GENES CODANT POUR LA CIS-LABD A-12,14-DIEN-8 ALPHA-OL (CIS-

ABIéNOL) SYNTHASE ET LA SKV-COPALYL-8-OL DIPHOSPHATE SYNTHASE ET LEURS UTILISATIONS

Domaine de l'Invention

La présente invention se rapporte à des gènes impliqués dans la synthèse du czs-abiénol et leur utilisation pour la préparation de celui-ci dans des organismes vivants tels que les bactéries, les levures, les cellules animales et les plantes.

Introduction

Les terpènes forment une classe nombreuse de molécules naturelles que l'on trouve dans tous les organismes vivants (bactéries, champignons, animaux, plantes). Chez les plantes, ils jouent des rôles variés, notamment dans l'attraction d'insectes bénéfiques pour la plante, et dans la défense vis-à-vis de pathogènes (bactéries, champignons, insectes). Les terpènes sont constitués de multiples d'unités isoprényles à 5 carbones. Le nombre d'unités isoprényles permet de les classer notamment en monoterpènes (composés à dix atomes de carbone ou ClO), sesquiterpènes (C 15), diterpènes (C20), triterpènes (C30), tetraterpènes (C40) et polyterpènes (>C45). Les voies de biosynthèse des précurseurs des terpènes ont largement été décrites dans la littérature (voir par exemple, Eisenreich et al, 2004). Les précurseurs universels de tous les terpènes sont l'isopentenyl diphosphate (IPP) et le diméthylallyl diphosphate (DMAPP). Deux voies distinctes conduisent à la formation de l'IPP et du DMAPP. L'une, la voie du mévalonate (MEV) est localisée dans le cytoplasme alors que l'autre, la voie du méthyl-erythritol (MEP), n'existe que chez certaines bactéries et les plantes où elle localisée dans les plastes. Toutes les étapes et les gènes codant les enzymes de ces deux voies sont connus. A partir des précurseurs, la première étape de la biosynthèse des terpènes est réalisée par des trαns-prényltransférases qui vont par condensation des deux précurseurs, l'IPP et le DMAPP, générer des chaînes de carbones constituées d'unités isoprényles (C5) de longueur variable. Ainsi, l'addition séquentielle d'une unité d'IPP à un DMAPP produit du trans- géranyl diphosphate (GPP, ClO), puis à partir du GPP du trαns, trαns- farnésyl diphosphate (FPP, C 15) et enfin à partir du FPP du trαns, trαns, trαns-géranyl géranyl diphosphate (GGPP, C20). Ces chaînes de prényl diphosphates de longueur variable sont les substrats d'une classe d'enzyme, les terpènes synthases qui permettent la formation du squelette de base des terpènes cycliques ou acycliques en ClO (monoterpène), C15 (sesquiterpène), C20 (diterpène), C30 (triterpène)

(Cane, 1999; McMillan and Beale, 1999; Wise and Croteau, 1999). La diversité de réaction de ces enzymes est à l'origine de la diversité des squelettes terpéniques cycliques que l'on retrouve dans la nature.

Le tabac cultivé {Nicotiana tabacum) produit au niveau de ses trichomes, ou poils sécréteurs, une sécrétion dont plus de la moitié est composée de diterpènes appartenant à deux classes, les cembranes et les labdanes. Parmi les labdanes, le czs-abiénol est le composé majoritairement produit par un grand nombre de variétés de tabac (N. tabacum). Chez certaines variétés, la quantité de czs-abiénol peut représenter plus de 1% de la matière fraîche des feuilles. Le czs-abiénol participe positivement aux caractéristiques aromatiques des feuilles de tabac. Il peut également être utilisé comme précurseur dans la synthèse d'ambroxides, molécules utilisées dans l'industrie de la parfumerie.

Dans la famille des labdanes, d'autres molécules ont été caractérisées comme par exemple :

(i) le sclaréol qui est présent dans les tissus floraux de la sauge sclarée

(Salvia sclarea) mais également produit dans le tabac en réponse aux pathogènes ;

(ii) les oryzalexines et les phytocassanes produites chez le riz en réponse aux attaques de pathogènes ; et

(iii) les gibbérellines et leur précurseur, la ent-kaurene.

Il a été démontré que la biosynthèse du squelette labdanoïde à partir du GGPP nécessite deux étapes. Dans une première étape, le GGPP est transformé en ent- ou syn- copalyldiphosphate (ent- ou syn-CDP) par la ent- ou syn-copalyldiphosphate synthase (ent- ou syn-CPS), respectivement. Dans une seconde étape, le CDP est transformé en une oléfine labdanoïde par une labdane synthase. Les gènes codant pour ces deux types d'enzymes ont été clones chez de nombreuses plantes. Par exemple, chez Arabidopsis, les gènes AtGAl (Sun et al., 1994) et KX.GA2 (Yamaguchi et al., 1998) sont impliqués dans la biosynthèse des gibbérellines et codent pour la ent-copalyldiphosphate synthase (ent-CPS) et la ent-kaurene synthase, respectivement. Chez le riz, deux gènes codent pour la ent-CPS (OsCPSl et OsCPS2) et un gène pour la syn-CPS (OsCPS3). OsCPSl est responsable de la biosynthèse du précurseur des gibbérellines, la ent-kaurene (Sakamoto et al., 2004). OsCPS2 et OsCPS3 sont impliqués dans la biosynthèse des précurseurs de plusieurs

phytoallexines de type labdane (ent-cassa-\2 ;15-diene ; ent-sandaracopimaradiene ;

Stemar-13-ene ; 9β-pimara-7,15-diene). Il existe dans le génome du riz neuf gènes homologues à la kaurene synthase d'Arabidopsis, notés OsKSl à 9 (Sakamoto et al, 2004). L'analyse de mutants déficients en acide gibbérellique a permis de démontrer que OsKSl code pour la ent-kaurene synthase (Sakamoto et al, 2004). Par ailleurs, la fonction de plusieurs OsKS a été déterminée in vitro après expression chez E. coli. Par exemple, OsKS7 et OsKSlO codent pour la ent-cassa-12,15-diene et la ent-sandaracopimaradiene, respectivement.

Chez le tabac, une activité de type czs-abiénol synthase a été détectée dans des cellules extraites à partir de trichomes. Cependant, les gènes codant pour la biosynthèse du cis- abiénol à partir du GGPP n'ont pas été identifiés. Comme pour l'ensemble des labdanoïdes, une molécule de type CDP est un intermédiaire probable dans la biosynthèse du czs-abiénol (Fig. 1). Plus particulièrement, la structure du czs-abiénol suggère que l'intermédiaire soit le syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) (Carman and Duffield, 1993, Guo et al, 1994). D'autres diterpènes labdanoïdes sont dérivés du copalyl-8-ol diphosphate, comme le sclaréol ou le (13E)-labdene-8,15-diol. La syn-CODP synthase, dont la séquence était inconnue à ce jour, constituerait donc la première étape de biosynthèse de ces molécules à partir du GGPP.

II existe une forte demande de procédés qui permettraient de produire à moindre coût des terpènes d'intérêt tels que l'abiénol ou le sclaréol qui sont difficilement accessibles à la synthèse. La caractérisation de la voie de synthèse du czs-abiénol permettrait de mettre au point des méthodes de production de cette molécule, très utile en parfumerie, ainsi que d'autres diterpènes labdanoïdes pouvant être préparés par cette voie de synthèse.

Résumé de l'Invention

L'invention concerne les activités enzymatiques, les séquences peptidiques responsables de ces activités et les séquences d'acide nucléique correspondantes, responsables de la biosynthèse du czs-abiénol à partir de GGPP. L'invention concerne également des méthodes de production du czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci utilisant ces activités enzymatiques.

La présente invention concerne donc une méthode de production du czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de géranyl géranyl diphosphate (GGPP) dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS), ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la

SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol (= cz ^' s-abiénol) synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, c) facultativement, la récolte du czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture.

La présente invention concerne également une protéine isolée ou recombinante ayant une activité czs-abiénol synthase et ayant une séquence présentant au moins 95 % d'identité avec la SEQ ID No 24. Elle concerne aussi un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une telle protéine, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des conditions stringentes et ayant une activité czs-abiénol synthase.

La présente invention concerne en outre une protéine isolée ou recombinante ayant une activité syn-COVS et ayant une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22. Elle concerne aussi un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une telle protéine, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des conditions stringentes et ayant une activité syn-COVS.

La présente invention concerne une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant une cassette d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention, une cellule hôte comprenant un vecteur, une cassette d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention, et un organisme transgénique non- humain comprenant une cellule, un vecteur, une cassette d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention.

La présente invention concerne l'utilisation d'une protéine, d'un acide nucléique, d'une cellule hôte ou d'un organisme transgénique selon la présente invention pour la préparation de syn-CODV ou de cz ^' s-abiénol ou de dérivés de ceux-ci.

La présente invention concerne enfin une cellule ou un organisme transgénique non- humain, caractérisé en ce que la voie de synthèse du czs-abiénol est bloquée par inactivation du gène codant pour une syn-COVS selon la présente invention ou du gène codant pour une czs-abiénol synthase selon la présente invention ou des deux gènes.

Brève Description des Figures

Figure 1 : Schéma de la biosynthèse du czs-abiénol à partir du géranylgéranyl diphosphate selon Carman and Duffield (1993). syn-CODP : syn-copalyl-8-ol diphosphate; czs-abiénol : czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol ; A : syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS) ; B : czs-abiénol synthase (ABS) C : Phosphatase.

Figure 2 : Niveau d'expression de fragment de gènes de tabac codant pour des protéines apparentées aux CPS et aux KS. L'analyse quantitative de l'expression a été réalisée sur des ADNc par PCR quantitative en temps réel avec des amorces spécifiques de chacun des gènes. Les ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN totaux isolés de feuilles et de trichomes de feuilles de tabac. Figure 2A) Niveau d'expression des gènes dans les trichomes par rapport à celui des feuilles. L'axe des ordonnées représente le rapport de la valeur obtenue dans les trichomes sur celle obtenue dans les feuilles. Figure 2B) Niveau d'expression des gènes par rapport au gène NtCBTS-02 dont l'expression est trichome spécifique. L'axe des ordonnées représente le rapport des valeurs obtenues dans les trichomes sur la valeur obtenue pour le gène CBTS dans les trichomes. NtCBTS-02 : CBT- ol synthase (NID:AF401234) ; NtCYP71D16B : CBT-ol hydroxylase similaire à CYP71D16 (NID : AF166332).

Figure 3 : Représentation schématique des ADN-T portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. km : gène de résistance à la kanamycine ; e35S : amplificateur du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur. CBTSter : terminateur du gène CBTS ; eCBTSl.O : promoteur de lkb du gène CBTS fusionné avec l'amplificateur du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur. NtCPS2 : phase codante du gène codant pour la

CPS de tabac (N. tabacum) ; NtKSL3 : phase codante du gène codant pour la CPS de tabac

(N tabacum). Figure 3A) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO58 ; Figure 3B) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO68 ; Figure 3C) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO69.

Figure 4 : Analyse des exsudats de plantes par chromatographie en phase gazeuse. Les exsudats des feuilles de plantes ont été extraits avec une solution de pentane et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse. Exemple de profils chromatographiques obtenus à partir d'extraits de feuilles de N. tabacum [Figure 4A], N. syîvestris [Figure 4B] et d'une lignée transgénique TO #3513 portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3 [Figure 4C]. La lignée transgénique #3513 a été obtenue à partir d'une lignée transgénique portant un transgène antisense de type ihpRNAi du gène CBTS. [1] czs-abiénol. Temps de rétention = 40.5 min ; [2] CBT-diol Temps de rétention = 43 min.

Figure 5 : Spectre de masse du pic correspondant au czs-abiénol obtenu après chromatographie en phase gazeuse réalisée à partir des exsudats de la plante #3513 portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. Figure 5A) Spectre de masse d'un standard de cis- abiénol. Figure 5B) Spectre de masse correspondant au pic N° 1 de la figure N° 4.

Figure 6 : Analyse des tests d'activité réalisés in vitro avec NtCPS2. Figure 6A) GC/MS des composés extraits du milieu de réaction. Figure 6B) GC/MS des exsudats des feuilles de N. tabacum extraits avec une solution de pentane. [1] czs-abiénol, temps de rétention = 41 min ; [2] CBT-diol, temps de rétention = 43,4 min ; [3] 9-beta labda-13-en-8,15-diol, temps de rétention = 48,1 min.

Figure 7 : Spectre de masse du pic N°3 de la figure 6 correspondant au 9-beta labda-13-en- 8,15-diol Figure 7A) Exsudats de N. tabacum . Figure 7B) Test d'activité réalisé avec NtCPS2.

Abréviations

CBT-ol : cembratrien-ol

CBTS : cembratrien-ol synthase czs-abiénol : czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol

syn-COOF : le 9-béta labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate ou le syn-copalyl-8- ol diphosphate syn-COVS : syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase ou 9-béta labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate synthase ou syn-CODP synthase CPS : copalyl diphophosphate synthase GC : chromatographie gazeuse GGPP : géranyl géranyl diphosphate KS : kaurene synthase ihpRNAi : intron hairpin ARN interfèrent MS : spectrométrie de masse

RACE : « rapid amplification of cDNA ends » SSC : « Sodium chloride-Sodium Citrate »

Description Détaillée de l'Invention La présente invention décrit donc pour la première fois les gènes codant pour les enzymes impliquées dans la voie de synthèse du czs-abiénol. En particulier, la présente invention concerne la caractérisation de la czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase (cz ^' s-abiénol synthase, ABS) de tabac qui permet la production de czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol (cis- abiénol), un diterpène appartenant à la famille des labdanes, à partir du 9-beta-labda-13-en- 8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODV). En outre, elle concerne également la caractérisation de la syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS) de tabac qui permet la production de 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODP) à partir de GGPP. Ces enzymes peuvent être utilisées pour la production de czs-abiénol ou de syn-COOF, in vitro ou in vivo dans des organismes transgéniques ou des cellules ou micro-organismes recombinants. Les organismes transgéniques, cellules ou micro -organismes tels que les bactéries, les levures, les cellules animales, d'insectes ou de plantes et les plantes ou animaux transgéniques sont considérés. Elles permettent également la production de composés dérivés du syn-CODV. Les procédés de la présente invention sont plus particulièrement applicables à la production de czs-abiénol dans les plantes possédant des trichomes glanduleux de type sécréteurs. La production de czs-abiénol peut également être diminuée ou supprimée dans des plantes, par exemple le tabac, par des techniques d'extinction de gènes.

La présente invention concerne donc une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-COPS, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une czs-abiénol synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No

24 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, c) facultativement, la récolte du czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture.

Dans un mode de réalisation particulier, le czs-abiénol produit est récolté à l'étape c). Dans un autre mode de réalisation particulier, le czs-abiénol produit est le produit de départ pour obtenir un autre composé d'intérêt comme l'Ambrox®.

Par « syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase » ou syn-COPS est entendue une enzyme capable de produire du 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODV) à partit du GGPP (géranyl géranyl diphosphate).

Par « cz ^' 5-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase » ou czs-abiénol synthase ou ABS est entendue une enzyme capable de produire du czs-abiénol ou czs-labda-12,14-dien-8 alpha- ol à partir du 9-beta-labda- 13-en-8-ol- 15-yl trihydrogen diphosphate.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule produit du GGPP. Dans un autre mode de réalisation, le GGPP est fourni à la cellule.

Dans un mode de réalisation particulier, les deux cassettes d'expression sont portées par une même construction. Dans un autre mode de réalisation, les deux cassettes d'expression sont portées par deux constructions distinctes.

La présente invention concerne donc une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule recombinante ayant une source de GGPP et comprenant un gène hétérologue codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et un gène hétérologue codant pour une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24. Par « hétérologue » est entendu que ce gène a été introduit par génie génétique dans la cellule. Il peut y être présent sous forme épisomale ou chromosomique. L'origine du gène peut être différente de la cellule dans laquelle il est introduit. Par exemple, le gène est dit hétérologue car il est sous le contrôle d'un promoteur autre que son promoteur naturel, il est introduit dans un endroit différent de celui-ci où il est situé naturellement. La cellule hôte peut contenir une copie du gène endogène au préalable de l'introduction du gène hétérologue ou elle peut ne pas contenir de copie endogène.

La présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. De préférence, le polypeptide présente au moins 90 ou 95% d'identité avec la SEQ ID No 22. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 22. Ce polypeptide présente probablement une séquence d'adressage vers les plastes. Elle est située à l'extrémité N-terminale de la protéine et comprend généralement environ les 50 premiers acides aminés. Un tel polypeptide tronqué de la séquence d'adressage vers les plastes est également considéré. Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide selon la présente invention présentant une délétion des 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 acides aminés N-terminaux. Ce polypeptide peut également comprendre une séquence additionnelle permettant de faciliter la purification de l'enzyme, par exemple une séquence étiquette comprenant plusieurs acides aminés histidine consécutifs.

La présente invention concerne également un acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique codant un polypeptide ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. Un exemple d'acide nucléique est l'acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 21 ou une séquence complémentaire de celle-

ci. La présente invention concerne un acide nucléique isolé capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence à un acide nucléique qui code un polypeptide ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 21. La présente invention concerne également une cassette d'expression, un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique selon la présente invention. Les conditions de forte stringence incluent une étape de lavage d'environ 0,1 x SSC à 65°C.

Les acides nucléiques peuvent être des ADN génomiques, des ADN complémentaires (ADNc) ou des ADN synthétiques. Ils peuvent être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Dans le cadre de la présente invention, les acides nucléiques transcrits sont de préférence des ADNc dénués d'introns. Les acides nucléiques transcrits peuvent être des molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement ou comprenant des bases non naturelles. Il s'agit typiquement de molécules dADN isolées, synthétisées par des techniques recombinantes bien connues en soi de l'homme du métier.

La présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une activité de czs-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 24. Ce polypeptide présente probablement une séquence d'adressage vers les plastes. Elle est souvent située à l'extrémité N-terminale de la protéine et comprend généralement environ les 50 premiers acides aminés. Un tel polypeptide tronqué de la séquence d'adressage vers les plastes est également considéré. Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide selon la présente invention présentant une délétion des 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 acides aminés N-terminaux. Dans ce cas, la présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une activité de czs-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Ce polypeptide peut également comprendre une séquence additionnelle permettant de faciliter la purification de l'enzyme, par exemple une séquence étiquette comprenant plusieurs acides aminés histidine consécutifs.

La présente invention concerne également un acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique codant un polypeptide ayant une activité de cz ^' s- abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Un exemple d'acide nucléique est l'acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 23 ou une séquence complémentaire de celle-ci. La présente invention concerne un acide nucléique isolé capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence à un acide nucléique qui code un polypeptide ayant une activité de cz ^' s- abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 23. La présente invention concerne également une cassette d'expression, un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique selon la présente invention.

La présente invention concerne tout particulièrement un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence hétérologue codant un polypeptide ayant une activité de cz ^' s- abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24 et un acide nucléique comprenant une séquence hétérologue codant un polypeptide ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. De préférence, l'organisme transgénique est une plante, en particulier une plante à trichomes glanduleux.

La présente invention concerne une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP comprenant la mise en contact du GGPP avec une syn-copalyl-8- ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 dans des conditions appropriées et la récolte du cz ^' s-abiénol ou de dérivés de celui-ci obtenus. Elle concerne l'utilisation d'une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 pour la préparation de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP.

La présente invention concerne une méthode de production de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir du GGPP comprenant la mise en contact du

GGPP avec une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins

80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 dans des conditions appropriées et la récolte du syn- copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci obtenus. Facultativement, la méthode comprend en outre l'incubation du syn-copalyl-8-ol diphosphate obtenu avec une phosphatase et la récolte du 9-beta-labda-13-en-8,15-diol. La présente invention concerne l'utilisation d'une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins

80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 pour la préparation de 9-beta-labda-13-en-8-ol-15- yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP.

La présente invention concerne une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate comprenant la mise en contact du syn- copalyl-8-ol diphosphate avec une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 dans des conditions appropriées et la récolte du cis- abiénol ou de dérivés de celui-ci obtenus. Elle concerne l'utilisation d'une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 pour la préparation de cz ^' s-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate.

De manière générale, une cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à la transcription et traduction du gène en une protéine. Notamment, elle comprend un promoteur, éventuellement un amplificateur, un terminateur de transcription et les éléments permettant la traduction.

Le promoteur est adapté à la cellule hôte. Par exemple, si la cellule est procaryote, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Si la cellule est eucaryote et animale, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétro virus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et Russell (2000) ou encore aux techniques décrites dans l'ouvrage d'Ausubel et al. (2006)

Le vecteur peut être un plasmide, un pliage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi ά' Agrobacterium, etc. Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un marqueur. Le marqueur peut être un gène rapporteur qui engendre un signal détectable. Le signal détectable peut être un signal fluorescent, une coloration, une émission de lumière. Le marqueur pourra donc être GFP, EGFP, DsRed, la béta- galactosidase, la luciférase, etc.. Le marqueur est de préférence un marqueur de sélection procurant à la cellule une résistance à un antibiotique. Par exemple, le gène peut être un gène de résistance à la kanamycine, néomycine, etc.. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples de vecteurs procaryotes figurent dans la liste suivante qui n'est pas exhaustive : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen) et pQE-30 (QIAGEN). Des exemples de vecteurs eucaryotes figurent dans la liste suivante qui n'est pas exhaustive : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia);. Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc. De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral.

La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp, et Pseudomonas sp ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, Saccharomyces cerevisiaé) ou un champignon filamenteux (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. La cellule peut être isolée, par exemple dans un milieu de culture. Les cellules peuvent également être comprises dans des organismes, par exemple des animaux non-humains transgéniques ou des plantes transgéniques.

La présente invention concerne donc une méthode de production de 9-beta-labda-13-en-8- ol-15-yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir du GGPP dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate

(syn-CODP) synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression du gène ; et, c) facultativement, la récolte du syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture.

Dans un mode de réalisation particulier, le syn-copalyl-8-ol diphosphate produit est récolté à l'étape c). Dans un autre mode de réalisation particulier, le syn-copalyl-8-ol diphosphate produit est le produit de départ pour obtenir un autre composé d'intérêt comme le 9-beta- labda-13-en-8,15-diol. Par exemple, le syn-copalyl-8-ol diphosphate peut être transformé en 9-beta-labda-13-en-8,15-diol par une phosphatase. Ainsi, la méthode peut comprendre en outre à l'étape a) l'introduction d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une phosphatase, permettant ainsi la récolte de 9-beta- labda-13-en-8,15-diol à l'étape c). Parmi d'autres dérivés d'intérêt du syn-copalyl-8-ol diphosphate figure le sclaréol. La présente invention concerne donc une méthode de production de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule recombinante ayant une source de GGPP et comprenant un gène hétérologue codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22.

La présente invention concerne donc une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate dans une cellule ayant une source de 9 syn-copalyl-8-ol diphosphate, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et,

c) facultativement, la récolte du czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture.

Dans un mode de réalisation particulier, le czs-abiénol produit est récolté à l'étape c). Dans un autre mode de réalisation particulier, le czs-abiénol produit est le produit de départ pour obtenir un autre composé d'intérêt comme l'Ambrox®. La présente invention concerne donc une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn- copalyl-8-ol diphosphate dans une cellule recombinante ayant une source de syn-copalyl-8- ol diphosphate et comprenant un gène hétérologue codant pour une une czs-labda-12,14- dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24.

La cellule peut également être partie d'un organisme multicellulaire, par exemple une plante ou un animal non-humain. Dans ce cas, la méthode comprend : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la

SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une czs-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, c) la récolte du cz ^' s-abiénol produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques.

Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non- humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes glanduleux. La méthode permet de faire produire du czs-abiénol à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de cz ^' s-abiénol produit par des organismes le produisant déjà.

La présente invention concerne également une méthode de production de 9-beta-labda-13- en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci comprenant : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol

diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la

SEQ ID No 22; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, c) la récolte du syn-copalyl-8-ol diphosphate produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques.

Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non- humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes glanduleux. La méthode permet de faire produire du syn-copalyl-8-ol diphosphate à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de syn-copalyl-8-ol diphosphate produit par des organismes.

La présente invention concerne également une méthode de production de czs-abiénol ou de dérivés de celui-ci comprenant : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une czs-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, c) la récolte du cz ^' s-abiénol produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques.

Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non- humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes glanduleux. La méthode permet de faire produire du czs-abiénol à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de cz ^' s-abiénol produit par des organismes.

L'invention est notamment applicable à toutes les plantes de familles possédant des trichomes glanduleux, par exemple les Astéracées (tournesol, etc.), Solanacées (tomate, tabac, pomme de terre, poivron, aubergine, etc.), Cannabacées (ex Cannabis sativa) et Lamiacées (menthe, basilic, lavande, thym, etc.). Elle est particulièrement adaptée aux plantes de la famille des Solanacées, telles que par exemple des genres Solanum,

Capsicum, Pétunia, Datura, Atropa, etc., et en particulier du genre Nicotiana par exemple le tabac cultivé {Nicotiana tabacum), et plus particulièrement le tabac sauvage Nicotiana syîvestris. De manière non limitative, l'invention peut s'appliquer aux plantes des genres suivants : Populus, Nicotiana, Cannabis, Pharbitis, Apteria, Psychotria, Mercurialis, Chrysanthemum, Polypodium, Pelargonium, Mimulus, Matricaria, Monarda, Solanum, Achillea, Valeriana, Ocimum, Medicago, Aesculus, Plumbago, Pityrogramma, Phacelia, Avicennia, Tamarix, Frankenia, Limonium, Foeniculum, Thymus, Salvia, Kadsura, Beyeria, Humulus, Mentha, Artemisia, Nepta, Geraea, Pogostemon, Majorana, Cleome, Cnicus, Parthenium, Ricinocarpos, Hymennaea, Larrea, Primula, Phacelia, Dryopteris, Plectranthus, Cypripedium, Pétunia, Datura, Mucuna, Ricinus, Hypericum, Myoporum, Acacia, Diplopeltis, Dodonaea, Halgania, Cyanostegia, Prostanthera, Anthocercis, Olearia, Viscaria. De préférence, la plante est une plante de la famille des Asteracées, Cannabacées, Solanacées ou Lamiacées. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la plante est du genre Nicotiana, de préférence Nicotiana syîvestris ou Nicotiana tabacum.

Dans ce mode de réalisation, les gènes sont placés sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression, de préférence spécifique, dans les trichomes de la plante. De tels promoteurs sont connus par l'homme du métier.

Au sens de l'invention, on entend par promoteur "spécifique" un promoteur principalement actif dans un tissu ou un groupe cellulaire donné. Il est entendu qu'une expression résiduelle, généralement plus faible, dans d'autres tissus ou cellules ne peut être entièrement exclue. Une caractéristique particulière de l'invention réside dans la capacité de construire des promoteurs spécifiques des cellules sécrétrices des trichomes glanduleux, permettant une modification de la composition des sécrétions foliaires de la plante, et notamment d'y exprimer les gènes de la présente invention permettant de préparer le cis- abiénol. Ainsi, le syn-copalyl-8-ol diphosphate, le czs-abiénol ou des dérivés de ceux-ci peuvent être récoltés au niveau des trichomes de ces plantes, en particulier dans l' exsudât des trichomes.

Par exemple, il a été montré qu'une séquence régulatrice de 1852 pb, située en amont de l'ATG du gène CYP71D16, permet de diriger l'expression du gène rapporteur uidA spécifiquement dans les cellules sécrétrices de trichomes de tabac (demande US2003/0100050 Al, Wagner et al, 2003). D'autre part, plusieurs séquences promotrices

extraites de différentes espèces ont été identifiées comme étant capables de diriger l'expression d'un gène hétérologue dans les trichomes de tabac.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le promoteur utilisé dans la cassette est dérivé des gènes NsTPS-02a, 02b, 03, et 04 de l'espèce Nicotiana sylvestris possédant une forte similarité de séquence avec CYC-2 (CBT-ol cyclase; NID : AF401234). Ces séquences promotrices sont plus amplement décrites dans la demande de brevet WO2006040479.

Parmi les séquences terminateurs préférées, on peut citer le terminateur NOS (Bevan et al, 1983), et le terminateur du gène d'histone (EPO 633 317).

Dans un mode de réalisation particulier, la cassette d'expression peut comprendre une séquence permettant d'augmenter l'expression (« amplificateur »), par exemple certains éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5 290 924). De préférence, les éléments activateurs du promoteur CaMV35S sont utilisés.

L'introduction des constructions portant un ou les deux gènes de l'invention dans une cellule ou un tissu végétal, y compris une graine ou plante, peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, y compris sous forme épisomale ou chromosomique. Les techniques de transgenèse végétale sont bien connues dans le domaine, et comprennent par exemple l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, Pélectroporation, des techniques biolistiques, transfection par un vecteur viral notamment, et toute autre technique connue de l'homme du métier.

Une technique communément utilisée repose sur l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, qui consiste essentiellement à introduire la construction d'intérêt (acide

nucléique, cassette, vecteur, etc.) dans la bactérie A. tumefaciens, puis à mettre en contact cette bactérie transformée avec des disques de feuilles de la plante choisie. L'introduction de la cassette d'expression dans la bactérie est typiquement réalisée en utilisant comme vecteur le plasmide Ti (ou T-DNA), qui peut être transféré dans la bactérie par exemple par choc thermique. L'incubation de la bactérie transformée avec les disques foliaires permet d'obtenir le transfert du plasmide Ti dans le génome des cellules des disques. Ceux-ci peuvent éventuellement être cultivés dans des conditions appropriées pour reconstituer une plante transgénique dont les cellules comprennent la construction de l'invention. Pour plus de détails ou des variantes de mise en œuvre de la technique de transformation par A. tumefaciens, on peut se référer par exemple à Horsch et al. (1985) ou Hooykaas and Schilperoort (1992).

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la cassette d'expression ainsi constituée est insérée entre les bordures gauche et droite de l'ADN de transfert (T-DNA) d'un plasmide Ti désarmé pour le transfert dans des cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens. Le T-DNA comprend également un gène dont l'expression confère une résistance à un antibiotique ou un herbicide et qui permet la sélection des transformants.

Une fois régénérées, les plantes transgéniques peuvent être testées pour l'expression hétérologue des gènes de la présente invention ou la production du cz ^' s-abiénol ou du syn- copalyl-8-ol diphosphate dans les trichomes. Ceci peut être réalisé en récoltant l'exsudat des feuilles et en testant la présence du produit d'intérêt dans cet exsudât. Ceci peut également être fait en analysant la présence d'une ou des enzymes hétérologues de la présente invention dans les feuilles et, plus particulièrement, dans les cellules de trichome (par exemple en analysant les ARNm ou l'ADN génomique au moyen de sondes ou d'amorces spécifiques). Les plantes peuvent éventuellement être sélectionnées, croisées, traitées, etc. pour obtenir des plantes présentant des niveaux d'expression améliorés.

Un autre objet de l'invention réside également dans une plante ou graine comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que définis précédemment.

La présente invention concerne enfin une cellule ou un organisme transgénique non- humain, caractérisé en ce que la voie de synthèse du czs-abiénol est bloquée par inactivation du gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase

selon la présente invention ou du gène codant pour czs-abiénol synthase selon la présente invention ou des deux gènes. L'expression de ces gènes peut être bloquée par de nombreuses techniques disponibles et connues par l'homme du métier. Les gènes peuvent être délétés, mutés (par exemple par mutagenèse chimique par Ethyl Méthane Sulfonate ou par rayonnements ionisants) ou interrompus (mutagenèse insertionnelle). Par ailleurs, le blocage de l'expression de ces gènes peut également être réalisé par extinction de gènes en exprimant un transcrit inhibiteur. Le transcrit inhibiteur est un ARN qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double brin, d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le transcrit du gène à bloquer.

La présente invention concerne également un acide nucléique capable de diminuer ou de supprimer l'expression d'un gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODV) synthase. En effet, un ARN inhibiteur qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double brin, d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase peut être préparé sur la base de l'enseignement de la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne un ARN inhibiteur du gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 21 ou d'une séquence complémentaire de celle-ci. De même, elle concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 21 ou d'une séquence complémentaire de celle-ci pour inhiber l'expression du gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase. L'inhibition de cette enzyme peut être utile pour stopper ou ralentir la voie de synthèse du cz ^' s- abiénol et rendre le GGPP disponible pour une autre voie de synthèse d'intérêt nécessitant un apport en GGPP. Par exemple, l'inhibition de cette enzyme peut permettre d'augmenter le taux de production du CBT-diol par les cellules glandulaires des trichomes de feuilles de tabac. La présente invention concerne donc des cellules ou des organismes transgéniques dans lesquels le gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase a été inactivé. L'inactivation peut être effectuée par des techniques d'ARN interfèrent, de délétion de gène, de mutation chimique ou d'inactivation par recombinaison homologue. Ainsi le taux de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de czs-abiénol peut être diminué dans ces cellules ou organismes transgéniques.

En outre, la présente invention concerne également un acide nucléique capable de diminuer ou de supprimer l'expression d'un gène codant une czs-abiénol synthase. En effet, un ARN inhibiteur qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double brin, d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le gène codant une cz ^' s- abiénol synthase peut être préparé sur la base de l'enseignement de la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne un ARN inhibiteur du gène codant une cz ^' s- abiénol synthase comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 23. De même, elle concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 23 pour inhiber l'expression du gène codant une czs-abiénol synthase. L'inhibition de cette enzyme peut être utile pour stopper la voie de synthèse du cz ^' s-abiénol et rendre le syn-copalyl-8-ol diphosphate disponible pour une autre voie de synthèse d'intérêt nécessitant un apport en ce composé, par exemple pour préparer des dérivés du syn-copalyl-8-ol diphosphate, par exemple, du sclaréol, ou du 9- béta labda-13-en-8,15-diol. Le sclaréol est utilisé industriellement pour la synthèse d'ambroxides, comme l'Ambrox®, qui sont des ingrédients de l'industrie de la parfumerie. La présente invention concerne donc des cellules ou des organismes transgéniques dans lesquels le gène codant une czs-abiénol synthase est inactivé. L'inactivation peut être effectuée par des techniques d'ARN interfèrent, de délétion de gène, de mutation chimique ou d'inactivation par recombinaison homologue. Ainsi le taux de czs-abiénol peut être diminué dans ces cellules ou organismes transgéniques.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Exemples

Identification de fragments de gènes candidats codant pour une CPS et une KS de tabac spécifiquement exprimés dans les cellules de trichomes de tabac.

Les séquences codant pour les enzymes apparentées aux kaurene-synthases (KS) et aux copalyl-diphosphate synthases (CPS) appartiennent à la même famille phylogénétique tout en constituant deux groupes distincts. Les séquences protéiques des membres représentatifs de ces deux familles ont été alignées avec le logiciel ClustalX (Thompson et al., 1997).

L'alignement a permis de définir un motif conservé, YDTAWV (motif A ; SEQ ID No 1), pour les deux familles et des motifs conservés pour chacune des deux familles, à savoir PWYASL (motif B ; SEQ ID No 2) pour la famille CPS et CAMAFR (motif C ; SEQ ID

No 3) pour la famille KS.

Des amorces dégénérées correspondant aux motifs conservés A, B, et C, respectivement, ont été conçues (Tableau 1). Une amplification d'ADN a été réalisée par PCR avec les couples d'amorces correspondant aux motifs A / B et A / C à partir d'ADNc de trichomes de feuilles de tabac (N tabacum) pour amplifier des fragments d'ADNc codant pour des séquences de type CPS et KS, respectivement. Deux et trois séquences ayant une forte homologie avec les séquences CPS et KS respectivement ont été identifiées et respectivement notées NtCPSl, NtCPS2, NtKSLl, NtKSL2, NtKSL3. Tableau 1 :

Séquences des amorces dégénérées correspondant aux motifs conservés des protéines codant pour des CPS et des KS.

Motif AA Motif # Famille Séquence amorce 5' --> 3' SEQ ID No

YDTAWV A CPS/KSL τà7GAYàïïNGCNfGGGT 4

PWYASL B CPS AGNGANGCRTACCANGG 5

PWYASL B CPS YAANGANGCRTACCANGG 6 PWYASL B CPS AGRCTNGCRTACCANGG 7

PWYASL B CPS AARCJJNjGCRJACCANGG 8 CAMAFR ^™ ~C KSL CGRAANGCCATNGCRCA 9

KSL

Des amorces spécifiques de chacun des gènes ont été définies pour déterminer le niveau d'expression des gènes dans les feuilles et les trichomes. L'analyse a été réalisée par PCR quantitative en temps réel à partir d'ADNc de feuilles et de trichomes de tabac (N tabacum). Les gènes codant pour la cembratriene-ol synthase (CBTS-02) (NID: AF401234), et la CBT-ol hydroxylase (CYP71D16B) (NID: AF166332), qui s'expriment

fortement et spécifiquement dans les cellules glandulaires de trichomes de tabac, ont été utilisés comme témoins positifs. La figure 2A montre que le gène NtCPS2 s'exprime plus spécifiquement dans les trichomes de tabac que dans la feuille alors que le niveau d'expression du gène NtCPSl est pratiquement identique dans les deux tissus. La figure 2 A montre également que les gènes NtKSL2 et NtKSL3 s'expriment spécifiquement dans les trichomes, alors que NtKSLl n'est pas spécifique des trichomes. La figure 2B indique que l'expression du gène NtCPS2 dans les trichomes est comparable à celui des gènes CBTS et CYP71D16B étant donné que le rapport d'expression du gène NtCPS2 sur CBTS est proche de 1 à la différence du rapport NtCPSl sur CBTS qui est très faible (10 ^~4 ). La même analyse a permit de conclure que le gène NtKSL3 s'exprime fortement et spécifiquement dans les cellules de trichomes de feuilles de tabac (Fig. 2A et 2B).

Identification des séquences nucléiques codantes complètes de NtCPS2 et NtKSL3.

Les séquences nucléiques codantes et complètes pour les deux gènes NtCPS2 et NtKSL3 ont été identifiées par les techniques classiques de 5' RACE et 3' RACE PCR en utilisant des amorces spécifiques de chaque séquence (Tableau 2). Des ADNc isolés à partir de trichomes de feuilles de tabac (N. tabacum) ont été utilisés comme matrice pour l'amplification PCR. Les fragments 5' et 3' obtenus pour chacun des différents gènes ont été assemblés pour former les séquences codantes NtCPS2 de 2409 bases (SEQ ID N°21) et de NtKSL3 (SEQ ID N°23) de 2379 bases codant respectivement pour des protéines de 802 AA (SEQ ID N°22) et 792 AA (SEQ ID N°24). Les séquences similaires à NtKSL3 ont été recherchées dans la banque de protéine SwissProt en utilisant le programme BlastP (Altschul et al., 1997). Le meilleur pourcentage d'identité a été obtenue avec la ent- kaurene synthase de citrouille (45%) et de l'arabette (44%) (Tableau 3). On peut noter également que la séquence NtKSL3 possède un très fort degré d'identité (90 %) avec une terpène cyclase putative de tabac (Wang and Wagner, 2005, PID AAS98912.1). En effet, le segment 1-722 de cette séquence de 759 résidus correspond au segment 46-766 de la séquence NtKSL3, le segment restant 723-759 n'ayant aucun rapport avec la séquence NtKSL3. La fonction de cette protéine n'a cependant pas été démontrée.

Tableau 2 :

Séquence des amorces pour amplifier les régions 5' et 3' des phases codantes des gènes

NtCPS2 et NtKSL3.

Cible Nom Description Séquence amorce 5' --> 3' SEQ ID No

NtCPS2 8Eξ03 5' RACE AAGACAAGATGGA^CATAGGTCTTTGA 11 NtCPS2 8E04 5' RACE CTCCCCATGAACCATCAGAAAGTTGA 12 13 14 15 16

NtKSL.3 8G05 5' RACE AACATGGTTGGTTCATAGAATATCTTGA 17 NtKSL3 8G06 5' RACE iliiπi ^A £AAGCAATGGATGGCTAGGA 18

NtKSL3 8C05 3' RACE ^" œTGCâTGâTCâAC^^ 19 NtKSL3 8C06 3' RACE CCTTGTAAATATGATGCTCTGCGAACGT 20

Tableau 3 :

Séquences présentant le meilleur pourcentage d'identité obtenu par recherche d'homologie avec le programme BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) contre la banque SwissProt avec la séquence NtKSL3.

Description urganisme ro accession fonction % α lαeπtiœ

CmKS entKaurene B Cucurbita maxima L AAB39482 ent-kaurene synthase 45

AtGA2 Arabidopsis thahana AAC39443 ent-kaurene synthase 44

AgE-a-bisabolene synthase Abies grandis AAC24191 E-alpha-bisabolene synthase 34

AgAbietadiene synthase Abies grandis AAB05407 Abietadiene synthase 27

TbTaxadiene synthase taxus baccata Q93YA3 Taxadiene synthase 26

Tableau 4 :

Séquences présentant le meilleur pourcentage d'identité obtenu par recherche d'homologie avec le programme BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) contre la banque SwissProt et

Genbank, respectivement, avec la séquence NtCPS2. Description Organisme N° Fonction % identité )

Ent-kaurene synthase A, Pisum sativum 004408 Ent-copalyldiphosphate synthase 44 ent-kaurene synthase A, Arabidopsis thahana Q38802 Ent-copalyldiphosphate synthase 45 chloroplast precursor

Abietadiene synthase, àbies grandis 038710 àbietadiene synthase 42 chloroplast precursor

âipha-bisabofene synthase àbies grandis ô8îô86 (ë)-alpha-bιsaboiene synthase 34

Description Organisme N° Fonction % identité accession avec copalyldiphosphate Lactuca sativa BAB12440.1 Putative copalyldiphosphate 48 synthase NoJ synthase copaiyi pyrophosphate Stevia rebaudiana ââB8709î .î Putative copalyldiphosphate 48 synthase synthase copalyl diphosphate Croton subiyratus Bàà956î2.î Putative copaïyîdiphosphate 48 copalyl diphosphate Lycopersicon BAA84918.1 Putative copalyldiphosphate 47 putative copalyï Scopana duicis BàD9î 286.î ënt-copaïyîdiphosphate synthase 46

Identification de la fonction de la protéine codée par NtCPS2 Afin d'établir la fonction de la protéine NtCPS2, la production de l'enzyme recombinante NtCPS2-HisTAG par E. coli a été réalisée, pour identifier son (ses) activité(s) potentielle(s). La séquence nucléique codant pour NtCPS2 (séquence ID N° 21) a été introduite dans le vecteur d'expression pET-30b (Novagen). Pour faciliter la purification de la protéine, le codon STOP de la séquence a été éliminé pour créer une protéine de fusion avec une queue de 5 histidines en position C-terminale. Le vecteur NtCPS2-pET30b a été introduit par électroporation dans des cellules E. Coli d'expression (BL21- CodonPlus, Stratagene). La production de la protéine dans ces cellules a été induite par addition d'IPTG 1 mM, à 16 ⁰ C, à partir de 500 ml de culture. Après 18 heures d'induction, les cellules sont collectées par centrifugation, et lysées par un choc de dépression (δP: 19 bar). Les protéines solubles dessalées sur une colonne PDlO (Amersham), sont appliquées sur une résine d'affinité nickel-nitrilotriacetique d'agarose (Ni-NTA) selon le protocole du fabriquant (Qiagen). Les tests d'activité ont été réalisés sur la fraction protéique enrichie en NtCPS2-HisTag dans un tampon contenant 50 mM Hepes,

100 mM KCl, 7,5 mM MgCl ₂ , 5% glycérol, et 5 mM DTT. Les substrats suivants GPP,

FPP, GGPP ont été testés séparément à une concentration de 65 μM avec 25 ou 50 μg de protéines, incubés à 32 ⁰ C pendant 2 heures. Les produits de la réaction ont ensuite été déphosphorylés par ajout de 20 unités de phosphatase alkaline d'intestin de veau (New England Biolabs) pendant 1 heure à 37 ⁰ C. Les produits ont été extraits par une mélange chloroforme:méthanol:eau (5:1:4). Les phases aqueuse et organique sont séparées par centrifugation, la phase organique est séchée sous courant d'azote, reprise dans du pentane et analysée par GC/MS.

La fonction enzymatique de NtCPS2 a été étudiée par la production de l'enzyme recombinante NtCPS2-HisTAG depuis E. coll. Le mélange d'enzyme soluble obtenu de la disruption de E. coli a ensuite été chargé sur colonne d'affinité. Un facteur d'enrichissement de 15 à 20 est évalué par électrophorèse sur gel SDS. Pour démontrer sa fonction, NtCPS2-HisTAG a été incubé avec 3 différents substrats : GPP, FPP et GGPP. Aucun nouveau produit n'a été détecté avec le GPP ou le FPP montrant que NtCPS2- HisTAG n'utilise pas ces substrats. En revanche, lorsque le GGPP a été utilisé, un nouveau diterpen-diol apparaît. L'ion moléculaire 308 est très minoritaire, mais l'ion 290 correspondant à la perte d'une fonction alcool par élimination d'une molécule d'eau (M- 18) est identifiable sur le spectre de masse (Figure 7). Le pic a été identifié comme étant le 9-beta labda-13-en-8,15-diol par comparaison avec le pic de 9-beta labda-13-en-8,15-diol naturellement produit dans l'exsudat des feuilles de N. tαbαcum (Figure 6). Le spectre de masse et le temps de rétention du nouveau composé sont identiques à celui présent chez N. tαbαcum (Fig. 7). Le produit obtenu correspond au produit de déphosphorylation du 9-beta labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-CODP).

Identification de la fonction des protéines codées par NtKSL3 et NtCPS2. Pour déterminer la fonction des gènes NtKSL3 et NtCPS2, leurs séquences ont été introduites par transformation génétique dans N. syîvestris, un tabac sauvage qui ne produit pas de cz ^' s-abiénol et dans une lignée transgénique de N. syîvestris (lignée source ihpCBTS) dont l'expression du gène CBTS a été inhibée par ARN interférence (Tissier et αl, 2005). Dans cette lignée, la quantité de CBT-diol des feuilles est très réduite. Un promoteur de tabac trichome spécifique (eCBTSl.0, Tissier et αl., 2004) a été mis en amont des séquences codantes NtCPS2 et NtKSL3 pour former les constructions eCBTS1.0-NtCPS2 [#1] et eCBTS1.0-NtKSL3 [#2]. Ces deux constructions ont été introduites dans un même

vecteur binaire contenant un gène de résistance à la kanamycine pour donner le vecteur binaire pLIBRO-58 (Fig. 3A). Les constructions #1 et #2 ont également été introduites de manière indépendante dans le même vecteur pour former les vecteurs binaires pLIBRO-68 (Fig. 3B) et pLIBRO-69 (Fig. 3C), respectivement. Les vecteurs ont été introduits dans la souche d ^' 'Agrobacterium LBA4404 par électroporation. Les souches contenant les différents vecteurs ont été utilisées pour réaliser la transformation génétique de N. sylvestris par la méthode des disques foliaires (Horsch et al., 1985). Environ 25 plantes résistantes à la kanamycine ont été obtenues pour chaque construction. La présence des transgènes dans chaque plante a été confirmée par PCR à partir d'ADN génomique de feuilles. Le niveau d'expression des transgènes a été vérifié par RT-PCR à partir d'ARNm de feuilles de tabac. Les exsudats des plantes qui expriment les transgènes ont été extraits par immersion dans une solution de pentane pendant 1 min. Les extraits ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectre de masse (GC/MS). Un exemple de profil chromatographique des exsudats de plantes obtenues par GC/MS est présenté sur la figure 4. Il montre que l'exsudat d'une lignée transgénique contenant les gènes NtCPS2 et NtKSL3 contient un pic supplémentaire noté n°l ' à 40,5 min. L'exacte superposition des temps de rétention et des spectres de masse du pic 1 à 40,5 min avec celui du czs-abiénol naturellement produit par N. tabacum (figures 4A et 5A), démontre l'authenticité du pic n°l comme étant le czs-abiénol. Les plantes qui expriment les deux transgènes NtCPS2 et NtKSL3 produisent des quantités importantes de czs-abiénol dans la lignée ihpCBTS (Tableau 5). Les lignées transgéniques ayant intégré le gène NtCPS2 seul ou le gène NtKSL3 seul ne produisent pas de czs-abiénol. Ces résultats indiquent que la présence des deux gènes est nécessaire à la synthèse de czs-abiénol. En conclusion, NtKSL3 et MCPS2 permettent la biosynthèse de cz ^' s-abiénol à partir de GGPP.

Tableau 5 :

Taux de czs-abiénol et de CBT-diol dans les exsudats des plantes transgéniques ayant intégré et exprimant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. La quantification de czs-abiénol a été réalisée par GC/MS par comparaison avec un standard de czs-abiénol purifié à partir d'exsudat de feuilles de N. tabacum. N. sylvestris ihpCBTS : Lignée transgénique dont l'expression du gène CBTS a été inhibée par ARN interférence.

3398 N. sylvestris ihpCBTS 14 169 3403 N. sylvestris ihpCBTS 13 53

3388 N. sylvestris ihpCBTS 8 550

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