Ca} de la invencidtt Un procedimienta para la obtención un producto para usa agricola, ganade@ y humana mediante una técnica fermentativa manipulando la composición del sustrato del cultivn, así como sus condiciones ambientales, y et inocuto que puede ser hongus, bacterias, levaduras como Gibberells zeae, Giberella fujikori, Fusarium moniliforme; Fusarium sp; Azetobacter chroococcum; Agrobacterium tumefaciens; Bacillus polymyxa; Torula pulcherima.

Estado de la Técnica INTRODUCCION Las giberelinas son una importante y numerosa familia de acides diterpénicus biológicamente derivadus de diterpenus hidrucarbunados tetraciclicus (Fraga 1979 y Grèbe y Rupers citados por Kumar y Lonsane 1989) que constituyen potentes hormonas del crecimienta de las plantas. Entre ester compuestos, la giberelina llamada GA3 también conocida como ácido giberélio (Nakanishi et al 19$3 j ha recibidn comparativamenter mucho mayor atención por parte de las numerosas investigadores que las han estudiada ( Jefferys 1979). El ácido giberélico, ampliamente utilizado como promutor de crecimientn vegetat y la floración en la agricultura y floricultura comerciales. es un metabolito del hongo fitopatógenu Gibberella fujikuroi (cuya forma asexual es Fusarium moniliforme) de donde fue aislado por primera vez en 1935 par Yabuta y Sumiki en Japón (Fraga 1979). El ácido giberélicn regula la tasa de) crecimiento y la longitud final de lus entrenudos de las plantas, entre otras funciones fisiológicas (Greabe Roper 1978). Para su obtencitin comercial las productores industriales actualmente recurren a técnicas de fermentación sumergida (smf). aún cuandn en los más eficientes procesos siguen rindiendo una cantidad de ácido giberélico por debajo de lo deseable (Vass y defferys 1979). A pesar de que no fue posible localizar información más actualizada, estos últimos investigadores opinaban en ese entonces que era posible reducir las costus de producción. Pur lu que respecta a México ; uoa consulta semi-exhaustiva de diferentes fuentes indica que al país no produce GA3 ni giberelinas para comercialización. Hay evidencias, sin embargo, de que algunos institutns de investigación ban conducidu, u están conduciendo, proyectus para producirlos. Eonsiderando esta situación. y el alto valor comercial de estos reguladores del desarrollo vegetal resulta importante investigar sobre el mejaramíentu de las técnicas de producción existentes.

Con el objets de explorar la posibilidad de conseguir una produccián aceptable de aside giberélicu en el ámbito experimental y baja la hpótesis de que se puede aumentar la capacidad del hongo para producir el metabolite manipulando la composición del substratn de cultiva, en esta investigacián se plantez el objectiva de producir ácido giberélico a partir de Fusarium moniliforme en cuncentracinnes comparativamente mayores a los rendimientus referidos en la literatura, utitizando fuentes baratas de carbohidratns en un medio de cultiva estándar.

LITERATURA REVISADA Lns antecedentes histáricns del descubrimientn del ácido giberélico se remontan a un viejo problema fitopatológico en el Japón. En el cultiva del arroz se presenta una enfermedad que produce tantu en plantas jóvenes como en adultas una excesiva elongación de las tallos y BSGASO fruto. Las granjerus japonneses la llaman con el sonido equivalente en castellano de nombres tales como : bakanae, ajoine, samennae, aganae, sasanae, etc. (Kumar y Lonsane 1989). Los primeros trabajos de investigación acerca de la causa de esta enfermedad que afecta un gran número de species vegetales fue realizados por Sawad, quien fue, el primern en sugerir que se debia a la infección de un hango, al que más tarde se identifie6 coma Gibberella fujikurni (Sawada) Wollenwober (Fraga 1979). En 1926 la sintomatologfa desarrollada por las plantas de arroz fue, acertadamente atribuida por Kurosawa (citado por Nakanishi 1983) a una "tuxina" que más tarde fue aislada y qufmicamente caracterizada por Yabuta y Sumiki y Yabuta y Hayashi (citados par Cross 1954). Kurosawa pudo demastrar también que las filtrados stériles de medios de cultivo en los que creció el hongo provocaban la enfermedad de bakanae cuando se inoculaban en tallos de plantas javanés. Las sintumas de la enfermedad se pudierun inducir también en plantas de arroz cuyas smillas habían sido germinadas en el extracto estéril del hongo. Estas observaciones establecierun definitivamente que la enfermedad era causada por un metabolitn producido por ex hung en cuestión (Kumar y Lonsane 1989).

Descripción de Fusarium moniliforme.

El hongo causante del efectn descritn en el párrafo precedente es un microorganismu perteneciente a la clase Deuterumycetes, orden Melanconiales, subclase Hiphomycetidae, familia Tuberculariaceae, género Fusarium y especie moniliforme. Todos los Deuteromycetes praducen espars conocidas como conidias que son producidas en esporogenos (Alexopoulos 1979).

Tanto la furma sexual, Giberalls spp, como la asexual, Fusariumáspp, producen ácido giberélico, el cual es un promotor del desarrollo vegetal (MacMilan y Takahashi 1968, y Nakanishi et al 1983).

Las enfermedades de las plantas asociadas con Gibberella o con Fusarium incluyen pudriciones del talo, mazorca y raíz, y tizones en el maíz : también causa sarna, tizón de las plántulas y pudrición del pie de species de grana pequefio cama trigo y otros cereales. Fusarium produce la pudrición de la raiz del frijol, espárrago y cebolla; Pudrición del pie de la calabaza, pudrición seca de las papas y pudriciones básales del tallo de numerosas species ornamentales, ast como también pudrición de las smillas y ahogamientn y tizún de las plántulas trios 1989). En particular, las enfermedades del maíz causadas por Gibberella se encuentran ampliamente distriuidas por todo el mundo y ocasionan perdidas considerables (Agrios 1989).

Las Qibere ! inas.

Las giberelinas han sido aisladas de hongos y bacteria (Kumar y Lonsane 1989) y sun constituyentes normales de las plantas verdes en las que ocurren en pequenfifsimas cantidades (Fraga 1979). En plantas taxonómicamente relacionadas se han identificado giberelinas estrurturalmente similares (Nakamurn y Tsuji 1974). Las giberelinas inducen efectos notables como promoturas del crecimientn : aceleran la elongación de plantas puco desarrolladas para que alcancen su tamaño normal, promueven la floración y la elongación de raíces y el crecimientn de los frutos. Estas efectns se asemejan en algunns aspectns a las que ocasiona el ácida indolacético (AIA), otra promotor de desarrollo vegetal cuya producción es inducida también por las giberelinas. Las auxinas (otra clase de reguladores del desarralln vegetal) y las giberelinas actúan sinergisticamente. Es muy probable que las giberelinas activen la liberación de genes reprimidos que intervienen en la síntesis de reguladures del desarrollo vegetal (Rojas y Ramírez 1987), a favoreciendo la permeabilidad de las membranas celulares a enzimas que estimulan diferentes process del crecimientn (Fraga 1979).

Naturaleza química y nomenclatura.- Las giberelinas se extrajeron por primera vez del hongo Gibberella fujikuroi, que como se mencionó, es el agente causal de la enfermedad de "bakanae" (que significa literalmente "plántula estúpidamente súper crecida" del arroz en Japan (Hori citado por Nakanishi et al 1983). El componente activo aislado y químicamente caracterizado por Yabuta y colaboradores y Yatazawa y Sumiki (citadins por Cross) 1954) en el período comprendido de fines de la década de las 30's hasta principias de los 50, s fu, nambrado giberelina B (mas tarde giberelina N para la que propusieron la furmula C22 H26 07 (Cross 1954). Cruss no-tubo éxitn, sin embargo, para reproducir Ins resultados de la investigación de IDS japoneses, pero sus investigaciones a su vez lo condujeron a descubrir un nuevo metabotito de mismo hongo al que nombró ácido giberélico. Este último resultó ser también un potente prnmntnr del desarrollo vegetal ocasionando la elungación de las brotes de crecimientn de plántulas de chicharo y trigo (Brian et al, citados por Cross

1954). La caracterización química del ácido giberélico (giberelina GA3 de acuerdo al sistema de nomenclatura de Takahashi et al 1955 y 1957 citados por MacMillan y Takahashi 1968) por el método cristalográfico indicó una formula C19 H22 06 (Gross 1954).

La nomenclatura inicial de las giberelinas origine algunas confusiones debido a que las dos grupos más importantes de investigadores de estos compuestus utilizaban distintas notaciones. El primer grupo, representada pur Takahashi et al, identificó en 1955 y 1957 a las giberelinas mediante sfmbulas representándoos por las letras GA seguidas de un subíndice numérico. Estus investigadores aislaran de un media fermentativo con fusarium moniliforme cuatro giberlinas a las que nombraron GA1, GA2, SA3 y GA4. Esta nomenclatura fue adoptada por MacMillan et al ; Eras et al ; Hansan y Galt (citados por MacMillan y Takahashi 1968). El segundo grupo, formado por Tamura y colaboradores y Mitsui y colaboradores, nombraban a las giberelinas usando el nombre de la planta donde se desculbrían; por ejemplo : giberelinas bamboo (que corresponde a la giberelina GAI9), Pharbitis (giberelina GA16), Canavalina I (GA21), Lupinus I (GA18), Lupinus II (GA23), etc (MacMillan y Takahashi 1968). La giberelina bamboo se aisló posteriormente de semillas de Phaseolus multiflorus lo que provoco no poca confusión. Muchos investigadores par este mufivo se indinan actualmente por la nomenclatur de GAn ya que tiene la ventaja de ir agregando nuevas giberelinas con sala numerarlas. Es importante mencionar que las derivados de las giberelinas se escriben con el nombre del derivado químico del que proceden seguida de la giberelina correspondiente : por ejemplo, 2-0-acetil GA3 (MacMillan y Takahashi 1968).

Algunos de las primeras trabajos de investigación permitieron el desarrolla de m, todos para el aislamientn de) principio activo de E. fujikuroi así como para su caracterización química y biológica (lto y Kimura, y Nisikado, citados par Kumar y Lansane 1989). Aunque las técnicas para la cristalización del metabolito en furma pura fuerun en ese tiempo poco efectivas (Kumar y Lunsane 1989). Más tarde, alrededor del periodo 1961-1963, se realizaron numerosos ensayos de sintesis química de las gibBreiinas y compuestos intermediarios utilizando diversas vías (Money et al; Kos y Loewenthal; Correy et al; Corey y Smith; Corey Munroe, citados por Kumar y Lonsane 1989).

El continus interés en las giberelinas ha culminado en el conocimiento de un gran número. de giberelinas en plantas y en medias de cultivas microbiamnos (Jeffereys 1969). Estas ensayos también revelaron un buen humera de propiedades químicas explotables como adsorción, habilidad para pasar a través de membranas semipermeables y estabilidad del metabnlita en agua cliente (Kumar y Lonsane 1989). una publicación de (Fraga 1979) menciona la identificaión de 57 giberelinas que pueden clasificarse dentro de una de dos grupos : las C20 giberelinas (que contienen las 20 tamos de carbono cararchterísticos de un diterpeno y cuyo carbón 20 puede ester en forma de

metito, alcohol, aldehdo o ácido) y las CI9 giberelinas (que han perdida el carbnn 20 y presentan el típico grupo lactónico en la posición C19-C20)(Fraga 1979).

Efectos biológicos y boquímicos de las giberelinas.

La investigación sobre la naturalez química, síntess bioquímica y efectus de las giberelinas las plantas experimento un fuerte impulsa a finales de la década de Ins 50. s y principin de los 80, s. Asf, las efectos de las giberelinas se estudiaron intensamente en cebada y otros cultivos. Algunos de los resultadus obtenidos evidenciaron nn sala incrementos en la producción de cebada sino también de la producción de malta; incrementos en el tamañn de frutas como la uva, rompimientn de la dormancia en smillas y reducción de dañn por heladas (Donaho y Walker; Weaver; Wittwer y Sukovac ; Galun ; Brian et al; Griggs y Iwakiri, citados por Kumar y Lonsane 1989). outra efecto típico de GA3 es la inducción de la síntesis de amilasa en las smillas en germinación, posibilitando la transformación de almidón en glucosa para generar la energía necesaria para el desarrollo del embrión. Según Jacobsen et al (citado por Rajas y Ramerez 1987) esta inducción se efectúa activando un precursor inactivo del ARN mensajero correspondiente. El GA3 es quizá también la única hormona que interacciona con el fitocromo, el receptor que"dice"a la planta las horas de luz diaria que recibe y que hace que las plantas se ajusten a su foto período para florecer. Este efectu implica por la tanin un papel del GA3 en la movilización del fluju de nutriente. Además, estas efectos conducen a otros secundarios coma aceleración de la germinación, floración fuera de fain período normal, desarrollo de los frutos, etc. (Rojas y Ramfrez 1987).

Producción industrial.

No fue posible tener acceso a información detallada relava a la producci6n industrial de giberelinas en México. Sin embargo, se pudo averiguar que una empresa del vecino estado de Goahuila, que produce y formula distintos componentes químicas de products utitizadas en agricultura, ha investigado sobre el prnceso de fermentación en medio líquida. Se pudo averiguar que la empresa comercializa el ácido giberédico importado desde China (a un cost de US $400-600/Kg en 1991) en mezcla con un soporte inerte, a una concentración de 10% y cost actual de $8.50 por una tableta de 10 g. Esta empresa utiliza la confirmación química analitica cualitatiamente y cuantitativa del ácido giberélico con fines de control de calidad por cromatugrafía en capa fina mediante la detection de fluorescencia comparando contra un estándar comercial purificado. Además, verifican la efectividad biológica del material técnico por medio de las pruebas de amilasa

(Fernandez y Juhnstnn 1986), crecimiento de hipocotilo de plántulas de lechuga (RDvaln yRojas 1982) y de segundo entrenudo de plántulas de frijol (Mitchell y Livingstnn 1973). A continuación se consigna información que brinda la literalura especializada sobre las process de producción de GA3. Una revisión exhaustiva del tema de fermentacióo y técnicas de fermentación la presentan Harrow et al (1961). <BR> <P> Proceso de fermentación.- Como en toda fermentación, la actividad microbial transforma subs@ra@os ricos en carbohidraios (substancias predominantes en lus tejidos vegetales), en alcoholes y ácidos orgánicas coma las giberelinas (Stanier, Doudoroff y Adelberg 1970).

Las fermentaciones que se utilizan para obtener CA3 se realizan en presencia de todas las nutrients necesarios y condiciones químicas y de temperatura óptimas, hasta que el crecimientu fungus agota el n las componentes limitantes de medio (condición liamada "limitación de nutrientes") a se desarrollan condiciones en las cuales hay escasez de disponibilidad de un nutriente (término liamado "restricción del nutriente" (Kumar y Lonsane 1989). Para la producción óptima de GA3 y kas giberalinas debe existir una condiclón de nitrogens limitado.

Durante el procesn de crecimiento de hongo se sintetizan también inhibidores de las giberelinas cuya presencia debe ser evitada al formular el producto final (Borrow et al 1961).

Estas últimos investigadores han aportado abundante información sobre el proceso de fermentación para la producción de GA3). De misma arlículo de Borrnw et al 1961, se tomaron las siguientes observaciones y conclusiones derivadas de distintas experimentus utilizando diversos medios de cultivo y micelio de una cepa de fusarium moniliforme no esporulada (Jefferys 1979).

La fase lag (esto es, el retraso en la duplicación del inóculo en los minutos siguientes a la adición del mismo) fue notada solamente en un media que cantenfa acetato de amonio, 0 bajo condiciones de alta concentración inicial de glucosa (30 g /100 ml). Se observó la existencia de un período de proliferación en presencia de todas los nutrientes (fase balanceada0 durante el cual una unidad de incremento en peso seco fue acompañada par una asimilación constante de glucosa, nitrógeno, fósforo, magnesio y potasio. El increment del peso seen fue exponencial, en tanto que la morfulogía y la composición química de las hifas permanecieron constantes en términos de grasas, carbohidratas, ADN, ARN y contenido de polioles. En estas condiciones las células muestran un crecimiento expnnencial lineal seguido mas tarde de un crecimiento desacelerado. El crecimiento exponencial finalmente se detiene y se inicia una fase estacionaria con el agotamiento del nitrógeno en presencia de glucosa. Esta fase está asaciado can la producción de giberelinas. En presencia continua de glucosa externamente administrada se presenta la" fase de mantenimiento" que continúa hasta que la glucosa externa es agotada, así

coma también se agotan las reservas internas de grasas (más no las de carbohidratos). Si la glucose es agotada después que el nitrógeno, entonces la producción de giberelinas puede continuar par un tiempo que depender de la duración de la fase de almacenamiento y por la tanto, de las reservas de grasa de reserva disponibles cuando estas se han agotado hasta aproximadamente al nivel presente en la fase balanceada del micelio, entonces empieza la "fase terminal". Esta última se caracteriza por el rompimiento y la lieberación de componentes de) micelio, fosfata y amonio en el medio Jefferys 1979).

Técnicas de fermentación.- los primeros estudios que se realizaron para la producción giberelinas utilizaron la técnica de "fermentación de superficie líquida" (Yabuta et al, citado por Kumar y Lonsane 1989 y Curtis y Cross) 1954), pero la técnica de "fermentaciún sumergida" vino a sustituir a la primera y se le utilíza con mayor frecuencia (Stodola et al, citadas pur Kumar y lonsane 1989).

El objetivo principal en la producción comercial de GA3 ha sido la manufactura del productn a bajo costs. Esta ha alentado el desarrnlla de investigaciones sobre diversas técnicas de fermentación. Entre éstas las más conocidas son la"fermentación de superficie liquida" ("liquid surface fermentation" o simplemente LSF), ya mencionada, que requiere de largos períodos de incubación y resulta en una baja producción de GA3 (Hepner. citado por Kumar y Lonsane 1989), la "fermentación sumergida" ("submerged fermentation" o simplemente SmF (Kumar y Lonsance 1989) también ya mencionada, la"fermentación sumergida continua"que se considera que tiene las mismas características económicas que la fermentación continua (Holmes y Zacharias; Bu'Lock et al, citados por Kumar y Lonsane 1989) y la fermentación en estado sólido (Kumar y Lonsane 1988). Las trabajos de investigación acerca de la producción de GA3 utilizando esta técnica se iniciaran en las 80's. En un trabajo realizado por un grupo de investigadores mencionan que las ventajas económicas de esta técnica son solo aparentes (Kumar y lansane 1989).

Finalmente, existe también una técnica de producción por "cólulas inlovilizadas". de la que no se obtuvo información acerce de sus perspectivas económicas, aún cuando se reporta que ciertos aspects de esta técnica son económicamente positives (Kumar y Lonsane 1988a y 1988b; Heinrich y Rhem : Uhlan y Malhotea, citadas par Kumar y Lonsne 1989).

Otros productos de fermentación.- Numerosos autores que han investgads la biosíntesis de las giberelinas reportan también numerosos compuesios relacionados con ellas. Entre otros se pueden mencionar a Wierzchuwski y Vierzchoska; Kuhr;Cross et al; Schreiber et al ; Cavell y Macmillan ; Serebryakov et al y Pietel et al, sitados par Kumar y Lonsane 1989. En las medios de cultivo utilizados para la praduccíon de GA3 se han detectado productos que provienen de la degradación de EN los cuales llegan a tener alguna actividad biológica en plantas (como es el casa del ácido isogibérico) y otras muchos productos entre promotores de desarrollo, ácidos orgánicos, amino

ácidos y compuestas de diversa naturaleza incluyendo enzimas y cofactores. Todos estos compuestos, exepto las enzimas, son producidos normalmente por el metabolismo del microorganismo e incluso algunos de ellos están implicados en la biosíntesis y degradación de las giberelinas (Kumar y Lonsane 1989).

En las fermentacianes utilizadas para producir EN a partir de 6. fujikuroi y F. moniliforme también se producen otros promotores del crecimiento. Una de estos es él ACIOO F#JICO el cual se produce a una concentracibn 2 veces menores que las giberelinas (Sternberg citada por Kumar y Lnnsanq 1989 y Jefferys 1979). También se reporta la producción de un inhibidar de crecimiento de plantas por F. monififorme (Kurosawa citado por Kumar y Lonsane 1989). El supresar es producida a 35 eG mientras que el estimulador se produce a 20 eG. Este supresor se ha cristalizado y su producción se inhibe a un pH 3 (Kurosawa yYabuta et al. citados por Kumar y Lonsane 1989). Este compuesto con el nombre trivial de " ACIOO FUS#RICO" fue identificado como ácido picolínica y después como ácida 5-n-butil picolínico (Yabuts et al y Yabuta y Hayashi, citados por Kumar y Lonsane 1988). La produción de un inhibidur nn identificado del crecimiento de plantas pur Fusariumásp fue también reporta par Thakur y Vyas (1983). En la producción cnmercial de giberelinas es esencial que este repressor del crecimiento de plantas que se produce concomitantemente con las giberelinas, sea eliminado, ya sea utilizando condiciones selectivas como pH bajo u otras condiciones apropiadas de cultiva (Yabuta et al y Kurosawa, citados por Jefferys. 1970). Estas investigadores consignan que es muy dificil inhibir su producción.

Descripción de la invención: A) De producto: Una composición : Para aumentar la producción : agrícola, animales y humanos.

Consta de : (a) Una fuente de nitrógeno como : Cloruro de Amonio, Sulfato de amonio, Fosfato de amonio, Nitrato de Sodio : Tartrato de amonio, Acetats de amonio. En una cantidad de 0. 5- 20 g/litro.

(b) Una fuente de carbohildratos como : Glucosa, Lactosa, Sacraosa, Manosa, Dextrose, Lactosa etc. 10-200 g/litro S Una fuente de minerals como : KH2P04, MgS04, K2S04, KCl, MgCl2, K2HP04.

(d) PH de 5.5 (3-8)

(e) Incubar a una temperatura de 30- 45°C, en agitacian o reposo, por 5-20 dfas y que induce la producción de un compuesto que se extrae con acetato de etilo y que inhibe el crecimiento de las plantas cuando SE usa concentrado, y estimula el crecimiento de las plantas de menor a mayor crecimiento progresivo según se diluya 0.1 hasta 0.00000000000000000000001 obteniendo excelentes resultados a una concentración de 0.0000000000001 De use : (a) Un producto UNICO para aumentar la productividad del campo, aumentar la productividad en animales y colaborar en la salud humana.

(b) De un producto"nueva"que es extraído con un solvente y que actúa como inhibidor cuando directamente se coloca directamènte en plantas, pero cuando se diluye en cantidades extremadamente pequeñas (nanodosis) sa obtiene un estimulador general de plantas y animales, comprobándose también el usa del medio"crudo"en diluciones semejantes obteniéndose el mismo resultado.

C) Puede ser que el producto obtenido presente inhibidaras a supresores coma el ácido fusárico, que se produce en cantidades 20 veces menores que las giberelinas, pero que se forma a temperaturas altas 35°C, mientras que el ácido giberélico y giberelinas se forma a 20°C. Al usar este INHIBIDOR en forma diluida resulta ser un excelente Activador General de Metabolismo de plantas y animales.

De Uso en diferentes cultivos : A) Citricos - Diferentes pruebas en este cultiva demostraron que la solución 5 provocó : a) un aumento en la floración, mayor amarre de fruto y por lo tanto aumento la productividad de la cosecha, aumento en algunas veces del tamañn del frutn. b) Mejor calidad de fruto mejor sabor. c) Comparado con ns testigos, en sequoia en iguales condiciones (sin agua de riego), se observó resistencia sequía Se recolecta fruto a pesar de estas condiciones, este fruto es algo pequeño, pero muy dulce, apto para jugo.

d) Se ha observado que aplicado a pequeños citricas (tamaño y edad) produce floración y amarre de fruto, el cual llega a su maduración. En invierno se ha observado que las árboles sin hojas, se Ilenan de flores. Se ha observado también resistencia a heladas.

B) Maiz.

Se ha observado en este cultivo, mayor crecimiento de la planta, y mayor número de olotes (hasta 5 por plantas). También mejora la calidad del producto ya que aumenta la cantidad de proteínas del mismo, grano más grande.

C) Papa.

Produce un aumento de la productividad y uniformidad de la misma, también se obtiene mayor cantidad de"papa'de primera.

D) Higueras.

En este cultive se ha observado un aumenta en productividad, inclusive todo el alio, con frutos de gran sabor, más compactas y menas perecederos. También se realizaran esquejes (pequeñas porcines de las plantas se transplantaron, fuera de temporada y se logra el enraizamiento de las mismas. Obteniendn mas árboles.

F) Calabazas.

Aumenta la cantidad. calidad y resistencia a condiciones de sequedad.

G) Tmnate Aumenta la cantidad, y calidad del mismo, también se observa que en condiciones de inundación el cultivo sobrevivió a estas condiciones, pudiéndose usar el fruto para puré, de los testigos no se recupera el fruto (perdida total de la cosecha).

H) Plátano Aumenta la cantidad y calidad del mismo.

I) FIns.

Provoca mayor calidad, mayor tamaño y cantidad de la misma, también se observa que sobrevieven con flores y en invierno (plantas que sun de una temporada) comparadas con plantas de las mismas no tratadas.

J) Nodales.

Aumenta la cantidad de nspales.

K) Perales.

Aumenta notablemente él numern de flores y amarre de frutos de tal manera que el fruto se da en ranimas, y mejorando el sabor.

@)Duraznos Aumenta el numero y el tamaño y sabor de los mismos.

M) Savates.

Provaca un aumento espectacular de misma, se observan raíces fuerte, y se ve más verde y con más savate, cuya usa puede ser para alimentar ganado o decorative etc.

N)Cebollas Aumenta el tamaño, cantidad y mejor sabor.

N) Manzanas. lnicia la producción d e manzanas en lugares na propicios para ella a temperaturas altas mayares de 40°C, la manzana , 1, producida es de excelente sabor y es producida por árboles jóvenes. Es importante mencionar que la manzana requiere estimulo de frío o estimulo químico para la floración y producción de fruto.

De uso en plantas que sufren conrliciones de "stress" ambientales com@ Ayuda a la plata a resistir condiciones de "stress" del medio ambiente como a) Salinidad.- Es factible que aumente la resístencia a sequía por desarrollo de una raíz más profunda y más fuerte. b) Acidez (debids a la lluvia ácida por contaminación).

Mayor resistencia a este factor por desarrollo mas fuerte de la planta, ya que soporta que plantas tratadas han sobrevivido tanto al fría como al calor a sequedad excesiva.

#lnundación. Las plantas tratadas con este producto a las diluciones mencionadas provocan que el cultivn resista comparadn con un testigo (en este se pierde toda la cosecha esto fue realizado en un cultiva de tomate).

(D) Ayudar en cultivos que tuvieran por algún error, "stress"de algún producto agrícola como herbicidas o fertílizantes.

El dE ds un producto agrícola que fovurece alos cultivos en tierras o condiciones "polores" El RESLILTADO EN % DE PRODUCTIVIDAD DE LA COSECHA . ES MÁS NOTORIO EN CULTIVONS RUE TIENEN FACTORES DE "STRESS" O EN COLTIVOS SIN NINGUN FERTIUZANTE.

El usa de un producto para obtener "cosechas o productos orgánicos".

Uso de un producto agrícola compatible con el media ambiente, no causa daños a flora, ni fauna, ni al humano, la cosecha obtenido no tiene ningún problema de residuns dañinos a la salud ni humana ni animal. Esta seria un producto de Ins llamados "PRODUCTOS ORGANICOS DEL CAMPO".

Usa de un producto con alta estabilidanl cuand@ esta preparado para us@rse en Usa de un producto que ya preparado, para usarse en el campo tiene una estabilidad 0 durabilidad de 3 meses.

Ilso de un producto que se cdnca m un sntmrte como tela o algodón y teniendo un fácil manejo.

El uso de un producto para obtener respuestas @leseables en animales y humanns como los siguientes: (Activador General de metabolismo de animales : (AGMA) y Aetivador General del Metabolismo de humanos (AGMH)) : También provoca efectos deseables o positivos en animales y humanns en bajas diluciones, no siendo tóxica ninguna dilución.

El producto usado es la solución 4, diluido en licor de diversos sabores, en tequila, en alcohol etílico, en vinos y se aplican 4 n 5 gotas en la lengua en el día cabe mencionar que si se toman toda el producto en un instante no les causa ningún daño.

Se realizaron observaciones primeramente en gatos, iniciando con la solución 4 y llegando a la dilución 1 : 1000 (solución 16) por vía oral, observándose, que las gatos aumentaron de tamaño, de peso, y siempre estuviernn muy sanos, también se observa un cambio en conducta que tienen un comportamiento más "cariñosos", y también se ve aumentado el deseo y cantidad de relaciones sexuales de elles.

Se realizó un estudio en pollo, 50 individuos, solo comían en el día (no de noche) y se observa un aumenta en un 30% de su peso, con un gran sabor.

También, se han observado en pollos caseros, desde chiquitos se le dio la solución, lo siguiente, unas crecieron muy altos (patas largas) y otros no crecieran tantos, pero eran de cuerpo grande. También con un comportamiento diferente, ya que se cuidaban entre ellos, siempre juntos, y sociables con las personas que los crfan.

En perros disminuye su agresividad, crecen más sanas.

Se probaran las soluciones desde el PRC concentrado hasta solución 4, en ratones y no se observó efecto toxic. Se observo una gran actividad sexual, que resulto en un gran número de crías, sin ninguna anomalía.

Sobre la base de estas observaciones se concluyo que el producto na era toxic y que tiene otras propiedades dignas de "explotar".

Snbre le base de esta empecé a usar este producto en mí, en la solución 4, observe que tenfa más anergía. Después de un tiempo mis familiares quisieron usarlo, provocando en ellos resultados similares, en Ins jóvenes, se observa mejor cuerpo, como si hicieran ejercicio, par la que elles ilamaron al productio "fortachón".

Se usa el products en diferentes personas y todos manifestaron que tenían mucha"Energfa"no se cansaban fácilmente.

También se lo usaron unos conocidos que tenía problemas de impotencia, manifestando que volvieron a la normalidad.

En personas normales provoca mayor actividad sexual tanto en hombres como mujeres.

El uso de un pradocto como antioxidante : En jugos y habidas ácidas como el agua de limón, naranja, toronja y sus respectivos jugos, al agregar el producto diluidn 1:1000- 1:10 000 al agregar 0. 1 ml se observa que las soluciones no se hacían amargas y conservaron un buen saber por varias días comparados con testigos preparados respectivamente al mismo tiempo y en las mismas condiciones. Este mismo producto puede usarse en alimentos susceptibles a este proceso coma manzanas, guacamole y plátanos.( cuadros A y cuadro B que se realizaron con limanada y jugo de naranja respectivamente.

Cuadro A-. Agua de limón con AGMP en diferentes concentraciones, probados en diferentes d@as y comparados con un testigo.

Solución Sabor del Sabor del Sabur del Sabor del Sabor del Sabor del probada agua de limnn agua de limón agua de limón agua de limón agua de limón agua de limón Diferentes el primer día el segundo el tercer día el cuarto día el quinto día el sexto día concentra día sinnes de AGMP testigo .+++. .- . .- . .- . .- . .- . 1:1000 +++ + + - - - 1:3000 +++ ++ + - - - 1:7000 +++ + + - - - 1:10000 +++ +++ ++ + - - ++= buen sabor

+ = regular sabor - = mal sabor (sabor amargo) Cuadra B. Jugn de naranja, con AGMP en diferentes concentraciones, probados en diferentes días y comparadas con un testigo.

Solución Saber de jugea Saber de jugs Saber de jugn Saber del jugu Sabor del jugn Sabir del jugo probada de naranja de naranja de naranja de naranja de naranja de naranja el primer día el segundo el tercer día el cuarbo día el quinto día el sexto día dfa testigo . +++ . .++ . . + . . - . . - . 1:1000 +++ + + + + 1:3000 +++ ++ + + ++ - 1:7000 +++ + + + + - 1:10000 +++ +++ ++ ++ ++ - +++= excelente sabur ++= buen sabor + = regular sabor = mal sabor (sabor amargo) C De dosis Usar una misma dosis para todas las variedades de cultives, animales y humanas, esta dosis se obtiens al hacer diluciones obteniéndose Ins mejores resultados a 1:1 000; 000 000; 1: 10 000 ; 000 000; 1:100 000; 000 000 ; 1: 1000,000 ; aun 000, 1:10 una 000 ; 000 0000 disueltos en la cantidad de agua necesaria para regar una hectárea, en casa de animales la dosis esta distribuida en el agua para beber y en humanas el producto esta diluida en liser de diferentes sabores, vinas, tequila, y urus.

A continuación se describe la metodología para obtener el producto Activador General del Metabolismo en sus diferentes modalidades, con sus resultados correspondientes.

Activador general de netabnlismo de las plantas:AGMP En este trabajo se plante6 cama objetiva encontrar un producto para aumentar la prudustDvidad en el campo (cuantitativamente y cualitativamente) se tumó como referencia un regulador de crecimiento conocido, el ácido giberélico (GA3), el cual se abtiene par un proceso de fermentación, y utiliza al hangs Fusarium moniliforme, sobre distintos substratos nutritivos. La metodología utilizada para el desarrollo de esta investigación consistió en la producción, extracción, identificación química comparativa usando el GA3 como referencia y es producida par et hongo mediante la técnica fermentación sumergida. Esta investigación incluyó también la comprobación in vivo del efecta del ácido giberélico obtenido sobre semillas de maíz y plántulas de lechuga.

En el proceso de fermentación para producir AGMP fueran variados, cualitativa y cuantitativamente, tanto la fuente de carbohidratos como el tiempo de fermentación. Se hizo una extracción con acetato de etilo y se obtuvo un sólido alque se Ilamó AGMPa se realizó una comparación qufmica de las dos products AGMPa y GA3 utilizando la técnuca de cromatografía en capa delgada de Cross (1954), esta técnica demostró la presencia de un producto que se encuentra a la misma altura de GA3 pero su forma es diferente (ovalada para el AGMPa) en los distintos tratamientos mientras que el GAS era redonda. El extracto obtenido con acetato de etilo AGMPa fue sometido a una prueba cuantitativo para determinar una equivalencia de cantidad aproximada entre el GA3 y el AGMPa esta es la técnica de Halbrook (1961) esta es una prueba de espectrofotometría y se aplicó esta técnica a las extractos AGMPa usando como referencia GA3 químicamente puro, mostrando que el AGMPa tiene una equivalencia mayor que el GA3, encontrando que la mayor cantidad de AGMPa se produjo en el tratamiento 20L15 (20 g/l de lactosa, 15 días de fermentación) con 1125 mg/l seguido por el tratamiento 2UG7 (20 g/1 de glucosa, 7 días de fermentación con 750 mg/l Según el estudio realizado por la técnica de Cromatografía líquida de alta resolución y la cuantificación del mismo por la técnica espectrofotometría de Holbrook evidenció diferencias substanciales entre los distintos tratamientos (naturaleza y cantídad unitaria de las substratos utilizados como fuentes de carbohidratos y tiempo de incubación). Sin embargo, las resultados de las bioensayos del efecto inductor del AGMPa y usando como testigo positivo el GA3 sobre la elongación del hipocotilo de plántulas de lechuga, muestran que el efecto promedio de las diluciones ensayadas-procedentes de las extractos AGMPa que rindieron tuvieron más potencia que et GA3. Hay evidencia de que la respuesta de los tallos de las plántulas de lechuga, dentro del rangn de diluciones utilizado, dependió de la concentración de éstas últimas, aún cuando latendencia de la respuesta no es clara, por to que se realizaron mas dilucinnes con resultados positivos a diluciones tan bajas como 1:10 000 000 000.

También se probó el efecto de la solucibn de AGMPa después de prepararla en agua y se encontró que tiene una duración de 3 meses, ventaja que no se presenta con el GA3, ya que preparada la solución de GA3 en agua, el día siguiente disminuye notablemente su efecto o In pierde del todo.

En el testigo relativo con GA3 estándar la elongación del hipocotilo aparentemente sigue una relación inversa al aumento de la concentración del primera. En cuanto a la actividad alfa-amilasa, en furma similar se observe un efecto diferencial entre las diluciones de las tres tratamientos ensayadas. Aparentemente siguiendo también una relación inversamente proporcional al incrementa en la concentración de la fitohormona. Esta tendencia inversa de la respuesta se manifesté sin ninguna duda dentro de la misma prueba de

estfmuto a la germinación y stangaciún can smillas de lechuga, que se realize para confirmación de las ensayos de inducción de la actividad alfa-amilasa y de la misma elongación de hipocotilo antes mencionadas. los bioensayos del MUMP, es el producto directo de la fermentación evidenciaran una respuesta positiv en el producto diluido, pero no tiene un efecto inhibitorio en diluciones concentradas coma la muestra la figura lí iniciando en la dilución 1 : 1 000 000, mostrando su optimo a las diluciones más bajas como la demuestran las sotuciones 4, 5, 19, 20, 21, 22, 23.

MATERIAL Y METODOS A) Metodología para obtener los productos AGMP y AGMPa : A continuación se describen la metodología, materiales y equipn que se ufflizarun en el desarrolla de esta investigación. Esencialmente ésta consistió en la producción, extracción, identifícación química y cuantificación de Ün producto reguladar de crecimiento AGMP comparándolo con estándares de ácido giberelico GA3, producido por una sepa de Fusarium moiliforme mediante la técnica de fermentación sumergida. La investigación incluyó también la comprobación in vivo del efecto de AGMP obtenido sobre semillas de maíz y plántulas de lechugá.

Manejo de Fusarium moniliforme.

Una cepa de Fusarium moiliforme donada localmente fue utilizada como fuente de producción del Activador General del Crecimiento de las Plantas (AGCP). Micelio del hongo sembrado en PDA fue incubado a 30 °C por un perfodo de 48 horas después de cual se guards en refrigeracibn a 2 °C. Cuando se requirió, la sepa fue activada en media de cultive PDA estándar incubándola a 30 °C durante 1-3 días en tubos de cultivo de 18 x 150 mm. Para extraer el hongo deestos últimos se adicionaron 5 ml de una solucibn salina estéril (NaCl) 0.85% en agua destilada), se agitó suavemente la mezcla y se extrajo el volumen requerido para inocular los medias de cultivo seleccionados para la investigacibn.

Activador General de) Metabolismo de las plantas (AGMP) : Para producir AGMP muestras de aproximadamente 1-2 ml del medio de cultivo con micelio fueron inoculadas en 150 mi de seis diferentes medias modificados descrittos originalmente por Calam y Nixan (citados por Kumar y Lonsane 1989). Estos medios contenían una base común de acetato de amonio (5 g/l de medio de cultivo) como fuente de nitrógeno y 1 ml de una solución de Grofol MR(1) conteniendo I g del producto comercial por litre de agua como fuente general de minerales. Los medios fueron preparados además

variando la cantidad (20 y 50 g/ It) de la fuente de carbohidratos : glucosa, lactosa o sacarosa, según el tratamientn. Todas Ins medias se ajustaron a pH 5.5 con NaOH 1 N y HCl I N según se requirió. Por duplicado los medios fueron colocados en frascos Erlen Meyer de 250 mi esterilizados en autoclave a 15 libras de presión y a 120 °C durante 15 mintos. El inóculo fue luego incubado estacionariamente durante 5, 7, 10, 13, 15, 17, 20, 22 y 25. días a una temperatura de 25-50°C. El producto resultante de esta fermentación es EI ACTIVATOR GENERAL DEL CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS (AGMP) y se realizó lo siguiente : a) Las medias resultantes fueran inmediatamente refrigerados a 29C y posteriormente deshidratados al media ambiente. (cuadro 6) b) outras medias resultantes se mantuvieron en refrigeración 2°C para hacer diferentes pruebas. c) El producto resultante AGMP se puede conservar indefinidamente al obtener el producto seeo por deshidratación o preservarse con alkohol.

Para distinguir las tratamientos se assigna una clave de identificación a cada una siguiendo el procedimiento de utilizar un número para designar la cantidad en gramos de la fuente de carbohidratos, seguido de la letra inicial del nombre de estos últimos y finalmente un número para indicar el período de incubación en días. De esta manera, la clave 2065 significó el tratamiento que contenía 20 g de glucosa y que fue incubado durante 5 dfas y as susesivamente.

Obtención del AGMPa De las medias de cultive tfquidos MMP fue separado un producto al que llamé AGMPa siguiendo la siguiente secuencia. Terminado el proceso de fermentación, volúmenes de 20 ml del medio se ajustaron a pH 3 añadiendo lentamente una solución de HCI IN. Las mezclas se traspasaron luego a embudos de separación y se les añadieron 20 ml de acetate de etilo. Una vez agitada la mezcla se procedió a separar la fase acuosa de la orgánica. traspasando ésta última a un matraz de separación. El volumen acuoso recuperado se volvió a tratar tres veces más con el mismo volumen de acetate de etilo repitiendo la separación para recuperar todo el AGMPa de la muestra original. Una vez junta los volúmenes de acetato de etilo se ajustó el pH a 7 y en un rota vapor se evaporó el solvente hasta el menor volumen posible. El residuo final (Ilamada en adelante extracto sólido AGMPa) se pasó a un vaso de precipitado y se le conservé as a temperatura ambiente para las ensayos subsiguientes.

Identificación química.

La comprobación química de la presencia de AGMPa en el residuo final extrafdo de la manera descrita en el párrafo precedente se realizó utilizando la técnica de separación por cromatografía en capa delgada y detecciún por fluorescencia descrita por Kumar y Lonsane (1986).

La muestra de extracta sólido recuperada del process de destilación fue resuspendida en 4 ml de acetato de etilo. Como testigo se preparó soluciones de un regulador de crecimiento conocido GA3 pura para hacer una comparación con otro producto puro y conocido (Sigma Chemical, Co. cat. G 7645;1993) conteniendo 1.25, 2.5, 5. 10, 15 y 20 mg/ml en etanol. Utilizando un tubo capilar se deposit una pequeña gota (de volumen no determinado) de las suspensiones estándar y del problema en la línea de origen de una placa de sflisa, en un medio sulvente de beneena : acetona : ácido acético (13:6:1). Las muestras se dejaron migrar en el solvente hasta aproximadamente 8 cm de borde de una placa. Una vez evaporada el survente la placa se asperjb con una solución de ácido sulfúrico al 70% para visualizar las manchas resultantes en una cámara obscura bajo la incidencia de luz ultravioleta. (figuraal y 2) Cromatografía liquida de alta resolución.- Para este análisis - según datos del laboratorio que realizó el trabajo- se emplie6 una columna de DOS con un detector UV/VIS de arreglo de diodes a 210 nm y scan 299-359 nm. Las muestras que se proporcionaron a dicht laboratorio se prepararon a partir de volúmenes de 20 ml de las medias líquidas de fermenteición correspondientes a los tratamientos 50L7 (dos muestras) y 50L10 (tres muestras), los cuales fueron sometidos al proceso de extracción can acetato de etilo ya descrito para obtener AGMPa. Esta es una prueba de comparación entre el AGMPa y el GA3 y se realizó mediante la técnica de adición de estándar añadiendo 20 ul de estándar concentrado de GA3 a 200 ul de muestra. (figura 11 y 12) Análisis cuantitativo.

La determinación cuantitativa de contenido del AGMPa en el medio líquido resultante del proceso de fermentació (AGMP), obtenidos en forma de residuos sáiidos (AGMPa) de la extracción con acetato de pila, de muestras de 20 ml del medio tfquido de fermentación (AGMP), se hizo empleando un ensayo espectrafotamétrica (Holbrook 1960).

Espectrofotometría.-

El análisis espectrofotométrico se llevó a cabo de la siguiente manera. Una muestra por tratamiento de las extractas sólidos (AGMPa) obtenidos de 20 ml de cada media de fermentación WIMP) se disolvió en 100 ml alcohol etílico absoluto. Un volumen de 19 ml de cada suspensión alcohólica fue entonces diluidn cun 90 ml de una solución de HCl al 30% y dejado reposar dentro de un recipiente con agua a temperatura ambiente durante 75 minutos. Para construir la lfnea de regresión de absurbancia vs. Concentración de GA3, soluciones conteniendo 0. 8, 1.6, 2. 4, 3.2 y 4 mg de ES en un volumen final solvente de 100 ml fueron preparada a partir de una solución madre de GA3 en alcohol etdico absoluta según se indica en el cuadro 1. El espectrofotómetro se calibró en ceros con diferentes blancos, utiliz ándose para el estándar de GA3 0 ml de aleohol absoluto y 90 ml de HCI 30%, y para las soluciones problemas una mezcla de 35 ml de HCl 5% y 65 ml de agua. La absorbancia de las soluciones fue cuantificada a 254 nm en un espectrofotómetro digital Beckman DU-29 Halbrook (1961). (figura 3,4,5,6,) Cuadro 3. Diluciones de ácido giberélico (GA3) preparadas a partir de una solución madre conteniendo 0. 4 mg/ml de ácido en alcohol etílico absoluto, utilizadas para construir la línea de regresión absorbancia-GA3. Solución madre(GA3) (ml) Et-OH absoluto ml HCl al 30 % mg/AGMP en (ml) 100 ml 2 8 90 0.8 4 6 90 1.6 6 4 90 2.4 8 2 90 3.2 10 0 90 4.2 blanco 10 90 COMPROBACION DEL EFECTO BIOLOGICO.

A)Se realizaron bioensayos con el AGMPa extraído con acetato de etilo La demostración del efecto biológico de los extractos crudos obtenidos se realiz6 únicamente con las muestras de las tratamientos (AGMP) 20G7, 20L15 y 50L10, que fueran las que mayor rendimiento de AGMP produjeron según el análisis espectrofotométrico. Para este propósito se utilizan las técnicas de estimulación de producción de alfa-amilasa (Fernandez y Jhahnstan 1986) en semilla de maíz, elongación del hipocati de plántulas de lechuga (Lactuca sativa) recién germinadas (Robalo y Rajas) 1982) y substitución de las requerimientus de luz en la germinación de lechuga (Rabaln y Rojas 1982).

Produccibn de alfa-amilasa.- El efecto estimulador del AGMPa sobre la síntesis de alfa-amilasa se realizá siguiendo el siguiente

procedimiento. A partir de una solución madre conteniendo 1 mg/ml de en agua (antes de diluir con agua el volumen de GA3 se disolvió en 1 mi de etanol) se prepare diluciones testigo conteniendo 0.1, 1, 10 y 199 ppm de Bp en un media acuoso conteniendo a su vez 0.7% de Phytagel MR y 9. 15% de amidon para iodometría. Dada que este media gelifica en poco tiempo, vniúmanes de 10 ml de la suspensión fueran rápidamente vertidas en cajas petri para preparar el ensayo. De la misma manera, los extractos sólidos obtenidos de 20 ml del medio de fermentación AGMPa se disolvieran en 199 mi. de alcohol etlico absoluto y se prepararon diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000 en agua respectivamente. Un mililitro de cade dilución fue entonces mezclado con 9 ml de la suspensión de Phytagel MR y almidón.

MR Agente gelificador sustituto del agar : Sigma Chemical En., Cat. P8169 Para detectar y comparar la actividad alfa-amilasa, una cierta cantidad de smillas de maíz fue remojada en una solución de H2S04 50% durante 1 hora, al cabo de la cual se trasvasaron a un recipiente con agua donde se dejaron repasar 24 horas. Cumplido este lapsa se eliminó el embrión de las smillas y se partieron longitudinalmente por la mitad, colocando una mitad de semilla por caja con la porción de) endospermo en contacta con el media. Después de 24 horas de incubación, se retiraron las smillas y se agregó lugal al media para detectar la presencia de áreas claras alrededor de las semillas, indicativo de la ausencia de amidon.

Alargamiento del hipocotilo de lechuga. A partir de una solución madre conteniendo 1mg/ml de GA3 en agua (el volumen de GA3 inicialmente se diluyb en 1 ml de etanol), se preparó diluciones conteniendo 0.1, 0.15, 0. 2 y í ppm en agua destilada estas son los santroles de GA3. El AGMPa que esta en las extractos sólidos extraídos y disueltos en etanol absoluto como ya fue descrito, se prepararon dilusiones 1 : 1000, 1 : 5000, 1 : 7000 y 1:10000 en agua. Cinco mililitros de cada una de estas fueron luego vertidas en cada una de 16 cajas petri provistas de un par de hojas de papel filtra en el fondo. Dos réplicas con solo agua destilada fueron utilizadas coma testigo. En cada caja se colocaron 20 smillas de lechuga y se dejaron incubar en oscuridad durante 48 horas, al cabo de las cuales se midió la longitud de las hipocotilos. (cuadro 4 A y B) Sustitución de las requerimientos de luz en la germinación. - El procedimiento para realizar este ensayo Es idéntico al ensayo del alargamiento del hipocotilo descrito previamente, en todo excepto en la medición del crecimiento del hipocotilo la cual se realiza al término del perfoda de germinación en oscuridad. Soluciones conteniendo 1, 10 y 190 ppm de GA3 y dilucionnes

1 : 10, 1 : 199 y 1 : 1000 de los extractos sólidos problemas (AGMPa) disueltus en ethanol absolute como ya fue descrito fueren empleados para esta prueba.

B) Se realizaron bioensayos con el AGMP obenido por el medio de fermentación.

La demostración del efecto biulógico del Producto Regulador del Crecimiento (AGMP) crudos obtenidos se realizó con todas las muestras de las tratamientos (AGMP) 20G5, 20G7,20G10, 20G15, 50G5, 50G7, 50G10 ,50G15, 20L5, 20L7, 20L10, 20L10,50L5,50L7,50L10,50L15, 20S5, 20S7, 20S10,20S15,50S5,50S7.50S10, 50S15 preparándose diluciones en agua de 1:10- 1:10 000 000 de producción de alfa-amilase (Fernandez y Jhuhnstun 1986) en semilla de maíz, elongación del hipocotilo de plántulas de lechuga Lactuca sativa) recién germinadas (Robalo y Rojas 1982) y substitución de las requerimientos de luz en la germinación de lechuga (Robalo y Rojas 1982). (figuras 5-8).

Producción de alfa-amilasa.- El efecto estimulador del AGMP sobre la síntesis de alfa-amilase se realizó siguiendo el siguiento procedimiento. A partir de una solución madre conteniendo 1 mg/ml de AGMP en agua (antes de diluir con agua el volumen de PRC se disolvió en 1 ml de etanol) se preparó dilucionnes testigo conteniendo 0.1, 1, 10 y 100 ppm de GA3 en un media acuoso contenienda a su vez dz 7% de Phytagel MR y 0. 15% de atmidán para iodometría. Dado que este medio gelifica en poco tiempo, volúmenes de 10 ml de la suspensián fueran rápidamente vertidus en cajas petri para preparar el ensayo. Solucionnes de diluciones en agua del (AGMP). 1:10- 1:10 000 000 000 000 000. Un mililitro de cada dilución fue entonces mezclada con 9 ml de la suspensión de Phytagel MR y almidón.

-MR Agente gelificador sustituto del agar; Sigma Chemical Co., Gat. P8169 Para detectar y comparar la actividad alfa-amilasa, una cierta cantidad de smillas de maíz fue remojada en una solución de H2S04 50% durante I hura al sabo de la cual se trasvasarun a un recipiente con agua donde se dejaran reposar 24 horas.

Cumplidn este lapsu se etimino el embrión de las smillas y se partieran tongitudinalmente por la mitad, colncando una mitad de semilla por caja con la porción de endosperma en contacto can el medio. Después de 24 haras de incubacián, se retiraron las smillas y se agregó lugon al medio para detectar la presencia de áreas claras alrededor de las semillas, indicativo de la ausencia de almidón.

Alargamiento del hipocotilo de lechuga.- A partir de una soluci6n madre conteniendo 1mg/ml de SAS en agua (el valumen de SAY inicialmente se diluyó en 1 mi de ethanol), se prepare diluciones conteniendo 0.1, 0.15, 0. 2 y 1 ppm en agua destilada estos son las

contrôles de GA3. Se hicieron diluciones del Producto Regulador del Grecimiento (AGMP) Soluciones de dilucianes En agua del (AGMP) en un rango de 1:10 hasta 1:10 000 000 000 000 000.Dos réplicas con soto agua destilada fueron utlizadas como testigo, y como control positive se usa GA3. En cada caja se colocaron 20 semillas de lechuga y se dejaron incubar en oscuridad durante 48 horas, al cabo de las cuales se midiú la longitud de las hipocotilos.

Sustitución de las requerimientos de luz en la germinación.- El procedimiento para realizar este ensayo es idéntico al ensayo de alargamiento del hipocotilo descrito previamente, en todo excepto en la medición del crecimiento del hipocotilo la cual se realiza al término de pertodo de germinación en oscuridad. Soluciones de diluciones en agua de (AGMP). Faeronde un rango de 1:10 hasta 1:10 000 000 000 000 000.

RESULTADOS Y DISCUSION A continuación se consignan los resultados de los análisis químicos y verficación de la actividad biológica de) products de la farmantacian sumergida de una sepa de Fusarium moniliforme al que he liamado Activador General del Metabolismo de las Plantas (AGMP) y de un producto extraído del mismo AGMPa. En el process de fermentación de AGMPfueron variados, cualitativa y cuantitativamente, tanto la fuente de carbohidratos como el tiempo de fermentación, tiempo y temperatura de incubación.

Identificación ou (mica.

Cromatografía.- Réplicas a escala de las cromatogramas obtenidos con muestras de AGMPa aislado con acetata de effila de las extractos sólidas procedentes de las tratamientos 5DL7 (AGMP) y 20L15 (AGMP) se muestran en las figuras l y 2. A diferencia de las demás tratamientos, con estos dos se obtuvieron buenos liofilizados fácil de manejarse por su consistencia. No se consideran necesario reprnducír las cromatngramas de las restantes 22 tratamientos dado que todos arrojaran el mismo resultado. El Rf calculado para et BA3 en el medio solvente utilizada es 0. 84. Las placas con GA3 en Et-0H, GAS en Et-OH acidulado y extracta sólido (AGMPa) en acetato de etilo, una vez reveladas con H2S04 mostraron claramente las manchas fluorescentes correspondientes a la presencia de AGMPa que muestra diferente forma al de GA3 (es et testigo) cuando se visualizaron baju la incidencia de luz ultravioleta (Cross 1954). (figura l y 2).

Cromatografia ffquida de alta resolución.

El cromatugráma de ! a solución estándar de GA3 mnstrá un pica mayaritario a 4. 96. La inyección directa de la muestra Producto regulador del Crecimiento (AGMPa) presentó una composición compleja con picos alrededor de los 4.96. Con esto se comprobó no hay la presencia de ácida giberélico en las muestras o no es significativa la cantidad presente (figura 11 y 12).

Espectrofotometría.- Los valores de absorbancia promedio abdenidos de dos muestras de extracto sólido de cada tratamiento y sus equivalencias en pesa de GAS (cuadro 5) fueron calculados a partir de una lfnea estándar ajustada a ojo (figura 3). Así mismo, en el cuadro 5 se concentraron los valores de rendimiento promedio de AGMPa arreglados por periodo de incubación y por concentración y tipo de la fuente de carbohidratos en el medio fermentativo (Gohlwar et al 1984).

Con las valores del cuadro 5 a su vez se dibujaron las lingas de tendencia de producción que se muestran en la figura 4, 5 y 6, la cual permite apreciar que no hay una tendencia definitiv y consistente en la retacián tiempo de fermentación-producción de AM si se comparan entre si los distintos substratos. Lo mismo sucede si se realiza esta comparación dentro de un misma sustrato al variar e ! contenido de ! azúcar correspondiente en el medio fermentativo. En este último caso no se aprecia una diferencia notable en la magnitud del rendimiento de AGMPa en los distintos perfodos de fermentación al comparar las dos concentraciones de la misma fuente de carbohidratos.

Tabla 1. Efecto de GA3 estándar y de 4 diluciones de las extractos sólidos resultantes (AGMPa) de las tratamientos 20G7 (Z0 g/l, 7 días de fermentación), 20L15(20 g/l de lactosa, 15 días de fermentación) y 50L10 (50 g/l de lactosa, 10 días de fermentación) sobre la longitud de hipocotilos de lechuga (A), y equivalentes estimados de GA3 (ppm) correspondiente a cada dilución, según el análisis espectrofotométrico de las muestras de extracto s6lido de cada tratamiento B. (A) Tratamienta Longitud de hipocotio en milFmetrus 1 : 1000 1:5000 1:7000 1:10 000 GA3 28 27 25 28 AGMPa 20G7 22 28 27 28 AGMPa 20L15 26 32 28 30 AGMPa 20L10 27 27 25 20 testigo 12 (B) Tratamiento Equivalencia en ppm entre GA3 y AGMPa según la Dilusibn currespundiente. 1 : 1000 1 : 5000 1 : 7000 1 : la ang GA3 1 0.2 0.15 0.1 AGMPa 20G7 0.15 0.03 0.02 0.015 AGMPa 20L15 0.225 0.045 0.032 0.025 AGMPa 50L10 0.106 0.0212 0.0151 0.0106

Cuadro 4. Valores promedio de absorbancia y sus equivalentes en mg de Producto de regulador de crecimientn (AGMPa)/It obtenidos con muestras de alícuotas del extracto sólido resultante AGMPa del proceso de fermentacinn sumergida AGMP de Fusar jum moniliforme en distintos sustratos y tiempos de incubación. Este es un método para cuantificar GAS en muestras sólidas y comparado con AGMPa de medio líquido resultante AGMP. Tratamiento (1) Equivalente de a 254 nm Alisorbancia GA3 (mg/lt) AGMPa aislado de AGMP de diferentes fuentes de azúcar y diferentes tiempos de incubación Glucosa 20G5 0.7 350 20G7 1. 50 2BGIB 0. 47 235 29915 9. 47 237 50G5 0.35 175 50G7 0.54 270 50G10 0.78 390 50G15 0.78 390 Lactosa 2QL5 0. 70 350 20L7 0. 50 250 20L10 0. 59 295 20L15 2.25 1125 50L5 194 94 470 50L7 0.94 470 50L10 1.00 500 50L15 1.06 530 Sacarosa 20S5 0.41 205 20S7 0. 65 325 2usa 0. 55 275 20S15 0. 47 235 50S5 0. 47 235 50S7 0. 47 235 50S10 0.24 120 50S15 0.24 470

(1) El primer número indica la cantidad (g/lt) en el media de cultivo de la fuente de carbohidratos : G = glucosa, L = lactosa y S = sacarosa ; el número en la derecha de la letra indica el tiempo de fermentación en días. íampnca se aprecia una diferencia sustancial cuando esta comparación se hace entre las fuentes distintas de azúcar. Dado que no fue posible localizar ninguna referencia bibliográfica que informara espectficamente sabré la curva de tendencia de producción de AGMPa en función del tiempo de fermentación, no es posible comparar las resultados de esta investigacián para verificar si las tendencias observadas y las rendimientos se ajustan o no a un patron obtenida previamente. Relacionado con el rendimiento de AGMPa, si se eliminan las das valores que se salen del rango en el que parecen moverse el resto de los tratamientos (las correspondiente a los tratamientns

20G7 y 20L15), la "glucosa" (tanto 20 como 50 g/lt) varia aproximadamente en el rango 175-390 mg/lt es decir una magnitud de 215 unidades ; la"lactosa"en 250-530, a sea una magnitud de 28 unidades; y la "sacarosa" en et rango de 120-470 que corresponde a una magnitud de 350 unidades. Las medias de la magnitud de variación correspondientes son 282. 5, 390 y 295, para las tratamientos con glucosa, lactosa y sacarosa, respectivamente. Lo que lleva a pensar que no existen realmente diferencias entre tratamientos.

Comprobación de efecto biológico. lnducción de la elongación del hipocotilo.- Efecto que tuvieron las extractos sólidas de AGMPa correspondientes a los tratamientos 20G7, 20L15 y 50L10 liamados AGMP (los tratamientos que dieron mayor rendimiento según la técnica de Hoolbrok 1961), sobre la longitud de hipocotilos de plántulas de lechuga(figuras 7-9). Por cuestiones de tiempa el resto de Ins tratamientos no se evaluaron.

Cuatro diluciones volumen a volumen del extracto sólido en ethanol AGMPa : 1 : 1999, 1 : 5000 1:7000 y 1:10000 fueron ensayadas y su efectn fue expresado en términos de magnitud (veces) la disminución o incremento de crecimiento promedio de Hipocotilo con respecta a cuatro concentraciones de estándar (GA3 puro) y un testigo absoluto al absoluto (sin GA3). En la figura 7, que muestra gráficamente el efecto de las diluciones procedentes del tratamiento 20G7 (AGMPa) sobre el incremento o disminución del hipocotilo, se observa que las diluciones 1 : 19990 y 1 : 5990 tienen un efecto similar; ambas induciendo una mayor elongación del hipocotilo en comparación a las concentraciones 9. 15 y 2 ppm de GA3, e igual a las concentraciones 0. 1 y 1 ppm de ácida. La dilución 1 :7000 produce una elongación de hipacotila mayor a la del control sala en la concentración 0. 15 ppm de GA3, una respuesta igual al control a 9. 2 ppm y una respuesta menor a la de control a 0.1 y 1 ppm. La dilución 1:1000 indujo en todos las casas una elangacibn menor a todas las concentraciones de AGMPa. En igual forma la figura 8 muestra el efecto de las diluciones procedentes de AGMPa tratamiento de 20L15(20 g/l de lactosa, 15 días de fermentacián). Las dilusinnes 1 : 10000 y 1 : 5000 tienen un efecto mayor que las controles de GA3, la dilusibn 1 : 7000 presenta un efecto mayor en las concentraciones de 0. 15 y 0. 2 ppm de GA3 y un efecto igual en las concentraciones de 0. 1 y 1 ppm de control. La diluci6n 1 : 1000 solamente tiene un efecto mayor cuando se compara con la concentración 0. 15 ppm de contra). Par último, la figura 9 muestra la gráfica que corresponde ai (AGMPa) del tratamiento 50L10. En ésta puede observarse que la dilución 1:10000 tiene un efecto mayor que las concentraciones del control, la dilución 1:7000 presenta un efecto comparativamente mayor a las concentraciones 0.1, 0.2 y 1 ppm, y un efecta igual a la concentración 0. 15 ppm de GA3. Las ditucíanes (AGMPa) 1:5000 y 1:1000 tienen un comportamiento similar, presentando un efecto mayor a la concentración 0. 15 ppm, un efecto igual a la concentración 0.2 y un efecto menor a las eancentracianes 0. 1 y 1 ppm de GA3. La figura 8 muestra la tendencia que sigue la respuesta de las plántulas de lechuga al estímulo de las diluciones de las extractos

sólidos (AGMPa) de los tratamientos 20L7, 20L15 y 50L10, así como a las distintas concentraciones de la solusibn estándar de BA3. Dado que son pocos las puntos con las que se construyeron las gráficas, las curvas de respuesta se trazaron en una escala semi-log. Esta figura muestra que GA3 tiene su efecto máximu a las concentraciones de 1 y 0. 1 ppm (longitud promedia de hipacotiln de 28 mm), y el menor efecto con la concentración 9. 15 ppm (crecimiento promedio de 27 mm). El efecto máximo de GAS sobre la etongacián del hipocatito fue superado por las diluciones 1:5000 y 1:10000 del AGMPa del tratamiento 20L15 y la dilución 1 : 19990 del AGMPa del tratamientn 50L10 y 1 :10000 del AGMPa de 50L10. El resto de los tratamientos (excepto 1:10000 del tratamiento 20G7) quedaron por debajo de la intensidad de respuesta inducida por la mejor concentración de GA3. fsbínulacián de la germinación.- El cuadro 10. Se consigna el efecto de tres diluciones volumen a volumen de las extractos solidus de AGMPa correspondientes a las tratamientos 20L7,20L15 y 50L10 sobre la germinación de semillas de lechuga. Estas diluciones fueron preparadas a partir de una dilución 1 : 100 en Et-OH del extracto sólido resultante de la extracción con acetato de etila realizado a 20 ml de media de cultive. Adicionalmente diluciones conteniendo 1,10 y 100 ppm de EM estándar en agua fueron utilizadas para comparar el efecto resultante. En los tres tratamientos se observa que la dilución 1:10 inhibe tutalmente la germinación. La dilución 1:1000 la promueve casi totalmente y la dilución 1 : 100 la promueve en una magnitud aproximadamente intermedia entre las dos anteriores. En cuanto al crecimiento de hipocotilo, la concentración 1:1000 induce el doble del crecimiento en las tres tratamientos cuando se le compara con la dilución 1:100. En cuanto al efecto de las diluciones de GA3 el ácido induce el 100% de germinación a las concentraciones de 1 y 10 ppm, mientras que la concentración mayor (100 ppm) la germinación es del 95 %. Casa igual sucede con el crecimiento de hipocotilo.

Cuadro 1a .- de efecto de diluciones del extracto sólido AGMPa sobre germinación y elongación del hipocotilo de plántulas de lechuga después de 72 horas. Promedio de 2 repeticiones portratamiento. El testigo agua presento 100% de germinación y 12 milímetros de longitud de hipocotilo. Tratamiento lureentaie promedia de germinación y longitud (Z) Prnmedin de hipocntiln se ! qún la dilución : 1 t : m--i : no t : tooo- % Germ Lnnn. % Germ Lonq % Germ Lonq 20 G7 15 ppm 15 ppm 1. 5 ppm i. 5 ppm 0. 15ppm 0. 15ppm - 35 4 90 8 20L15 22. 5 ppm 22. 5 ppm 2. 25 ppm 2. 25 ppm . 225ppm 0. 225ppm 0 35 4 En 8- SODOtn. EppmJÜ. BppmLOEppm t. DEppmMm ajnBppm a : 404gn7 GA3 11111 nm Id nnm I nnm 95 7 100 13 100 13 (1) 20G7= 20 g/l de glucosa, 7 dlas de fermentación 20L15= 20 g/l de lactosa, 15 días de fermentación 50L10= 50 g/l de lactosa, 10 dEas de fermentarinn GA3= Acido giberélico (2) Equivalentes en ppm de la dilución correspondiente en determinado tratamiento.

Efecto sobre la actividad alfa amilasa.- El cuadro 6 muestra la actividad amilasa de smillas de maíz inducida par distintas diluciones de tas extractos sólidos AEMPa de las tratamientos 211G7, 20L15 y 50L10 (AGMP). Para propósitos de comparación además del testigo sin GA3 se ensayaran cuatro concentraciones de GA3 estándar. los resu) tados indican una respuesta similar entre las diluciones de GA3 y las de las tratamientos 20G7 y 50L10(AGMP). Estos últimos indujeron una actividad alfa-amilasa máxima a la dilución 1:100, que corresponde al efecto de la dilución de 10 ppm de GA3. El tratamiento 20L15 induja la máxima actividad a una diluciGn de 1 : 10 la que hace suponer que en este tratamiento la cantidad de AGMPa es menor que en las outras dos.

Cuadro 2a .- Muestra el efecto de las diluciones de los extractos sólidos AGMPa obtenido de la fermentación de distintos sustratns par la actividad de Fusarium monilifurme sobre la actividad amilasa de semillas de maíz por la técnica de Robalo y Rojas (1982):

Tratamiento Actividad alfa amilasa en las diluciunes AGMP 1:10000 1:1000 1:100 1:10 ZD G7 0.015 ppm 0.15 ppm 1.5 ppp 15 ppm + + ++ - 20 L15 0.0225 ppm 0.225 ppm 2. 25 pom 22. 5 pom ++ 50 L10 0.0106 ppm 0.106 ppm 1.06 ppm 10.6 ppm + + ++ - GA3= Acido giberlelico Testigo absoluto: + Escala: GA3 estándar 0.1 ppm: + - = sin alo GA3 estándar 1.0 ppm: + += alo peque@@o GA3 estándar 10 ppm:++ ++= alo grande GA3 estándar 100 ppm: -

Activador General did Metabolismo de las Plantas (AGMP) Se realizó la evaporación al medio ambiente de Solución madre AGMP (50S7). Obeteniéndose las siguientes resultados.

Cuadro 6.-Muestra los pesos en gramos, y consistencias del AGMP sólido, obtenido por evaporación de diferentes muestras.

Cantidad en mi del Sin madre AGMP sólido en gr AGMP sólido Apariencia del sólido AGMP En 1 It de AGMP 800 21. 4 53. 5 Viscoso café obscura jE 20 5 51. 25 Viscose y café oscura 800 18.2 45.5 Viscoso y café oscuro 800 16.17 40.42 Viscoso y café oscuro 800 21.6 54.0 Viscoso y café oscuro 800 20.0 52.5 Viscoso y café oscuro 800 22.6 56.5 Viscoso y café oscuro 80 17. Et 44.5 Viscoso y café oscuro

CONCUISIONES A) SYMPA Se conclue que el AGMPa obtenido de este process de fermentación usado EN FORMA DILUIDA es más potente que el ácido giberelico GA3, en su efecto biológico en plántulas de lechuga, observándose que a medida que se diluye el producto provoca un crecimiento en las plántulas iniciando su optima efecto en las diluciones más bajas.

Las técnicas de cromatografía en capa delgada y cromatografía líquida de alta resolución demostraron la presencia de un producto diferente de ácido giberélico (GA3) (figura) y 2).

B) AGMP También se concluye que el Activador General del Metabolismo de las Plantas (AGMP) tiene su mayor efectn al diluirse a cantidades extremadamente pequeñnas como 1 : 10 000, OBUB Lu CUAL SUBIERE LA PRESENCIA DE UN NUEVO PRODUCTO D DE UN INHIBIDOR O SUPRESOR COMO EL ACIDO FUS#RICO (ACIDO PICONILICO) QUE SE PRODUCE A UNA TEMPERATURA DE 35 C Y EN UNA CANTIDAD 20 VECES MENER QUE LAS GIBERELINAS, Y DUE TIENE UN EFECTO MAJOR QUE CUALQUIER REGULADOR DE CRECIMIENTO CONOCIDO AL DILUIRSE, POR LO QUE A ESTE PRODUCTO HAY QuE USARLO DE UNA MANERA DIFERENTE UNICA En comparación con los otros reguladores de crecimiento como el GA3.Lo cual también se comprobó en campo(Cuadro 7 y 8 ; figuras 13 y 14).

BIOENSAYOS REALIZADOS PREPARACION DE SOLUCIONES A) Preparación de GA3 que se usa en campa, diluido al 10%. Dando una concentración del mg/ml.

I. Se pesan 100 mg de GA3 (10%en un soporte inerte) 2. Sé aforan a 19 mis de etanol 3. Se envaso, rotutn y se guardo en el refrigerador B) Pracedimiento para la preparación de concentrado de GA3 puro. lmg/ml 1. Se pesan ID mg de GA3.

2. Se aforan a 10 mis de etanol 3. Se envaso, rotulo y se guardo en el refrigerador

C) Satucinnes del AGMPa (provienen de 20 ml del medio AMP y es extraída con acetato de etílo), el extracto súlids resultante ASMP se disolvió en etanol en el menor volumen posible (lml) y se hicieron las siguientes diluciones las cuales se etiquetaron con las letras sol y un numern : Tablal de soluciones del AGMP Número de Snluci6n (Sln) Dilución cnrrespondiente SjnJS----------------) :) []-------------------.- Sin 7-----------------) :) [] [)--------------------- Sln 11---------------------------------------------------------- I : ID OOD------------------------------------- Sjnj)---------------------) :) [] [) [] []--------------- Sn7-------------------) :) [] [] [] [j []----------------- Sn)---------------- :) (] [) [] [] [] []-------------- Stn2--------------- :) a Mf] [) [] []---------------- Sin ; n3------------------- : fao Baa Mn------------- sn4------------------- :) a [] [) üM nnn-------------. StnS---------------- : 2tH] [t Mu [] [) ;]------------- s) n) 4------------- : 3aü [] [íaa n------------- sn5----------------) : tü aaü oaü aüa------------ Sln ng-.------------).-4onnanDaos----'------------- Sin 6--------------------;-------------------------------------1 6666DDD DOO------------------------------------------------- SjnB-----------------) : BBBB Ma üM------------ Sin 6 1. 66660U0 00 Sin ! n) 2--------------) : 7a [] [] nan Mt]--------- s3-------------------hsaaa Mn n [] []-------4-- sin n) 5----------------- t.-gnnonMaoa------------- Sin g----------------) OOD DDD DOD---------------------------------------------- Sln 20---------------------------------------------------------- I : IODO 000 DDD DDD---------,----------------------------------- sn2)-------------) :) n uno nnn üan [jga---------- s ! n22---------------) :) [] n na)] aan naa aan-------- 23------------).-) n [] n nnn nm otjoooo--------- s) n 24-------------) : ta Ma aM non nnn [) [] []--------

BIOENSAYO CUN SEMILLAS DE LECHUGA Desarrollo del bioensayo : 1.-Se preparan 2 soluciones de GA3 comerciales una diluido al ID% al que se etiqueto como GA3 y el otro no esta diluidn y le etiqueto como GA3 puro, estos son controles positivos.

2. -Se hacen diluciones en tubo según la solution requerida del AGMPa 3.- Se colocan el papel filtro, y se dispersa las 20 smillas de lechuga.

4. -Se agregan las aguas, controles positivos de GA3 y las soluciones de AGMP u AGMPa según corresponda en las cajas petri.

5.- Se incuban a 30° C por 5 dias 6.-. Se hacen las lecturas y se sacan las medias

Resuhados Tsars poins y figuras AGMPa- BIOENSAYO DE HIPOCOTILO <BR> <BR> Cuadro 7.- Muestra el efecto de saluciones de AGMP (diluiclas y concentradas) observándose un@ inhibiciún en el<BR> @@@@@@@@@@@ en las soluciones concentradas y una estimulacion de las soluciones diluidas de soluciones, se hicierun con respectivos testigos. SnJuciánPromBdiadE crEcimiEnto dB hipncntitndE Echugaen mm H29 destilada 13 H20 patable 15 GA3 0. 1 ppm 31 GA3 t ppm 31 ArMPa 1 : 1 5 AGMPa 1 : 100 7. 5 AGMPA 1 : 1 DUO la AGMPaHanO) 0 AGMPa 1 : 100 aaa) 13 AEMPaHanaon) 3 ASMPal : lDDD DDD 15 AEMPaHanannon20 PBMPB 1 : 190 aun Búa 24 AEMPamMüMÜ24 MMPahtanacaonaüsn AGMPa 1 : 10 009 999 099 37. 5 AGMPa 1 : 1 OUU 00 U0 36 AEMPA 1 : 1999 BUB 999 999 3B AEMPaHnüanasnaQMase

AGMP- BIOENSAYO DE HIPOCOTILO Tabla de soluciones y promedios del AGMP Cuadro 8.- Muestra el efecto de soluciones de AGMP (diluidas y concentradas) observándase que no hay inhibición en el crecimiento en las soluciones concentradas, se hicieron can respectivos testigos.

Sa) Promedin de creeimienta de hipaeatilas de lechuga en mm H29 desdada) 3 H29 putable 14 GA3 9. 1 ppm su GA3 I ppm 30 AGMP 1 : 19 14 AGMP 1 : 199 13 AEMPtJOOn) 5 AGMP 1 : 1 OU 15 AMP 1 : 19 999 t4 AGMP 1 : 199 999 15 AGMP 1 : lDDD DDD 16 AMP 1 : 19 999 099 21 AGMP I : IBU 099 989 25 AGMP 1 : 1999 909 OOD 32 AGMP 1 : 19 909 990 990 37 AGMP 1 : 109 999 009 999 37 AEMpHoaanaaQnQa, 37 AEMpmaonaüonaa. 37 AGMP 1 : 1000 DOODDOODO 36

Bioensayus en camps.

Para preparaciones en campo se hicieron los cálculos correspondientes según la tabla 3 de soluciones siguiente: Nombre 0 numero de Producto Concentración AGMP Producto puro (Líquido) SI'n madre AGMP (se parte de esta solución + alcohol AGMP + alcohol (1:1) para las soluciones siguientes Sln 18 1 : 19 Sln 17 1:100 Sln 16 1:1000 Sln 11 1 : 10 000 Sin 7 1 : 100 000 Sln 1 1 : 1000 Don Sln 2 1:10 000 000 Sln 3 1:100 000 000 Sin 4 1:1000 000 000 Sln 8 1:10 000 000 000 Sln 14 1:100 000 000 000 Sin 5 1:1000 000 000 000 Sin 9 1 : 4000 000 DUO 000 Sln 10 1 : 5000 000 000 000 Sln 6 1:6666 000 000 000 Sln 12 1 : 7000 una 000 una Sln 13 1:8000 000 000 000 Sln 15 1 : 9000 000 000 000 Sin 19 1:100 000 000 000 Sin 20 1 : 1000 000 000 000 Sln 21 1:10 000 000 000 000 Sln 22 1 : 100 000 000 000 000 Sln 23 1:1000 000 000 000 000 Sln 24 1 : 10 000 000 Don 000 non

Tabla 4 para preparar diferentes cantidades de la soluciúm 4(1:1000 000 000) volumen a preparar Cantidad de sin 4 requerida 1300 mts3 (1 ha) Preparar una solución 1:10 de la son madre AGMP (100 ml de la sin madre AGMP + 900 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solucibn se toman 1.3 ml y agregar a la cantidad de agua requerida para regar una ha u 1300 m3 de agua 10 mts 3 Preparar una solución I : 100 de la son madre AGMP(10 ml de la sin madre AGMP + 990 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 mi y agregar a la cantidad de 10. m3 de agua. 100 Its Preparar una solución 1 :10 000 de la son madre AGMP ( 0.0001 ml de la sln madre AGMP + 999. 9 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 ml y agregar a la cantidad de 100 It de agua. 3D Its Preparar una solución 1 : 109 99D de la son madre AGMP ( 0. 00001 ml de la sln madre AGMP+ 999. 99 ml de alcohol) para 1 litru/de esta solución se toman 3 ml y agregar a la cantidad de 30 It de agua. la Its Preparar una solución 1:100 000 de la son madre AGMP( 0. 99991 ml de la sin madre AGMP + 999. 99 ml de alcohol) para 1 litro/de esta sduciun se toman 1 ml y agregar a la cantidad de 30 It de agua. 3 Its Preparar una solución 1:100 000 de la son madre AGMP ( 0. 99991 mí de la sin madre AGMP + 999. 99 ml de alcohol) para I litru/de esta solución se toman 3 ml y agregar a la cantidad de 30 It de agua. 1 It Preparar una solución 1:100 000 de la son madre AGMP ( 0. 00001 ml de la sin madre AGMP + 999. 99 ml de alcohol) para 1 litrn/de esta solución se toman 0. 1 ml y agregar a la cantidad de 30 It de agua. Preparar una sulución 1 :1 000 000 de la son madre AGMP ( 100 ml 0.000001 ml de la sln madre AGMP + 999. 999 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 mi y agregar a la cantidad de 199 mi de agua. ID ml Preparar una solución 1:10 000 000 de la sln madre AGMP ( 0.0000001 ml de la sln madre AGMP + 999.9999 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 ml y agregar a la cantidad de 19 mi de agua.

Tabla 5 para preparar diferentes cantidades Solución 5 (1;10,000; 000 000)

Volumen a preparar Cantidad de sin 4 requerida 1300 mts3 (1 ha) Preparar una solución 1 :100 de la son madre AGMP (19 ml de la sin madre AGMP + 990 mi de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1. 3 ml y agregar a la cantidad de agua requerida para regar una ha a 1300 m3 de agua 10 mts 3 Preparar una solución 1:1000 de la son madre AGMP (1 ml de la sin madre AGMP + 999 ml de alcohol) para 1 litro/de esta soiucion se toman 1 ml. y agregar a la cantidad de u m3 de agua. 199 Its Preparar una solución 1 :100 000 de la son madre AGMP( D. 00001 ml de la sln madre AGMP + 999. 99 ml de alcohol) para 1 litra/de esta solución se toman I ml y agregar a la cantidad de 100 It de agua. 30 Its Preparar una solución 1 : 1000 000 de la son madre AGMP ( 0. 000001 ml de la sln madre AGMP + 999. 999 ml de alcohol) para I litrn/de esta solución se toman 3 ml y agregar a la cantidad de 30 It de agua. 10 Its Preparar una solución 1 : 1000 000 de la son madre AGMP ( 0. 000001 ml de la sln madre AGMP + 999. 99 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 mi y agregar a la cantidad de 30 It de agua. 3 Its Preparar una solución 1:10 000 000 de la son madre AGMP ( 0. 0000001 ml de la sln madre AGMP + 999.9999 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 3 ml y agregar a la cantidad de 3D It de agua. 1 It Preparar una solución 1:10 000 000 de la son madre AGMP ( 0. 0000001 ml de la sln madre AGMP + 999.9999 ml de alcohol) para 1 litro/de esta solución se toman 1 ml y agrgar a la cantidad de 30 It de agua. Preparar una solución 1:100 000 000 de la son madre 100 ml AGMP(0.00000001 ml de la sln madre AGMP + 999. 99999 ml de alcool) para 1 litro/de esta solución se toman) mi y agregar a la cantidad de 100 ml de agua. 10 ml Preparar una solución 1:1000 000 000 de la sin madre AGMP (0. 000000001 ml de la sin madre AGMP + 999.999999 mi de alcool) para 1 litro/de esta solución se toman I ml y agregar a la cantidad de tu ml de agua.

Estas soluciones fueran las que se probaran en campo en las cantidades indicadas. Para volúmenes pequeñus se hacen mediante diluciones, para poder tomar la cantidad indicada para preparar la solución correspondiente.

Para una buena presentación visual del producto líquido. Se agrega 0. 1 g/litro de alcohol que puede ser etanol o metanol, de un colorante verde esmeralda que se utiliza en alimentas. Todas las soluciones se pueden colocar en un supurte inerte como algadón, papel o tela, etc., según la solución correspondiente y por evaporación el principin activa se queda en el soporte y para usarse se coloca el algadón en una determinada cantidad de agua, se agita y se agrega esa agua con todo el y soporte, al agua final con la que se regara el cultivo. Este soporte puede tener diferentes coloraciones según e I cultivo.

También se realizó un estudio de cadusidad del producto AGMP ya preparada para su usa en campo, realizándose primera pruebas en laboratorio en hipocotilos de lechuga, mostrando una actividad de 3 meses después de prepararse en agua. Las soluciones evaluadas fueron 4 (1 :1, 1000;000 000) y la solución 5 (1;10,000; 000 000). Se hizo el experimento semanalmente para evaluar cada una de las soluciones y se realizaron las promedios por cada mes, El resultado del cuarto mes sala muestra la evaluación de la primera semana.

Cuadro 9.-Muestra la caducidad de AGMP comparado can agua potable y destilada, y con GA3 a0.1 ppm y 1. 0 ppm. Solución Promedio de1 Promedio del Prumediz del Promedis del Crecimiento del Crecimiento del Crecimienta del Crecimiento del hipocotilo en el hipocotilo en el hipocotilo en el tercer hipocotilo en el primer mes evaluadas primer segundo mes evaluadas cada primer cuarto cada semana evaluadas cada semana evaluadas cada semana semana (mm) (mm) (mm) (mm) H2 destilada 14 15 12 13 H2O potable 14 13 14 15 GA3 D. Ippm 29* 15 15 14 GA3 1.0 ppm 32* 15 13 14 Solución 4 33 30 24 14 Solución 5 38 33 28 15 * El GA3 perdió su potencia al siguiente dia de su preparación, en cnndicinnes ambientales.

Aplicación de las soluciones anteriores en campo.

RESULTAOOS: Observaciones y/O porcientos(%) generales. EI incremento de la cosecha correspondiente puede variar según las condiciones de cultiva, ya que en cultives con eandieiones tantu de suelo como ambientales adecadas, si se observa un incremento en

calidad y en cantidad de la cosecha, pers es más notoria en cultivos que sufren condiciones como suelos no tratados con agroquímicos, fertilizantes, mejaradores de suelo,"stress"de agua, u ntras condiciones adversas como inundacinnes, heladas etc.

Pur la que el parciento de incremento de una cosecha puede variar 20-100%.

A)Citrícos.

-Diferentes pruebas en este cultivo demostrarnn que la solución 4 y 5 estimulan los siguientes efectos en las plantas : a) un aumenta en la floración, mayar amarre de fruto y par la tanto aumento la productividad de la cosecha, aumento en algunas veces del tamaño de fruto. b) Mejor calidad de fruto mejor sabor, c) Comparado con los testigos, en sequía, en iguales condiciones (sin agua de riego), se nbservó resistencia sequfa. Pudiéndose recolectar fruto a pesar de estas condiciones, este fruto es algo pequeño, pero muy dulce, pudiéndose utlizar para jugo. d) Se ha observado que aplicado a pequeños citricos (tamaño y edad) produce floración y amarre de fruto, el cual Ilega a su maduración. En invierno se ha observado que las árboles sin hojas, se Ilenan de flores. Se ha observado también resistencia a heladas.

B)Maíz.

Se ha observado en este cultivo, mayor crecimiento de la planta, y mayor número de olotes (hasta 5 por plantas).También mejora la calidad del producto ya que aumenta la cantidad de proteínas del mismo, grano más grande.

Estimula un aumento en la cosecha de un can mejor sabor.

C)Papa.

Produce un aumento de la productividad y unifarmidad de la misma, también se obtiene mayor cantidad de papa de primera.

D)Higueras.

En este cultive se ha observado un aumento en productividad, inclusive todo el año, con frutos de gran sabor, más compactos y menus parecederos. También serealizaron esquejes (pequeñas porciones de la plantas se transplantaron, fuera de temporada y se togro el enraizamiento de las mismas. Obteniendo mas árbofes.

F)Calabazas.

Aumenta la cantidad, calidad y resistencia a condiciones de sequedad.

G)Tomate Aumenta la cantidad, y calidad del mismo, también se observa que en condiciones de inundación el cultivo sobrevivió a estas condiciones, pudiéndose usar el fruto para puré, de las testigos no se recupero el fruto (perdida total de la cosecha).

11)Flátano Aumenta la cantidad y calidad del mismo.

I)Flores.

Provoca mayor cadidad, mayor tamaño y cantidad de la misma, también se observa que sobreviven con flores y en invierno (plantas que son de una temporada) comparadas con plantas de las mismas no tratadas.

J)Nopales.

Aumenta la cantidad de nopales.

K)Perales.

Aumenta notablemente el numero de flares y amarre de frutos de tal manera que el fruto se da en racimos, y mejorando el sablier.

L)Duraznos.

Aumenta el numero y el tamaño y sabor de tas mismas.

N) Samares Provúca un aumento espectatular del mismo, se observan raíces fuerte, y se ve más verde y con más sácate, cuyo uso puede ser para alimentar ganado o decorativo etc.

N)Cebollas Aumenta et tamaño, cantidad y mejor sabar.

Ñ) Manzanas.

Inicia la producción d e manzanas en lugares no propicios para ella a temperaturas altas mayores de 4D eG, la manzana prnducida es de excelente sabor y es producida por árboles jóvenes. Es importante mencionar que la manzana requiere estimulo de fríii u estimda químico para la floración y producción de fruto.

HACER M#S ESTUDIOS

Es necesaria hacer mas estudios en campo para evaluar tudos los factores de estres a los que se enfrentan las plantas como: a)Salinidad.-Es factible que aumente la resistencia a sequía pur desarrolla de una raíz más profunda y más fuerte. b)Acidez (debido a la Iluvia ácida por contaminación). c) Resistencia a heladas.- El producto ha demostrado en plantas sensibles. resistencia ha este factor ambiental.

Mayor resisbencia a este actor por desarrollo mas fuerte de la planta, ya que soporta que plantas tratadas harr sobrevivida tanto al frro como al calor a sequedad excesiva.

B) Activador General del metabolismo de animales (AGMA) y Activador General del Metabolismo de humanos (AGMH) También provoca efectos deseables o positives en animales y humanos en bajas diluciones, na siendo toxic ninguna dilución.

Uso del producto en animeles.

El producto usado es la solución 4 (1:1,000, 000 000), diluido en licor de diversos sabores, en tequila, en alcohol etilico, en vinos y se aplican 4 n 5 gotas en la lengua en el día cabe mencionar que si se toman tado el producto en un instante na les causa ningún daño.

Se realizaron estudias prímeramente en gatos, iniciando con la solución 4 (1:1,1000;000 000) y Hegandu a la diluciun 1:1000(solución 16) par vía oral, observándose, que las gatos aumentaron de tamaño. de peso, y siempre estuvieron muy sanos, también se observa un zambia en conducta que se hacen cariñosos, y también, se ve aumentado el deseo y cantidad de relaciones sexuales de ellos.

Se realizu un estudio en puilo, 50 individuos, sulo comiarr en el dia (no de nuche) y se observu un aumenta en un 30% de su pesn, con un gran sabor.

También, se han observado en pallos caseros, desde chiquitos se le din la solución, lo siguiente, unas crecieron muyaltas (patas largas) y otros no crecieron tantos, pero eran de cuerpo grande. También con un comportamiento diferente, siempre juntos, les gusta estar con las personas que las crían.

En perros disminuye su agresividad, son más cariñosos. Frecen más, y más sanns.

Se probaron las soluciones desde el PRE concentrado hasta solución 4 (1 : 1000;000 000), en ratones y no se observó efectu táxico.

Se observa una gran actividad sexual, que results en un gran número de crías, de muy buen tamaño.

Sobrelabasede estas observarJinnes se concluyo que el producto no era tóxícíi y que tiene otras propiedades dignas de "explotar".

Experimento 1. Se realize un estudia con 60 ratones de ambos sexos, divididas en grupos de 20, y en las mismas condiciones de alimentación y temperatura. Al grupo testigo se le dio de beber agua, el grupo 1 tamó una solución 1:100 del AGMA (Activador general del metabolismo de animales) y el grupo Il tumo una solución 1:1000, 000 000 del AGMA Se tomo su peso antes de iniciar el experimento. Se pesaban 2 veces por semana y se observa su comportamiento.

Resultando en un aumento de peso, mucha actividad sobre todo sexual.

Cuadro 10.- Muestra resultados del incremento en peso de ratones tratados con la solución 4(1:1000 000 000) ER (20ratones por PESO PROMEDIO % de incremento del peso Erupt) testigo 28. 25 g Grupol (1 : 00 AGMA) 33.06 g 17% Groups 11(1:1000 000 000) 36.26 g 28%

Se observó aumento de peso y gran actividad sexual.

Experimento 2. Se realizó un estudio con 40 pollos machos, divididos en grupos de 10 y en las mismas condiciones de alimentación y temperatura. AI grupo # testigo se le dis de beber agua, el grupa 11 tamo agua con AGMA diluido 1:1000 000 000 y se le inyecto I ml de la misma una vez par semana, al grupo III se le inyecto, una vez por semana I ml de la solución AGMA diluido 1: 000 000 000 y toma agua putable, al grupo IV tomo la solución de AGMA diluido 1000 000 000. Se concluyá este experimento a las 8 semanas los animales se pesaron y se sacrificaron.

Cuadro 11.- Muestra un incremento en peso de pallos que tomarun y/u se les inyecto la solución 4 (1:1000 ;000 000).

GRUPO Pesa inicial de las Pesa final al concluir 8 % de incremento pDIIos. Promedio semanas comparado con el testigo Grupol Testigo 48.9 gr I, 667 gr ------- Grupo II (Inyectado y 49.3 go 2,199 gr 31.9% tomado) Grupo III(inyectados) 48.0 gr 2,170 gr 30.0% Grupo IV (tamadn) 50.0 gr 2,011 gr 20.0% Humanos: Activador gemeral del metahalismo da humano (AGMH).

Sobre la base de esto empecé a usar este producto en mí, en la solución 4 (1:1000;000 000), observe que tenía más energía.

Después de un tiempo mis familiares quisieran usarlo, provocando en ellos resultados similares, en los jávenes, se observa mejor cuerpo, como si hicieran ejercicio, por la que ellos Ilamaron al producto "fortachón".

Se uso el productu en diferentes personas y todos manifestaran que tenían mucha"Energía"no se cansaban fácilmente.

También se lo usaron unos conocidos que tenía problemas de impotencia, manifestandn que volvieron a la normalidad.

En personas normales provoca mayor actividad sexual tanto en hombres como mujeres.

Se hiza un estudio 16 personas donde se evaluó la fatiga, el cansancio, la actividad sexual y el comportamiento. Se evaluó de la siguiente manera : Cuadro 12.- Se realizo una evaluaciún de diferentes parámetros para medir la vitalidad en el ser humano.

+= buenn ++=muy bueno +++= excelente Humera de individua Fatiga Cansancio Actividad sexual Carácter 1-+ + + + + ++ + 2 ++ ++ +++ + zu 5 +++ ++ +++ + .,. .,..,. E + + + ++ + + 9 + +++ +++ +++ la... ++ ++ ++ 11 ++ + + 12 + ++ +++ + 13 ++ + ++ + 14 +++ + ++ + 15 + ++ +++ + 16 ++ ++ + En general las personas manifestaron sentirse muy bien, sin cansancio, y con gran actividad sexual, manifestarun ser más felices con sus respectivas parejas.

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