llevan a cabo las siguientes etapas:

- desalar los productos obtenidos tras la etapa d) utilizando un cartucho de fase reversa Sep-Pak C18,

- desecar la muestra con los productos desalados anteriores en vacío;

- purificar los diferentes productos desecados por TLC preparativa o HPLC preparativa en una columna amino;

- calcular el peso molecular de los productos de la etapa anterior mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo;

- caracterización de la posición de las O-acetilaciones u O- propionilaciones mediante secuenciación por espectrometría de masas "electrospray".

31. Compuesto definido por la fórmula general (I), excepto cuando:

- Z es un grupo de fórmula (Zi), Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- Z es un grupo de fórmula (Z1), X1 es -CH2-0-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (II);

- Z es un grupo de fórmula (Z^, X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3) X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (IV) y X5 es OH;

OJA ü>&. ^ ^lAZ ( lcg!& 2c) - Z es un grupo de fórmula (Zi), Xi es -CH2-0-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es OH;

- Z es un grupo de fórmula (Zi), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (V), X5 es -OH;

- Z es un grupo de fórmula (Z2), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es OH;

- Z es un grupo de fórmula (Z2), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (II);

- Z es un grupo de fórmula (Z2), X1 es -CH2-OH, X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (IV), X5 es -O-CO-X6 y Χβ es un grupo CH3.

32. Compuesto definido por la fórmula (la), excepto cuando:

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (II);

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH3, X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (IV) y X5 es OH.

33. El compuesto según una de las reivindicaciones 31 ó 32, donde Y es una ceramida que comprende una esfingosina y un ácido graso natural o sintético.

34. El compuesto según la reivindicación 33, donde la esfingosina comprende de 18 a 20 átomos de carbono y de 0 a 2 insaturaciones. 35. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34, donde el ácido graso comprende de 8 a 24 átomos de carbono y con un número de insaturaciones de 0 a 4.

36. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, donde X2 es un grupo metilo.

37. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, donde X2 es un grupo etilo.

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23)

38. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, donde X2 es un grupo -CH2COOH. 39. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, donde X3 es H.

40. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, .donde X3 es OH.

41. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, donde X3 es un grupo de fórmula (II).

42. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, donde X3es un grupo de fórmula (III).

43. El compuesto según la reivindicación 42, donde X es H.

44. El compuesto según la reivindicación 42, donde X4 es un compuesto de fórmula general (IV).

45. El compuesto según la reivindicación 42, donde X4 es un compuesto de fórmula general (V). 46. El compuesto según una de las reivindicación 44 ó 45, donde X5 es un grupo OH.

47. El compuesto según una de las reivindicación 44 ó 45, dondeXs es un grupo -O-COX6.

48. El compuesto según la reivindicación 47, donde XQ es un metilo.

49. El compuesto según la reivindicación 47, donde XQ es un etilo.

50. El compuesto según la reivindicación 47, donde Χβ es un grupo - CH2COOH. 51. El compuesto según una de las reivindicaciones 31 ó 32, que se selecciona de la siguiente lista: 0-propionil-GD1b, 0-propionil-GD3, 0-propionil-GD2, A-O- propionil-GT1b, B-0-prop¡on¡l-GT1b, di-0-propionil-GT1b, B-0-acetil-GT1b, di- 0-acetil-GT1 b, 0-Propionil-GM3, 0-Malonil-GM3, 0-Propionil-GM2, O-Malonil- GM2, 0-Malonil-GD3, 0-Malonil-GD2, 0-Propionil-GD1a, 0-Malonil-GD1a, O- Malonil-GD1b, A-0-Malonil-GT1b, B-0-Malonil-GT1b, di-0-Malonil-GT1b, B-O- Acetil-GQ1b, di-0-Acetil-GQ1b, A-0-Propionil-GQ1b, B-0-Propionil-GQ1b, di- 0-Propionil-GQ1b, A-0-Malonil-GQ b, B-0-Malonil-GQ1b y di-0-Malonil-GQ1b.

52. El compuesto según la reivindicación 32, que se selecciona de la siguiente lista:

0-propionil-GD3

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 23)

0-propionil-GD1b

0-propionil-GT1b

B-0-acetil-GT1b donde Y es cualquier ceramida.

53. Compuesto sintetizado según el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 30.

54. Composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto según la reivindicación 31 y al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

55. Composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto según la reivindicación 32 y al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

56. La composición farmacéutica definida en una de las reivindicaciones 54 ó 55, que además comprende otro principio activo. 57. Uso del compuesto de una de las reivindicaciones 31 a 53, o de la composición farmacéutica de una de las reivindicaciones 54 a 56, para la elaboración de un medicamento.

58. Uso del compuesto de la reivindicación 32, o de la composición farmacéutica de una de las reivindicaciones 55 ó 56, para la elaboración de un medicamento.

HOJA DE REEMPLAZO (Regía 23)

59. Uso del compuesto según una de las reivindicaciones 56 ó 57, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de tumores.

60. Uso del compuesto según la reivindicación 58, donde el tumor se selecciona de la lista que comprende: astrocitoma, glioblastoma, oligodendroglioma, neuroblastoma o meningioma.

61. Uso del compuesto de una de las reivindicaciones 31 a 53, como reactivo en ensayos biológicos.

Description:
DERIVADOS DE GANGLIOSIDOS Y SU USO COMO INHIBIDORES DE LA DIVISION DE CÉLULAS TUMORALES

La presente invención se refiere a nuevos inhibidores de la división de células tumorales. Dichos inhibidores, son derivados semisintéticos de la neurostatina.

5 Además la presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de síntesis

de los inhibidores y de la neurostatina. Y también en general se refiere a un procedimiento para obtener gangliósidos O-acilados específicamente en los siálicos terminales. Además se refiere al uso de estos inhibidores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores cerebrales.

10

La invención se encuadra en el sector farmacéutico, y es aplicable en el sector médico para el tratamiento de tumores cerebrales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

15

El glioblastoma multiforme es el tumor cerebral primario más frecuente en adultos y también el más mortal. En Estados Unidos, solo la mitad de los pacientes que reciben el tratamiento estándar sobreviven un año después del diagnóstico. Menos de uno de cada diez sobrevive más de cinco años. Suele

20 presentarse en personas mayores de cuarenta años, con un máximo de

incidencia entre los 50 y 55 años y es más frecuente entre los varones. En adultos, hay unos 17.000 nuevos casos de tumores cerebrales cada año

(además, otros tipos de cáncer pueden metastatizar al cerebro), lo que supone unas 14000 muertes. Los tumores cerebrales son la primera causa de muerte

25 por cáncer en niños y menores de 20 años.

El tratamiento depende de la localización y del grado del tumor; se aplica cirugía cuando el tumor es accesible y no hay peligro de dañar estructuras vitales. La radioterapia se utiliza para detener el crecimiento del tumor o para

30 hacer que disminuya de tamaño y la quimioterapia destruye las células

tumorales que quedan después de la cirugía y la radioterapia. La quimioterapia más habitual (BCNU, CCNU) no parece tener un efecto significativo, aunque en algunas ocasiones se ha conseguido aumentar algunos meses la supervivencia. Por tanto, el desarrollo de nuevas moléculas capaces de detener la proliferación de gliomas es de gran interés para el tratamiento de esta enfermedad. Los gangliósidos, son glicolípidos formados por una cadena de ceramida (que se compone de unresiduo del aminoalcoholesfingosina unido a un ácido graso) unida a una cadena de oligosacárido. Los gangliósidos tienen como característica estructural, la presencia de uno o varios residuos de ácido siálico en la cadena de oligosacárido. La Neurostatina se caracteriza por ser un gangliósido de la serie b, GD1 b, con una modificación en forma de O- acetilación en uno de los hidroxilos de su siálico terminal (Romero-Ramirez L, Nieto-Sampedro M. Inhibiting human astrocytomagrowth: structure- activityrelationships in neurostatinrelatedglycolipids. Journal of Medicinal Chemistry 2004;47(21):4983-4.). La posición de esta O-acetilación es preferentemente en el hidroxilo del carbono 9, ya que aunque también han sido descritas O-acetilaciónes en los carbonos 7 y 8, en condiciones de pH fisiológico los O-acetilos en esos carbonos migran a la posición 9. La O- acetilación es la modificación más frecuente en la naturaleza y se encuentran preferentemente en los siálicos de los gangliósidos unidos en enlaces a(2,8) y a(2,3) a la cadena glicídica.

La Neurostatina es un gangliósido natural que se expresa en concentración muy baja en el sistema nervioso central de los mamíferos (Abad-Rodríguez J, Bernabé M, Romero-Ramirez L, Vallejo-Cremades M, Fernandez-Mayoralas A, Nieto-Sampedro M. Purification and structure of neurostatin, aninhibitor of astrocyted ¡visión of mammalianbrain. Journal of Neurochemistry 2000;74(6):2547-56.). El procedimiento de purificación de la neurostatinay de otros gangliósidos O-acetiladosa partir de cerebros de mamífero es muy laborioso y el rendimiento obtenido hace inviable su usopara el estudio del papel biológico de esta modificación, en la experimentación animal o para su posible uso en clínica.

Recientemente, se han desarrollado una serie de procedimientos para la obtención de gangliósidos O-acetilados mediante diferentes métodos de O- acetilación del gangliósido comercial GD1 b y de otros gangliósidos( Va//e-/4rgos B, Gomez-Nicola D, Nieto-Sampedro M. Synthesis and characterization of neurostatin-relatedcompoundswithhighinhibitoryactivity of glioma growth. EuropeanJournal of Medicinal Chemistry; 2010, 45(5):2034-43.). Aunque los procedimientos químicos reducen los pasos para la obtención de gangliósidos O-acetilados, son reacciones inespecíficas donde no se controlan ni el número, ni la posición de las O-acetilaciones. En consecuencia, se obtiene una gran variedad de productos que dificultan su purificación a homogeneidad y reducen considerablemente el rendimiento de la reacción. A pesar de que este procedimiento reduce los pasos necesarios para producir neurostatina, el producto obtenido sigue siendo insuficiente para su posible uso clínico. Además, dada la poca abundancia de estas sustancias en la naturaleza, el estudio de su actividad biológica hace necesaria la búsqueda de nuevos procedimientos para su obtención.

Por otro lado el procedimiento descrito en la publicación (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. Identification of a sialate O-acetyltransferase from Campylobacter jejuni: demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminalalpha-2, 8-linked sialic acid. TheJournal of BiologicalChemistry 2006;281(17):11480-6) consigue O-acetilar polisacáridos de glicolípidos derivados del éster del ácido hexanoico6-(5-Fluorescein-carboxamido)- (FCHASE) y glicoproteínas, pero no gangliósidos.

El procedimiento descrito en la patente (WO 2007016792) es bastante general. Los rangos de pH que describe son bastante amplios (de 5 a 8), habla de un donador de grupos acetilo y un aceptor de los grupos acetilo, donde se prevé el uso de sustancias tampón y la reacción se lleva a cabo entre 0 y 40 °C, preferentemente entre 20 y 37 °C, en medio acuoso. También describe que la mezcla de reacción puede contener cationes metálicos divalentes (tales como magnesio o manganeso) y también puede contener detergentes solubilizantes o disolventes orgánicos, si fuese necesario. Este procedimiento no detalla ningún protocolo específico para O-acetilargangliósidos y siguiéndolo no se consigue O-acetilargangliósidos.

En el procedimiento descrito por Houliston, R. et al. (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. Identification of a sialate O-acetyltransferase from Campyiobacter jejuni: demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminalalpha-2, 8- linked sialic acid. The Journal of BiologicalChemistry 2006;281(17):11480-6) que utiliza una O-acetiltransferasa de la bacteria Campylobacterjejuni. Este procedimiento fue utilizado para O-acetilar específicamente los ácidos siálicos terminales de las cadenas de polisacaridos de glicolípidos derivados del éster succidimil del ácido hexanoico 6-(5-Fluorescein-carboxamido) (FCHASE) y también glicoproteínas. El uso de este enzima para O-acetilar oligosacáridos se encuentra patentado (WO 2007016792 20070215). El procedimiento descrito por estos investigadores no pudo O-acetilar con éxito gangliósidos. Los gangliosidos en solución acuosa se agrupan en micelas que impiden el acceso de la O-acetiltransferase al siálico terminal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una nueva serie de gangliósidos con actividad inhibidora (de la familia de la neurostatina) de la división de células tumorales y del crecimiento de gliomas. Además la presente invención describe un novedoso procedimiento de obtención de gangliósidos O-acetilados y de la neurostatina que se caracteriza por su sencillez, especificidad y alto rendimiento. Este procedimiento tiene un interés comercial en el campo de la glicobiología para la producción de estos gangliósidos O-acetilados en grandes cantidades. Utilizando el mismo procedimiento que se describe hemos obtenido nuevos gangliósidos de la familia de la neurostatina O-propionilados y O-malonilados, no descritos en la naturaleza y que tienen mayor actividad inhibidora de la proliferación de la línea de glioma C6 (Tabla 1 ). Estos compuestos podrían ser más resistentes a la hidrólisis por glicosidasas, por lo que su efecto sería más duradero.

Por lo tanto, estos gangliósidos O-propionilados y O-maloniladosson unos productos muy interesantes para su uso clínico como antitumorales.

Teniendo en cuenta la gravedad de los glioblastomas y la escasa efectividad de los tratamientos disponibles, el desarrollo de nuevas moléculas capaces de detener la proliferación de gliomas es de enorme interés.

Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de un compuesto, concretamente un gangliósido, de fórmula gener

(l)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde:

Y es una ceramida;

Ac es un grupo acetilo;

Z se selecciona entre un grupo de fórmula Zi :

(Zi) de manera ue la fórmula general (I) corresponde a la fórmula (la):

(la)

o Z es un grupo de fórmula (Z 2 ):

(¾)

de manera que la fórmula general (I) corresponde a la fórmula (Ib):

(Ib)

donde tanto para la fórmula la como para la formula Ib:

Xi se selecciona entre -CH 2 -O-CO-X 2 y -CH 2 OH;

X 2 se selecciona entre un grupo alquilo Ci-C 2 y-CH 2 COOH;

X3 se selecciona entre H, OH, un grupo de fórmula (II) o un grupo de fórmula

(II) (i») donde en la fórmula III, X4 se selecciona entre H, un grupo de fórmula (IV) o un grupo de fórmula (V):

(V)

donde tanto para la fórmula IV como para la fórmula V:

X5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -0-COXe;

Xese selecciona entre un grupo alquilo C 1 -C 2 o -CH 2 COOH; excepto cuando:

- Z es un grupo de fórmula (Z 1 ) o (Z 2 ), X 1 es -CH 2 -OH y X 3 es H;

- Z es un grupo de fórmula (Z 1 ) o (Z 2 ), X 1 es -CH 2 -OH y X 3 es OH; - Z es un grupo de fórmula (Zi) o (Z 2 ), Xi es -CH 2 -OH y X 3 es el grupo de fórmula (II);

- Z es un grupo de fórmula (Zi) o (Z 2 ), Xi es -CH 2 -OH, X 3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- Z es un grupo de fórmula (Z1) o (Z 2 ), X1 es -CH 2 -OH, X 3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es el grupo de fórmula (IV) y X 5 es OH;

- Z es un grupo de fórmula (Z1) o (Z 2 ), X1 es -CH 2 -OH, X 3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es el grupo de fórmula (V) y X 5 es OH; que comprende las etapas de: a) disolver un gangliósido en una solución tampón; b) adicionar un emulgente a la mezcla de la etapa a) c) adicionar a la mezcla de la etapa b) la enzima o-acetiltransferasa; y d) parar la reacción por adición de metanol a la mezcla obtenida en la etapa c).

En adelante, dicho procedimiento puede ser referido como procedimiento de la invención.

Según una realización preferida, el gangliósido de fórmula general (I) se selecciona del grupo formado por O-acetil-GM3, O-acetil-GM2, O-acetil-GD3, O-acetil-GD2, Neurostatina, A-O-acetil-GT1 b, A-O-acetil-GQ1 b, O-propionil- GD1 b, O-propionil-GD3, O-propionil-GD2, A-O-propionil-GT1 b, B-O-propionil- GT1 b, B-O-acetil-GT1 b, di-O-acetil-GT1 b, O-Propionil-GM3, O-Malonil-GM3, O- Propionil-GM2, O-Malonil-GM2, O-Malonil-GD3, O-Malonil-GD2, O-Propionil- GD1 a, O-Malonil-GD1 a, O-Malonil-GD1 b, A-O-Malonil-GT1 b, B-O-Malonil- GT1 b, di-O-Malonil-GT1 b, B-O-Acetil-GQ1 b, di-O-Acetil-GQ1 b, A-O-Propionil- GQ1 b, B-O-Propionil-GQ1 b, di-O-Propionil-GQ1 b, A-O-Malonil-GQ1 b, B-O- Malonil-GQ1 b y di-O-Malonil-GQ1 b, según se definen a continuación:

0-propionil-GD1b

di-0-acetil-GT1b

A-0-propionil-GT1 b

B-0-propionil-GT1b

di-0-propionil-GT1 b

0-acetil-GD3

A-0-acetil-GT1b

Q-Acetil-GM2

0-Acetil-GD1a

A-0-Acetil-GQ1 b

Q-Propionil-GM3

Q-Malonil-GM3

Q-Propionil-GM2

0-Malonil-GM2

0-Malonil-GD2

0-Propionil-GD1a

0-Malonil-GD1a

0-Malonil-GD1b

A-0-Malonil-GT1b

B-0-Malonil-GT1b

di-0-Malonil-GT1b

B-0-Acetil-GQ1b

B-0-Propionil-GQ1b

di-0-Propionil-GQ1b

A-0-Malonil-GQ1b

B-0-Malonil-GQ1b

di-0-Malonil-GQ1b

donde Y es cualquier ceramida, que está compuesta por una esfingosina y un ácido graso. De manera preferida la esfingosina comprende de 18 a 20 átomos de carbono y tiene un número de insaturaciones de 0 a 2. De manera preferida el ácido graso puede contener de 8 a 24 átomos de carbono y con un número de insaturaciones de 0 a 4;

En la presente invención los términos GD1 b, GD3, GD2, GT1 b, GQ1 b, GM3, GM2, GM1 a o GD1 a, hacen referencia a gangliosidos del mismo nombre conocidos en el estado de la técnica por cualquier experto en la materia. En este mismo sentido estos gangliosidos comprenden entre otros elementos, una ceramida (Y) que a su vez comprende una esfingosina y un ácido graso. La esfingosina es preferentemente de 18 de átomos de carbono con una insaturación o de 20 átomos de carbono con una insaturación. De manera preferente el ácido graso es de 18 átomos de carbono sin ninguna insaturación o con una insaturación. En otra realización preferida del procedimiento de la presente invención, el com uesto de fórmula general I presenta la fórmula (la):

(la)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde:

Y es una ceramida;

Ac es un grupo acetilo;

Xi es -CH 2 -O-CO-X 2 ;

X2 es un grupo alquilo C1-C2;

X3 se selecciona entre H, OH, un grupo de fórmula (II) o un grupo de fórmula (III):

(II) (III) donde en la fórmula III, X4 se selecciona entre H o un grupo de fórmula (IV)

(IV) donde: X 5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -Ο-COXe; y ΧΘ es un grupo alquilo C1-C2;

excepto cuando:

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (III) y X4 es H;

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (II);

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (IV) y X 5 es OH;

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (la) y X4 es OH; que comprende las etapas de: a) disolver un gangliósido en una solución tampón; b) adicionar un emulgente a la mezcla de la etapa a) c) adicionar a la mezcla de la etapa b) la enzima o-acetiltransferasa; y d) parar la reacción por adición de metanol a la mezcla obtenida en la etapa c).

En una realización preferida de cualquiera de las anteriores, el gangliósido se selecciona del grupo formado por GD1 b, GD3, GD2 y GT1 b, según se han definido anteriormente. Dichos gangliósidos GD1 b, GD3, GD2 y GT1 b, como se menciona anteriormente, comprenden entre otros elementos, una ceramida (Y) según se definió anteriormente, que a su vez comprende una esfingosina y un ácido graso. La esfingosina es preferentemente de 18 de átomos de carbono con una insaturación o de 20 átomos de carbono con una insaturación. De manera preferente el ácido graso es de 18 átomos de carbono sin ninguna insaturación o con una insaturación.

En una realización preferida de cualquiera de las anteriores, se añade una concentración de gangliósido entre 50 a 600 pmoles/L de reacción, preferentemente entre 300 y 600 pmoles/L y más preferiblemente de 500 moles/L

En otra realización preferida de cualquiera de las anteriores, se añade la solución tampón en una concentración desde 1 hasta 250 mmoles/L de reacción preferiblemente desdel O hasta 100 mM, más preferiblemente a una concentración de 50 mM, a un pH desde 6 a 9, preferiblemente a un pH entre 7 y 8, más preferiblemente a un pH de 7.0. De manera preferida la solución tampón es de TRIS(tris(hidroximetil)aminometano), MES (ácido 2-(N- morfolino)etanosulfonico), fosfato, etc, preferiblemente de MES.

Según una realización preferida se añade a la solución tampón MgC (10 mmoles/L) y DTT (Ditiotreitol) (1 mmoles/L). Según una realización preferida se añade a la solución un tampón y un derivado de la coenzima A seleccionado entre Acetil-Coenzima A, Propionil- Coenzima A y Malonil-Coenzima A, más preferiblemente Acetil-Coenzima A ó Propionil-Coenzima A, a una concentración desde 0.1 a 10 mmoles/L reacción, preferiblemente entre 0,5 y 2 mmoles/L más preferiblemente a 1 mmoles/L.

En otra realización preferida de cualquiera de las anteriores, el emulgente es un ácido biliar o sal biliar a una concentración preferible entre 0,05% y 0,2% peso/volumen total de la reacción, más preferiblemente a 0,1 % en peso/volumen total de la reacción. Es decir, el emulgente es un ácido biliar o sal biliar a una concentración preferible entre 0,05% y 0,2% en peso respecto del volumen total de la reacción, más preferiblemente a 0,1 % en peso respecto del volumen total de la reacción.

De manera preferida, el ácido biliar se selecciona del grupo formado por el ácido cólico, ácido deoxicólico, taurocólico, glicocólico, ursodeosicólico, litocólico, etc como sus sales sódicas y potásicas, (ejemplo: colato, taurocolato, deoxicolato,ursodeoxicolato, glicocolato, etcétera). De manera preferida el emulgente es la sal biliar colato sódico.

El emulgente reduce el micelado de los gangliósidos, aumentando la accesibilidad de los siálicos terminales al enzima O-acetiltransferasa. En otra realización preferida de cualquiera de las anteriores, en la etapa c), se añade la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de entre 2 y 30 pg/μΙ de reacción, preferiblemente entre 15 y 25 pg/μΙ, más preferiblemente a 20 Mg/μΙ- El procedimiento de la presente invención utiliza como catalizador una O- acetiltransferasa obtenida de la bacteria Campylobacterjejunni, cuya clonación, secuenciación y actividad han sido patentadas (WO 2007016792 20070215) y publicadas por Houliston R. et al (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. TheJournal of BiologicalChemistry 2006;281(17):11480-6).

En otra realización preferida de cualquiera de las anteriores, la reacción de la etapa c) se realizó entre 30-40°C, preferiblemente entre 35-38°C, más preferiblemente a una temperatura de 37°C. En otra realización preferida de cualquiera de las anteriores, la reacción de la etapa c) se realizó durante un tiempo de reacción entre 1 hora y 24 horas, preferiblemente entre 5 y 12 horas, más preferiblemente durante 7 horas, y en agitación. Tras parar la reacción con metanol en la etapa d), se llevaron a cabo las siguientes etapas:

- desalar los productos obtenidos tras la etapa d) utilizando un cartucho de fase reversa Sep-Pak C18 (Waters),

- desecar la muestra en vacío (Speed-Vac).

- purificar los diferentes productos por TLC preparativa o HPLC preparativa en una columna amino.

- calcular el peso molecular de los productos mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS).

- caracterización de la posición de las O-acetilaciones u O- propionilaciones mediante secuenciación por espectrometría de masas

"electrospray".

El procedimiento descrito en la presente invención, es un protocolo específico para la O-acetilación de gangliósidos. A diferencia del procedimiento descrito en (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. Identification of a sialate O- acetyltransferase from Campylobacter jejuni: demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminalalpha-2, 8-linked sialic acid. TheJournal of BiologicalChemistry 2006;281(17):11480-6) y en la patente (WO 2007016792), en el procedimiento de la presente invención se añade a la mezcla de reacción un emulgente, que puede ser un ácido biliar o una sal biliar, que en combinación del pHreduce el micelado de los gangliósidos, aumentando la accesibilidad de los siálicos terminales al enzima O-acetiltransferasa.EI pH de la reacción tiene que ser igual o superior a 6,5 para que el colato sódico sea soluble en el tampón y pueda actuar sobre los gangliósidos.

El procedimiento descrito en la presente invención es específico para los siálicos terminales y no para cualquier grupo hidroxilo O-acetilable, como ocurre en los otros procedimientos del estado de la técnica anterior.

Por lo tanto, el número de productos de reacción se reduce, favoreciendo la purificación de los productos. Además, el procedimiento tiene un rendimiento muy superior a los descritos anteriormente. En el caso de la reacción para obtener neurostatina (O-acetilGD1 b) a partir de GD1 b, el rendimiento es del 90%, frente al escaso 10-15% de otros procedimientos descritos en el estado de la técnica anterior. Gracias a este rendimiento, la neurostatina puede considerarse ahora como un producto interesante como antitumoral en pacientes y, por lo tanto, con posible uso comercial.

El procedimiento descrito en la presente invención también permite obtener productos naturales O-acetilados de la familia de la neurostatina, como O- acetil-GD2 y O-acetil-GT1 b, que no han sido descritos en la literatura científica como antitumorales; y otros, como el di-O-acetil-GT1 b, que no han sido descritos ni en la naturaleza, ni como antitumorales. Además de gangliósidos O-acetilados, el procedimiento descrito en la presente invención, puede ser utilizado para preparar gangliósidos O-propionilados y O-malonilados. Tanto los productos O-acetilados, O-propionilados u O-malonilados pueden referirse a los derivados con uno o dos grupos acilo (acetilo, propionilo o malonilo). Estos productos O-propionilados, como O-propionil-GM3, O-propionil-GM2, O- propionil-GD3, O-propionil-GD2, O-propionil-GD1 b, O-propionil-GT1 b y O- propionil-GQ1 b, y sus respectivos O-malonilados nunca han sido descritos en la literatura, ni se encuentran en la naturaleza. Además, estos productos O- propionilados tienen mayor actividad inhibidora de la proliferación de la línea de glioma C6 (Tabla 1 ) y podrían ser más resistentes a la hidrólisis por glicosidasas, por lo que su efecto sería más duradero.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto (en adelante también referido como gangliósido o compuesto de la invención), que presenta la fórmula general (I) de acuerdo a como se definió anteriormente, excepto cuando:

- Z es un grupo de fórmula (Zi), Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (I I I) y X4 es H ;

- Z es un grupo de fórmula (Z1 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (I I);

- Z es un grupo de fórmula (Z1 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (I I I), X4 es el grupo de fórmula (IV) y X 5 es OH ;

- Z es un grupo de fórmula (Z1 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es OH ;

- Z es un grupo de fórmula (Z1 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (I I I), X4 es el grupo de fórmula (V), X 5 es -OH ;

- Z es un grupo de fórmula (Z 2 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es OH ;

- Z es un grupo de fórmula (Z 2 ), X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es un grupo CH 3 , X3 es el grupo de fórmula (I I);

- Z es un grupo de fórmula (Z 2 ), X1 es -CH 2 -OH , X 3 es el grupo de fórmula (I I I), X4 es el grupo de fórmula (IV), X 5 es -O-CO-X6 y ΧΘ es un grupo CH 3 .

En una realización preferida, el compuesto de la invención presenta la fórmula

(la) o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde;

Y es una ceramida,;

Ac es un grupo acetilo;

Xies un grupo -CH2-O-CO-X2

X2 es un grupo alquilo C1-C2;

X3 se selecciona entre H, OH, un compuesto de fórmula general (II) o un compuesto de fórmula general (III)

(II) (III)

X^se selecciona entre H y un compuesto de fórmula general (IV):

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

X 5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -0-COXe; Χβ es un grupo alquilo C1-C2;

excepto cuando:

- Xi es-CH 2 -O-CO-X2, X2 es metilo, X3 es el compuesto de fórmula general (III) y X4 es hidrógeno;

-Xies -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, y X3 es el compuesto (II); y

- Xies -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo,X3 es el compuesto de fórmula general (III) donde X4 es el compuesto de fórmula general (IV) donde X 5 es OH;- X1 es - CH2-O-CO-X2, X 2 es un metilo, X 3 es OH;

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X 2 es metilo, X 3 es OH;

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, X3 es el grupo de fórmula (II);

- Xi es -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, X3 es el grupo de fórmula (III), X4 es el grupo de fórmula (V) y X 5 es OH;

Según una realización preferida, Y es una ceramida que comprende una esfingosina y un ácido graso natural o sintético. De manera preferida la esfingosina comprende de 18 a 20 átomos de carbono y tiene un número de insaturaciones de 0 a 2. De manera preferida el ácido graso comprende de 8 a 24 átomos de carbono y tiene un número de insaturaciones de 0 a 4;

Según otra rea ización preferida, X 2 es un grupo metilo.

Según otra rea ización preferida, X 2 es un grupo etilo.

Según otra rea ización preferida, X 2 es un grupo -CH 2 COOH.

Según otra rea ización preferida, X 3 es H.

Según otra rea ización preferida, X 3 es OH.

Según otra rea ización preferida, X 3 es un grupo de fórmula (II).

Según otra rea ización preferida, X 3 es un compuesto de fórmula general (III)

Según otra rea ización preferida, X4 es H.

Según otra rea ización preferida, X4 es un compuesto de fórmula general (IV)

Según otra rea ización preferida, X4 es un compuesto de fórmula general (V).

Según otra rea ización preferida, X 5 es un grupo OH.

Según otra rea ización preferida, X 5 es un grupo -Ο-COXe.

Según otra realización preferida, Χβ es un metilo. Según otra realización preferida, Χβ es un etilo.

Según otra realización preferida, Χβ es un grupo -CH 2 COOH. Según otra realización preferida los compuestos de la presente invención se seleccionan de la siguiente lista: O-propionil-GD1b, O-propionil-GD3, O- propionil-GD2, A-O-propionil-GT1b, B-O-propionil-GT1b, di-O-propionil-GT1b, B-O-acetil-GT1b, di-O-acetil-GTIb, O-Propionil-GM3, O-Malonil-GM3, O- Propionil-GM2, O-Malonil-GM2, O-Malonil-GD3, O-Malonil-GD2, O-Propionil- GD1a, O-Malonil-GD1a, O-Malonil-GD1b, A-O-Malonil-GT1b, B-O-Malonil- GT1b, di-O-Malonil-GT1b, B-O-Acetil-GQ1b, di-O-Acetil-GQ1b, A-O-Propionil- GQ1b, B-O-Propionil-GQ1b, di-O-Propionil-GQ1b, A-O-Malonil-GQ1b, B-O- Malonil-GQ1b y di-O-Malonil-GQ1b, según se definieron anteriormente en la presente memoria.,

Según otra realización preferida los compuestos de la presente invención se seleccionan de la siguiente lista:

0-propionil-GD3

0-propionil-GD2

0-propionil-GD1b

B-0-acetil-GT1b

di-0-acetil-GT1b

B-0-propionil-GT1 b donde Y es cualquier ceramida, que está compuesta por una esfingosina y un ácido graso. De manera preferida la esfingosina comprende de 18 a 20 átomos de carbono y tiene un número de insaturaciones de 0 a 2. De manera preferida el ácido graso puede contener de 8 a 24 átomos de carbono y con un número de insaturaciones de 0 a 4;

En la presente invención los términos GD1 b, GD3, GD2, GT1 b, GQ1 b, GM3, GM2, GM1 a o GD1 a, hacen referencia a gangliosidos del mismo nombre conocidos en el estado de la técnica por cualquier experto en la materia.

En este mismo sentido estos gangliosidos comprenden entre otros elementos, una ceramida (Y) que a su vez comprende una esfingosina y un ácido graso. La esfingosina es preferentemente de 18 de átomos de carbono con una insaturación o de 20 átomos de carbono con una insaturación. De manera preferente el ácido graso es de 18 átomos de carbono sin ninguna insaturación o con una insaturación. Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto sintetizado según el procedimiento de la invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al compuesto de fórmula general (I) para su uso como medicamento.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos al compuesto de fórmula general (I), o un compuesto de fórmula (la), y al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

En una realización preferida, la composición farmacéutica además comprende otro principio activo.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del gangliósido de fórmula general (I), o un gangliósido de fórmula (la), o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde;Y, Ac, Xi, X2, X3, X4, X5 y ΧΘ se definen como se definieron anteriormente para la elaboración de un medicamento.

Una realización preferida se refiere al uso para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de tumores, preferiblemente para el tratamiento o prevención de astrocitomas, glioblastomas, oligodendrogliomas, neuroblastomas o meningiomas.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del gangliósido de fórmula general (I), o del gangliósido de fórmula (la), o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde: Y, Ac, X1 , X2, X3, X4, X5 y ΧΘ se definen como se definieron anteriormente, como reactivo en ensayos biológicos. El compuesto descrito en la presente invención, sus sales, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas, cosméticas y nutricionales que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende el compuesto anteriormente descrito, o una sal, profármaco o solvato del mismo.

En una realización preferida de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinilpirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio.

Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por los métodos convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes.

Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia. La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, intraperitoneal o intravenosa. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar.

La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a3 átomos de carbono o de 1 a 2 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 2 átomos de carbono o preferiblemente el grupo alquilo es un metilo. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo,azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, éster carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido.alcóxido, tiol, amino, acilamino, ciano, carboxilato, carboxamida, carboxiéster, arilo o heteroarilo o combinaciones de estos grupos. Cuando el grupo alquilo está sustituido, lo está preferentemente por uno o varios grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A) Preparación de Neurostatina (0-acetil-GD1 b),

A una solución del gangliósido GD1 b (400 g) en tampón MES (ácido 2- morfolinoetanosulfónico), 50 mM, pH=7.0, se añadió MgC (10 mM), DTT (1 mM), Acetil-Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió el enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μΙ, en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (600 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol .

La reacción de O-acetilación de GD1 b dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina (TLC) fue diferente a GD1 b. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDI TOF-MS) y Electrospray se caracterizó como Neurostatina, por presentar una única O-acetilación en el siálico terminal. El rendimiento de la reacción fue del 90%.

B) Preparación de 0-acetil-GT1 b y di-0-acetil-GT1 b

El gangliósido GT1 b (1000 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- morfolino etanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgC^ O O mM), DTT (1 mM), Acetil-Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg/μ\ en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol .

La reacción de O-acetilación de GT1 b dio lugar a dos productos de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GT1 b. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrospray el compuesto de mayor movilidad en cromatografía en capa fina presentó 2 O- acetilaciones, cada una en uno de los dos siálicos terminales y fue denominado di-O-acetil-GT1 b. El segundo producto presentó una sola O-acetilación. La caracterización de este compuesto dio lugar a dos especies: el compuesto denominado A-O-acetil-GT1 b, que presenta la O-acetilación en el siálico terminal que se encuentra unido a otro siálico; y el compuesto denominado B- O-acetil-GT1 b que se encuentra mono O-acetilado en el siálico no unido a otro siálico. El rendimiento de la reacción fue del 60% para las especies mono-O- acetiladas y del 20% para la especie di-O-acetilada.

C) Preparación de 0-propionil-GD1 b

El gangliósido GD1 b (400 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- morfolinoetanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgC^ CI O mM), DTT (1 mM), Propionil-Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μΙ en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (600 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol . La reacción de O-propionilación de GD1 b dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GD1 b. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrosprayse caracterizó como un derivado mono O-propionilado en el siálico terminal que denominamos O-propionil-GD1 b. El rendimiento de la reacción fue del 10%.

D) Preparación de 0-propionil-GT1 b

Siguiendo el mismo procedimiento que para el O-propionil-GD1 b, pero partiendo del gangliósido GT1 b se obtuvo un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía de capa fina (TLC) fue diferente a la de GT1 b. Dicho producto fue caracterizado mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y Electrospray, como el gangliósido GT1 b con una O- propionilación en el siálico terminal que se encuentra unido a otro siálico y fue denominado O-propionil-GT1 b. El rendimiento de la reacción fue del 20%.

E) Actividad inhibitoria de los compuestos obtenidos anteriormente La actividad inhibitoria de la división de células tumorales de los gangliósidos y sus derivados O-acetilados y O-propionilados obtenidos fue determinada mediante en ensayo MTT que mide la actividad mitocondrial, en cultivos de la línea tumoral C6 (glioma de rata) durante 48 horas de tratamiento, utilizando 10 ng/ml de FGF básico como mitógeno

Tabla 1 . Inhibición de la división en células C6 (48 h) en valores promedio de ID 50 (nM).EI símbolo "-"indica que el compuesto inhibió débilmente la proliferación a la concentración máxima ensayada (4 μΜ), pero no lo suficiente como para calcular el valor de su ID 5 o- En la tabla 1 presentamos la actividad de los gangliósidos GD1 b, GT1 b, y sus derivados modificados. El gangliósido GD1 b no tiene actividad inhibitoria de la proliferación de la línea de glioma C6. Mientras que los compuestos derivados de GD1 b, Neurostatina (O-acetil-GD1 b), y el O-propionil-GD1 b presentan actividad en el rango nanomolar. El gangliósido O-propionil-GD1 b es ligeramente más activo que la Neurostatina.

El gangliósido GT1 b tiene una actividad inhibidora de la proliferación. El compuesto O-acetil-GT1 b mejora casi al doble su actividad inhibidora respecto al GT1 b. Cuando el gangliósido GT1 b se modifica con dos O-acetilaciones (di- O-acetil-GT1 b) también mejora su actividad al doble respecto al O-acetil-GT1 b y 4 veces respecto al GT1 b. La adición de O-acetilos al gangliósido GT1 b aumenta progresivamente su actividad inhibidora de la proliferación en las células C6.

Los gangliósidos O-propionilados tienen mayor actividad inhibitoria (O- propionil-GD1 b y O-propionil-GT1 b) que sus respectivos gangliósidos mono-O- acetilados (O-acetil-GD1 b y O-acetil-GT1 b). Estos compuestos O-propionilados podrían ser más resistentes a la hidrólisis por glicosidasas, por lo que su efecto sería más duradero.

F) Preparación de 0-malonil-GD1 b El gangliósido GD1 b (400 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- moríolino etanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgCI 2 (10 mM), DTT (1 mM), Malonil- Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μl en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol.

La reacción de O-malonilación de GD1 b dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GD1 b. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrospray se caracterizó como un derivado mono O-malonilado en el siálico terminal que denominamos O-malonil-GD1 b. El rendimiento de la reacción fue del 5%. G) Preparación de 0-acetil-GM3

El gangliósido GM3 (1000 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- moríolino etanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgCI 2 (10 mM), DTT (1 mM), Acetil- Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μl en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol. La reacción de O-acetilación de GM3 dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GM3. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrospray se caracterizó como un derivado mono O-acetilado en el siálico que denominamos O-acetil-GM3. El rendimiento de la reacción fue del 90%.

H) Preparación de 0-acetil-GD3 El gangliósido GD3 (400 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- morfolino etanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgCI 2 (10 mM), DTT (1 mM), Acetil- Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μl en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol.

La reacción de O-acetilación de GD3 dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GD3. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrospray se caracterizó como un derivado mono O-acetilado en el siálico terminal que denominamos O-acetil-GD3. El rendimiento de la reacción fue del 80%.

I) Preparación de 0-acetil-GD1a

El gangliósido GD1 a (1000 g) en un tampón 50 mM de MES (ácido 2- morfolino etanosulfónico) pH=7.0, al que se añadió MgC^ CI O mM), DTT (1 mM), Acetil-Coenzima A (1 mM) y 0.1 % en peso/volumen de colato sódico. Finalmente, se añadió la enzima O-acetiltransferasa a una concentración de 20 μg μl en un volumen de reacción total de 432 μΙ. La reacción se realizó a 37°C durante 7 horas con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo por adición de metanol.

La reacción de O-acetilación de GD1 a dio lugar a un producto de reacción cuya movilidad en cromatografía en capa fina fue diferente a la de GD1 a. Mediante espectrometría de tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y electrospray se caracterizó como un derivado mono O-acetilado en el siálico unido en enlace alpha(2-3) al radical galactosa-N-acetil-galactosamina que denominamos O- acetil-GD1 a. El rendimiento de la reacción fue del 70%.