Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes.

Der Begriff'RNA-Virus mit genetischer Heterogenität'bezeichnet RNA-Virusarten, die mit einer eigenen Polymerase replizieren, welche mit einer relativ großen Fehlerrate arbeitet, wodurch regelmäßig Mutationen in das Virusgenom eingebaut werden. Dies gilt auch für Retroviren wie HIV, die zu den Viren zählen, die mit Einzelstrang-RNA und Doppelstrang-DNA-Zwischenprodukt und einer ungenauen RNA-Polymerase replizieren. Die hohe Mutationsrate (z.B. für HCV um 1.4-1.9 x 10-3 Basenveränderungen pro definierter Genomstelle pro Jahr) ist charakteristisch für RNA- Viren und führt zur Veränderung der Oberflächenstruktur und des Proteinmusters der Virushülle. Diese Veränderungen sind die Ursache dafür, daß die betreffende RNA-Viren mittlerweile eine solche genetische Vielfalt aufweisen, dass in jeder dieser Virenarten heute mehrere (im Fall von HCV sechs) verschiedene Genotypen klassifiziert und in jedem Genotyp eine Vielzahl von Subtypen unterschieden werden. Die biologische Konsequenz besteht zum einen darin, daß das RNA-Virus im Laufe der Infektion nicht mehr oder nur partiell vom Immunsystem des Wirts erkannt werden kann und das Virus der Immunantwort des Patienten, nämlich neutralisierenden Antikörpern oder zytotoxischen T-Lymphozyten, entkommen kann. Zum zweiten wird der Wirt initial bei der Virusinokulation mit einer solchen genetischen Vielfalt und damit Oberflächenvariabilität des RNA-Virus konfrontiert, daß auch eine breite Immunantwort in der Regel nicht ausreicht, alle genetisch unterschiedlichen Genotypen und Subtypen

dieses Virus zu eliminieren. Durch die Selektion von Mutanten kann das RNA-Virus trotz einer deutlichen Immunantwort des Patienten dauerhaft persistieren. Bei HCV-, HIV-, Influenza-und vergleichbaren Infektionserkrankungen bzw. malignen Tumoren wird dies als einer der Hauptmechanismen, wenn nicht sogar als entscheidender Mechanismus angesehen, der zur Chronifizierung der Infektionserkrankung oder zur dauerhaften Etablierung einer Tumorerkrankung führt.

Die Infektion mit Hepatitis C Virus (HCV) gilt als häufigste Ursache für die Entwicklung einer Posttransfusions-bzw. Non-A-Non-B-Hepatitis. Die humorale und zelluläre Immunreaktion des Patienten gegen HCV ist polyklonal und multispezifisch. Sie reicht aber aus den vorstehend dargelegten Gründen in der Regel nicht aus, das Virus dauerhaft zu eliminieren. Mehr als 70-80% der infizierten Menschen bleiben nach der Exposition mit HCV in der Folge chronische Virusträger bzw. entwickeln eine chronische Hepatitis. Im weiteren Verlauf der Erkrankung kann diese chronische Hepatitis dann zu einer Leberzirrhose (in ca. 20-40% der Virusträger) oder auch zu einem hepatozellulären Karzinom führen. Diese Folgeerkrankungen gehen mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität einher. Leider sind die therapeutischen Möglichkeiten bisher begrenzt. Die diversen Quasispezies, Subtypen und Genotypen von HCV stellen eine große Herausforderung für die Entwicklung antiviraler Strategien dar, weil Immunisierungsansätze aber auch Virusinhibitoren (z. B. NS3-Proteaseinhibitoren) mit einer großen genetischen Heterogenität konfrontiert sind. Bis dato konnte keine protektiv wirksame Hepatitis C Vakzine entwickelt werden, die ein geeignetes Mittel zur Eindämmung der Weiterverbreitung von HCV darstellt.

Im Prinzip ganz ähnlich stellt sich die Situation im Fall von Humane- Immundefizienzvirus- : V)-, Influenzavirus-A-oder Influenzavirus-B-Infektionen dar.

Als Vakzine gegen RNA-Viren kommen insbesondere die DNA-Vakzine und die Protein-bzw. Peptidvakzine in Betracht.

Das Prinzip der DNA-Vakzine bzw. DNA-Immunisierung beruht darauf, daß ein Plasmid, das die genetische Information für ein gewünschtes Zielprotein trägt, in die Patientenzellen injiziert wird. Die Injektion kann intrakutan oder intramuskulär erfolgen.

Nach der Aufnahme des Plasmids in die Zellen wird endogen das bzw. die gewünschte (n) Protein (e) exprimiert. Diese Proteine oder gegebenenfalls aus diesen durch Spaltung bzw. Prozessing hervorgegangene Peptide werden im endoplasmatischen Retikulum auf MHC-Moleküle geladen und auf der Zelloberfläche vornehmlich im MHC-Klasse 1 Kontext präsentiert. Das führt zu einer MHC-restringierten Aktivierung von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), die bei der Viruselimination eine große Rolle spielen. Gleichzeitig kann das exprimierte Protein von Makrophagen aufgenommen werden und eine MHC-Klasse II Antwort induzieren, die wiederum zur Stimulation von T-Helfer-und B-Zellen führt. Die stimulierten T-Helfer-und B-Zellen produzieren antigenspezifische Antikörper und damit die humorale Immunantwort.

Untersuchungen zur Immunantwort nach DNA-Immunisierung gegen die Strukturproteine von HCV sind im Stand der Technik bekannt. Es wurde gezeigt, daß das HCV Core Protein, wenngleich hochkonserviert zwischen den Genotypen, nicht sehr immunogen ist (vgl. Geissler, M. et al., 1997 und Tokushige, K. et al., 1996). Die publizierten Ergebnisse von Untersuchungen zur Immunogenität gegen die HCV Envelope Proteine sind kontrovers (vgl. Saito, T. et al. 1997 und Nakano, I. et al. 1997), bei diesen Envelope Proteinen besteht das Problem der hohen genetischen Variabiltät zwischen Genotypen und Subtypen. Die Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort gegen die Nichtstrukturproteine von HCV ist ebenfalls beschrieben (Encke, J. et. al., 1998). Keines dieser bekannten Untersuchungsergebnisse liefert aber einen konkreten Anhaltpunkt oder gar Ausgangsstoff für die Entwicklung einer HCV- Vakzine mit zumindest befriedigenden therapeutischen Eigenschaften.

Bei der Entwicklung von Protein-bzw. Peptidvakzinen als prophylaktische Vakzine gegen RNA-Viren besteht das Problem, daß diese Vakzinen im wesentlichen allein eine MHC-Klasse II Antwort d. h. ein Antikörperproduktion induzieren, und daß die infolge der Immunisierung mit rekombinatem Protein eines oder auch mehrerer RNA-Virus- Genotypen und Subtypen gebildeten neutralisierenden Antikörperspezies nach den bisherigen Erfahrungen-insbesondere am Beispiel von HCV-nicht ausreichen, um die Vielzahl aller RNA-Virus-Genotypen und-Subtypen therapeutisch wirksam zu bekämpfen. Die DNA-Vakzine hat demgegenüber den Vorteil, daß sie vornehmlich und

zu allererst eine Immunantwort über den MHC-Klasse-I-Weg induziert, nämlich eine zytotoxische T-Zellantwort, und zusätzlich eine MHC-Klasse II Antwort.

Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff bzw. eine Vakzine gegen RNA-Viren zu entwickeln, der bzw. die dazu geeignet ist, eine therapeutisch wirksame Immunreaktion gegen eine Vielzahl verschiedener Genotypen und Subtypen des betreffenden RNA-Virus zu erzeugen und damit die Weiterverbreitung von RNA-Virus-Infektionserkrankungen, insbesondere von Hepatitis-C-Virus- (HCV)-, Humane-Immundefizienzvirus- (HIV)-, Influenzavirus-A-oder Influenzavirus-B- Infektionserkrankungen einzudämmen.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines genetischen Impfstoffes der eingangs beschriebenen Art, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Nukleotidsequenzen (bzw. Nukleinsäuren) voneinander verschieden sind, nämlich von Genabschnitten einer Mehrzahl (d. h. wenigstens zweier) verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus mittels Transkription oder Translation abgeleitet sind und für Proteine und/oder Proteinfragmente dieser Mehrzahl verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus kodieren.

"Abgeleitet"heißt im vorliegenden Zusammenhang, daß die Nukleotidsequenzen vollständig oder nahezu vollständig homolog oder komplementär zu den betreffenden Genabschnitten sind, wobei die Abweichungen in einzelnen Nukleotidpositionen im Fall der nur nahezu vollständigen Homologie oder Komplementarität auf die Degeneration des Gentischen Codes zurückzuführen sind, oder daß die Nukleotidsequenzen zumindest mit diesen Genabschnitten unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Die Anzahl der verschiedenen RNA-Virus-Genotypen und/oder-Subtypen beträgt vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen genetischen Impfstoffes sind die verschiedenen Nukleinsäuren von Genabschnitten verschiedener bekannter und charakterisierter Genotypen und/oder Subtypen des RNA-Virus abgeleitet. Diese Impfstoffvariante stellt eine sogenannte"definierte

Immunisierungslibrary"dar, bei der bekannt ist, welche und wieviele verschiedene Genotypen/Subtypen des betreffenden RNA-Virus in welchen Mengen vorhanden sind.

Eine Alternative hierzu besteht in derjenigen Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen genetischen Impfstoffes, bei der die verschiedenen Nukleinsäuren von Genabschnitten verschiedener, in einem Pool aus mehreren, hinsichtlich des betreffenden RNA-Virus-positiven Patientenseren vorhandener HCV-Genotypen und/oder Subtypen abgeleitet sind. Diese Impfstoftvariante stellt eine sogenannte "undefinierte Immunisierungslibrary"dar, denn der Impfstoff enthält eine unbekannte Menge genetischer Virusheterogenität, d. h. hier ist nicht oder zumindest nicht genau bekannt, welche und wieviel verschiedene Genotypen/Subtypen des betreffenden RNA- Virus in welchen Mengen vorhanden sind.

Die verschiedenen Nukleotidsequenzen, die für die verschiedenen Proteine und/oder Proteinfragmente der verschiedenen Genotypen und/oder Subtypen des betreffenden RNA-Virus kodieren, sind vorzugsweise in einem Vektor insertiert, und zwar entweder alle oder wenigstens gruppenweise in demselben Vektor oder einzeln bzw. separiert bzw. vereinzelt, d. h. jede Art für sich, jeweils einem Vektor. Als Vektoren kommen sowohl Plasmide n als auch Adenovirein betracht. In der Praxis haben sich insbesondere die Plasmide pM-CGlb und pc DNA 3.1 als gut geeignet erwiesen.

Die Erfindung betrifft neben dem Impfstoff auch ein Verfahren zur Herstellung eines genetischen Impfstoffes, welches durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist : (a) Isolierung der Virus-RNA aus einer Mehrzahl positiver Patientenseren, (b) Amplifizierung der isolierten Virus-RNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die Genabschnitten des RNA-Virus-Genoms entsprechen, (c) Ligierung/Insertierung der gewonnenen Amplifikate in einen oder mehrere Vektoren, vorzugsweise in eine oder mehrere Plasmide, Klonierung dieses/dieser rekombinanten Vektors/Vektoren bzw. Plasmids/Plasmide, nämlich (d) Transfektion von kompetenten Zellen, mit diesem/diesen rekombinanten Vektor (en) bzw. Plasmid (en) und (e) Selektionierung und Vermehrung der transformierten Zellen, (f) Gewinnung des Vektors aus den transformierten Zellen mittels (vorzugsweise pyrogenfreier) Plasmid- Mini-,-Mega-oder-Giga-Präparation, (h) Aufnahme der Vektoren in physiologischer Lösung, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden Plasmide als Vektor eingesetzt, vorzugsweise die oder eines der Plasmide pM-CGIb und/oder pc DNA 3. 1 und zur Transfektion gemäß Schritt (d) werden kompetente E. coli-Zellen verwendet.

Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (a) gewonnene Virus-RNA oder die in Schritt (b) erhaltenen Virus-RNA- Amplifikate hinsichtlich des Genotyps und/oder Subtyps des betreffenden RNA-Virus identifiziert ist bzw. sind, und daß die Ligation gemäß Schritt (e) entweder in den gleichen Vektor erfolgt oder in verschiedene Vektoren erfolgt. Das hiermit gewonnene Produkt ist eine sogenannte definierte Immunisierungslibrary-im Unterschied zur sogenannten undefinierten Immunisierungslibrary, bei der die verschiedenen Genotypen und/oder Subtypen des betreffenden RNA-Virus nicht'identifiziert und damit nicht definiert sind.

Der erfindungsgemäße genetische Impfstoff bzw. die erfindungsgemäße genetische Vakzine ermöglicht erstmals eine wirksame prophylaktische Immunisierung gegen ein heterogenes Virusinokulum (d. h. gegen eine Vielzahl diverser RNA-Sequenzen bzw.- Sequenzabschnitte und Proteine eines bestimmten RNA-Virus), wie es gewöhnlich bei einer Neuinfektion mir einem RNA-Virus, beispielsweise einer HCV-, HIV-oder Influenza-Neuinfektion vorliegt.

Die Vektor-bzw. Plasmid-Konstrukte der erfindungsgemäßen DNA-Vakzine können schnell, ohne besonderen technischen Aufwand und preisgünstig hergestellt werden. In relativ kurzer Zeit kann eine große Anzahl von Vektor-bzw. Plasmid-Konstrukten konstruiert und kloniert werden, welche die unterschiedlichsten genetischen Informationen einer Vielzahl verschiedener Genotypen bzw. Subtypen und/oder Mutanten eines bestimmten RNA-Virus, insbesondere eines Hepatitis-C-Virus (HCV), eines Humanen Immundefizienzvirus (HIV, eines Influenzavirus A oder eines Influenzavirus B enthalten und infolgedessen gegen zumindest alle diese verschiedenen Genotypen bzw. Subtypen und/oder Mutanten dieses bestimmten RNA-Virus, insbesondere des Hepatitis-C-Virus (HCV) oder des Humanen Immundefizienzvirus

(HIV) oder des Influenzavirus A oder B eine zelluläre und eine humorale Immunantwort induzieren können.

Die erfindungsgemäße DNA-Vakzine hat außerdem den Vorteil, daß die Vektor-DNA, insbesondere die Plasmid-DNA oder das Adenovirus bei Raumtemperatur gelagert werden kann. Diese Eigenschaft ermöglicht den Einsatz einer solchen Vakzine auch in Ländern der Dritten Welt.

Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel einer DNA-Vaccine gegen HCV- Infektionen sowie an DNA-Vaccinen gegen HIV und Influenza-Viren näher erläutert.

Die Beispiele umfaßt Herstellungs und Anwendungsverfahren mit dazugehörigen Figuren.

Unter den Figuren zeigen : Fig. 1. : die Lage der zur PCR verwendeten Primer innerhalb des HCV-Genoms Fig. 2 : Schema zur Herstellung der HCV-Konstrukte und Klonierung der Konstrukt in Plasmide für die DNA-Vakzine Fig. 3 : DNA-Vakzine-Konstrukte und Impfstoffgruppen Fig. 4 : Immunisierungsschema zur DNA-Vakzinierung Fig. 5 : ELISA (I) gegen rekombinantes HCV EI Protein Fig. 6 : ELISA (II) gegen ein Peptid-Mix von HCV EI Fig. 7 : T-Zell-Proliferationsassay gegen HCV E1 Fig. 8 : ELISPOT-Assay gegen HCV EI Beispiel 1 : Gewinnung einer erfindungsgemäßen"multigenetischen"Anti- HCV-DNA-Vakzine Das Prinzip der erfindungsgemäßen"multigenetischen"Anti-HCV-DNA-Vakzine besteht darin, entweder (A) definierte Nukleotidsequenzen einer Mehrzahl bekannter Genotypen und/oder Subtypen des HCV (eine sogenannte"definierte Immunisierungslibrary") in ein definiertes Plasmid zu integrieren (inserieren, ligieren) oder (B) eine unbekannte Menge

genetischer Virusheterogenität (eine sogenannte"undefinierten Immunisierungslibrary") in ein definiertes Plasmid zu integrieren (inserieren, ligieren).

(A) Zur Gewinnung der multigenetischen Anti-HCV-DNA-Vakzine auf der Basis einer definierten Immunisierungslibrary wurde folgendermaßen verfahren : Als Ausgangsmaterial diente aus HCV-positiven Patientenseren isolierte und charakterisierte HCV-E1-RNA verschiedener bekannter und charakterisierter HCV- Genotypen und-Subtypen gemäß Tabelle 1. Diese virale RNA wurde mittels RT-PCR und anschließender nested PCR revers transkribiert und amplifiziert. Als Primer dienten die in Tabelle 2 aufgelisteten und charakterisierten Oligonukleotidprimer (CS1, E2AS1, E1AS2, CS2 und E1AS2HIS), in die jeweils zwei Restriktionsschnittstellen (EcoRV und HindIII) sowie ein Start-Codon vor der Virussequenz (Sense-Primer) und ein Stop- Codon danach (Antisense-Primer) integriert wurden. Um die verschiedenen HCV- Genotypen und-Subtypen zuverlässig zu erfassen, wurden teilweise degenerierte Primer verwendet. Die Lage der zur PCR verwendeten Primer innerhalb des HCV-Genoms ist auf die Genomabschnitte für das Virusprotein EI exemplarisch beschränkt und in Figur 1 näher dargestellt.

Mit dieser Methode wurden die HCV-El-RNA-Amplifikate (cDNA-Klone) A1, Bl, Cl, D1, Fl, H77, 11, J1 und K2 gewonnen, wobei die Benennung analog der Benennung der Patientenseren erfolgte. Zusätzlich wurde ein HCV-El-RNA-Amplifikat"MIX-Pos" gewonnen, indem ein RNA-Gemisch aller vorhandenen RNA-Proben der RT-PCR unterworfen wurde. Dieses als"MIX-Pos"bezeichnete HCV-El-RNA-Amplifikat stellt eine definierte Genbibliothek für HCV-E1 dar, die die virale Heterogenität in diesem Bereich abdeckt. Als Positiv-Kontrolle in der PCR diente der Ansatz H77 (Genotyp lb).

Die verschiedenen HCV-E1-RNA-Amplifikate wurden jeweils mit dem Fachmann bekannten und geläufigen Verfahren in die Plasmide pM-CG16 und pcDNA3. 1. Zeo (-) ligiert. Mit den rekombinanten Plasmiden wurden anschließend kompetente E. coli transfiziert und die transformierten Zellen selektioniert und vermehrt. Als Kontrolle wurde ein Transfektionsansatz mit dem"leeren"Plasmid, dh. dem Plasmid ohne inseriertes HCV-RNA-Amplifikate (pM-CG16), durchgeführt. Von den Transfektionsansätzen"MIX-Pos"und"D"wurden jeweils 20 Klone, von allen anderen

Ansätzen jeweils 2 Klone gepickt und der (dem Fachmann bekannten und geläufigen) Plasmid-Minipräparation unterworfen. Der Erfolg der Klonierung wurde durch einen Restriktionsverdau und Auftrennen auf einem Agarose-Gel überprüft.

Das Prinzip dieses Verfahrens zur Gewinnung einer multigenetischen Anti-HCV-E1- DNA-Vakzine auf der Basis einer definierten Immunisierungslibrary ist in Figur 2 schematisch dargestellt.

Positive Bakterienklone aus der Minipräparation wurden zur pyrogenfreien Plasmid Mega-bzw. Gigapräparation verwendet.

Die gewonnenen Plasmid-HCV-El-Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau und Sequenzierung kontrolliert. Das Ergebnis dieser Kontrolluntersuchung ist in Tabelle 3 dargestellt.

In dieser Tabelle 3 sind die Sequenzen der Inserts der Plasmide pM-Al, pM-Bl, pM-Cl, pM-Dl, pM-F2, pM-11, pM-Jl, pM-K2, pM-H77-1, pc-B-HIS und pc-J-HIS in direkter Gegenüberstellung aufgelistet und außerdem die Sequenzen der PCR-Primer. Die in allen untersuchten Plasmidsequenzabschnitten übereinstimmenden Nukleotide sind in der Tabelle grau unterlegt. Diese Gegenüberstellung verdeutlicht, wie sehr sich die verschiedenen klonierten HCV-Genotypen und-Subtypen auf der Nukleotidebene unterscheiden.

Alle dargestellten Plasmidsequenzabschnitte weisen (in 5'-3'-Richtung) die Restriktionsschnittstelle EcoRV (GATATC) auf, gefolgt von einem Startcodon (ATG) und der sich daran anschließenden Sequenz des Sense-Primers CS2.

Die von dem Vektor pM-CG16 abgeleiteten Plasmid-HCV-El-Konstrukte (pM-Al, pM- Cl, pM-B1, pM-H77, pM-Dl, pM-F2, pM-Jl, pM-I1 und pM-K2) weisen in den dargestellten Plasmidsequenzabschnitten im Anschluß an die Primersequenz eine 639 Nukleotide (= 213 Aminosäuren) lange Nukleinsäure auf, gefolgt von einem Stoppcodon (TGA) und der sich daran anschließenden Restriktionsschnittstelle Hindou (AAGCTT).

Die von dem Vektor pcDNA3. 1. Zeo (-) abgeleiteten Plasmid-HCV-El-Konstrukte (pc-B-HIS und pc-J-HIS) weisen in den dargestellten Plasmidsequenzabschnitten im Anschluß an die Primersequenz ebenfalls eine 639 Nukleotide (=213 Aminosäuren) lange Nukleinsäure gefolgt von einem Stopcodon (TGA) auf. Zusätzlich enthalten diese

beiden Plasmidsequenzabschnitte zwischen dem Ende der El-Sequenz und dem Stopcodon eine 6xHistidinsequenz (CATCACCATCATCACCAT).

(B) Zur Gewinnung der multigenetischen Anti-HCV-DNA-Vakzine auf der Basis einer undefinierten Immunisierungslibrary wurde folgendermaßen verfahren : Als Ausgangsmaterial diente wiederum aus HCV-positiven Patientenseren isolierte HCV-E1-RNA verschiedener HCV-Genotypen und-Subtypen. Im Unterschied zur Vorgehensweise nach Beispiel (1A) wurden im vorliegenden Fall die HCV-positiven Patientenseren von 20 verschiedenen Patienten gepoolt und aus diesen gepoolten Seren die HCV-E1-RNA isoliert. Das Poolen erfolgte derart, daß alle Klone die von den 20 verschiedenen Patientenseren gewonnen worden waren, durch Überstreichen der Nährbodenplatte in einen gemeinsamen Bakterienkulturansatz eingebracht wurden. Die eigentlichen Virussequenzen sind bei dieser Vorgehensweise (1B) zwar nicht mehr bekannt, es ist aber davon auszugehen, daß zumindest die meisten wenn nicht gar alle in den 20 gepoolten Patientenseren enthaltenen HCV-El-RNA-Sequenzen der verschiedensten HCV-Genotypen und HCV-Subtypen in der Immunisierungslibrary abgebildet werden.

Die gewonnene gepoolte virale RNA wurde mittels RT-PCR und anschließender nested PCR revers transkribiert und amplifiziert. Das erhaltene und als"MIX-Lib"bezeichnete HCV-El-RNA-Amplifikat wurde mit dem Fachmann bekannten und geläufigen Verfahren in die Plasmide pM-CG16 und pcDNA3. 1. Zeo (-) insertiert (ligiert) und kloniert. Hierbei wurde wie in Beispiel (1A) beschrieben vorgegangen.

Mit den rekombinanten Plasmiden wurden anschließend kompetente E. coli transfiziert und selektioniert. Als Kontrolle wurde ein Transfektionsansatz mit dem"leeren"Plasmid ohne insertiertes HCV-RNA-Amplifikat (pM-CG16) durchgeführt. Von den Transfektionsansätzen wurden jeweils etwa 40 Klone gepickt und der (dem Fachmann bekannten und geläufigen) Plasmid-Minipräparation unterworfen. Der Erfolg der

Klonierung wurde durch einen Restriktionsverdau, Auftrennen auf einem Agarose-Gel und Sequnezierung überprüft.

Das Prinzip dieses Verfahrens zur Gewinnung einer multigenetischen Anti-HCV-DNA- Vakzine auf der Basis einer undefinierten Immunisierungslibrary ist ebenfalls in Figur 2 schematisch dargestellt.

In Abbildung 4 sind noch einmal die verschiedenen Vakzinierungsgruppen zusammengefasst.

Beispiel 2 : Immunisierung von Mäusen mit der erfindungsgemäßen "multigenetischen"Anti-HCV-DNA-Vakzine Analog der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurden die HCV-E1-DNA- Plasmid-Konstrukte gemäß Fig. 3 und daraus die beiden multigenetischen Anti-HCV-El- DNA-Vakzinen"MIX-pos" (definierte Immunisierungslibrary) und"MIX-Lib" (undefinierte Immunisierungslibrary), sowie zu Vergleichszwecken die herkömmlichen "unigenetischen"Vakzinen"pM-A-1","pM-B-1","pM-C-1","pM-D-1", "pM-F-2", "pM-I-1","pM-J-1","pM-K-2"und"pM-H77-1"hergestellt. Hierzu wurde die betreffende Plasmid-DNA in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, und zwar in der Konzentration 75 ug HCV-E1-DNA pro 100gl physiologischer Kochsalzlösung.

13 Gruppen von jeweils 10 Balb/c und C57/Black-Mäusen wurden mit Bupivacain 0,25 % präinjeziert. Fünf Tage später wurde jeder Maus intramuskulär in den Oberschenkel injiziert. Diese Behandlung wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal wiederholt. 12 Tage nach der dritten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, die Seren jeder (Impf-) Gruppe gepoolt und die humorale und zelluläre Immunantwort mittels ELISA, T-Zell-Proliferationsassay (CD4+-T-Zellantwort) und als Maß der zytotoxischen T-Zellantwort (CD8+-T-Zellen) mit ELISPOT gemessen.

Als Testantigen für den ELISA (I) und auch zur ex vivo Stimulation in den anderen immunologischen Assays kam ein rekombinantes, E. coli exprimiertes EI Protein,

Genotyp I"HCV-E1-Genotyp-1" (Fa. Biogenesis, UK) zur Anwendung. Die Ergebnisse des ELISAs (I) sind in Fig. 5 dargestellt. Alle Mausgruppen zeigten eine deutliche humorale Immunantwort, nämlich eine Induktion signifikanter Antikörperlevel. Der Antikörperlevel nach Impfung mit der definierten multigenetischen Anti-HCV-El-DNA- Vakzine (definierten Immunisierungslibrary)"MIX-Pos"war im Vergleich zu den "unigenomischen"Vakzinen in fast allen Fällen signifikant höher. Die Antikörperlevel nach Impfung mit der undefinierten multigenetischen Anti-HCV-El-DNA-Vakzine (undefinierten Immunisierungslibrary)"MIX-Lib"lagen zumindest deutlich über dem Hintergrund (nach Immunisierung mit Mock Plasmid pM-CG-16).

Als Testantigen für den ELISA (II) diente ein definierter Peptid-Mix aus vier definierten Peptiden (Prädiktion der Epitope durch Computerprogramm) mit Sequenzen, die einem Genotyp 1 entnommen wurden). Die Ergebnisse des ELISAs (II) sind in Fig. 6 dargestellt. Nur die Mausgruppen, die mit der"unigenetischen"Vakzine gegen die HCV- Genotypen IV und V geimpft bzw. immunisiert worden waren, nämlich die Gruppen "pM-I-l","pM-J-l"und"pM-K-2" (vgl. Tab. 1), und die Mausgruppe, die mit der definierten multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA-Vakzine (definierten Immunisierungslibrary)"MIX-Lib"geimpft bzw. immunisiert worden war, zeigten eine deutliche humorale Immunantwort, nämlich eine Induktion signifikanter Antikörperlevel.

In Fig. 7 sind die Ergebnisse des T-Zell-Proliferationsassays gegen HCV EI dargestellt, nämlich der Proliferationsindex bzw. Stimulationindex von CD4-T-Zellen nach dreitägiger in-vitro Stimulation mit dem oben beschriebenen rekombinanten Protein "HCV-E1-Genotyp-1" (Fa. Biogenesis, UK). Ein Proliferationsindex bzw.

Stimulationindex größer 2 war nur bei derjenigen Mausgruppe nachweisbar, die mit der "unigenetischen"Vakzine gegen die HCV-Genotypen V ("pM-K-2") geimpft bzw. immunisiert worden war. Siginifikant hohe T-Zell-Proliferationslevel wurden aber auch bei denjenigen Mausgruppen ermittelt, die mit den definierten multigenetischen Anti- HCV-El-DNA-Vakzinen (definierten Immunisierungslibraries)"MIX-Pos"und "MIX-Lib"geimpft bzw. immunisiert worden waren.

In Fig. 8 sind die Ergebnisse des ELISPOT-Assays gegen das Genotyp 1 HCV EI rekombinanten Protein (Fa. Biogenesis, UK) dargestellt. Der ELISPOT bildet die Zahl der IFN-gamma produzierenden T-Zellen auf Einzelzellebene ab und gilt damit als relatives Maß für die zytotoxische T-Zellantwort. Nach Immunisierung mit den beschriebenen multigenetischen und unigenetischen Vakzinen wurde eine signifikant hohe CD8-T-Zellaktivität bei denjenigen Mausgruppen festgestellt, die mit den multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA-Vakzinen (Immunisierungslibraries)"MIX-Pos" und"MIX-Lib"geimpft bzw. immunisiert worden waren, und ebenfalls bei derjenigen Mausgruppe, die mit der"unigenetischen"Vakzine gegen die HCV-Genotypen Ib geimpft bzw. immunisiert worden war ("pM-H77-1").

Insgesamt zeigen die Ergebnisse der immunologischen Experimente nach genetischer Immunisierung gegen EI deutlich, dass die erfindungsgemäßen multigenetischen Vakzinen unterschiedliche Genotypen unterschiedliche Epitope anderer oder gleicher Genotypen erkennen, übergreifende Immunantworten induzieren und damit für eine erfolgreiche HCV Bekämpfung geeignet sind.

Beispiel3 : Gewinnung einer erfindungsgemäßen"multigenetischen"Vakzine gegen HIV und einer erfindungsgemäßen"multigenetischen" Vakzine gegen Influenza-Viren Hüllenproteine von HIV oder Influenza-Virus unterschiedlicher Genotypen und Subtypen werden analog dem DNA-Impfstoff für HCV (vgl. Bsp. 1) in ein Plasmid oder einen Adenovirus kloniert. Für Influenza wird dabei das Hämagglutinin und das Neuraminidasegen verschiedener Subtypen verwendet (isoliert aus Serum von Patienten oder Vögeln bzw. Säugetierarten in Südostasien). Bei HIV wird gpl20 als Membranprotein mit hoher Variabilität neben anderen Membranproteinen verwendet (Klonierung aus Patientenseren analog zu HCV). Über degenerierte Primer an den Enden dieser Proteine werden mittels RT-PCR die Genabschnitte in einen Plasmid-oder viralen

Vektor eingebracht und nachfolgend mittels Westernblotanalyse in vitro überprüft. Zur Geno-bzw. Subtyp-unabhängigen Expressionsnalyse mit Immunoblot wird ein myc-Tag in das Plasmid mit eingebracht.

Beispiel 4 : Immunisierung von Mäusen mit der erfindungsgemäßen "multigenetischen"Anti-HIV-DNA-Vakzine bzw. mit der erfindungsgemäßen"multigenetischen"Anti-Influenza-Virus-DN A- Vakzine Analog der in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise werden BALB/c und C57/BL6 Mäuse mehrfach intramuscular und/oder subcutan mit der gemäß Beispiel 3 gewonnenen DNA-Vakzine gegen HIV oder gegen Influenza-Virus immunisiert. Die Messung der humoralen Immunantwort erfolgt über einen ELISA. Dabei werden Proteine unterschiedlicher Genotypen und Subtypen bzw. in der Literatur publizierte Peptidsequenzen unterschiedlicher Subtypen von HIV oder Influenza-Virus verwendet.

Subtyp-übergreifende humorale Immunantworten mit Subtyp-übergreifenden neutralisiernden Antikörpern beweisen die breite genetische Hetrogenität, die mit einer solchen erfindungsgemäßen Impfung abgedeckt wird. Gleiches gilt für die zelluläre Immunantwort. Hier wird die CD4-T-Zellantwort im Thymidin-Proliferationsassay bzw. im ELISPOT und die CD8-zytotoxische T-Zellantwort über mit den Adenoviren infizierte Zielzellen gemessen. Beide spielen für eine Viruselimination, vor allen Dingen auch bei bereits infizierten Patienten (Einsatz als therapeutische Vakzine), eine entscheidende Rolle. Im Mausmodell wird mit den beschriebenen Immunisierungen eine genotyp/subtyp übergreifende breite Immunantwort erzeugt, die dem Virus eine Immunevasion über genetische Mutation (die nach herkömmlichen Impfungen auftritt) unmöglich macht. Es können keine oder nur geringste Mengen sog. Escape-Mutanten entstehen.

Beispiel 5 : Immunisierung von Affen mit einer erfindungsgemäßen "multigenetischen"DNA-Vakzine In einem Virus-Challenge Modell in Affen wird die prophylaktische Wirksamkeit der gemäß Beispiel 1 oder Beispiel 3 gewonnenen"multigenetischen"DNA-Vakzine gegen HCV oder HIV oder Influenza-Virus durch erfolgreichen Elimination des Challengeisolates verschiedener Geno-und Subtypen bewiesen.

Literaturzitate : 1. Saito, T. et al. : Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins : immune responses in mice. Gastroenterology 112,1321-30 (1997).

2. Geissler, M. et al. : Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine- expressing plasmids. JImmunol 158, 1231-7 (1997).

3. Tokushige, K. et al. : Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology 24,14-20 (1996).

4. Nakano, I. et al. : Immunization with plasmid DNA encoding hepatitis C virus envelope E2 antigenic domains induces antibodies whose immune reactivity is linked to the injection mode. J Virol 71, 7101-9 (1997).

5. Encke, J. et al. : Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in a murine model. JImmunol 161, 4917-23 (1998).

Tabelle 1. : Genotypen der zur Klonierung verwendeten (Patienten-) Seren Patient/Serum HCV-Genotyp A B Ia C nib D IbIa/Ib E IIa/IIc F IIb G IIa, b, c H IIIa H77 Ib I IV J IVc/IVd Va Tabelle 2. : Zur PCR verwendete. Oligonukleotidprimer Name Orientierung Schnittstelle Sequenz : 51-31 RT-PCR CS 1 Sense-GGTTGCTCTRTCTCTATCTTC RT-PCR E2AS 1 Antisense GGCA (iTCCTRTTGATGTGCC PCR ElAS2 Antisense HizdIII GATAAGCTTTCACGCGTCGACGCCGGC AAA PCR CS2 Sense EcoRV CCGGATATCATGGGTTGCTCTTTCTCT ATCTTC PCR ElAS2HIS Antisense HindIII GATAAGCTITCAATGGTGATGATGGTGA TGCGCGTCGACGCCGGCAAA Tabelle 3 : Sequenzvergleich der insertierten HCV-Konstrukte in den Plasmiden für die DNA-Vakzine