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Patent Searching and Data


Title:
GEL CONTAINING FIBRINE AND ANTIBIOTIC FOR TREATING INFECTED BONES AND PREPARATION PROCESS THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1981/000516
Kind Code:
A1
Abstract:
A gel based on fibrine and antibiotic for the treatment of an infected bone contains fibrinogene, a solution containing thrombin and enriched with calcium ions as well as an antibiotic of the tobramycin, gentiamycin group and/or one of their physiologically acceptable salts. The gel may be prepared by mixing the fibrinogene in the form of a lyophilisate or cryoprecipitate with an antibiotic in sterile conditions and then adding a thrombin solution enriched with calcium ions.

Inventors:
BRAUN A (DE)
Application Number:
PCT/EP1980/000083
Publication Date:
March 05, 1981
Filing Date:
August 27, 1980
Export Citation:
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Assignee:
MERCK PATENT GMBH (DE)
BRAUN A (DE)
International Classes:
A61K9/00; A61K9/14; A61K31/21; A61K31/70; A61L24/00; A61L26/00; A61L27/22; A61L27/52; A61F2/00; (IPC1-7): A61K9/18; A61K31/71; A61L15/06
Foreign References:
DE2651441A11978-05-24
DE2511122A11976-09-23
US2385802A1945-10-02
DE2852319A11979-06-07
US3723244A1973-03-27
Other References:
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 72, Nummer 23, 8. Juni 1970 (Columbus, Ohio, USA) M. POP, "Experimental covering of the dental pulp in the dog with biological substances" siehe Seite 209, Spalte 1, Zusammenfassung 119944n, Stomatologia 1969, 16(5) 397-403(Rom) siehe die Zusammenfassung.
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 85, Nummer 24, 13. Dezember 1976 (Columbus, Ohio, USA) I. SUGIE, "The chemical modification of fibrin film as artificial skin", siehe Seite 318, Spalte 1, Zusammenfassung 182381k, Aichi Ika Daigaku Igakukai Zasshi 1976, 4(3) 183-192(Japan) siehe die Zusammenfassung.
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 80, Nummer 13, 1. April 1974 (Columbus, Ohio, USA) JP, A, 73 80 779, Mihama Hisaharu siehe Seite 114, Spalte 2, Zusammenfassung 67835w, siehe die Zusammenfassung.
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Claims:
Patentansprüche:
1. FibrinAntibiotikumGel zur Behandlung des infizier¬ ten Knochens mit einem Gehalt an Fibrinogen, einer mit CalciumIonen angereicherten thrombinhaltigen Lösung und einem Antibiotikum aus der Gruppe der Aminoglyko side, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antibiotikum Tobram cin, Gentamycin und/oder eines ihrer physio¬ logisch unbedenklichen Salze enthält.
2. Verfahren zur Herstellung des Gels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein humanes Fibrinogen in Form eines Kryopräzipitats oder eines Lyophilisats mit_ dem Antibiotikum unter sterilen Bedingungen ver 'mischt und dann eine mit CalciumIonen angereicherte thrombinhaltige Lösung zusetzt. O FI ,, WIPO .
Description:
Fibri -Antibiotikum-Gel zur Behandlung des infizierten Knochens und Verfahren zu. seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Fibrin-Antibiotikum-Gel zur Behandlung des infizierten, insbesondere staphylokokken- infizierten Knochens und ein Verfahren zu seiner Herstellung. -_. • Es ist bekannt, Antibiotika zu Polymethylmethacrylat ("PMMA"; Knochenzement) für die lokale Therapie von Knocheninfektio¬ nen zuzumischen. Insbesondere eignet sich die Mischung von Gentamycin mit PMMA in Form von Gentamycin-PMMA-Kugelketten gut für die lokale antibakterielle Chemotherapie von Knochen- und Weichteilinfektionen.

Da die implantierten Kugeln Fremdkörper darstellen, müssen sie wieder entfernt werden. Dies kann z.B. geschehen, indem man die letzte Kugel durch den Hautverschluß herausragen läßt und daran dann die ganze Kette nach zehn bis vierzehn Tagen herauszieht. Die Entfernung der Kugeln ist jedoch insgesamt ein für den Patienten belastender und daher un¬ erwünschter Eingriff.

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Man hat bereits versucht, die Nachteile bei der Verwen¬ dung von PMMA-Kugelketten auszuschalten und die Möglich¬ keit eines einfacheren Behandlungsweges aufzuzeigen.

So ist es z.B. bekannt (vgl. Bosch et al. , Archiv für orthopädische und Unfall-Chirurgie, Band 90 (1977) , Seiten 63 - 75) , in Verbindung mit Knochentransplantaten zur Auffüllung von Knochendefekten ein Fibrinklebesystem anzuwenden, wobei das Fibrin erst am Ort der Wahl, also unmittelbar in der Knochenhöhle durch den Zusatz von Thrombin zu einer Fibrinogenlösung gebildet wird. Dabei wurden bei Bedarf auch handelsübliche Kombinationsprä- parate des Neo ycins in Pulverform zugesetzt.

Es wurde nun gefunden, daß überraschenderweise zwei be¬ stimmte Antibiotika, nämlich Tobramycin und Gentamycin sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze, mit Fibri ein F ' ibrin-Antibiotikum-Gel bilden, das außergewöhnlich gut zur Behandlung des infizierten Knochens geeignet und außerordentlich wirksam ist. Dabei ist es nicht erfor¬ derlich, dieses Fibrin-Antibiotikum-Gel -erst im Körper (unmittelbar in der Knochenhöhle) herzustellen; die Be¬ standteile werden vielmehr zweckmäßig extrakorporal ge¬ mischt. Dabei ist es möglich, den Gerinnungsvorgang des Fibrins zeitlich zu steuern, indem man die Konzentration des Thrombins variiert.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Fibrin- Antibiotikum-Gel zur Behandlung des infizierten Knochens mit einem Gehalt an Fibrinogen, einer mit Calci m-Ionen angereicherten thrombinhaltigen Lösung und einem Anti¬ biotikum aus der Gruppe der Aminoglykoside, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß es als Antibiotikum Tobramyci , .Genta ¬ mycin und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze enthält.

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Als physiologisch unbedenkliche Salze eignen sich ins¬ besondere die Sulfate. Alle Bestandteile des Gels wer¬ den zweckmäßig in Form üblicher Handelspräparate ver¬ wendet.

So verwendet man z.B. humanes Fibrinogen in Form eines Kryopräzipitats, das etwa 90 mg thrombinfällbares Protein enthält, oder als Lyophilisat (z.B. aus menschlichem Blut von gepooltem Spenderplasma gewonnen) .

Die thrombinhaltige Lösung wird zweckmäßig hergestellt, indem man Thrombin (z.B. in Form eines Pulvers) in einer wässerigen Calciumchlorid-Lösung auflöst. Die Konzen¬ tration an Calciumchlorid ist vorzugsweise etwa 30 bis 50, insbesondere 40, mMol/1. Die Konzentration des Throm- bins liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 500 NIH-Einheiten/ml.

Das Antibiotikum wird zweckmäßig in einer auf das Körper¬ gewicht bezogenen Menge eingesetzt, wobei die Tages- höchstdosis beachtet werden sollte. Die Konzentration •des Antibiotikums in dem erfindungsgemäßen Gel liegt vor¬ zugsweise zwischen etwa 1 und etwa 10, insbesondere zwi¬ schen 2 und 5 Gewichtsprozent.

Die Herstellung des Gels kann dadurch erfolgen, daß man Fibrinogen mit einem Antibiotikum (beispielsweise To- bramycinsulfat oder Gentamycinsulfat, jeweils etwa 5 mg/kg Körpergewicht) unter sterilen Bedingungen vermischt und dann die mit Calcium-Ionen angereicherte thrombinhaltige Lösung zur Polymerisation des Fibrinogens zu Fibrin zu¬ setzt. Bevorzugt wird das Gel extrakorporal hergestellt, also vor der eigentlichen Anwendung in der Knochenhöhle.

Die Gerinnungszeit hängt von der Thrombin-Konzentration ab. So kann man die plastische Verformbarkeit des ent¬ stehenden Gerinnsels für die Dauer von 1/2 bis 1 Minute aufrechterhalten, wenn man eine Thrombin-Konzentration von etwa 150 NIH-Einheiten pro ml verwendet.

Die Fließeigenschaften des Gels werden durch niedrigere Thrombinkonzentration (10-15 NIH-Einheiten/ l). wesent¬ lich länger aufrechterhalten (etwa bis zu 3 Minuten) . Die Fibringerinnung wird dadurch verlangsamt, die Rei߬ festigkeit des Polymerisats eher erhöht.

Das Fibrin-Antibiotikum-Gel mit primärer Spongiosaplastik beherrscht nicht nur den Infekt, sondern verbessert auch die osteogenetische Potenz des biologischen Implantates.

Es ist natürlich möglich, auch infektgefährdete Knochen, z.B. nach offenen Frakturen, zur Infektionsverhütung mit dem ir'ibrin-Antibiotikum-Gel zu behandeln. Dabei wird ein hoher lokaler Wirkstoff-Spiegel durch das Antibiotikum erzielt.

Beispiel 1

I. Versuchstiere

Als Versuchstiere wurden 60 Kaninchen der Rasse "Weiße Neuseeländer" gewählt. Davon waren 22 weib¬ liche und 38 männliche Tiere. Das durchschnittliche Körpergewicht betrug 4130 g.

I. Versuchsplanung

30 Versuchstiere wurden nach Randomisierung der Be¬ handlung mit dem Fibrin-Antibiotikum-Gel unterworfen (Gruppe A) . Die restlichen 30 Versuchstiere dienten

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als Kontrollgruppe und wurden nur mit Fibrin behan¬ delt. (Gruppe B) . In beiden Gruppen war der Knochen mit Staphylococcus aureus kontaminiert. Am 7. post¬ operativen Tag wurden die Tiere getötet und die Be¬ funde makroskopisch, bakteriologisch und histomorpho- logisch unterwucht.

III. Herstellung des Fibrin-Antibiotikum-Gels

1. Fibrinkleber

Fibrinkleber (Handelspräparat) wird durch Kälte- präzipitation aus humanem Spenderplasma hergestellt. Zum Aufbewahren wird das Fertigpräparat tiefgefro¬ ren und bei -18°C oder kälter gelagert. 1 ml der Lösung- enthält durchschnittlich 90 mg thrombinfäll¬ bares Protein. Der Gesamteiweißgehalt der Lösung beträgt etwa 10 %. Neben dem fällbaren Fibrinogen enthält 1 ml Fibrinkleber 5 - 12 % kälteunlδsliche Globuline, maximal 5 % Albumin und etwa 10 Einheiten Faktor XIII, sowie Spuren von Plasminogen und Ge- rinnungsfaktoren des Intrinsic-Systems. Das kälte¬ konservierte humane Fibrinogen wird etwa 20 - 30 Minuten vor der geplanten Verwendung bei Zimmer¬ temperatur aufgetaut. Die Viskosität des Präparats sinkt mit steigender Temperatur. Die Lagerung bei Zimmertemperatur über 4 Stunden bedingt eine Akti¬ vierung der Gerinnungsfaktoren einerseits (Koagula¬ tion) sowie des Plasminogens andererseits. Das auf¬ getaut solartige humane Fibrinogen steht in einer Fertigspritze zur Verfügung. 0,25 ml pro Versuchs¬ tier werden zur weiteren Verarbeitung auf eine Petrischale gegeben.

2. Tobramycinhaltige Lösung

15 mg Tobramycinsulfat-Trockensubstanz pro Ver¬ suchstier werden in 0,1 ml destilliertem Wasser aufgelöst und mit 0,25 ml Fibrinkleber gut ver¬ mischt.

3. Mit Calciumionen angereicherte, thrombinhaltige Lösung

Man löst 3000 NIH-Einheiten Thrombin-Trockensub¬ stanz (Handelspräparat) in 20 ml einer wässerigen Calciumchloridlösung, die 35 mMol/1 CaCl 2 ent¬ hält.

IV. Operative Technik

Als Prämedikation zur Anästhesie wurde intramusculär 0,2 mg Atropinsulfat sowie 0,5 ml/kg Xylazin gespritzt. Für den operativen Eingriff am Knochen konnte mit ^0 mg/ g Ketamm rür etwa " inuten e ne ausreicnen- de Anästhesie erreicht werden.

Nach sterilem Abdecken des rasierten Kniegelenkes wurde von lateral die distale Femurmetaphyse darge¬ stellt. Mit Bohrer und Fräse wurde durch -eine Schablo¬ ne die Corticalis auf 4 x 8 mm perforiert und spongioser Knochen herausgefräst, so daß sich der Defekt mit ca. 0,5 ml auffüllen ließ. Der Markraum wurde zur Blutstil¬ lung mit Knochenwachs tamponiert. Ein 4 4 1 mm großes Kollagenvlies wurde mit 0,05 ml Staphylokokken- suspension beimpft und die Knochenhöhle damit kontaminier Das entspricht einer Keimdichte von 0,5 - 2 x 10 kolo¬ nienbildenden Einheiten. Der Verschluß des Knochende¬ fektes erfolgte nach Randomisierung in Gruppe A mit dem Fibrin-Antibiotikum-Gel und in Gruppe B mit Fibrin. Bei guter plastischer Verformbarkeit während der Polymeri¬ sation wurde in Gruppe A die distale Femurmetaphyse.mit

0,45 ml Fibrin-Antibiotikum-Gel aufgefüllt und das Fibringerinnsel über dem Corticalisfenster für 2 Mi¬ nuten manuell komprimiert. In der Gruppe B (Kontroll¬ gruppe) wurde 0,1 ml tobra ycinhaltige Lösung durch 0,1 ml destilliertes Wasser ersetzt, so daß 0,25 ml Fibrinogen durch 0,2 ml thrombinhaltige Lösung zur Gerinnung gebracht wurden.

Bakteriologische Methodik

Als Testkeim wurde ein aus einem Wundabstrich der Orthopädischen Universitätsklinik Heidelberg isolier¬ ter, koagulase-positiver, tobramycinempfindlicher (MHK < 0,125 cg/ml) Staphylococcus aureus verwendet Zur Herstellung der angewendeten Bakteriensuspension wurde der Stamm auf Trypticase Soy Agar (BBL) über 18 - 24 Stunden bei 37°C angezüchtet, mit steriler physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und die Bakterienabschwem ung durch Trübungsvergleich (Röhrchen Nr. 1 der Bariumsulfat-Trübungsreihe nach

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McFarland) auf eine Keimdichte von ca. 3 x 10 Keime/ml eingestellt. Die genaue Bestimmung der Keimzahl (kolonienbildende Einheiten) der Suspen¬ sion erfolgte im Plattengußverfahren zum Zeitpunkt der Anwendung am Tier. Als Keimzähllager wurde ein Nähragar folgender Zusammensetzung verwendet (jeweils Gramm pro 1000 ml Wasser) :

Fleischextrakt 3, Witte Pepton 5 , Natriumchlorid 5, Agar 12; pH 7,2. -

Zur Auswertung wurden mit sterilen Wattetupfern Abstriche aus Markraum und extraarticulärem Gewebe abgenommen und jeweils in 0,2 %iger Traubenzucker¬ nährbouillon und auf Agarplatten (10 % Hammelblut-

zusatz ) angelegt. Nach einer Bebrütungszeit von 18 - 24 Stunden bei 37 C wurden die Nährmedien auf Wachs¬ tum überprüft und bei fehlender Trübung bzw. Kolonien¬ bildung für weitere 24 Stunden inkubiert. Als steril wurde das Material bezeichnet, .wenn sich bis zu diesem Zeitpunkt kein Wachstum gezeigt hatte. Die angewachse¬ nen Staphylokokken wurden durch das mikroskopische Präparat, Form und Farbe der Kolonien, Hämolysever- ögen und Nachweis der gebundenen Koagulase (clumping- factor) identifiziert.

VI. Histologische Technik

Die bei der Sektion der Versuchstiere entnommenen Knochenstücke wurden in 4%igem, neutralem, gepuffer¬ tem Formalin fixiert und anschließend schonend ent¬ kalkt. Die Entkalkungslösung bestand aus 200 g Äthy- lendia intetraessigsäure-Tetranatriumsalz, mit Wasser - auf 1000 ml aufgefüllt und mit Citronensäure auf pH 7,0 - 7,2 eingestellt. Nach der Entkalkung wurden die Proben in üblicher Weise in Paraffin eingebettet. 3 - 5 u dicke Schichten wurden mit Hämatoxylin-Eosin, van Gieson, Di PAS, Giemsa, Ladewig und nach der Weiger 'sehen Darstellungsmethode von Fibrin gefärbt.

Ergebnisse

Die Versuchstiere wurden am 7. postoperativen Tag getötet und die Befunde makroskopisch, bakteriologisch und histo- morphologisch ausgewertet. Von den Tieren der Kontroll¬ gruppe B verstarben 15 zwischen dem 2. und 7. Tag an einer Sepsis. Die Abnahme des Körpergewichtes betrug bei die¬ ser Gruppe durchschnittlich 530 g. Bei den mit Fibrin- Tobramycin behandelten Kaninchen (Gruppe A) verstarb kein Tier an den Folgen einer Infektion. Das Körpergewicht hatte nur durchschnittlich um 136 g abgenommen.

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Makroskopischer Befund

In der Gruppe A ergab der makroskopische Befund von Knochen und Weichteilgewebe bei 22 Versuchs¬ tieren in situ keine Zeichen einer eitrigen Ent¬ zündung. Bei 6 Tieren war der Befund fraglich; nur in 2 Fällen mußte mit Sicherheit eine phlegmonöse Entzündung angenommen werden. Der Knochen zeigte beim S gen eine feste Konsistenz. Fibrinreste des Verbundes waren in den meisten Fällen noch gut nachzuweisen, jedoch hämorrhagisch infiltriert. Alle Tiere der Kontrollgruppe B zeigten die klassi¬ schen Sympitome einer eitrigen Entzündung. In eini¬ gen Fällen entleerte sich bereits spontan Eiter aus der dehiszent gewordenen Wunde. Im periarti- culären Weichteilgewebe des Kniegelenkes ließ sich in allen Fällen eine ausgeprägte eitrige, stellen¬ weise abszedierende, stellenweise phlegmonöse Ent¬ zündung nachweisen. Der Knochen war bei 7 Tieren in Höhe des Corticalisfensters spontan frakturiert. Weiches, atrophisches Knochengewebe war beim Er¬ öffnen des Markraumes mit der oszillierenden Säge offensichtlich. In der distalen Femurmetaphyse zeigte sich eine entzündlich destruierende Mark- raumphlegmone. Fibrinreste des Verbundes waren teilweise noch nachzuweisen und ebenfalls hämorrha¬ gisch infiltriert.

Bakteriologischer Befund

Bei allen Tieren wurde aus dem Operationsgebiet sowohl im periarticulären Weichteilgewebe als auch im distalen Fe ur intramedullär ein Abstrich zur bakteriologischen Untersuchung entnommen. Von den 30 Kaninchen der Gruppe A waren die Abstriche bei 27 Tieren steril und bei 3 Tieren infiziert. Dabei

ließen sich einmal subkutan, einmal intraossär und einmal subkutan und intraossär Staphylokokken nachweisen. Von den 30 Tieren der Kontrollgruppe (Gruppe B) waren alle " Abstriche staphylokokkenin- fiziert. Die Ergebnisse der bakteriologischen Un¬ tersuchung lassen sich zu einer Vierfeldertafel zusammenfassen. Die Auswertung nach dem modifizier-

2 ten. x -Test der Geigy-Tabellen S. 192 (1973) ergab

2 x = 59,64. Die Signifikanzschranke liegt bei der festgelegten Signifikanzwahrscheinlichkeit (P = 0,01) bei x = 6,635. Damit unterscheiden • sich Testgruppe und Kontrollgruppe hinsichtlich des Behandlungsverfahrens mit einer Irrtumswahr¬ scheinlichkeit von höchstens 1 %. Die lokale Tobra- mycinanwendung im Fibrin-Antibiotikum-Gel ist nach dieser statistischen Aussage als außergewöhnlich wirksam anzusehen.

in. H-is- ologischer Befand

Die feingewebliche Untersuchung ergab bei allen Tieren im operierten Bereich eine unspezifische Entzündung. Entsprechend der Wahl des Erregers handelte es sich um eine eitrige Entzündung, die allerdings in verschiedenen Schweregraden auftrat. So bestand bei den Tieren der Gruppe A im Mittel eine weit weniger schwere Entzündung. Typischerweise ließ sich in dieser Gruppe ein ausgedehnter Fibrin¬ rest nachweisen. Um ihn " herum hatte sich bereits ein Granulationsgewebe entwickelt, das auch von Granulozyten und einigen Makrophagen durchsetzt war. In einigen Fällen ließen sich neugebildete Knochen- bälkchen aus geflechtartigem Knochen nachweisen. In der Regel war der infizierte Bezirk durch dieses Gra¬ nulationsgewebe umschlossen, die distale Epiphysen-

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fuge unversehrt, so daß insgesamt von einem lokali¬ sierten osteomyelitischen Prozess gesprochen werden konnte. Das Ausmaß der zelligen Infiltration wech¬ selte, benachbarte Knochen- und Weichteilstrukturen wurden nur in Einzelfällen in den Entzündungs- prozess mit einbezogen. In diesen Fällen war auch der Erregernachweis noch positiv. Im Gegensatz da¬ zu ließ sich bei der nur mit Fibrin behandelten Gruppe B in der Regel weniger Fibrin nachweisen. Es bestand eine schwere eitrige, vielfach nekroti- sierende Osteomyelitis, die in zahlreichen Fällen die distale Epiphysenfuge zerstörte, auf die Epi- physe übergriff und die umgebenden Weichteile mit einbezog. Auch nach proximal schritt der Prozess vielfach fort. Sowohl Kompakta als auch verbliebene Spongiosa zeigten ausgedehnte Nekrosen im Sinne von Sequestrierungen. Heilungs orgänge im Sinne einer einsetzenden Knochenneubildung konnten in keinem j.'a±J.e nacngewiesen werden, während also bei lokal antibiotisch behandelten Versuchstieren die Entzün¬ dung in der Regel auf die Eintrittspforte beschränkt blieb und stellenweise bereits eine Knochenneubildung nach der kurzen Versuchsdauer beobachtet werden konn¬ te, führte in den nur mit Fibrin behandelten Tieren der virulente Erreger zu einer sich vielfach unge¬ hemmt ausbreitenden phlegmonös-nekrotisierenden Osteo¬ myelitis. Das histologische Bild spricht dafür, daß das Antibiotikum aus dem Matrixmaterial in die Um¬ gebung übertritt und offensichtlich auf den Erreger wirksam wird.

Beispiel 2

Man arbeitet analog Beispiel 1 , ersetzt jedoch das Tobra- mycinsulfat durch 15 mg Gentamycinsulfat und erhält ver¬ gleichbare Ergebnisse.

Beispiel 3

Applikations-Set

Der Applikations-Set enthält folgende EinzelbestandteiLe:

(a) Calciumchlorid-Lösung 40 mMol/1 2 ml

(b) Thrombin, lyophilisiert 300 NIH-Einheit

(c) Tobramycinsulfat 350 mg

Man löst (c) in 2 ml destilliertem Wasser, mischt diese Lösung mit 4 ml aufgetautem ca. 9 %igem Fibrinogen- Kryopräzipitat und vereinigt das Gemisch kurz vor der Anwendung mit einer frisch bereiteten Lösung von (b) in (a) .

Beispiel 4

Applikations-Set

Der Applikations-Set enthält folgende Einzelbestandteile:

(a) Calciumchlorid-Lösung 40 mMol/1 4 ml

(b) Thrombin, lyophilisiert 600 NIH-Einheit

(c) Gentamycinsulfat 600 mg

(d) Fibrinogen, lyophilisiert 800 mg

Man löst (c) in 4 ml destilliertem Wasser, mischt diese Lösung mit einer Lösung von (d) in 8 ml destilliertem Wasser und gibt kurz vor der Anwendung eine frisch be¬ reitete Lösung von (b) in. (a) hinzu.

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