Système génétique pour le contrôle du développement du type floral d'une plante dicotylédone, et mise en œuvre dans des procédés de détection et de sélection.

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de la sélection de variétés de plantes, et en particulier à la sélection du type sexuel des plantes. Elle est relative à la détection génotypique du sexe des plantes par analyse du polymorphisme d'un gène A, ainsi qu'à des moyens de mise en œuvre de cette détection et à des procédés d'obtention de plantes dont le phénotype sexuel est modifié.

ART ANTERIEUR

La réalisation de plantes hybrides est d'un grand intérêt en agronomie et en agriculture. En effet, les plantes hybrides, grâce au phénomène d'hétérosis appelé également vigueur hybride, présentent une supériorité pour de nombreux caractères, par rapport à la moyenne de leurs deux parents. Cette supériorité peut s'illustrer par exemple par une meilleure vigueur, un meilleur rendement, une plus grande adaptation au milieu dans lequel l'hybride est cultivé, et une grande uniformité des hybrides par rapport à ses parents. Cette vigueur hybride est d'autant plus importante que les parents sont éloignés génétiquement. La création de lignées pures et stables, futurs parents de l'hybride est un passage obligé pour la création de variété hybrides homogènes et reproductibles exprimant le plus d'hétérosis. Il est donc nécessaire de créer des lignées pures et stables, puis de croiser ces lignées pour obtenir des hybrides.

La création de lignées pures implique l'autofécondation d'une plante de sorte à obtenir des plantes présentant un même patrimoine génétique, fixé pour l'ensemble des caractères de productivité, régularité du rendement ou encore de résistance aux maladies, recherchées.

Pour créer des lignées pures, II est donc nécessaire d'utiliser des plantes dont le type sexuel permet l'autofécondation, par exemple des plantes hermaphrodites.

Or, beaucoup de plantes dicotylédones, et en particulier les cucurbitaceae peuvent être monoïque, andromonoïque, gynoïques ou hermaphrodites.

Une première technique mise en œuvre, pour l'obtention de lignées pures, consiste à réaliser un traitement chimique des plantes de sorte à obtenir des plantes aptes à s'autoféconder, par exemple des plantes hermaphrodites. Chez le melon (cucumis melo) par exemple, la pulvérisation d'inhibiteurs de la synthèse de l'éthylène tel que le nitrate d'argent ou le thiosulfate d'argent entraîne l'apparition temporaire d'étamines dans les fleurs femelles (Rudich et al., 1969 ; Risser et al., 1979). De cette manière, la transformation des plantes gynoïques en plantes hermaphrodites est utilisée pour le maintien de lignées pures.

Cependant, la production de lignées pures par cette méthode est limitée par le coût des agents chimiques, leur durée d'action, et leurs effets phytotoxiques. De plus, de tels agents peuvent ne pas être efficaces en ce qui concerne la réalisation d'hybrides à partir de plantes dont la durée de floraison est longue, car de nouvelles fleurs apparues après traitement pourraient ne pas être affectées par le traitement chimique.

Il existe donc un besoin pour un système qui permettrait de contrôler le développement du type floral d'une plante dicotylédone, et d'obtenir une plante d'un type floral déterminé. De plus, de très nombreux croisements sont nécessaires pour obtenir des hybrides intéressants, à partir de lignées pures, et à chaque croisement, les plants présentant le phénotype le plus prometteur sont retenus.

Lors du croisement des lignées pures entre elles, il est indispensable de pouvoir choisir le sens du croisement effectué, et d'éviter l'auto pollinisation des plantes qui conduirait à des plantes ne présentant pas la vigueur hybride recherchée.

Là encore, du fait de la diversité du type sexuel des plantes dicotylédones, il est nécessaire de séparer les fleurs mâles et les fleurs femelles d'un même plant pour éviter l'autopollinisation.

Une première technique, mise en œuvre notamment pour le maïs, consiste à utiliser des moyens mécaniques pour réaliser une émasculation des plantes. Cependant cette technique s'avère extrêmement coûteuse puisqu'elle nécessite l'émasculation de chaque plante dont on veut éviter l'autopollinisation, pour chaque croisement effectué.

Une autre technique consiste à réaliser une émasculation chimique des plantes, bloquant la formation de pollen viable. Ainsi, chez le melon (Cucumis melo), le traitement de plantes monoïques par de l'éthrel (précurseur de l'éthylène) entraîne la disparition temporaire des fleurs mâles.

De tels agents chimiques, appelés gamétocides, utilisés pour provoquer une stérilité mâle transitoire présentent plusieurs inconvénients, comme un coût élevé ou une grande toxicité, comme cela a été rappelé ci-dessus.

Les techniques mécaniques ou chimiques de contrôle du type floral décrites ci-dessus s'avèrent donc très coûteuses, d'autant que de très nombreux croisements sont nécessaires pour obtenir des plants hybrides présentant les caractères recherchés et pouvant être commercialisés. Pour faciliter la création de lignées pures et d'hybrides, II existe donc également un besoin pour un système qui permettrait de contrôler le développement du type floral d'une plante dicotylédone, et d'obtenir une plante d'un type floral déterminé.

Une autre voie pour obtenir des plants capables d'autopollinisation utiles pour la création de lignées pures, ou non capables d'autopollinisation, pour la création d'hybrides, pourrait consister respectivement en une sélection d'individus exclusivement hermaphrodites, ou exclusivement femelles, présents dans une espèce. Cependant, une telle technique s'avérerait extrêmement coûteuse elle aussi, puisqu'elle nécessiterait la culture d'un nombre très important de plantes, jusqu'au moment où il est possible d'en déterminer le type sexuel. Cette technique serait de plus aléatoire, car les mécanismes de

détermination du sexe des fleurs dépendent notamment de facteurs environnementaux.

Il existe donc également un besoin pour un procédé qui permettrait de sélectionner des plantes dycotylédones par exemple hermaphrodites ou femelles, sans devoir pour autant les cultiver.

Ce procédé devrait permettre de sélectionner des plantes, particulièrement utiles pour la réalisation de lignées pures ou d'hybrides comme cela a été précisé ci-dessus.

SOMMAIRE DE L'INVENTION

L'invention fournit un système qui permet de contrôler le développement du type floral d'une plante dicotylédone. Les inventeurs ont en effet montré que deux éléments génétiques de contrôle, (A/a) et (G/g) possédant tous deux au moins deux allèles, (A) et (a) pour le premier élément génétique et (G) et (g) pour le second, participent au contrôle du déterminisme du sexe chez les cucurbitacées.

Les inventeurs ont également montré que physiologiquement, les deux allèles (A) et (a), se distinguent par des taux différents d'une nouvelle protéine.

L'invention a donc pour objet un système génétique pour le contrôle du développement du type floral d'une plante dicotylédone, ledit système comprenant la combinaison de deux éléments génétiques de contrôle, respectivement :

- un premier élément génétique de contrôle (A/a) présent dans une plante dicotylédone, sous la forme d'un allèle dominant (A), et d'un allèle récessif (a), dans lequel :

- l'allèle dominant (A), consiste en un acide nucléique (NA) comprenant : (i) un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel dans une plante dicotylédone, et

(ii) un acide nucléique dont l'expression est régulée par le polynucléotide régulateur (PA), ledit acide nucléique codant pour la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3,

- l'allèle récessif (a), se distingue de l'allèle dominant (A) par : (i) un acide nucléique (NA) non présent dans la plante, ou

(ii) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, ou (iii) un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active, ou

(iv) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, et un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active, et

- un second élément génétique de contrôle (G/g) présent dans une plante dicotylédone, sous la forme d'un allèle dominant (G), et d'un allèle récessif (g), dans lequel :

- l'allèle dominant (G), consistant en un acide nucléique (NG) dont l'expression conduit au développement d'une plante andromonoique ou monoique, et - l'allèle récessif (g), se distingue de l'allèle dominant (G) par :

(i) un acide nucléique (NG) non présent dans la plante, ou (ii) la présence d'un acide nucléique (Ng) dont l'expression, dans une plante dicotylédone, conduit au développement d'une plante hermaphrodite ou gynoïque, étant entendu que le premier élément génétique de contrôle a été artificiellement introduit dans ladite plante dicotylédone.

L'invention a également pour objet les polynucléotides régulateurs (PA) et (Pa) en tant que tels.

L'invention est également relative à des procédés d'obtention d'une plante transformée dont le phénotype sexuel a été modifié, ainsi que les parties d'une telle plante, notamment ses semences.

L'invention a encore pour objet la protéine ACCS telle que définie plus en détail ci-après, ou un fragment de cette protéine, ainsi que des anticorps dirigés contre la protéine ACCS. L'invention a également trait à des procédés pour détecter la présence des allèles (A) et (a) dans un échantillon.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les inventeurs ont montré que deux éléments génétiques de contrôle, (A/a) et (G/g) possédant tous deux au moins deux allèles, (A) et (a) pour le premier élément génétique et (G) et (g) pour le second, participent au contrôle du déterminisme du sexe chez les cucurbitacées.

Il a en effet été démontré par les inventeurs que l'allèle (A) contrôle le caractère andromonoïque des plantes, et l'allèle (G) contrôle le caractère gynoïque des plantes, comme cela est illustré dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

Le tableau 1 illustre la correspondance entre le génotype et le phénotype sexuel de fleurs de plantes dicotylédones.

Les inventeurs ont également montré que physiologiquement, les deux allèles (A) et (a), se distinguent par des taux différents d'une nouvelle protéine.

En particulier, Les inventeurs ont montré que physiologiquement, chez Cucumis melo, les deux allèles (A) et (a), se distinguent par des taux différents d'une nouvelle protéine, de type ACCS, impliquée dans le métabolisme de l'éthylène.

Or, différentes études ont montré que les gènes de la biologie florale des cucurbitacées codent pour des protéines impliquées dans la voie de biosynthèse ou de régulation de l'éthylène (Kamachi et al., 1997 ; Kahana et al., 2000).

Les inventeurs ont montré que l'allèle (a) se distingue physiologiquement de l'allèle (A) par un taux de protéine ACCS faible dans la plante, comparé à celui d'une plante portant un allèle (A).

Du point de vue génétique, les inventeurs ont montré que l'allèle (A) se distingue de l'allèle (a) par une différence au niveau de la séquence promotrice de la séquence codant pour la protéine ACCS. C'est cette différence qui, du point de vue des inventeurs, induit un taux de protéine distinct pour les deux allèles (A) et (a) et, un phénotype sexuel distinct.

Les inventeurs ont également montré dans l'exemple 1 que l'allèle (A) se distingue également de l'allèle (a) par une différence au niveau de la séquence de la protéine ACCS elle-même. En effet l'allèle (A) est associé à la présence d'un résidu alanine en position 57 de la séquence codant pour la protéique ACCS, et l'allèle (a) est associé à la présence d'un résidu valine en position 57 de cette même séquence.

Les inventeurs ont également montré dans l'exemple 2 que cette différence au niveau de la région promotrice, et dans la séquence de la protéine elle-même se traduit par une expression temporelle et spatiale distincte de la protéine ACCS pour les deux allèles.

Sans vouloir être liés à une quelconque théorie les inventeurs pensent que le système de contrôle objet de l'invention peut être généralisé à toute plante dicotylédone, pour laquelle la détermination du sexe est dépendante du taux d'éthylène comme cela a été rappelé ci-dessus. En effet, les inventeurs ont montré dans l'exemple 3 que l'expression de l'allèle (A) ou de l'allèle (a) dans une plante dicotylédone n'appartenant pas à la famille des cucurbitacées permet d'obtenir respectivement un phénotype gynoïque ou hermaphrodite.

Enfin, les inventeurs ont identifié que l'allèle (A) est dominant sur l'allèle (a).

L'invention a donc pour objet un système génétique pour le contrôle du développement du type floral d'une plante dicotylédone, ledit système comprenant la combinaison de deux éléments génétiques de contrôle, respectivement :

- un premier élément génétique de contrôle (A/a) présent dans une plante dicotylédone, sous la forme d'un allèle dominant (A), et d'un allèle récessif (a), dans lequel :

- l'allèle dominant (A), consiste en un acide nucléique (NA) comprenant : (i) un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel dans une plante dicotylédone, et

(ii) un acide nucléique dont l'expression est régulée par le polynucléotide régulateur (PA), ledit acide nucléique codant pour la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3, - l'allèle récessif (a), se distingue de l'allèle dominant (A) par :

(i) un acide nucléique (NA) non présent dans la plante, ou

(ii) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, ou

(iii) un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active, ou (iv) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, et un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active, et

- un second élément génétique de contrôle (G/g) présent dans une plante dicotylédone, sous la forme d'un allèle dominant (G), et d'un allèle récessif (g), dans lequel :

- l'allèle dominant (G), consistant en un acide nucléique (NG) dont l'expression conduit au développement d'une plante andromonoique ou monoique, et

- l'allèle récessif (g), se distingue de l'allèle dominant (G) par : (i) un acide nucléique (NG) non présent dans la plante, ou

(ii) la présence d'un acide nucléique (Ng) dont l'expression, dans une plante dicotylédone, conduit au développement d'une plante hermaphrodite ou gynoïque, étant entendu que le premier élément génétiques de contrôle a été artificiellement introduit dans ladite plante dicotylédone.

Le système de contrôle génétique, identifié par les inventeurs, permet de contrôler, et/ou de modifier le sexe des fleurs de plantes dicotylédones, et est donc très avantageux, par rapport aux systèmes de contrôle mécaniques, souvent coûteux, ou chimiques, souvent toxiques, tels que décrits dans la partie introductive.

Par « allèle », on entend au sens de la présente invention, l'une des formes d'un gène occupant un site ou locus sur une paire de chromosomes homologues. Les allèles d'un gène se rapportent au même trait génétique mais peuvent déterminer des phénotypes différents. Un allèle dominant est un allèle dont le niveau d'expression phénotypique est beaucoup plus important que celui de l'allèle homologue (dit récessif). La dominance peut être complète ou partielle.

Un allèle récessif est un allèle ne s'exprimant dans le phénotype que lorsque la plante reçoit les allèles identiques de chacun de ses deux parents. En revanche, l'expression de l'allèle récessif est masquée si l'allèle homologue dominant est présent.

Ainsi, le système défini ci-dessus existe sous la forme de différents états correspondants chacun à un phénotype.

Lorsque le premier élément génétique de contrôle (A/a) présent dans une plante dicotylédone est sous forme d'allèle (A), la plante est de phénotype monoïque ou gynoïque.

Lorsque le premier élément génétique de contrôle (A/a) présent dans une plante est sous forme d'allèle (a), la plante est de phénotype hermaphrodite ou andromonoïque. Lorsque le second élément génétique de contrôle (G/g) présent dans une plante dicotylédone est sous forme d'allèle (G), la plante est de phénotype monoïque ou andromonoïque.

Lorsque le second élément génétique de contrôle (G/g) présent dans une plante est sous forme d'allèle (g), la plante est de phénotype hermaphrodite ou gynoïque.

La correspondance entre allèles et phénotypes et résumée dans le tableau 1.

La suite de la description expose des variantes, ou modes de réalisation préférés des premier et second éléments génétiques de contrôle faisant partie du système de contrôle objet de l'invention.

Elément génétique de contrôle A/a, sous forme d'allèle dominant (A) du système selon l'invention

De manière générale, l'élément génétique de contrôle A/a, présent dans une plante sous la forme de l'allèle dominant (A), permet d'obtenir un taux plus élevé de protéine ACCS, par rapport au taux observé lorsque l'allèle (A) n'est pas présent dans ladite plante.

Dans la suite de la description, on considère qu'un « taux élevé » de protéine ACCS correspond au taux moyen de la protéine ACCS mesuré dans une plante comprenant l'allèle dominant (A) dans son génome, et qu'un « taux faible » de protéine ACCS correspond au taux moyen de protéine ACCS observé dans une plante ne comprenant pas l'allèle dominant (A) dans son génome. L'allèle dominant (A), consiste en un acide nucléique (NA) comprenant :

(i) un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel dans une plante dicotylédone, et

(ii) un acide nucléique dont l'expression est régulée par le polynucléotide régulateur (PA), ledit acide nucléique codant pour la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3.

- polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel

Un polynucléotide régulateur ou promoteur (PA) fonctionnel selon l'invention consiste en un acide nucléique qui permet l'expression de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3 chez les plantes dicotylédones.

A titre d'exemple un tel promoteur comprend une séquence nucléotidique allant du nucléotide 1 au nucléotide 5906 de la séquence SEQ ID N°1.

Ainsi, l'invention a pour objet un système génétique de contrôle dans lequel le polynucléotide régulateur (PA) comprend ou consiste en une séquence nucléotidique allant du nucléotide 1 au nucléotide 5906 de la séquence SEQ ID N°1.

L'invention a également pour objet le polynucléotide régulateur (PA) en tant que tel, défini ci-dessus, ainsi que des fragments de cet acide nucléique, comme cela sera décrit plus en détails dans la partie intitulée « Acides nucléiques selon l'invention »

Un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel selon l'invention peut également consister en un promoteur connu pour diriger l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine ACCS de façon constitutive ou de façon tissu spécifique. Un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel selon l'invention peut ainsi être choisi parmi des promoteurs tissu spécifique tel que ceux des gènes de la famille des « MADS box » de la classe A B C D et E, tels que décrits par Theiβen et al., 2001 ou tout autre promoteur de gènes homéotiques.

Un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel selon l'invention peut ainsi être choisi parmi : le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou le promoteur 19S ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S), décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ;

- le promoteur actine du ri3 suivi de l'intron actine de ri3 (pAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al., 1991 ;

- le promoteur constitutif EF-1α du gène codant pour le facteur d'élongation végétale décrit dans la demande PCT n°WO 90/02172 ou encore dans l'article de AXELOS et al. (1989) ;

- le superpromoteur chimérique PSP (NI et al., 1995) constitué de la fusion de trois copies de l'élément d'activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la octopin synthase de Agrobacterium

tumefaciens et de l'élément d'activation de la transcription du promoteur du gène de la mannopin synthase de Agrobacteήum tumefaciens ; et le promoteur ubiquitine du tournesol (BINET et al., 1991 ) ; - le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al., 1996). le promoteur de l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996)

Un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel selon l'invention peut également consister en un promoteur inductible.

Ainsi, l'invention a pour objet un système de contrôle tel que défini ci- dessus, dans lequel le polynucléotide régulateur (PA) est sensible à l'action d'un signal inducteur, et de préférence, dans lequel le polynucléotide régulateur

(PA) est un polynucléotide activateur inductible de la transcription ou de la traduction.

Lorsque le polynucléotide régulateur activateur de la transcription ou de la traduction est sensible, directement ou indirectement, à l'action d'un signal inducteur activateur, il s'agit d'un polynucléotide « activateur inductible » au sens de l'invention.

Selon l'invention, un polynucléotide régulateur du type « activateur inductible » est une séquence régulatrice qui n'est activée qu'en présence d'un signal externe. Un tel signal externe peut être la fixation d'un facteur de transcription, la fixation d'un facteur de transcription pouvant être induite sous l'effet du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur est directement ou indirectement sensible.

Lorsqu'une telle construction d'acides nucléiques est utilisée dans un hôte cellulaire, l'expression du polynucléotide codant pour la protéine ACCS selon l'invention peut être induite en mettant en contact l'hôte cellulaire transformé avec le signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur activateur est, directement ou indirectement, sensible.

Lorsque l'on recherche l'absence d'expression du polynucléotide codant pour un polypeptide ACCS chez cet hôte cellulaire transformé, il suffit alors

d'éliminer ou supprimer la présence du signal inducteur activateur auquel le polynucléotide régulateur de la transcription ou de la traduction est sensible.

L'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine des polynucléotides régulateurs, en particulier ceux actifs chez les végétaux, pour définir les constructions répondant à la définition du mode de réalisation ci-dessus.

La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour une protéine ACCS peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que : - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYAMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998);

- une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par CADDICK et al. (1998);

- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.

- une séquence de promoteur inductible par un pathogène ou par un métabolite produit par un pathogène. - une séquence régulatrice de gènes de type PR, inductible par l'acide salicylique ou le BTH ou l'aliette (Gorlach et al., 1996, Molina et al., 1998) ;

- une séquence régulatrice de type récepteur Ecdysone (Martinez et al., 1999) inductible par le tebufeno3ide (référence produit RH5992, commercialisé par ROHM & HAAS) par exemple, appartenant à la famille des diben3oylhydra3ines.

-Acides nucléiques codant pour la protéine ACCS

De préférence, l'acide nucléique codant pour la protéine ACCS comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', au moins :

(i) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 5907 au nucléotide 6086 de la séquence SEQ ID N°1 , (ii) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 6181 au nucléotide 6467 de la séquence SEQ ID N°1 , et (iii) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 7046 au nucléotide 7915 de la séquence SEQ ID N°1.

Elément génétique de contrôle A/a, sous forme d'allèle récessif (a) du système selon l'invention

De manière générale, l'élément génétique de contrôle (A/a) sous la forme de l'allèle récessif (a), lorsqu'il est présent dans une plante qui ne possède pas l'allèle dominant (A) dans son génome, ne permet pas d'obtenir un taux de protéine ACCS, aussi élevé que celui obtenu lorsque l'allèle (A) est présent.

On peut donc définir l'allèle (a) comme toute altération du génotype correspondant à l'allèle (A), ne permettant pas d'obtenir un taux d'ACCS aussi élevé que l'allèle (A).

L'allèle récessif (a), se distingue de l'allèle dominant (A) par : (i) un acide nucléique (NA) non présent dans la plante, ou

(ii) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, ou

(iii) un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active, ou

(iV) un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel dans une plante dicotylédone, et un acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active.

- Polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel

Un polynucléotide régulateur (Pa), ou promoteur non fonctionnel selon l'invention est un acide nucléique qui :

(i) ne permet pas l'expression de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3 dans une cellule hôte, ou

(ii) permet l'expression de cette protéine à un taux faible en comparaison du taux observé avec le polynucléotide régulateur (PA), ou (iii) permet l'expression de la protéine ACCS au cours de la vie de la plante, pendant une durée inférieure, en comparaison de celle observée avec le polynucléotide régulateur (PA).

Pour comparer le niveau d'expression de plusieurs promoteurs, une technique simple, connue de l'homme du métier consiste à placer un gène marqueur de sélection sous le contrôle des promoteurs à tester. Un gène marqueur de sélection peut être par exemple le gène de résistance à l'herbicide

BASTA, bien connu de l'homme du métier.

Une autre technique peut consister à mesurer le taux de la protéine

ACCS obtenue lorsque la séquence codant pour cette protéine est sous le contrôle de différents promoteurs, en utilisant des anticorps dirigés à rencontre cette protéine, et les procédés décrits dans la partie « polypeptides selon l'invention ».

A titre d'exemple, un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel comprend une séquence nucléotidique allant du nucléotide 1 au nucléotide 3650 de la séquence SEQ ID N°2.

Ainsi, dans le système de contrôle objet de l'invention un polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel peut comprendre une séquence nucléotidique allant du nucléotide 1 au nucléotide 3650 de la séquence SEQ ID N°2.

L'invention a également pour objet le polynucléotide régulateur (Pa) en tant que tel, défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID N°2. Un tel acide nucléique comprend un polynucléotide régulateur (Pa) et un acide nucléique codant pour la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3. Un polynucléotide (Pa) non fonctionnel peut également être tout polynucléotide dérivé de du polynucléotide (PA) tel que défini ci-dessus dont la

séquence nucléotidique comprend une insertion, une substitution ou une délation d'un ou plusieurs nucléotides, par rapport à la séquence nucléotidique du polynucléotide régulateur.

Ainsi, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique portant au moins une altération choisie parmi une mutation, une insertion ou une délétion, par rapport à l'acide nucléique allant du nucléotide 1 au nucléotide 5907 de la séquence SEQ ID N°1 , ledit acide nucléique altéré conduisant à une expression réduite de la protéine ACCS, lorsqu'il contrôle l'expression de ladite protéine, par rapport à l'expression de la protéine ACCS contrôlée par l'acide nucléique allant du nucléotide 1 au nucléotide 5907 de la séquence SEQ ID N°1.

L'invention a également pour objet un système de contrôle tel que défini ci-dessus, dans lequel le polynucléotide régulateur (Pa) est sensible à l'action d'un signal inducteur, et de préférence, dans lequel le polynucléotide régulateur (Pa) est un polynucléotide répresseur inductible de la transcription ou de la traduction.

Par polynucléotide régulateur « répresseur », on entend selon l'invention une séquence régulatrice dont l'activité constitutive peut être bloquée par un signal externe. Un tel signal externe peut être l'absence de fixation d'un facteur de transcription reconnu par le polynucléotide régulateur répresseur. L'absence de fixation du facteur de transcription peut être induite sous l'effet du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est sensible.

Selon ce premier mode de réalisation particulier, l'expression de la séquence codant pour une protéine ACCS est constitutive dans l'hôte cellulaire choisi, en l'absence du signal inducteur répresseur auquel le polynucléotide régulateur répresseur est directement ou indirectement sensible.

La mise en contact de l'hôte cellulaire avec le signal inducteur répresseur a pour effet, grâce à une action directe ou indirecte sur le polynucléotide régulateur répresseur, d'inhiber et/ou de bloquer l'expression du polynucléotide codant pour la protéine ACCS.

Pour réaliser les constructions d'ADN selon l'invention comprenant un polynucléotide régulateur répresseur, l'homme du métier aura recours à ses connaissances générales techniques dans le domaine de l'expression de gènes chez les végétaux. Un procédé d'obtention d'une plante transformée, mettant en œuvre ce type de polynucléotide régulateur est décrit dans la partie intitulée « procédés d'obtention d'une plante transformée selon l'invention ».

- acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active

Par « acide nucléique codant pour une protéine ACCS non active » , on entend au sens de la présente invention, un acide nucléique qui code pour une protéine qui diffère de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3, par la substitution, la délétion, ou l'insertion d'un ou plusieurs acides aminés, et qui ne possède pas l'activité biologique de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3.

- protéine ACCS non active

Par « protéine ACCS non active », on entend au sens de la présente invention, une protéine qui diffère de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3, par la substitution, la délétion, ou l'insertion d'un ou plusieurs acides aminés, et qui ne possède pas l'activité biologique de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3. D'une manière générale, une protéine ACCS non active est une protéine dont l'expression est associée à un phénotype andromonoïque ou hermaphrodite.

A titre d'exemple, une protéine ACCS non active peut être une protéine qui ne permet pas de transformer la S-adénosyl méthionine en ACC (1- aminocyclopropane-1 -carboxylate).

Les inventeurs ont montré dans l'exemple 1 qu'une protéine ACCS non active selon l'invention est par exemple une protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3 dans laquelle le résidu alanine en position 57 est remplacé par un résidu valine.

Elément génétique de contrôle G/g, sous forme d'allèle récessif (g) du système selon l'invention

De manière générale, l'élément génétique de contrôle (G/g) sous la forme de l'allèle récessif (g), lorsqu'il est présent dans une plante conduit au développement d'une plante hermaphrodite ou gynoïque.

Acides nucléiques selon l'invention

Comme indiqué ci-dessus, il a été caractérisé selon l'invention deux variants alléliques (A) et (a) d'un premier élément génétique de contrôle (A/a) Les inventeurs ont identifié l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 comme étant un acide nucléique correspondant au variant allélique dominant (A) et l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2, comme correspondant au variant allélique récessif (a), d'un premier élément génétique de contrôle sous forme d'un gène (A/a). Dans le système de contrôle objet de l'invention, l'un au moins des deux éléments génétiques de contrôle a été introduit artificiellement dans une plante. Comme cela a été exposé ci-dessus, une telle introduction provoque un changement du sexe de la fleur de la plante, ce qui est un des buts recherchés selon l'invention. En conséquence les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 font partie des objets de l'invention.

La présente invention a donc pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, à condition qu'un

tel acide nucléique possède les caractéristiques fonctionnelles de l'allèle (A) ou de l'allèle (a) tels que définis ci-dessus.

Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus. Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, à condition qu'un tel acide nucléique possède les caractéristiques fonctionnelles de l'allèle (A) ou de l'allèle (a) tels que définis ci-dessus.

L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les « fragments » d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.

L'invention est également relative aux acides nucléiques comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID N°1 ou 2. L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins

12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les « fragments » d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.

L'allèle (A) défini par la séquence SEQ ID N°1 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement : a) une séquence non codante portant des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 5906 de la séquence SEQ ID N°1 ;

b) une région dite « codante » qui comprend les trois exons et les deux introns du gène (A/a), cette région codante étant localisée du nucléotide en position 5907 jusqu'au nucléotide en position 7915 de la séquence SEQ ID N°1 ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 7915 jusqu'au nucléotide en position 13380 de la séquence SEQ ID N°1.

L'allèle (a) défini par la séquence SEQ ID N°1 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement : a) une séquence non codante portant des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 3650 de la séquence SEQ ID N°2; qui diffère sensiblement de la séquence non codante localisée en partie 5' de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 , b) une région dite « codante » qui comprend les trois exons et les deux introns du gène (A/a), cette région codante étant localisée du nucléotide en position 3651 jusqu'au nucléotide en position 5659 de la séquence SEQ ID N°2, qui diffère peu de la séquence codante de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 , et code pour une même protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3. et c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 5659 jusqu'au nucléotide en position 11137 de la séquence SEQ ID N°1 , qui diffère peu de la séquence non codante localisée en partie 3' de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1.

Les caractéristiques structurales des trois exons et des deux introns du gène A/a sont détaillées dans le tableau 2 ci-après. Les caractéristiques structurales des exons et des introns des allèles (A) et (a) du gène (A/a) sont très proches, de sorte que les exons des allèles (A) et (a) codent pour une même protéine de séquence SEQ ID N°3. Comme cela a été rappelé ci-dessus, la différence majeure entre les séquences nucléotidiques correspondant aux allèles (A) et (a) se trouve dans les séquences régulatrices amont correspondant à ces deux allèles. Ces deux séquences possèdent donc

une région commune constituée de 3 exons et 2 introns, et une région non commune, comprenant des régions régulatrices disctinctes.

TABLEAU 2 Séquences des exons du gène A/a

Exon n° Position du nucléotide en 5' sur Position du nucléotide en 3' sur

SEQ ID N ⁰ I SEQ ID N°2 SEQ ID N°1 SEQ ID N°2

(allèle A) (Allèle a) (Allèle A) (Allèle a)

1 5907 3651 6086 3830

2 6181 3924 6467 4209

3 7046 4790 7915 5659

L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène A/a, tel que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 1 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.

Un tel acide nucléique code pour au moins une partie de la protéine ACCS et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant, en vue de d'obtenir une plante de génotype (A).

Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène (A/a) dans un échantillon. Le cas échéant les séquences décrites ci-dessus peuvent porter une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à induire la synthèse d'une protéine ACCS non active, et à modifier le type sexuel d'une plante portant un tel gène (A/a) muté. De telles séquences répondent à la définition d'acides nucléiques codant pour une protéine ACCS non active, définis de manière générale ci-dessus.

TABLEAU 3

Séquences des introns du αène (A/a)

Intron n° Position du nucléotide en 5' sur Position du nucléotide en 3' sur SEQ ID N ⁰ I SEQ ID N°2 SEQ ID N°1 SEQ ID N°2

1 6087 3831 6180 3923 2 6468 4210 7045 4789

L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène (A/a), tel que les polynucléotides 1 et 2 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.

Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène (A/a) dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène (A/a).

Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène (A/a) ou l'inhiber par une approche sens ou co-suppression, ou par l'utilisation d'ARN double brin (Wassenegger et al. 1996 ; Kooter et al. 1999) pour interférence. Un tel acide nucléique peut également être utilisé pour rechercher des variants alléliques fonctionnels du gène (A/a), qui pourront être utilisés dans une méthode de sélection de plantes possédant un type sexuel déterminé.

Il est précisé que, sur leur région commune, à savoir les 3 exons et les deux introns décrits ci-dessus, les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 ont un pourcentage d'identité en nucléotides supérieur à 95%, ce pourcentage étant en fait supérieur à 99%.

Autres acides nucléiques selon l'invention, codant pour la protéine ACCS

L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 5907 et se terminant au nucléotide en position 7915 de la séquence SEQ ID N°1 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 5907 et se terminant au nucléotide en position 7915 de la séquence SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 5907 et se terminant au nucléotide en position 7915 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 5907 et se terminant au nucléotide en position 7915 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant, au moins : (i) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 5907 au nucléotide 6086 de la séquence SEQ ID N°1 , (ii) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 6181 au nucléotide 6467 de la séquence SEQ ID N°1 , et (iii) une séquence ayant au moins 95% d'identité avec le polynucléotide allant du nucléotide 7046 au nucléotide 7915 de la séquence SEQ ID N°1.

L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' :

(i) une séquence allant du nucléotide 5907 au nucléotide 6086 de la séquence SEQ ID N ⁰ I , (ii) une séquence allant du nucléotide 6181 au nucléotide 6467 de la séquence SEQ ID N ⁰ I , et

(iii) une séquence allant du nucléotide 7046 au nucléotide 7915 de la séquence SEQ ID N ⁰ I .

Un acide nucléique codant pour la protéine ACCS, peut comprendre en outre des séquences leader et terminateur, classiques pour l'homme du métier.

Produits de transcription et de traduction du gène (A/a) et polypeptides selon l'invention.

L'invention a donc encore pour objet le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3, également nommé « protéine ACCS » dans la présente description, ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°3 ou un fragment ou un variant de celui-ci. Un fragment d'une protéine ACCS selon l'invention comprend au moins

10, 50, 100, 200, 300, 400, 420, 430, 440 ou 445 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°3.

L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence d'une protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3.

Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquence SEQ ID N°3, ou un fragment peptidique de ce dernier. De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.

Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL et al. (1989).

Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.

A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a; 1965b).

De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°3.

Un polypeptide codé par le gène (A/a) selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°3, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°3 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.

L'invention a encore pour objet un polypeptide de séquence SEQ ID

N°10 ou un fragment polypeptidique de cette séquence tel que défini ci-dessus.

Le polypeptide de séquence SEQ ID N°10 code pour une protéine ACCS « non active » selon la définition donnée ci-dessus et diffère de la séquence SEQ ID

N°3 par la présence d'un résidu valine en position 57.

Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène (A/a) ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°3 ou 10, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi le sexe de la plante, sans pour autant devoir la cultiver.

Par "anticorps" au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine

de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.

Des anticorps monoclaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975). La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).

L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,778 ou encore par

MARTINEAU et al. (1998).

Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par

RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°3, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon. Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.

L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.

Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un variant allélique d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus dans des programmes de sélection de plantes pour l'obtention de plantes dont le type floral a été modifié.

Acides nucléiques comprenant un polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel

Un polynucléotide régulateur ou promoteur (PA) fonctionnel selon l'invention consiste en un acide nucléique qui permet l'expression de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3 chez les plantes dicotylédones.

Un tel polynucléotide régulateur (PA) fonctionnel permet ainsi, lorsqu'il est introduit artificiellement dans une plante, de modifier le sexe des fleurs d'une telle plante, et en particulier permet d'obtenir des plantes femelles, non capables d'autopollinisation.

L'invention a donc également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 5906 de la séquence SEQ ID N°1 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 5906 de la séquence SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au

nucléotide en position 5906 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 5906 de la séquence SEQ ID N°1 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide régulateur, tel que défini ci- dessus. Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie de l'allèle (A) du gène (A/a) dans un échantillon, pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène (A/a). Un tel acide nucléique peut également être utilisé pour rechercher des variants alléliques fonctionnels du gène (A/a), ou pourront être utilisés dans une méthode de sélection de plantes possédant un type sexuel déterminé.

Des procédés de détection mettant en œuvre des acides nucléiques tels que décrits ci-dessus sont décrits dans la partie intitulée « Procédés de sélection selon l'invention » Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour inhiber une séquence cible déterminée au sein du gène (A/a) par une approche antisens ou co- suppression, ou par l'utilisation d'ARN double brin (Wassenegger et al. 1996 ; Kooter et al. 1999) pour interférence.

Acides nucléiques comprenant un polynucléotide régulateur Pa non fonctionnel

Un polynucléotide régulateur (Pa), ou promoteur non fonctionnel selon l'invention est un acide nucléique qui :

(i) ne permet pas l'expression de la protéine ACCS de séquence SEQ ID N°3 dans une cellule hôte, ou

(ii) permet l'expression de cette protéine à un niveau très faible en comparaison du niveau observé avec le polynucléotide régulateur (PA), ou (iii) permet l'expression de la protéine ACCS au cours de la vie de la plante, pendant une durée inférieure, en comparaison de celle observée avec le polynucléotide régulateur (PA).

Un tel polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel permet ainsi, lorsqu'il est introduit artificiellement dans une plante, par exemple en remplacement d'un polynucléotide (A) de modifier le sexe des fleurs d'une telle plante, et en particulier permet d'obtenir des plantes hermaphrodites, capables d'autopollinisation.

L'invention a donc également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 3650 de la séquence SEQ ID N°2 ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 3650 de la séquence SEQ ID N°2, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 3650 de la séquence SEQ ID N°2 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique débutant au nucléotide en position 1 et se terminant au nucléotide en position 3650 de la séquence SEQ ID N°2 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie de l'allèle (a) du gène (A/a) dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène (A/a).

L'invention concerne enfin des acides nucléiques comprenant l'association un ou plusieurs acides nucléiques tels que définis ci-dessus, par exemple un acide nucléique codant pour une protéine ACCS fonctionnelle sous le contrôle d'un promoteur de type (PA) ou (Pa).

Définitions générales

Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL

(1984) et AUSUBEL et al. (1994) .

De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.

Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.

Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique "

englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.

Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G,

C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N ⁰ WO 95/04064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.

Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.

Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des

« gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.

Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.

De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les " variants " d'un acide nucléique selon l'invention.

Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse. En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique " variant " sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de

référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.

Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant. De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.

De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.

Font partie des « variants » d'un acide nucléique codant la protéine ACCS les acides nucléiques des gènes orthologues à la protéine ACCS inclus dans le génome de plantes, et possédant une identité en nucléotides d'au moins 95% avec un acide nucléique codant la protéine ACCS.

Par " fragment " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.

SONDES ET AMORCES

Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les polynucléotides régulateurs (PA) et (Pa), ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène (A/a) ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon. En particulier, les sondes et amorces ci-dessus dérivés des séquence

SEQ ID N°1 , et en particulier dérivées du polynucléotide régulateur (PA) peuvent être utilisées pour détecter la présence de l'allèle (A) dans une plante dicotylédone.

De même, les sondes et amorces ci-dessus dérivées des séquence SEQ ID N°2, et en particulier dérivées du polynucléotide régulateur (Pa) non fonctionnel peuvent être utilisées pour détecter la présence de l'allèle (a) dans une plante dicotylédone.

Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un polynucléotide régulateur (PA) ou (Pa).

L'invention a donc également pour objet un acide nucléique, utilisable en tant que sonde ou amorce, hybridant spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Les conditions d'hybridation ci-dessous sont mises en œuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique, sonde ou amorce, de 20 bases de longueur. Le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ;

b) la composition en bases de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:

Tm= 81 ,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54- 9.62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 ⁰ C, de préférence de 5 à 10 ⁰ C en-dessous de Tm.

Par « conditions d'hybridation de forte stringence » selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation telles que l'on se place à une température d'hybridation de 5°C au-dessous du Tm.

Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur et de la composition en bases de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).

A titre illustratif, les conditions d'hybridation utilisées pour un acide nucléique de 200 bases de longueur sont les suivantes : Préhvbridation: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.

Hybridation:

5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA) 5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)

100 μg/ml ADN de sperme de saumon

0.1% SDS durée: 1 nuit. Lavages: 2 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C

1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C

0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C

0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C.

Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en

particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 ou 2 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 ou 2 ou de sa séquence complémentaire.

De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

A titre d'exemple, le couple d'amorces défini par la séquence SEQ ID

N°7, correspondant à une amorce sens, et SEQ ID N°8 correspondant à une amorce antisens permet d'amplifier un fragment de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou un fragment de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n°EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par

des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs ( ³² P ³ H, ³⁵ S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.

Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n°FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).

De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al; (1991) ou encore dans le brevet européen n°EP 0 225 807 (Chiron).

Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à tout acide nucléique codant pour la protéine ACCS, en en particulier les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 ou 2, ou encore dans des hybridations à l'ARN lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex. En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il

comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.

L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.

Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène (A/a) peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2.

Vecteurs, cellules et plantes selon l'invention

Dans le système de contrôle objet de l'invention, pour permettre qu'au moins un des éléments génétiques de contrôle soit artificiellement introduit dans la plante dicotylédone, les acides nucléiques, et les polynucléotides régulateurs définis ci-dessus doivent être introduits dans des vecteurs, puis dans des cellules.

Ainsi, l'invention a également pour objet des vecteurs, des cellules et des plantes transformées, qui comprennent les polynucléotides régulateurs (PA) et (Pa), les acides nucléiques codant pour des protéines ACCS actives ou non

actives, ainsi que les acides nucléiques correspondant aux allèles (G) et (g) tels que décrits ci-dessus, et les amorces définies ci-dessus.

Vecteurs Un acide nucléique tel que défini ci-dessus, nommé ci-après acide nucléique d'intérêt, peut être inséré dans un vecteur approprié.

Par " vecteur " au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin. Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.

Il peut s'agir notamment d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale. Dans tous les cas, l'acide nucléique d'intérêt est placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, soit que les signaux de régulation soient tous contenus dans l'acide nucléique d'intérêt, comme c'est le cas dans les constructions d'acides nucléiques décrites dans la section précédente, soit que l'un, plusieurs d'entre eux, ou encore tous les signaux de régulation soient contenus dans le vecteur receveur dans lequel l'acide nucléique d'intérêt a été inséré.

Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelles dans les cellules hôtes dans lesquelles leur expression est recherchée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection.

Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs des signaux de régulation de l'expression tels que définis ci-dessus dans la description.

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).

Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N ⁰ CRL 1711 ) dérivée de Spodoptera frugiperda.

De manière préférée, et pour l'application principale des vecteurs de l'invention consistant à obtenir une expression stable, et préférentiellement inductible, d'une séquence codant pour une protéine ACCS dans une plante, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:

- vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH (PaIo Alto, Californie, USA);

- vecteur pBI 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;

- vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH;

- vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)

- vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP 672 752 et Ishida et al., 1996).

A titre d'exemple, dans le système de contrôle objet de l'invention, le gène (A/a), sous la forme de l'allèle (A), peut être introduit artificiellement dans la plante dicotylédone en utilisant l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°9, qui comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' :

- une partie de la séquence d'un vecteur pEC2, localisée du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 633 de la séquence SEQ ID N°9,

- la séquence du site de restriction Notl, localisée du nucléotide en position 634 jusqu'au nucléotide en position 641 de la séquence SEQ ID N°9 - la séquence d'un acide nucléique comprenant le gène (A/a), sous la forme de l'allèle (A), localisé du nucléotide en position 642 jusqu'au nucléotide en position 14020 de la séquence SEQ ID N°9

- la séquence du site de restriction Notl, localisée du nucléotide en position 14021 jusqu'au nucléotide en position 14028 de la séquence SEQ ID N°9

- une partie de la séquence d'un vecteur pEC2, localisée du nucléotide en position 14029 jusqu'au nucléotide en position 16177 de la séquence SEQ ID N°9.

Ainsi, la séquence SEQ ID N°9 comprend un vecteur pEC2 linéarisé, dans lequel la séquence d'un acide nucléique comprenant le gène (A/a), sous la forme de l'allèle (A) a été insérée, en utilisant le site de restriction Notl du vecteur.

Cellules Les méthodes les plus répandues pour introduire des acides nucléiques dans des cellules bactériennes peuvent être utilisées dans le cadre de cette invention. Ce peut être la fusion de cellules réceptrices avec des protoplastes bactériens contenant l'ADN, l'électroporation, le bombardement par projectiles, l'infection par des vecteurs viraux, etc. Les cellules bactériennes sont souvent utilisées pour amplifier le nombre de plasmides contenant le construit comprenant la séquence nucléotidique, objet de l'invention. Les bactéries sont mises en culture et les plasmides sont ensuite isolés selon des méthodes bien connus de l'homme du métier (se reporter aux manuels de protocoles déjà cités), incluant les kits de purification de plasmides vendus dans le commerce comme par exemple EasyPrepI de Pharmacia Biotech ou QIAexpress Expression System de Qiagen. Les plasmides ainsi isolés et purifiés sont

ensuite manipulés pour produire d'autres plasmides qui seront utilisés pour transfecter les cellules végétales.

Pour permettre l'expression d'un acide nucléique d'intérêt selon l'invention placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier.

L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.

Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.

Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.

Avantageusement, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.

Parmi les cellules susceptibles d'être transformées selon le procédé de l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes dicotylédone, de préférence appartenant à la famille des cucurbitaceae, dont les membres sont détaillées ci-après dans la partie intitulée « plantes selon l'invention ».

Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention.

Préférentiellement, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante appartenant à l'espèce cucumis melo.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique d'intérêt, pour fabriquer une plante transformée dont le phénotype sexuel est modifié.

L'invention est également relative à l'utilisation d'un vecteur recombinant tel que défini dans la présente description pour fabriquer une plante transformée dont le phénotype sexuel est modifié.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'un hôte cellulaire transformé par un acide nucléique d'intérêt, pour fabriquer une plante transformée dont le phénotype sexuel est modifié.

L'invention concerne aussi une plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes telles que définies ci-dessus.

Plantes transformées selon l'invention

L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par au moins l'un des acides nucléiques tels que définis ci-dessus ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.

La plante transformée peut contenir une pluralité de copies d'un acide nucléique codant pour la protéine ACCS, dans les situations dans lesquelles une surexpression de la protéine ACCS est recherchée. Une surexpression de la protéine ACCS est recherchée notamment lorsque l'on souhaite obtenir des plantes produisant des fleurs femelles, non capables d'autopollinisation.

L'invention est donc également relative à une plane transformée telle que définie ci-dessus dont les fleurs sont exclusivement femelles ou hermaphrodites.

Les plantes transformées selon l'invention, comprennent toutes au moins un élément choisi parmi les acides nucléiques, et les polynucléotides régulateurs définis ci-dessus artificiellement introduit dans leur génome.

Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes transformées selon l'invention font également partie de l'invention.

L'invention concerne aussi toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille, la fleur et surtout la graine ou le fruit.

L'invention a encore pour objet une semence ou une graine de plante produit par une plante transformée telle que définie ci-dessus.

Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies des premiers et seconds éléments génétiques de contrôle tels que définis ci-dessus, artificiellement introduits dans ladite plante dicotylédone permettant la synthèse de la protéine ACCS à un taux élevé ou à un taux faible, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.

Selon un mode de réalisation préférentiel d'une plante transformée selon l'invention, on cherche à exprimer de manière contrôlée la protéine ACCS, ce qui implique que la plante transformée ne contient, en tant que copie fonctionnelle d'un polynucléotide codant pour la protéine ACCS, uniquement la ou les copies qui ont été artificiellement introduites dans leurs cellules, et préférentiellement dans leur génome, alors que les séquences du gène (A/a) codant pour ACCS, retrouvées naturellement dans la plante sauvage portent au moins une mutation provoquant un défaut dans l'expression du gène (A/a).

Les plantes transformées selon l'invention sont des dicotylédones, de préférence appartenant à la famille cucurbitaceae, et en particulier aux genres choisis parmi : Abobra, Acanthosicyos, Actinostemma, Alsomitra, Ampelosicyos, Anacaona, Apat3ingania, Apodanthera, Bambekea, Benincasa, Biswarea, Bolbostemma, Brandegea, bryonia, Calycophysum, Cayaponia, Cephalopentandra, Ceratosanthes, Chalema, Cionosicyos, Citrullus, Coccinia, Cogniauxia, Corallocarpus, Cremastopus, Ctenolepis, Cucumella, Cucumeropsis, Cucumis, Cucurbita,, Cucurbitella, Cyclanthera, Cyclantheropsis, Dactyliandra, Dendrosicyos, Dicoelospermum, Dieterlea, Diplocyclos, Doyerea, Ecballium, Echinocystis, Echinopepon, Edgaria, Elateriopsis, Eureiandra, Fevillea, Gerrardanthus, Gomphogyne, Gurania, Guraniopsis, Gymnopetalum, Gynostemma, Halosicyos, Hanburia, Helmontia, Hemsleya, Herpetospermum, Hodgsonia, Ibervillea, Indofevillea, Kedrostis, Lagenaria,, Lemurosicyos, Luffa, Marah, Melancium, Melothria, Melothrianthus, Microsechium, Momordica,

Muellerargia, Mukia, Myrmecosicyos, Neoalsomitra, Nothoalsomitra, Odosicyos, Oreosyce, Parasicyos, Penelopeia, Peponium, Peponopsis, Polyclathra, Posadaea, Praecitrullus, Pseudocyclanthera, Pseudosicydium, Psiguria, Pteropepon, Pterosicyos, Raphidiocystis, Ruthalicia, Rytidostylis, Schi3ocarpum, Schi3opepon, Sechiopsis, Sechium,, Selysia, Seyrigia, Sicana, Sicydium, Sicyos, Sicyosperma, Siolmatra, Siraitia, Solena, Tecunumania, Telfairia, Thladiantha, Tήchosanthes, Tήcyclandra, Trochomeria, Trochomeήopsis, Tumamoca, Vaseyanthus, Wilbrandia, Xerosicyos, 3anonia, 3ehneήa, 3ombitsia, ou 3ygosicyos. De préférence, les plantes transformées appartiennent au genre cucumis, et à l'espèce Cucumis MeIo.

Procédés de détection selon l'invention

L'identification du système de contrôle du développement du type floral par les inventeurs, a permis de mettre au point des procédés de détection du phénotype sexuel des plantes extrêmement simples, qui sont détaillés ci-après.

Procédé de détection de la présence d'un allèle (A) ou (a), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :

1 ) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus avec l'échantillon à tester ; et

2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Procédé de détection de la présence d'un allèle (G) ou (g), ladite méthode comprenant les étapes de : 1 ) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus avec l'échantillon à tester ; et

2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Ces deux procédés de détection permettent de sélectionner des plantes dont les phénotypes et génotypes ont été résumés dans le tableau 1.

La détection du complexe entre un acide nucléique et une sonde peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, et en particulier en utilisant des sondes ou amorces marquées, telles que décrites dans la partie « Sondes et amorces selon l'invention ». Ces procédés sont particulièrement avantageux car ils évitent de devoir cultiver une plante dicotylédone, pour connaître son phénotype sexuel. Il est ainsi possible de réaliser la détection du phénotype sexuel d'un très grand échantillon de plantes, à moindre coût.

De plus ces procèdes permettent de sélectionner de caractères phenotypiques à expression tardives tel l'apparition du phénotype sexuel des fleurs sur des plantes à un stade très jeune (plantule avec les premières feuilles. L'application ci dessus permet un gain de temps et d'espace considérable.

Les inventeurs ont montré (exemple 1 ) que l'allèle (A) et l'allèle (a) sont associés à un polymorphisme nucléotidique simple (SNP). Ainsi, l'allèle (A) de séquence SEQ ID n°1 comprend, de la position 6074 à la position 6077, une séquence AGCT, se traduisant par la présence dans la protéine ACCS de SEQ ID N°3, d'un résidu alanine en position 54. L'allèle (a) de séquence SEQ ID n°2 comprend, de la position 3817 à la position 3820, une séquence AGTT, se traduisant par la présence dans la protéine ACCS d'un résidu valine en position 54.

Les inventeurs ont montré que parmi les deux séquences identifiées ci- dessus, seule la séquence AGCT en position 6074 à 6077 de la séquence SEQ ID N°1 correspondant à l'allèle (A) et présentant un résidu cytosine en position 6076 constitue un site de restriction pour l'enzyme AIu I. En conséquence, la méthode dite de « digestion enzymatique des fragments amplifiés » (En anglais : Cleaved Amplified Polymorphic Séquence Marker ou CAPS) connue de l'homme du métier peut être utilisée pour identifier la présence de l'allèle (A) ou de l'allèle (a) dans une plante. Dans cette méthode, une étape d'amplification par PCR est réalisée, en utilisant un couple d'amorces particulier répondant aux critères suivants :

- le couple d'amorces encadre la région du SNP,

- le couple d'amorces permet d'amplifier l'allèle (A) et l'allèle (a),

- le couple d'amorces permet d'observer après digestion enzymatique par AIu I un nombre de fragments de restrictions différent selon que l'allèle (A) ou l'allèle (a) a été amplifié.

A titre d'exemple un tel couple d'amorces comprend les séquences SEQ ID N°11 et SEQ ID N°12.

Dans une seconde étape, les produits issus de la PCR sont mis en présence de l'enzyme de restriction AIu I, dans des conditions permettant un clivage.

Les produits de PCR ainsi digérés ou non digérés par l'enzyme, en fonction de leur séquence nucléotidique sont ensuite discriminés par des techniques usuelles, par exemple en fonction de leur taille.

En appliquant cette méthode, l'homme du métier peut aisément discriminer une plante portant l'allèle (A) d'une plante portant l'allèle (a) puisque les produits PCR issus d'une plante portant l'allèle (A) seront digérés par l'enzyme de restriction au niveau du SNP. Ces produits de PCR pourront aisément être distingués des produits PCR issus d'une plante portant l'allèle (a), non digérés par l'enzyme de restriction au niveau du SNP. L'invention a donc également pour objet un procédé de détection de la présence d'un allèle (A) ou (a), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :

- amplifier par PCR l'ADN d'un échantillon à analyser en utilisant les amorces de séquence SEQ ID N°11 et SEQ ID N°12, - digérer le produit obtenu par l'enzyme de restriction AIu I, et

- détecter les fragments de restriction obtenus.

Pour détecter les fragments de restrictions obtenus, l'homme du métier procédera par exemple à une électrophorèse de manière à pouvoir détecter les fragments en fonction de leur taille. Pour les plantes portant l'allèle (A) 4 fragments de restrictions sont obtenus. Leur taille est de 327, 197, 137 et 116 pb.

Pour les plantes portant l'allèle (a) 3 fragments de restrictions sont obtenus, leur taille est de 524, 137 et 116 pb.

Le procédé permet donc une détection facile du phénotype sexuel d'une plante.

Procédés de sélection selon l'invention

Les procédés de détection ci-dessus peuvent être mis en œuvre dans les procédés de sélection détaillés ci-après.

L'invention a pour objet un procédé de sélection du type floral d'une plante appartenant au genre cucurbitaceae, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à : a) déterminer la présence des allèles (A) et (a), dans une plante d'intérêt appartenant à la famille des cucurbitaceae, par exemple en utilisant les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, ou un anticorps dirigé contre la protéine ACCS et b) sélectionner positivement la plante qui possède l'allèle (A) ou l'allèle (a) dans son génome.

L'invention a également pour objet un procédé de sélection du type floral d'une plante appartenant au genre cucurbitaceae, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à : a) déterminer la présence des allèles (G) et (g), dans une plante d'intérêt appartenant à la famille des cucurbitaceae, par exemple en utilisant les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, et b) sélectionner positivement la plante qui possède l'allèle (G) ou l'allèle (g) dans son génome.

La détermination de la présence des allèles (A), (a), (G) et (g) peut être avantageusement effectuée en mettant en œuvre les procédés de détection ci- dessus.

L'homme du métier peut aisément combiner les procédés de sélection définis ci-dessus, en se référant au tableau 1 , donnant la correspondance entre

génotype et phénotype, pour obtenir des plantes de phénotype uniquement femelle ou hermaphrodites, par exemple.

Procédés d'obtention d'une plante transformée selon l'invention L'invention concerne tout d'abord un procédé pour l'obtention d'une plante transformée visant à insérer l'allèle (A) dans une plante ne comprenant pas cet allèle.

L'invention a ainsi pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée, appartenant à la famille cucurbitaceae, portant des fleurs femelles, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale d'une plante d'intérêt ne portant pas l'allèle (A), dans son génome, par une séquence nucléotidique (NA); ou un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome, l'acide nucléique (NA) ; c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b).

Ce type de procédé est particulièrement utile en ce qu'il permet de d'insérer l'allèle (A) dans le génome d'une plante, qui présentera ainsi un phénotype monoïque ou gynoïque.

L'invention a également pour objet un procédé de transformation de plantes visant à supprimer l'allèle (A) dans une plante, ou a remplacer l'allèle (A) par un allèle (a) de sorte à obtenir une plante de phénotype hermaphrodite.

L'invention a donc pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée, appartenant à la famille cucurbitaceae, portant des fleurs hermaphrodites, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) le remplacement dans une plante, de l'allèle (A), par un allèle (a), b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome l'allèle (a). c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b),

d) croisement de plantes obtenues à l'étape c) pour l'obtention d'une ne portant plus d'allèle (A).

Dans un premier mode de réalisation, du procédé ci-dessus, l'étape a) consiste à transformer une plante comportant l'allèle (A) dans son génome, par un acide nucléique de type « antisens » tel que défini ci-dessus, et en sélectionnant les plantes ne comportant plus l'allèle (A).

Un résultat identique peut être obtenu en mettant en œuvre des phénomènes de recombinaison homologue visant à remplacer tout ou partie de l'acide nucléique (NA) par un acide nucléique de structure altérée, qui ne permet pas d'obtenir un phénotype correspondant à l'allèle (A).

Un tel acide nucléique de structure altérée, peut consister en un polynucléotide régulateur (Pa), ou un acide nucléique codant pour une protéine ACCS altérée.

L'invention a ainsi pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée, appartenant à la famille cucurbitaceae, portant des fleurs hermaphrodites, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale d'une plante d'intérêt comportant un allèle (A) par un polynucléotide régulateur (Pa) ou par un acide nucléique codant pour une protéine ACCS altérée; ou un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un polynucléotide régulateur (Pa) ou un acide nucléique codant pour une protéine ACCS altérée. c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b), d) croisement de plantes obtenues à l'étape c) pour l'obtention d'une ne portant plus d'allèle (A).

Ce type de procédé est particulièrement utile en ce qu'il permet d'obtenir des plantes ne comprenant plus d'allèle (A), et qui sont de type andromonoïque ou hermaphrodite.

L'invention concerne également un procédé de transformation de plantes visant à insérer l'allèle (G).

L'invention a ainsi pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée, appartenant à la famille cucurbitaceae, portant des fleurs femelles, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale d'une plante d'intérêt ne comprenant pas l'allèle (G), dans son génome, par une séquence nucléotidique (NG); ou un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur l'acide nucléique (NG) ; c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b).

L'invention concerne également un procédé de transformation de plantes visant à remplacer l'allèle (G) par l'allèle (g).

L'invention a ainsi pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée, appartenant à la famille cucurbitaceae, portant des fleurs hermaphrodites, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) le remplacement dans une plante, de l'allèle (G), par un allèle (g), b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome l'allèle (g). c) Régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b), d) croisement de plantes obtenues à l'étape c) pour l'obtention d'une ne portant plus d'allèle (G).

Les procédés ci-dessus peuvent être combinés entre eux en se fondant sur le tableau 1 , de sorte à obtenir des plantes exclusivement femelles ou exclusivement hermaphrodites, dont l'intérêt industriel a été discuté ci-dessus.

Pour simplifier les procédés pour l'obtention d'une plante transformée exclusivement femelle ou exclusivement hermaphrodite, il est possible de réaliser une étape préalable dans les procédés définis ci-dessus, au cours de

laquelle des mutations des gènes (A/a) et (G/g) présents naturellement dans la plante sont effectuées, par exemple par insertion au hasard du transposon Mutator dans une population de plantes de phénotype sauvage, puis en détectant chez les mutants obtenus, ceux d'entre ces mutants qui sont de génotype (aagg), par exemple à l'aide des sondes ou des amorces nucléotidiques décrites dans les exemples.

Selon ce mode de réalisation préférentiel, la plante transformée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle possède un génotype (aagg) et présente des fleurs exclusivement hermaphrodites. Dans un mode de réalisation des procédés d'obtention d'une plante transformée définis ci-dessus, le polynucléotide (NA) lorsqu'il est utilisé comprend un polynucléotide régulateur (PA) activateur inductible.

L'invention a donc également pour objet un procédé pour l'obtention de graines de plantes dont le développement produit des plantes portant des fleurs femelles, comportant les étapes suivantes : a) cultiver une plante d'intérêt ne portant pas l'allèle (A) tel que défini dans la revendication 1 dans son génome, transformée par une séquence nucléotidique (NA) comprend un polynucléotide régulateur (PA) activateur inductible ; ou par un vecteur recombinant comprenant cet acide nucléique ; en l'absence d'un signal inducteur auquel le polynucléotide activateur inductible est sensible. b) mettre en contact la plante transformée définie en a) avec le signal activateur inductible auquel le polynucléotide activateur inductible est sensible, c) récupérer les graines matures, dont le développement produit exclusivement des plantes portant des fleurs femelles.

Dans un autre mode de réalisation, un polynucléotide régulateur (Pa) répresseur inductible est utilisé pour remplacer le polynucléotide régulateur naturellement présent dans la plante, et permettre de faire baisser le taux de protéine ACCS à un moment déterminé.

-Procédés préférés d'obtention d'une plante portant exclusivement des fleurs femelles

De manière tout à fait préférée, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante portant exclusivement des fleurs femelles, caractérisé en ce qu'il consiste à :

- détecter les allèles (A), (a), (G) et (g) en mettant en œuvre les procédés de détection ci-dessus, et

- obtenir une plante comprenant au moins une copie de l'allèle (A) et aucune copie de l'allèle (G), en mettant en œuvre les procédés de sélection ou les procédés d'obtention d'une plante transformée tels que définis ci-dessus.

Les plantes obtenues selon le procédé ci-dessus portent exclusivement des fleurs femelles, et sont donc particulièrement intéressantes d'un point de vue industriel, puisqu'elles ne sont pas capables d'auto pollinisation. Ces plantes peuvent donc être utilisées dans des procédés de sélection en vue d'obtenir des plantes hybrides.

-Procédés préférés d'obtention d'une plante portant exclusivement des fleurs hermaphrodites

De manière tout à fait préférée, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante portant exclusivement des fleurs hermaphrodites, caractérisé en ce qu'il consiste à :

- détecter les allèles (A), (a), (G) et (g) en mettant en œuvre les procédés de détection définis ci-dessus, et

- obtenir une plante ne comprenant aucune copie de l'allèle (A) et aucune copie de l'allèle (G), en mettant en œuvre les procédés de sélection ou les procédés d'obtention d'une plante transformée tels que définis ci-dessus.

Les plantes obtenues selon le procédé ci-dessus portent exclusivement des fleurs hermaphrodites, et sont donc particulièrement intéressantes d'un point de vue industriel, puisqu'elles ne sont capables d'auto pollinisation. Ces

plantes peuvent donc être utilisées dans des procédés de création de lignées pures.

Procédés de transformation des plantes selon l'invention Les méthodes les plus répandues pour introduire des acides nucléiques dans des cellules végétales peuvent être utilisées dans le cadre de cette invention.

La transformation de cellules végétales peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+), l'électroporation (Fromm et al. 1985), l'utilisation d'un canon à particules, ou la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al, 1987).

Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumefaciens (An et al. 1986), ou A. rhizogenes (Guerche et al. 1987).

De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium. Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des dicotylédones. Selon un autre

protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.

Exemples

Exemple 1 Identification d'un polymorphisme nucléotidique simple (SNP)

L'analyse de la séquence d'un fragment d'ADN contenant le promoteur de la région du gène (A/a) (2kb en amont du codon d'initiation) révèle un taux important de polymorphisme dans la région régulatrice en 5' et dans les séquences introniques, alors que seule une mutation ponctuelle dans la séquence codante de la protéine a été identifiée (figure 1A). Cette mutation ponctuelle au niveau de l'acide nucléique se traduit au niveau de la séquence polypeptidique de la protéine ACCS, par le remplacement d'un résidu alanine en position 57 par un résidu valine (figure 1 B). En utilisant des méthodes de prédiction de substitution d'acides aminés, sur la base d'homologies de séquences et de propriétés physiques, il a été recherché si la mutation ponctuelle identifiée dans l'allèle a est dommageable pour la fonction protéique.

Le logiciel SIFT (Ng PC and Henikoff S., 2001 )prédit que la substitution Ala57Val est grandement dommageable pour la fonction A. De plus, des analyses de structures cristallines de l'ACC synthase de pomme et de tomate (Capitani et al., 2002 ; Huai et al., 2001 ) mettent en exergue le rôle important de cet acide aminé.

Suite à l'identification de ce polymorphisme nucléotidique simple (ou SNP), des analyses d'haplotypes et d'associations dans une collection de 30 germplasmes de melon ont révélé que ce SNP est totalement associé au phénotype sexuel. Toutes les entrées monoïquesportent une alanine en position 57 alors que toutes les entrées andromonoïques portent une valine.

Aucune exception n'a été trouvée ni aucun autre type de changement d'acide aminé à cette position.

Enfin, ce polymorphisme nucléotidique simple a été analysé dans le but d'identifier des enzymes de restriction qui pourraient être utilisées pour développer une méthode dite de « digestion enzymatique des fragments amplifiés » (En anglais : Cleaved Amplified Polymorphic Séquence Marker ou CAPS). Il apparaît que la substitution du nucléotide C en un nucléotide T conduit à une perte d'un site de restriction AIu I dans l'allèle a.

Exemple 2 Expression spatiale et temporelle de l'élément génétique de contrôle (A/a)

Pour étudier l'expression de l'élément génétique de contrôle A/a sous la forme de l'allèle A, des hybridations in situ ont été effectuées en utilisant des sondes spécifiques de l'allèle A sur des plantes, et plus précisément sur des méristèmes floraux de plantes mâles, femelles et hermaphrodites, de génotype AA GG, aa GG, AA gg et aa gg. Dans les méristèmes floraux A l'expression est localement forte et le signal d'hybridation est détecté de manière spécifique dans les primordia des carpelles des fleurs femelles et hermaphrodites des plantes monoïques, andromonoïques, gynoïques et hermaphrodites. En se référant aux différents stades de développement de la fleur décrit pour le concombre (Bai et al., 2004), il apparaît que chez le melon le gène (A/a) est exprimé à un stade précoce du développement des méristèmes floraux avant qu'une distinction morphologique puisse être effectuée entre les fleurs mâles et les fleurs femelles.

Dans les fleurs mâles et hermaphrodites, aucune expression n'est détectée dans les anthères. Ces données indiquent que l'expression de l'allèle (>4) dans les carpelles des fleurs femelles empêche le développement des étamines. Du fait que, dans les fleurs hermaphrodites, l'allèle récessif (a) présente le même profil d'expression que l'allèle A dans les fleurs femelles, on

peut conclure que la fonction du gène A dépend de sa tissu-spécificité d'expression ainsi que de la nature de la protéine ACCS synthétisée.

Exemple 3 Transqénèse chez Arabidopsis thaliana

Les effets potentiels du gène A/a, et de la protéine ACCS sur le phénotype sexuel floral et l'architecture de la fleur de plantes n'appartenant pas aux cucurbitacées ont été étudiés par transformation d'Arabidopsis thaliana par Agrobacteήum. Les plantes transgéniques d' Arabidopsis portantnt l'allèle de melon A ou a présentent un phénotype au niveau de I' architecture florale et des siliques. (figures 2A et 2B). En effet les siliques des transformants d'Arabidopsis sont plus courtes que celles d'une plante Arabidopsis sauvage et l'architecture des fleurs des transformants d'Arabidopsis est très affectée. Ces résultats permettent d'étendre l'utilisation du gène de melon (A/a) à des plantes dicotylédones n'appartement pas à la famille des cucurbitacées.

Références

An et al., (1986) Plant Physiol. 81 , 86-91

Aoyama T et al., (1997) The Plant Journal, vol.11 (3):605-612. Ausubel et al., (1997) Current protocols in molecular biology

Bai et al., 2004 Planta 220 : 230-240

Beaucage et al. (1981 ), Tetrahedron Lett., 22:1859-1862.

Berbal, 1984 .

Bevan ét al., Nucleic Acids Research, vol.12:8711-8721. Brown ét al. (1979), Methods Enzymol., 68:109-151.

Causse et al. (1995) Molecular Breeding 1 : 259-272.

Capitani et al., 2002 J. Biol. Chem 51 : 49735-49742

Christensen et al. (1996), Transgenic. Res., 5:213

Finer et al. (1992) Plant CeII Report, 11 , 323-328 FROMM M. et al. (1990), Biotechnology, 8:833-839

GAIT (éd.), (1984). Nucleic Acid Hybridization.

GORLACH J, VOLRATH S, KNAUF-BEITER G, HENGY G, BECKHOVE U,

KOGEL KH, OOSTENDORP M, STAUB T, WARD E, KESSMANN H, RYALS J.

(1996) Benzothiadiazole, a novel class of inducers of systemic acquired résistance, activâtes gène expression and disease résistance in wheat. Plant

CeII 8:629-43

GLOVER (éd.), 1985. DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II

Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.

Guerche et al. (1987), Mol Gen. Genêt 206, 382 HAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization: a practical approach,

Hames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.

HAJDUKIEWICZ, P. SVAB. Z. AND MALIGA P. Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994

(1994).

Huai et al., 2001 J ; Biol. Chem 41 : 38210-38216 Ishida et al. (1996) Nature biotechnology 14, 745-750

JEFFERSON, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol.5:387-405.

Kay et al., (1987) Science 236, 4805

Kahana, A., Silberstein, L., Kessler, N., Goldstein, R. S. and Perl-Treves, R.

(2000) expression of ACC oxidase gènes differs among sex génotypes and sex phases in cucumber. Plant Mol Biol. Nov ; 41 (4): 517-528. Kamachi, S., Sekimoto, H., Kondo, N. & Sakai, S., (1997). Cloning of a cDNA for a 1-aminocyclopropane-i-carboxylate synthase that is expressed durig development of female flowers at the apices of Cucumis sativus L. The Plant

CeII Physiol., 38:1197-206.

Kohler G and Milstein C;, (1975), Nature, volume 256:495 KOOTER, JM., MATZKE, MA., AND MEYER, P. (1999) Listening to the silent gènes: transgene silencing, gène régulation and pathogen control. Trends Plant

Sci. 4, 430-437

Kozbor et al., (1983), Hybridoma, vol.2 (1):7-16.

Léger OJ et al., (1997), Hum Antibodies, vol.8 (1 ):3-16 Martineau P et al., (1998), J. Mol. Biol. vol.280(1 ):117-127.

Martinez, A., Sparks, C, Hart, CA., tompson, J., and Jepson, I. (1999)

Ecdysone agonist inducible transcription in transgenic tobacco plants. Plant J.

19:97-106

McNELLIS T W, 1998, The Plant Journal, vol.14 (2): 247-257 Molina A, Hunt MD, Ryals JA (1998) Impaired fungicide activity in plants blocked in disease résistance signal transduction. Plant CeII 10:1903-14

NARANG et al. (1979), Methods Enzymol., 68: 90-98.

Neuhaus et al., (1987).Theor. Appl. Genêt. 75(1 ), 30-36

Ng PC and Henikoff S. (2001) Génome Res. 11 (5):863-874 Reinmann KA et al. (1997), Aids Res. Hum retroviruses, vol.13 (11 ):933-943.

Ridder R. et al., (1995), Biotechnology (NY), vol.13 (3):255-260.

SALTER MG et al., 1998, vol.16 (1 ): 127-132

Risser, G. and Rode, J. C, 1979. Induction par le nitrate d'argent de fleurs staminées chez des plantes gynoïques de melon (Cucumis melo L.). Annales de l'Amélioration des Plantes, 29:349-352.

Rudich, J., Halevy, A.H. and Kedar, N., 1969. Increase of femaleness of three cucurbits by treatment with Ethrel, an ethylene-releasing compound. Planta,

86:69-76.

Sambrook et al., (2001 ), Molecular Cloning A-laboratory manual Sanchez Pescador, (1988), J. Clin. Microbiol., 26 (10):1934-1938.

Urdea et al. (1988), Nucleic Acids Research, 11 :4937-4957.

WASSENEGGER, M., AND PéLISSIER, T. (1998) A model for RNA-mediated gène silencing in higher plants Plant Mol. Biol. 37, 349-362

Watson et al. (1994) ADN recombinant, Ed. De Boek Université, 273-292 YANG F. MOSS LG, PHILIPS GN JR. Nat. Biotechnol. 1996 Oct. 14(10):1246-

51.

YANG TT, CHENG L. KAIN SR, Nucleic acids Res. 1996, Novembre 15;

24(22):4592-3.