ENDOMETRIAL

Sector de Ia técnica

La presente invención se refiere a Ia determinación de Ia receptividad del endometrio humano a partir de un perfil de expresión génica. Más concretamente, consiste en Ia elaboración de un microarray de expresión específico de receptividad endometrial (ERA o Endometrial Receptivity Array) que permita evaluar el estado receptivo de un endometrio humano, así como valorar el estado del endometrio con fines diagnósticos y terapéuticos.

Estado de Ia técnica

El endometrio es Ia mucosa que recubre el interior de Ia cavidad uterina. Su función es Ia de alojar al embrión, permitiendo su implantación y favoreciendo el desarrollo de Ia placenta. Este proceso requiere de un endometrio receptivo capaz de responder a las señales del blastocito que es el estadio de desarrollo en el que se encuentra el embrión cuando implanta. El endometrio humano es un tejido regulado hormonalmente de forma cíclica, las hormonas que Io preparan para alcanzar dicho estado de receptividad son el estradiol que induce Ia proliferación celular y Ia progesterona que está implicada en Ia diferenciación, provocando un gran número de cambios en el perfil de expresión génica del endometrio que alcanza un fenotipo receptivo durante un corto periodo de tiempo llamado ^" ventana de implantación ^" . Aunque no hay total acuerdo sobre el periodo de implantación en los humanos, los estudios clínicos sugieren que este proceso tiene lugar entre los días 20 y 24 de un ciclo ovulatorio normal (Wilcox y cois., 1999), considerándose crítico el día LH+7 (día 20-21).

La evolución de nuestro conocimiento sobre el endometrio humano contrasta con Ia ausencia de progreso en el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos para su datación y estudio. En Ia actualidad, Ia valoración del endometrio todavía se realiza por medio de estudios histológicos basados en observaciones descritas hace más de 50 años (Noyes y cois., 1950) o con técnicas macroscópicas y poco resolutivas como estudios ecográficos igualmente poco objetivos, faltos de concreción y que producen resultados con grandes variaciones.

En 1950, Noyes y colaboradores describieron por primera vez, un método de datación endometrial basado exclusivamente en criterios histológicos y en los cambios morfológicos de los distintos compartimentos del endometrio en respuesta a Ia presencia de estrógenos y progesterona. Noyes y sus colaboradores examinaron los rasgos histológicos de biopsias endometriales tomadas durante 8.000 ciclos espontáneos en 300 mujeres (Noyes y cois., 1950; 1953). Fueron capaces de relacionar distintos patrones histológicos con momentos particulares del ciclo menstrual correlacionando los cambios histológicos con Ia temperatura corporal basal. Estos criterios morfológicos siguen siendo usados hoy en día y se consideran como el "GoId Standard' para el estudio del endometrio, evaluación de Ia receptividad endometrial y detección de anomalías endometriales.

Sin embargo, esta técnica no está exenta de inconvenientes. Se demuestra que el uso de las características histológicas falla a Ia hora de distinguir Ia fase del ciclo menstrual, así como forma de discriminar entre mujeres fértiles e infértiles, concluyéndose que no es útil para su uso clínico. La subjetividad que supone Ia observación visual hace que exista una variabilidad interobservador, intraobservador e interciclo que alteran Ia consistencia de los resultados obtenidos. Además, Ia estimulación ovárica propia de los tratamientos de reproducción asistida (TRA) produce modificaciones en el proceso de maduración endometrial comparado con ciclos naturales que difícilmente pueden ser explicados con los criterios de Noyes (Papanikolaou y cois., 2005). Es por esto, que existe en Ia literatura muchos trabajos que cuestionan las observaciones histológicas interpretadas por uno o varios patólogos, tanto en estudios clínicos retrospectivos (Balash y cois., 1992; Batista y cois., 1993; Shoupe y cois., 1989), prospectivos (Li y cois., 1989; Creus y cois., 2002; Ordi y cois., 2003), así como recientemente en estudios aleatorios (Murray y cois., 2004; Coutifaris y cois., 2004). Asimismo, el comité práctico de Ia Sociedad Americana de Medicina Reproductiva (ASRM) establece que aunque el criterio clásico del defecto de Ia fase lútea consiste en un retraso en Ia maduración endometrial de >2 días siguiendo los criterios de Noyes, este comité tiene serias dudas sobre Ia exactitud de dichos criterios histológicos y por Io tanto de Ia prevalencia del defecto de Ia fase lútea (DFL) e incluso de su relevancia clínica como causa de infertilidad (ASRM, 2000).

En este sentido, Balasch y cois., demostraron que Ia incidencia de DFL y los patrones endometriales histológicos eran similares en mujeres fértiles e ¡nfértiles. Más aún, una histología endometrial adecuada en el ciclo de Ia ovulación o en los anteriores no estaba relacionada con los datos de embarazo en mujeres infértiles concluyendo que Ia evaluación histológica del endometrio en Ia fase lútea no resulta útil para predecir o mejorar los resultados reproductivos (Balasch y cois., 1992). En otros estudios del mismo grupo se demostró Ia existencia de una clara disociación en Ia expresión temporal de una serie de marcadores relacionados con Ia ventana de implantación (integrinas alpha y beta 3) y Ia expresión de pinópodos. No encontraron, además, diferencias de expresión de estos marcadores entre mujeres fértiles e infértiles (Creus y cois., 2002). También demostraron una alta variabilidad entre ciclos y una baja reproducibilidad para estos marcadores (Ordi y cois., 2003).

Li y cois., realizaron Ia datación de 63 biopsias endometriales en dos ocasiones distintas por el mismo patólogo demostrando que sólo en un 24% de ellas hubo un acuerdo total. En un estudio separado observaron que entre distintos ciclos de Ia misma mujer sólo en un 4% de los casos hubo acuerdo total. Estos datos enfatizan Ia falta de precisión de los métodos de datación tradicionales y su falta de garantía para predecir el desarrollo en los ciclos siguientes (Li y cois., 1989).

Las diferencias entre patólogos varían dependiendo del día del ciclo menstrual en que Ia biopsia endometrial es recogida. Más de un 20% de las biopsias endometriales fueron datadas con una diferencia de al menos dos días entre patólogos en Ia fase lútea temprana, media y tardía. Con respecto a las variaciones interciclos, éstas llegan a ser del 60% en Ia fase lútea media (Murray y cois., 2004). Se ha demostrado que, durante Ia ventana de implantación, un porcentaje muy similar de mujeres tienen el endometrio fuera de fase, 49,4% de fértiles frente al 43,2% de infértiles (p = 0,33) y que, finalmente, Ia datación histológico no está relacionado con el estatus de fertilidad (Coutifaris y cois., 2004). Estas variaciones descritas sugieren que los criterios tradicionales no son precisos y que se requiere nuevas tecnologías para datar e identificar funcionalmente las muestras endometriales. En Ia era pre-genómica, sólo se podían llevar a cabo estudios "gen a gen" para seleccionar candidatas útiles para el estudio de Ia receptividad uterina o para determinar Ia situación endometrial en mujeres con endometriosis o sin ella.

Así, en Ia era genómica en Ia que nos encontramos, se buscan herramientas objetivas basadas en criterios moleculares que vengan a mejorar Ia capacidad diagnóstica de determinadas técnicas como Ia histológica, muy útil, sin embargo, para otro tipo de necesidades.

A mediados de los 90 (Schena y cois., 1995), se desarrolló una tecnología revolucionaria para Ia determinación y cuantificación de Ia expresión de los ARN mensajeros (ARNm) en una muestra, los microarrays de expresión génica. Su principal ventaja es que ofrecen Ia posibilidad de analizar simultáneamente miles de genes en un solo experimento. Un microarray de ADN consiste en un gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido de manera que formen una matriz de secuencias en dos o tres dimensiones. Estos fragmentos de material genético pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucleótidos o de mayor tamaño, como es el ADN complementario (ADNc) que es sintetizado a partir de ARNm, o bien productos de PCR (replicación in vitro de secuencias de ADN mediante Ia reacción en cadena de polimerasa). A estos fragmentos de nucleótidos de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina "sondas". Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos métodos (enzimáticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo Ia hibridación (reconocimiento y unión entre moléculas complementarias) de secuencias homologas. Durante Ia hibridación, las muestras de material genético marcadas se unen a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo Ia identificación y cuantificación del ADN presente en Ia muestra. Después, el escáner y las herramientas bioinformáticas adecuadas permiten interpretar y analizar los datos obtenidos (Al-Shahrour F y cois., 2005).

Para utilizar un microarray se puede recurrir a los que existen comercialmente, o se puede diseñar uno personalizado.

Para diseñar un microarray se deben realizar las operaciones siguientes:

a) Elección del tipo de sonda, oligos, ADNc... b) Mareaje de sondas o muestras: enzimático, fluorescente...

c) Material de soporte: vidrio, plástico, membranas...

d) Inmovilización de sondas: activa, pasiva, covalente...

e) Fabricación: impresión, síntesis ¡n situ...

f) Detección de Ia hibridación: escáner, fluorimetría...

g) Procesamiento de datos: software.

Esta tecnología se está aplicando al análisis de Ia expresión génica, secuenciación, seguimiento de terapias, medicina preventiva, toxicología de fármacos y diagnóstico molecular. Se ha descrito Ia fabricación de microarrays, denominados también bioarrays o biochips en varios documentos de patente, como por ejemplo, WO 2005/018796 A1 , US 2005/0048554 A1 , y US 2005/0046758 A1. También su utilización se ha aplicado a dendrímeros (WO 2005/040094 A1) y grandes biomoléculas (US 2005/0042363 A1) o para recabar información sobre muestras, como por ejemplo, identificar una célula cancerígena o patógena en un individuo (WO 2005/016230 A2). También se conoce su utilización para inmovilizar ácidos nucleicos que son complementarios de una variedad de genes, aplicándose al campo de Ia química, Ia biología, Ia medicina y los diagnósticos en medicina (US 6,821 ,724 B1). En Ia actualidad se están utilizando los microarrays para hacer comparaciones basándose en datos genómicos y para investigar distintos sistemas.

Existen diversas publicaciones de literatura patente y no patente sobre este tema. En Ia actualidad, Ia tecnología del microarray ha permitido estudiar de forma global Ia expresión génica del endometrio bajo condiciones fisiológicas durante las diferentes fases del ciclo menstrual en ciclo natural (Ponnampalam y cois., 2004, Talbi y cois., 2005). En Io que respecta a Ia ventana de implantación humana los perfiles de expresión génica del endometrio en el ciclo natural han sido descritos (Borthwick y cois., 2003; Carson y cois., 2002; Riesewijk y cois., 2003;Mirkin y cois., 2005). También se ha analizado el perfil de expresión génica del endometrio durante Ia ventana de implantación en ciclos estimulados (Mirkin y cois., 2004; Horcajadas y cois., 2005; Simón C y cois., 2005) y en respuesta a fármacos como RU486 (Catalano y cois., 2005; Sharkey y cois., 2005). Asimismo se ha estudiado el perfil refractario del endometrio humano en presencia de un dispositivo intrauterino (DIU) durante Ia ventana de implantación (Horcajadas y col. 2006). Todos estos trabajos han sido revisados recientemente por los autores de Ia presente solicitud (Horcajadas y cois., 2007). La conclusión de dicho estudio es que aunque en los últimos 4 años, se han llevado a cabo diversos estudios genómicos del endometrio humano en distintas condiciones fisiológicas y patológicas, los cuales han generado gran cantidad de información sobre Ia regulación de los genes durante Ia ventana de implantación, tanto en mujeres fértiles como ¡nfértiles, sin embargo, las moléculas y mecanismos clave todavía están por descubrir.

En el campo de las patentes, existen varias que tratan de determinar Ia receptividad/no receptividad del endometrio, aunque ni los genes, ni Ia tecnología, ni los sistemas predictivos que postulan coinciden con Ia actual patente.

En el documento de patente US 2003/0077589 A1 se describe un método para diagnosticar Ia endometriosis, basado en Ia identificación del producto de al menos uno de los genes del grupo que consiste en fibronectina, receptor de transmenbrana PTK7, colágeno tipo XVIII, alfa 1 , proteína similar a Ia subtilisina (PACE4), cadena de laminina M (merosina), elastina, colágeno tipo IV, alfa 2, gen p27 interferón alfa inducible, reticulocalbina, aldehido deshidrogenasa 6, gravina, nidogen y fosfolipasa C epsilon, en Ia que una pequeña cantidad del gen control indica Ia presencia de endometriosis.

En Ia solicitud de patente US 2003/0125282 A1 se describen dos proteínas humanas MATER (se conocían las MATER de ratón) y su relación y utilización para las alteraciones relacionados con Ia fertilidad.

En el documento US 2003/0186300 A1 se describen métodos y composiciones comerciales para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades asociadas a Ia reproducción. La invención también se refiere a métodos y composiciones para Ia determinación y modulación de Ia receptividad del endometrio.

En Ia patente US 2005/0032111 A1 se utiliza Ia expresión de Ia cadherina-11 en el tejido endometrial como indicador de Ia capacidad para establecer o mantener un embarazo. El documento US 2005/0106134 A1 se refiere al papel de Ia enzima proproteína convertasa 5/6 durante el embarazo, y particularmente de su detección y

Ia de sus isoformas en el útero. Esta enzima es útil en el control de Ia fertilidad, para monitorizar un embarazo prematuro y para Ia detección de Ia receptividad del útero en los mamíferos. También se describen nuevas formas de proproteína convertasa 5/6,

En Ia patente US 2003/0228636 A1 se describe un método para detectar Ia receptividad del endometrio para Ia implantación embrionaria, que comprende: obtener una muestra del endometrio, poner en contacto el endometrio con un anticuerpo monoclonal de β ₃ , y detectar β ₃ en el endometrio. También se mencionan los contraceptivos y kits de diagnóstico útiles para llevar a cabo los métodos de Ia invención.

En Ia solicitud de patente WO 2005/061725 A1 se describen métodos para detectar marcadores asociados con enfermedades endometriales o una determinada fase endometrial en una mujer, que comprenden medir los marcadores endometriales peptídicos o los polinucleótidos que codifican los marcadores, en Ia muestra estudio. La invención también proporciona métodos para detectar enfermedades endometriales, así como kits para llevar a cabo los métodos de Ia invención.

El documento WO 01/89548 A2 se refiere a Ia utilización farmacéutica del polipéptido y el ácido nucleico de Ia fibulina-1 en el control de Ia natalidad en las mujeres, y para el diagnóstico y tratamiento de Ia endometriosis.

En Ia patente WO 2004/058999 A2 Ia invención se refiere a un método y los medios para determinar las condiciones específicas o los cambios en Ia mucosa del útero o en el epitelio de otros órganos. El método permite determinar Ia sobre- expresión de subunidades ARNm del tipo l-β (β7,β6,β6e) de gonadotropina humana. Las medidas de Ia expresión de β7,β6,β6e se utilizan para indicar Ia receptividad de Ia mucosa uterina a Ia implantación de un embrión o para indicar cambios neoplásicos en el epitelio.

En Ia patente US 2004/0005612 A1 se identifican secuencias genéticas con niveles de expresión que son reprimidos o inducidos en el endometrio humano durante Ia ventana de implantación. Los genes caracterizados durante Ia ventana de implantación proporcionan material para ensayos con el objeto de determinar alteraciones del endometrio e infertilidad, así como métodos de control de Ia natalidad basados en el endometrio.

En Ia patente US 6,733,962 B2 se describe un método para diagnosticar un desarrollo anormal del endometrio de una mujer basándose en Ia expresión de Ia ciclina E y Ia p27 en una muestra obtenida después del día 20 del ciclo menstrual de una mujer que idealmente dura 28 días.

Resumiendo, durante más de 50 años se ha tratado de determinar un estándar histológico para utilizar en el diagnóstico clínico de receptividad endometrial basado en observaciones morfológicas. Hoy día, con Ia tecnología de los microarrays, mucho más precisa que las observaciones morfológicas, se han publicado trabajos que se refieren a distintos genes presentes a Io largo del ciclo menstrual, pero los resultados no coinciden ya que el diseño experimental, Ia recolección de muestras y Ia selección de los genes son cruciales a Ia hora de sacar conclusiones.

Por Io tanto, todavía y más que nunca, es necesario tener disponible un microarray que englobe una selección de genes que generen un perfil de expresión que sirva para diagnosticar y determinar si el estado de un endometrio particular corresponde al estado de receptividad/no receptividad.

Por ello, en Ia presente solicitud se ha determinado una lista de genes y sondas, los cuales una vez incorporados a un microarray, por medio del estudio de Ia expresión de estos genes en Ia muestra objeto del estudio, permite detectar el estado de receptividad/no receptividad de una muestra de endometrio obtenida 7 días después del pico de Ia LH, así como situaciones de sub-fertilidad de origen endometrial en función del perfil de expresión génica de todos ellos.

Descripción detallada de Ia invención

La presente invención consiste en determinar el estado funcional de receptividad endometrial humana por medio de Ia invención de un microarray específico que identifica el perfil de expresión génica de Ia situación de receptividad /no receptividad del endometrio humano.

Para ello, se siguen los pasos siguientes: 1. Identificar un conjunto de los genes que estén implicados en Ia receptividad endometrial para su inclusión en un microarray específico de receptividad endometrial (Endometrial Receptivity Array, ERA).

2. Creación del microarray específico.

3. Analizar el patrón de expresión del ERA durante Ia ventana de implantación mediante herramientas bioinformáticas, para poder establecer el perfil de receptividad endometrial y crear un clasificador.

4. Desarrollar con este clasificador un predictor que, basado en el perfil de expresión génica, permita evaluar y predecir, de forma cuantitativa y objetiva el estado receptivo endometrial in vivo.

El fundamento del microarray es el siguiente: cuando un gen está activo, se producen muchas moléculas de ARNm, que tienen Ia misma secuencia de bases complementarias que el gen. Cuando un gen está inactivo no se produce ARNm. Los investigadores extraen todo el ARNm de dos poblaciones celulares que varían en Ia situación a estudiar, en este caso el endometrio receptivo y no receptivo, Io marcan con una sustancia fluorescente y Io añaden sobre el microarray. Como cada ARNm se aparea sólo a Ia sonda del gen que tiene su misma secuencia de bases complementarias, aquellos puntos que capturen más ARNm -y que por tanto brillen con más fluorescencia- indicarán qué genes estaban más activos. Si comparamos el patrón de fluorescencia del endometrio receptivo contra el no receptivo, sabremos qué genes están expresados de forma diferencial en una situación con respecto de Ia otra, y que por tanto asumimos que están relacionados con el proceso.

Las sondas están diseñadas para que se unan a ellas los ARNm del gen al cual pertenecen, y son las que están fijadas en el soporte del array. Los oligonucleótidos que forman Ia sonda se insertan de forma automatizada en una capa de cristal, nylon o plástico, colocándose en unas casillas que actúan a modo de microtubo de ensayo. Los microarrays de oligonucleótidos son fabricados de manera automatizada e insertados por robots mediante fotolitografía o impresión piezoeléctríca. El resultado es un proceso automatizado y normalizado que permite miles de impresiones por cm ² y minuto.

Generalmente se observa Ia distribución de las sondas en el microarray como un conjunto de sondas; las que tienen Ia misma secuencia se sitúan en Ia matriz en un mismo punto. En nuestro array personalizado las sondas poseen oligos de 60 nucleótidos, de todos modos, se trata de una tecnología en constante perfeccionamiento. De este modo, Io que está marcado y suelto en Ia disolución que ponemos a hibridar en el microarray son estos ARNm marcados que serán los que se unan a Ia sonda fijada al soporte de Ia manera explicada, por homología de secuencia, de modo que cuanto más ARNm marcado se una a un punto, que corresponde a una sonda específica, más luz será detectada en ese punto, y más cantidad habrá de ese gen.

Una vez establecido el funcionamiento del microarray objeto de Ia invención, así como delimitado el patrón de expresión de receptividad para evaluar mediante métodos bioinformáticos el estado de receptividad/no receptividad de un endometrio, se podrá evaluar igualmente, utilizando el mismo método, otros procesos patológicos que deriven en infertilidad o subfertilidad de origen endometrial como fallos de implantación o endometriosis.

Además del uso de este microarray para el diagnóstico molecular, también se puede utilizar como herramienta biotecnológica para el estudio del posible efecto de fármacos en el endometrio, como por ejemplo, Ia respuesta a fármacos contraceptivos, tanto en ensayos in vitro como in vivo.

Breve descripción de las figuras

Fig 1. Lista de los 293 genes y de las 738 sondas de los genes que incluye el ERA. En "negrita" se muestran las 567 sondas correspondientes a los 238 genes con un FDR<0,05 y un FC>3, que son los que se han seleccionado y se especifican en Ia Figura 2.

Fig 2. Lista de los 238 genes seleccionados con un FDRO, 05 y un FC>3 que serán utilizados por el predictor bioinformático para clasificar.

Fig 3. Microarray específico (ERA) (agilent technologies). La figura muestra como el ERA, microarray de expresión de oligos, tiene un formato de 8x15K (8 arrays de 15.000 sondas) por portaobjetos. Cada array contiene 15.744 puntos: 738 sondas en las que se incluyen los genes seleccionados (8 réplicas, 5.904 puntos), 536 puntos control y 9.304 puntos libres (vacíos). Fig 4. Tabla en Ia que se muestran los cebadores directos e inversos diseñados de los genes a amplificar mediante PCR cuantitativa.

Fig 5. Media de Ia expresión de las sondas de cada gen en el array comparada con Ia expresión en Ia PCR cuantitativa.

Fig 6. Distintos clasificadores denominados SVM (Support Vector Machine), KNN (Nearest Neighbour), DLDA (Diagonal Linear Discriminant Análisis), PARM, SOM (Self-Organizing Map), que son algoritmos matemáticos que utilizan distintos procedimientos para clasificar los perfiles de expresión como LH+7 (receptivo) y OTRO (no receptivo). En Ia figura se representa el error de clasificación para cada clasificador en el eje de las ordenadas, y el número de sondas empleadas agrupadas por orden de significatividad, en el eje de las abscisas.

Fig 7. Representación del error en función del número de sondas. Se muestran dos ejemplos de Ia clasificación obtenida con dos de los clasificadores. En el caso en que Ia clasificación del algoritmo coincida con Ia clase real, se representa en gris, y si no se enmarca en un círculo. La figura 7a clasifica con un error de 0, con todas las agrupaciones de sondas, pero en el mostrado en 7b, se observa como con 200 sondas discrepa en 2 de 14 (error= 2/14 =0,14).

Fig 8. Tabla en Ia que se comparan todos los métodos para cada array y se clasifica como LH+7 o como OTRO. Se escogen los clasificadores con error 0 y se ve que existe una predicción consenso.

Fig 9. Muestra Ia comparación de los resultados con las predicciones obtenidas con el ERA contra los obtenidos por datación morfológica (Noyes).

Ejemplos

1. IDENTIFICACIÓN DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL PARA LA GENERACIÓN DEL MICROARRAY ESPECÍFICO DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL.

La primera fase del proyecto consiste en Ia identificación de los genes que se encuentran regulados de forma específica en el endometrio del día LH+7 y que van a formar parte del microarray personalizado.

En Ia mayoría de los trabajos publicados los genes mencionados se han seleccionado cuando se encuentran inducidos o reprimidos dos veces. En Ia presente invención se han seguido unos criterios de selección distintos y más estrictos:

Criterio de selección de genes.

La selección de genes ha sido realizada en base a las diferencias del perfil de expresión génica endometrial representado por LH+1 , LH+3 y LH+5 (no receptivo) contra LH+7 como estado receptivo. Los niveles de expresión se han obtenido a partir de un microarray de expresión de oligos de genoma completo. Se han escogido aquellos genes que muestran diferencias significativas de expresión en estas dos situaciones utilizando los criterios de FDR<0,05* y de FC>3**.

^* FDR: de las siglas en inglés de False Discovery Rate. Parámetro que corrige el

P-valor en función del tamaño de Ia muestra. El valor de FDR 0,05 es Ia significatividad que de forma estándar se tiene en cuenta a nivel estadístico y supone el correr un riesgo del 5% de que las diferencias se deban al azar, y no al proceso biológico en cuestión.

** FC: de las siglas en ingles de FoId change. Significa: número de veces que cambia Ia expresión de un gen en una situación con respecto de Ia otra. En cuanto al FO 3, el criterio es suponer que si cambia más de tres veces es suficiente cambio para considerar el gen importante para el proceso.

Con el FDR se ha considerado Ia posibilidad de que las diferencias de expresión puedan deberse al azar, y no al proceso biológico. Además, se han seleccionado los genes con un Fc por encima de un valor umbral de 3 para que el número final de genes con los que vamos a trabajar sea factible. De este modo, estamos dando más importancia a los genes que cambian más, porque asumimos una relación directamente proporcional entre un mayor cambio y una mayor importancia para el proceso. Este criterio estricto auna tanto el requerimiento estadístico como el biológico. Además, hemos corroborado el sentido funcional de esta selección génica en el proceso biológico de Ia receptividad endometrial. Para ello, hemos realizado, mediante el uso de herramientas bioinformáticas, Ia clasificación ontológica de los genes utilizando FATIGO GEPAS (Al-Shahrour F y cois., 2005) viendo que los procesos biológicos representados de una manera superior a Ia esperada con una significatividad de 0,05, son Ia respuesta al estrés, Ia respuesta de defensa y Ia adhesión celular, procesos bastantes relevantes en preparar un endometrio a Ia posible implantación del blastocito.

Se han escogido aquellos genes con estas características y por medio de programas informáticos han resultando un total de 238 genes representados por 567 sondas.

La lista final del ERA esta compuesta por 293 genes representados por 738 sondas más controles. La Figura 1 muestra en "negrita" las 567 sondas correspondientes a los 238 genes con un FDR<0,05 y un FC>3, que son los que se han seleccionado y se especifican en Ia Figura 2.

2. CREACIÓN DEL MICROARRAY ESPECÍFICO (ERA) (Agilent Technologies)

El ERA es un microarray de expresión de oligos con un formato de 8x15K (8 arrays de 15.000 sondas) por portaobjetos (Figura 3). Cada array contiene 15.744 puntos: 738 sondas en las que se incluyen nuestros genes seleccionados (8 réplicas, 5.904 puntos), 536 puntos control y 9.304 puntos libres (vacíos).

Entrenamiento v predicción del ERA

En esta sección hemos utilizado los datos de expresión generados por el ERA para Ia clasificación de las muestras endometriales en dos grupos (LH+7 (receptivo) y OTRO (no receptivo) y para comprobar su capacidad de predicción.

Para ello, se obtuvieron 30 muestras de biopsias endometriales de mujeres fértiles (14 del conjunto de entrenamiento + 16 del conjunto de prueba). Todas las muestras independientes, de mujeres con fertilidad probada, en distintos días del ciclo menstrual. Se trata de mujeres caucásicas con un índice de masa corporal entre 19 y 25 kg/m ² y cuya edad oscila entre 19 y 34 años.

Dichas muestras se utilizaron para generar un clasificador (entrenamiento) y testar el valor de predicción del ERA.

Para ello, el ARN total fue extraído usando el protocolo del Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Inc., USA). Las muestras se homogeneizaron usando 1 mi de TRIzol por cada 75 mg de tejido, se incubaron a temperatura ambiente 5 min, se añadieron 200 μl volúmenes de cloroformo para Ia misma cantidad de tejido y se incubaron a temperatura ambiente 5 min. Posteriormente se centrifugaron 15 min a 12.000xg (4°C). La fase acuosa se precipitó con un volumen igual de 2-propanol (isopropanol), se incubaron en hielo 5 min y centrifugaron 30 min a 12.000xg (4°C). El precipitado se lavó con etanol 70% en agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) ₁ para posteriormente resuspenderlo en agua DEPC (15 μl). Con este protocolo se suelen obtener 1-2 μg de ARN total por mg de tejido endometrial. El ARN así extraído se trata con ADNsa durante 1 hora a 37 ⁰ C para eliminar las trazas de ADN y purificarlo de nuevo usando el kit RNeasy de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN que se obtiene tras las columnas del kit RNeasy se analiza para comprobar su calidad en el bioanalizador Agilent 2100 usando los chips para ARN específicos de Ia marca Agilent, el ARN Nano LabChip.

Sólo se han utilizado para posteriores análisis aquellos ARNs que cumplían las características siguientes:

- No presentaban ADN genómico detectable,

- poseían una concentración superior a 200 μg/ml,

- el valor del radio de rARN era 28s/18S >1 ,2, y

- el valor de RIN>7,0, (ARN Integrity Number).

Tras los análisis, con las muestras seleccionadas por su calidad adecuada, a partir del ARN total se genera ADN complementarios de una sola cadena (ADNc) incubándolo entre una y dos horas a 40 ⁰ C con retrotranscriptasa, nucleótidos y un oligonucleótido polydT-T7 que porta, no solamente Ia secuencia poly T que híbrida con Ia cola poliA de los ARN mensajeros, sino además Ia secuencia de reconocimiento de Ia ARN polimerasa de T7.

A partir del ADNc obtenido en el paso anterior, se incuba durante 2 horas a 4O ⁰ C en presencia de ARN polimerasa de T7 y nucleótidos, uno de los cuales está marcado con Cy3, para producir ARN complementario llamado ARNc.

Se purifica ese ARNc por medio de un kit de purificación basado en una cromatografía de afinidad, y se cuantifica.

Una vez purificado, ese ARNc marcado se fragmenta durante 30 min a 60°C y se híbrida en el microarray durante 17 horas a 65°C. Una vez transcurrido ese tiempo, se lava el microarray para eliminar las hibridaciones inespecíficas. Una vez hibridados y lavados, los microarrays se centrifugan a 3.000 rpm durante 3 minutos para secar los microarrays y se procede a su lectura por medio de su escaneo en un Axon GenePix 4100A leyendo para las intensidades de Cy3 (532nm).

Como resultado, tras el pertinente procesado de datos que adjuntamos a continuación, se generó una matriz de expresión génica cuyas filas corresponden a las 567 sondas de los 238 genes seleccionados y cuyas columnas, a las distintas muestras.

Procesado de los datos del arrav

La corrección del efecto del fondo se ha realizado restando Ia mitad de Ia mediana de este, a Ia media de Ia intensidad del punto. La normalización interarray se ha hecho usando el método de los cuantiles.

Después es calculada Ia mediana de las ocho réplicas de cada sonda. Las diferentes sondas del mismo gen son analizadas individualmente y los resultados son procesados por herramientas bioinformáticas. Validación de los resultados del ERA mediante PCR

Los resultados obtenidos en el ERA han sido validados mediante PCR cuantitativa con objeto de dar mayor consistencia a nuestros resultados y comprobar que el análisis por microarrays es fiable.

Se lleva a cabo Ia retrotranscripción para obtener el ARN en forma de ADNc, para ello 1μg de ARN total se puso en presencia de 1μg oligo (dT) (Clontech) hasta llegar a un volumen final de 12,5 μl con agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato). Se calentó 2 minutos a 7O ⁰ C para que se desnaturalizara cualquier posible estructura secundaria en los ARNm y luego se mantuvo en hielo 2 minutos.

Después se añadió 6,5 μl por cada una de las 30 muestras a validar, de una solución MIX con 4 μl de tampón, 1 μl dNTP, 0,5 μl ARNsa y 1 μl de retrotranscriptasa (Rt-PCR clontech). Se prosiguió Ia retrotranscripción 1 hr en el termociclador. Se añaden 80 μl de agua con DEPC y se mide por espectrofotometría Ia concentración del ADNc de simple cadena obtenido poniendo 2 μl de muestra y 98 μl de agua DEPC. La cantidad de ADNc que se ha retrotranscrito debe estar entre 80 a 120 ng / μl para partir de concentraciones similares, aunque se normaliza con el patrón interno en nuestro caso GAPDH. De todos modos, para que Ia PCR cuantitativa funcione correctamente el rango de ADNc a amplificar debe estar entre 50-500 ng / μl. Si alguna muestra no está en esos parámetros, se diluye.

Diseñamos los cebadores directos e inversos para cinco genes aumentados en

LH+7 (Figura 4). Las secuencias de oligonucleótidos de los cebadores fueron diseñadas con el programa bioinformático Gene fisher (ver Figura 4 y listado de secuencias). El sistema de detección se realizó con el SYBR Green I de unión a ADN de doble cadena (Roche). Este sistema de detección establece un rango dinámico linear para detectar productos específicos de PCR. Todos los experimentos de Q-PCR se realizaron usando el SYBR Green PCR Master Mix (roche) y las condiciones universales de los parámetros de ciclos térmicos indicados por los fabricantes utilizando el Light cycler de Roche. Se realizaron 40 ciclos. Las temperaturas a las que funcionan bien los cebadores se pueden observar en Ia figura 4, La cuantificación relativa se realizo mediante el método estándar de Ia curva patrón. La expresión de GPX3; CLDN10; FXYD2 ; SPP1 ;y MT1G, corresponden en el ERA a los valores de expresión de las siguientes sondas:

Considerando que se trata de técnicas distintas, Ia PCR cuantitativa, cuya sensibilidad es mucho mayor pero que proporciona un solo valor de expresión, y los arrays en los que se tiene Ia expresión de distintas sondas para un mismo gen. Por ello, para poder comparar se ha realizado en el array Ia media de Ia expresión de las distintas sondas de un gen (Figura 5).

Debido a su distinta sensibilidad, se considera que Ia relación del valor de expresión entre ambas técnicas correspondería a un factor de corrección de 10 (aumentos de expresión de 1Ox en el array se admite que se corresponden con un máximo de 10Ox en Ia PCR cuantitativa (Figura 5).

3. ANALIZAR EL PATRÓN DE EXPRESIÓN DEL ERA DURANTE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN PARA PODER ESTABLECER EL PERFIL DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL. GENERACIÓN DE UN CLASIFICADOR .

Entrenamiento:

Un predictor es una herramienta matemática que utiliza una matriz de datos, en nuestro caso los generados con el ERA, y aprende a distinguir clases (Medina I ₁ y cois, 2007), en nuestro caso dos clases (LH+7 (receptivo)/OTRO (no receptivo)). El razonamiento que subyace a esta estrategia es el siguiente: si podemos distinguir entre las clases como consecuencia del distinto nivel de expresión génica, entonces en teoría, es posible encontrar Ia expresión génica característica de LH+7 y usarla para asignar una clase al perfil de expresión de Ia muestra problema analizada con el microarray personalizado ERA.

Al conjunto de muestras que entrena al clasificador para definir las clases, se denomina conjunto de entrenamiento ("training set"). Es decir, los perfiles de expresión génica de estas muestras, medidos con el ERA, son utilizados por el programa para saber que sondas son las más informativas para predecir (LH+7 contra OTROS). Las biopsias utilizadas para generar el modelo de clasificación, están cuidadosamente escogidas y datadas de Ia manera más fiable de Ia que disponemos en Ia actualidad. Este conjunto de entrenamiento consta de 14 muestras: LH+7 (8), LH+2 (4), y días 9- 10 (2). Son todas muestras independientes, de mujeres distintas, sanas, en ciclo natural y con fertilidad probada. Se trata de mujeres caucásicas con un índice de masa corporal entre 19 y 25 kg/m ² y entre 19 y 34 años.

La clasificación es realizada por el programa bioinformático utilizando distintos algoritmos matemáticos (Figura 6). Un algoritmo es una lista bien definida, ordenada y finita, de operaciones que permite hallar Ia solución a un problema. Dado un estado inicial y una entrada, a través de pasos sucesivos y bien definidos se llega a un estado final, obteniendo una solución. El clasificador consigue distinguir las clases según un procedimiento llamado validación cruzada. Se calcula Ia eficacia del clasificador y generamos clasificaciones con error 0, Es decir, que todas las muestras del conjunto de entrenamiento son clasificadas en Ia clase real asignada.

En Ia Figura 6, se muestran los distintos clasificadores denominados SVM

(Support Vector Machine), KNN (Nearest Neighbour), DLDA (Diagonal Linear Discriminant Análisis), PARM, SOM (Self-Organizing Map), que son algoritmos matemáticos que utilizan distintos procedimientos para clasificar los perfiles de expresión como LH+7 y OTRO. A priori no se puede saber como se distribuyen los datos en el espacio, sólo se sabe como se ubican en las dimensiones que se pueden distinguir, que son tres. De este modo, hay diferentes algoritmos a aplicar, que funcionarán mejor o peor según como los datos introducidos se distribuyan en el espacio. Se aplican los más usados en matemáticas, que son los arriba indicados, y vemos cual separa mejor en dos grupos (LH+7 y OTRO). De este modo el DLDA establece una separación en virtud a una recta, el KNN en función del punto vecino más cercano, se basa en distancias... y así cada método se basa en un criterio de separación matemático que se ajustará más a menos a Ia realidad de las muestras.

En Ia Figura 6 se representa el error de clasificación para cada clasificador en el eje de las ordenadas, y el número de sondas empleadas agrupadas por orden de significatividad, en el eje de las abcisas. Si de 14 muestras, clasifica todas como Ia clase real, el error es 0/14=0, si clasifica distinto 1 de las 14, el error será 1/14=0,07.

Otra manera de representar el error en función del número de sondas se muestra en las listas de figura 7 a y b. En dichas figuras se muestran dos ejemplos de Ia clasificación obtenida con dos de los clasificadores. Si Ia clasificación del algoritmo coincide con Ia clase real, se representa en gris, y si no se enmarca en un círculo. En el ejemplo que muestra 7 a de Ia izquierda clasifica con un error de 0, con todas las agrupaciones de sondas, pero en el mostrado en 7b, vemos como con 200 sondas discrepa en 2 de 14 (error= 2/14 =0,14). 4. DESARROLLO DE UN PREDICTOR QUE PERMITA EVALUAR Y PREDECIR, DE FORMA CUANTITATIVA Y OBJETIVA EL ESTADO RECEPTIVO ENDOMETRIAL BASÁNDOSE EN EL PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA.

Testado:

Para comprobar el poder de predicción de los distintos modelos de clasificación, han sido analizadas con el ERA, 16 muestras endometriales consideradas como el conjunto de prueba ("test set"): 8 muestras en: día 20 (2), día 21 (2), día 22 (1) y LH+7 (3), y 8 de diferentes días del ciclo: día 8 (2), día 14 (1), día 9 (1), día 10 (1), día 11 (1), día 16 (1), y día 26 (1). También se trata de endometrios de mujeres sanas y de fertilidad probada, caucásicas, con un ICM entre 19-25 kg/cm2, y una edad entre 19 y 34 años. Sólo se han escogido aquellas muestras cuyo dataje histológico aplicando los criterios de Noyes, coincide entre los dos patólogos y con el día del ciclo menstrual.

Los resultados esperados para Ia predicción según los métodos de dataje actuales (histología y día de Ia última menstruación) serían que las ocho primeras muestras fueran LH+7 y las ocho restantes fueran clasificadas como OTRO. El análisis del perfil de expresión génica de las 16 muestras con los modelos de entrenamiento creados, mostró que las predicciones generadas eran distintas según el modelo.

Criterios para determinar Ia predicción

En función del error mínimo de clasificación del método con el conjunto de entrenamiento, se asigna un valor a Io que predice en el conjunto de prueba. Si el error es 0 para todos los modelos, el valor de Ia predicción es el mismo, pero si no, se calcula Ia contribución relativa para darle a Ia predicción mayor o menor peso. Existe una relación inversamente proporcional entre el error y Io que debería contribuir a Ia decisión. Si se relativizan los errores a uno, y se restan a uno ese valor que da cada método, se consigue hacer Ia relación directa, ya que a mayor error, Ia resta con respecto de uno, da un valor menor, y con ello, los métodos con más error tienen un coeficiente de ponderación menor, y Ia aportación a Ia decisión de predecir, LH+7 u OTRO será menor.

A LH+7 se Ie da el valor de 1, y a OTRO el valor de -1, se multiplica el coeficiente de ponderación según el error del método, por 1 o -1 según haya predicho. Al final se comparan todos los métodos para cada array, y se hace el sumatorio, si el valor que da es >0, Io clasifica como LH+7, y si el valor es <0, como OTRO.

En función de todo esto se establece una predicción consenso (ver figura 8).

La predicción establece un valor distinto al clasificado según Noyes en las muestras 7 (LH+7), 14 (día 26), y 15 (día 16), pero esto no es considerado un error, ya que estas muestras aunque correspondan a un día del ciclo en el primer caso receptivo y en el segundo y tercero no receptivo, pueden tener un perfil génico de expresión distinto, tal y como predice el modelo según el perfil de expresión.

En Ia figura 9 se muestra Ia comparación de los resultados con las predicciones obtenidas con el ERA contra los obtenidos por datación morfológica (Noyes).

La datación de Noyes posee mayor tasa de error en los días que comprenden

Ia fase lútea del ciclo ovárico, y precisamente las muestras 14 y 15, que son de otro día del ciclo que se clasifican distinto son las dos que se encuentran en este momento del ciclo. En cuanto a Ia muestra 7 del array, es una paciente LH+7 según Noyes, y

OTRO día del ciclo según el ERA.

El ERA se puede utilizar para Ia identificación positiva de Ia receptividad endometrial así como para el diagnóstico de su alteración asociado a alteraciones endometriales propias de patologías como Ia endometriosis, fallo de implantación, hidrosalpinx, etc. Así mismo esta herramienta diagnóstica permitiría detectar las modificaciones funcionales inducidas por fármacos interceptivos o que pretendan mejorar Ia receptividad endometrial, alterando Ia situación de normalidad/anormalidad en el perfil receptivo del endometrio de una mujer. BIBLIOGRAFÍA

- Al-Shahrour F y Dopazo J. In Azuaje F y Dopazo J (eds), Data analysis and visualization in genomics and proteomics. Wiley 2005; 99-112.

- Al-Shahrour F ₁ Minguez P, Vaquerizas JM, Conde L y Dopazo J. BABELOMICS: a suite of web tools for functional annotation and analysis of groups of genes ¡n high- throughput experiments. Nucleic Acids Res 2005; 33:460-464,

- Balasch J, Fabregues F, Creus M y Vanrell JA. The usefulness of endometrial biopsy for luteal phase evaluation in infertility. Hum Reprod 1992; 7:973-977.

- Batista MC, Cartledge TP, Merino MJ, Axiotis C, Platia MP, Merriam GR. Midluteal phase endometrial biopsy does not accurately predict luteal function. Fértil Steril 1993;

59:294-300,

-Borthwick J, Charnock-Jones S, Tom BD y cois, (2003) Determination of the transcript profile of human endometrium. Mol Hum Reprod 9, 19-33,

-Carson D, Lagow E, Thathiah A y cois, (2002) Changes in gene expression during the early to mid-luteal (receptive phase) transition in human endometrium detected by high-density microarray screening. Mol Hum Reprod 8, 971-979.

- Catalano RD, Yanaihara A, Evans AL, Rocha D, Prentice A, Saidi S, Print CG, Charnock-Jones DS, Sharkey AM and Smith SK (2003) The effect of RU486 on the gene expression profile in an endometrial explant model Mol Human Reprod 9,465- 473.

- Coutifaris C, Myers ER, Guzick DS, Diamond MP, Carson SA, Legro RS, McGovern PG, Schlaff WD, Carr BR, Steinkampf MP, Silva S, Vogel DL y Leppert PC. Histological dating of timed endometrial biopsy tissue is not related to fertility status. Fértil Steril 2004; 82:1264-72.

- Creus M, Ordi J, Fabregues F, Casamitjana R, Ferrer B, CoII E, Vanrell JA y Balasch J. Alphavbeta 3 integrin expression and pinopod formation in normal and out-of-phase endometria of fertile and ¡nfertile women. Hum Reprod 2002; 17:2279-2286, -Horcajadas JA, Sharkey AM, Catalano RD, Sherwin JRA, Domínguez F, Burgos LA, Castro A, Peraza MR, Pellicer A and Simón C (2006) Use of Gene-Expression Profiling to Identify Human Endometrial Refractoriness. J Clin Endocrinol Metabol.

-Horcajadas JA, Pellicer A y Simón C. (2007) Wide Genomic Analysis of Human Endometrial Receptivity. New times, new opportunities. Human Reprod Update 13, 77- 86,

-Kliman HJ, Honig S, WaIIs D, Luna M, McSweet JC, Copperman AB. Optimization of endometrial preparation results in a normal endometrial function test (EFT) and good reproductive outcome in donor ovum recipients. J Assist Reprod Genet 2006; 23:299- 303,

- Lessey BA, Castelbaum AJ, Sawin SW, Sun J. Integrins as markers of uterine receptivity in women with primary unexplained ¡nfertility. Fértil Steril 1995; 63:535-542.

- Li TC, Dockery P, Rogers AW y Cooke ID. (How precise is histologic dating of endometrium using the standard dating criteria?. Fértil Steril 1989; 51:759-763,

- Medina I, Montaner D, Tarraga J, Dopazo J. Prophet, a web-based tool for class prediction using microarray data. Bioinformatics. 2007; 23(3):390-1.

-Mirkin S, Arslan M, Churikov D, Corica A, Diaz Jl, Williams S, Bocea S y Oehninger S (2005) In search of candidate genes critically expressed in the human endometrium during the window of implantation Human Reprod 20:2104-2117.

-Mirkin S, Nikas G, Hsiu JG, Diaz J and Oehninger S (2004) Gene expression profiles y structural/functional features of the peri-implantation endometrium in natural and gonadotropin-stimulated eyeles. J Clin Endocrinol Metab 89:5742-5752.

- Montaner D, Tarraga J, Huerta-Cepas J, Burguet J, Vaquerizas JM, Conde L, Minguez P, Vera J, Mukherjee S, VaIIs J, Pujana MAG, Alloza E, Herrero J, Al-

Shahrour F y Dopazo J. Next station ¡n microarray data analysis: GEPAS. Accepted Nucleic Acids Res. 2006, - Murray WIJ, Meyer WR, Zaino RJ, Lessey BA, Novotny DB, lreland K, Zeng D y Fritz MA. A critical analysis of the accuracy, reproducibility, and clinical utility of histologic endometrial dating in fertile women. Fértil Steril 2004; 81:1333-1343,

- Noyes RW, Hertig AT, y Rock J. Dating the endometrial biopsy. Fértil Steril 1950; 1 :3- 17.

- Ordi J, Creus M, Quinto L, Casamitjana R, Cardesa A y Balasch J. Within-subject between-cycle variability of histological dating, alpha v beta 3 integrin expression, and pinopod formation in the human endometrium. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:2119-2125,

- Papanikolaou EG, TouARNye H, Verpoest W, Camus M, VeARNeve V, Van Steirteghem A, Devroey P; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermTo Searc h=15576388&ordinalpos=79&itool=EntrezSystem2.PEntrez .Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pu bmed RVDocSum Early and late ovarían hyperstimulation syndrome: early pregnancy outcome and profile. Hum Reprod. 2005; 20(3): 636-641.

- Ponnampalam AP, Weston GC, Trajstman AC. Molecular classification of human endometrial cycle stages by transcriptional profiling. Mol Hum Reprod 2004; 10, 879- 893,

-Riesewijk A, Martin J, Horcajadas JA Polman J, Pellicer A, Mosselman S y Simón C (2003) Gene expression profiling of human endometrial receptivity on days LH+2 contra LH+7 by microarray technology. Mol Hum Reprod 9:253-264,

- Schena Wl, Shalon D, Davis RW y Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression pattems with a complementary ADN microarray. Science 1995; 270:467- 470,

- Sharkey AWI, Catalano R, Evans A, Charnock-Jones DS and Smith SK (2005) Novel antiangiogenic agents for use in contraception. Contraception 71,263-271.

- Shoupe D, Mishell DR Jr, Lacarra M, Lobo RA, Horenstein J, d ^' Ablaing G. Correlation of endometrial maturation with four methods of estimating day of ovulation. Obstet Gynecol. Obstet Gynecol 1989; 73:88-92. - Talbi S, Hamilton AE, Vo KC, Tulac S, Overgaard M T, Dosiou C, Le Shay N, Nezhat, CN, Kempson R, Lessey BA, Nayak NR y Giudice LC. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology 2005; 147:1097-1121.

-Wilcox AJ, Baird DD, Weinberg CR. Time of implantation of the conceptus and loss of pregnancy. N Engl J Med. 1999;340: 1796-1799.

T-REX (http://www.gepas.org/)

FATIGO(http://babelomics.b¡oínfo.cipf.es/EntrvPoint?loa dForm=fatigo)

PROPHET(http://gepas.b¡o¡nfo.cipf.es/cgi-bin/loadtool.c gi?tool=prophet)

Agilent earrav 4.5 ( https://earrav.chem.agilent.com/earray/)