MILIEU DE CULTURE

La présente invention a pour objet une souche bactérienne génétiquement modifiée, en particulier une souche de Bacillus thuringiensis, ainsi que l'utilisation d'une telle souche pour produire de la kurstakine. L'invention a également pour objet un procédé de production de kurstakine en milieu liquide et l'utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique et biosurfactant.

Bacillus thuringiensis est une bactérie ubiquitaire que l'on le retrouve dans pratiquement tous les sols, les milieux aquatiques, l'air et le feuillage des végétaux. Aussi appelé bacille de Thuringe, cette bactérie a été découverte au tout début du XXe siècle et utilisée comme agent de lutte microbiologique ou insecticide depuis les années 50. Elle est utilisée en agriculture, en culture maraîchère, en protection des forêts, mais aussi en lutte antivectorielle pour le contrôle d'insectes porteurs de maladies comme le paludisme.

La particularité de Bacillus thuringiensis tient à sa capacité à synthétiser des cristaux protéiques toxiques pour certains insectes. Ces cristaux sont majoritairement composés de protéines toxiques appelées delta-endotoxines ou toxines Cry. Une fois ingérés par les insectes (généralement lors des stades larvaires), les cristaux rencontrent, dans l'intestin moyen des insectes, un milieu capable d'assurer la dissolution de leurs constituants, grâce au pH alcalin ou acide, et à la présence de protéases, et la libération des protéines toxiques. Ces protéines interagissent avec la paroi intestinale de l'insecte et détruisent les cellules qui la composent en formant des pores dans la paroi digestive. Aujourd'hui, Bacillus thuringiensis, ou Bt, est l'insecticide le plus utilisé au monde en agriculture biologique : il représente à lui seul près de 95% des bioinsecticides.

La kurstakine est un lipopeptide produit en faible quantité par certaines souches du groupe Bacillus cereus, notamment plusieurs souches de l'espèce Bacillus thuringiensis, chez laquelle cette molécule a été isolée pour la première fois en 2000 (Hathout et al.). La kurstakine est produite de façon non-ribosomique par une Non Ribosomal Peptide Synthase (NRPS), complexe multi-enzymatique fonctionnant de façon modulaire. Les enzymes de ce complexe sont exprimées à partir d'un opéron (appelé opéron krs) comprenant les gènes krsE, krsA, krsB, krsC et krsD (de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' de l'opéron). La kurstakine se présente sous différents isoformes.

La kurtakine présente une activité anti-fongique contre la souche Stachybotris charatum, initialement décrite par Hathout et al. (2000). Les inventeurs ont maintenant mis en évidence l'effet anti-fongique de la kurstakine contre deux autre souches phytopathogènes : Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea.

Il serait de plus intéressant d'utiliser la kurstakine en tant que biosurfactant.

M n'existe actuellement aucun procédé permettant une production à grande échelle de kurstakine, notamment en milieu liquide. En effet, deux verrous technologiques limitent actuellement la possibilité de produire et extraire ce lipopeptide à l'échelle industrielle : le faible niveau d'expression des gènes de l'opéron kurstakine et la faible production de lipopeptides qui en découle.

En vue d'une utilisation de ce lipopeptide dans le domaine phytosanitaire, les inventeurs ont modifié génétiquement des souches de Badllus thuringiensis de sorte à augmenter leur capacité de production de kurstakine. En utilisant ces souches améliorées, ils ont mis au point un procédé de production et de purification de kurstakine en milieu liquide.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente Invention a pour premier objet une souche bactérienne génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine Cry.

Les souches bactériennes qui peuvent être modifiées conformément à la présente invention sont toutes les souches bactériennes qui expriment la kurstakine, de façon naturelle ou non.

Une souche bactérienne pouvant être génétiquement modifiée selon l'invention est donc tout d'abord une souche portant l'opéron krs nécessaire à la synthèse de la kurstakine.

D'une façon générale, toutes les souches appartenant au groupe Bacillus cereus sont susceptibles d'exprimer la kurstakine. Parmi les souches utilisables à cette fin, on peut citer les souches de Bacillus thurengiensis (Bt) ou de Bacillus cereus qui expriment naturellement l'opéron krs, et en particulier les souches Bt HD-1, Bt HD-73, Bt 407, Bt serovar chiniensis, BT IS5056, Bt HD789, Bt YBT 1518, etc..

Une souche bactérienne pouvant être modifiée selon l'invention peut aussi être une souche n'exprimant pas naturellement la kurstakine mais qui a été préalablement modifiée génétiquement par apport des gènes de l'opéron krs, de sorte à ce qu'elle exprime la kurstakine. Une telle souche peut par exemple être une souche de Bacillus subtills. Une souche bactérienne selon l'invention se définit donc comme une souche exprimant la kurstakine et n'exprimant pas de toxine Cry.

Par « souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry », on entend une souche bactérienne qui n'est pas capable de produire de toxine Cry du fait qu'au moins un des gènes responsables de l'expression de ces protéines, est inactivé ou absent (par mutation, délétion ou insertion au niveau du gène lui-même ou de son promoteur). Les gènes cry responsables de la production des toxines Cry étant naturellement portés par des plasmides, il est possible d'éliminer ces plasmides pour supprimer la production de toxine. Une telle perte de plasmide a été réafisée et a permis l'obtention des souches Bt 407 Cry ^' , Bt HD73 Cry ^' , et Bt 407 Cry ^' àspoOA décrites par Yang et al., (2012), Lereclus et al., (1989) et Lereclus et al., (1995). Une souche n'exprimant pas de toxine peut également être une souche qui a conservé le plasmide porteur des gènes cry mais dans laqueHe ce plasmide ne permet pas l'expression de toxines Cry. il est entendu qu'une souche n'exprimant pas de toxine Cry peut être toute souche bactérienne chez laquelle l'opéron krs est absent, en particulier absent naturellement. Dans un mode de réalisation particulier, une souche bactérienne selon l'invention est une souche exprimant la kurstakine, n'exprimant pas de toxine et dans laquelle une séquence stabilisatrice de CARNm a été introduite en amont du gène krsE de l'opéron krs.

Oans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, cette séquence stabilisatrice de l'ARNm correspond à STAB-SD de séquence SEQ ID NO. 1. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche selon l'invention correspond à une souche Bt génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine Cry et comprenant un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs.

De plus, afin d'augmenter le niveau d'expression de la kurstakine, le promoteur endogène de l'opéron krs peut être remplacé par le promoteur cry3A « Pcry3a » et une séquence terminatrice « termcrylAc » peut être introduite en aval du gène krsD. La séquence de Pcry3A correspond à la SEQ ID NO. 2 et la séquence terminatrice termcrylAc correspond à la séquence SEQ ID NO. 3. Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu'il est à la portée de l'homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes. Dans un autre mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry et incapable de sporuter. Afin de supprimer l'activité de sporulation d'une souche Bt, il est possible d'inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l'expression des facteurs sigma de sporulation SigE, SigH et SigK, et en particulier de supprimer l'expression de la protéine SpoOA, par exemple en délétant le gène spoOA Dans un mode particulier de mise en oeuvre, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry suite à la perte du plasmide porteur des gènes responsable de la production de ladite toxine et dans laquelle le gène spoOA est inactivé.

Un exemple d'une telle souche est la souche Bt 407 Cry- bspoOA.

Dans un autre mode de réalisation, une souche selon l'invention est une souche Bt surexprlmant la protéine KrsE.

Les inventeurs ont en effet démontré que la surexpression de KrsE permet une excrétion du tipopeptide dans le milieu de culture. Ce résultat est très intéressant du fait qu'il permet une production en milieu liquide, élément nécessaire au développement d'un procédé de production à grande échelle. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention n'exprime pas de toxine Cry et surexprime KrsE. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, une souche selon l'invention comprend en outre une délétion du gène spoOA, un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs, le remplacement du promoteur endogène de Copéron krs par le promoteur cry3A « Pcry3a » et l'introduction d'une séquence terminatrice « termcrylAc » en aval du gène krsD.

Une souche ainsi modifiée peut en outre surexprimer les protéines Sfp et KrsD.

La surexpression des protéines KrsE, Sfp et KrsD peut être obtenue par introduction de la séquence codante de ces protéines dans la bactérie, par exemple en introduisant un plasmide porteur d'une cassette d'expression pour ces protéines. Ce plasmide peut permettre l'insertion de ladite cassette dans le génome de la bactérie ou persister à l'état épisomal.

La présente invention a pour second objet l'utilisation d'une souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production de kurstakine, notamment une souche de Badllus thurlngiensls, ladite souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry.

La séquence protéique de la kurstakine ainsi produite correspond à la séquence suivante : Les inventeurs ont montré que les souches Bt 407 Cry' et Bt HD-73 Cry- (n'exprimant pas de toxine Cry) présentent une propriété intéressante puisque leur capacité de production de kurstakine est augmentée d'un facteur 3 à un facteur 5 selon les souches, par rapport aux souches correspondantes exprimant naturellement les toxines Cry (Cf Exemple 1.4). Toutefois, pour pouvoir utiliser ces souches pour la production de kurstakine à grande échelle, il était nécessaire d'améliorer encore leur capacité de production.

La présente invention se décline en différents modes de réalisation correspondant à l'utilisation des différentes souches décrites précédemment en tant qu'objets de l'invention.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche a été modifiée par l'introduction du promoteur Pcry3A et du stabilisateur d'ARNm STAB-SD en amont de l'opéron krs de la souche Bt HD-73 Cry ^" , et l'introduction de la séquence termcrylAc en aval du gène krsD. Dans ce contexte, le stabilisateur STAB-SD permet une augmentation d'environ 2096 de la production de kurstakine. Cet effet est même amplifié lorsque que le gène spoOA est délété chez cette souche (Cf Exemple 1.6). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, on privilégie l'utilisation des souches Bt Cry ^' comportant un stabilisateur d'ARNm et, de manière préférée, les souches Bt Cry ^' comportant un stabilisateur d'ARNm et une déiétion du gène spoOA.

Les inventeurs ont également montré pour la première fois que l'introduction de la séquence termcrylAc permet à elle seule une augmentation de la production (Cf Exemple 1.8). Ainsi, dans un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, la séquence termcrylAc peut être utilisée pour augmenter l'expression d'un gène et de la protéine associée, en particulier en stabilisant PARNm correspondant.

Dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche exprimant la kurstakine, n'exprimant pas de toxine Cry et comportant une séquence termcrylAc située en aval du gène krsD. Cette combinaison avantageuse s'ajoute aux autres modifications génétiques précédemment décrites.

Les inventeurs ont également montré que la surexpression de la protéine KrsE présente un intérêt pour la production de kurstakine en milieu liquide. Ils ont ainsi participé à élucider le rôle de cette protéine en mettant en évidence l'effet de KrsE sur la libération de la kurstakine dans le surnageant de culture. A l'aide d'un système d'expression inductible, ils ont mis en évidence une augmentation de la production de kurstakine proche d'un facteur 20 lorsque KrsE est surexprimée (Cf Exemple 1.7).

Dans le cadre de la présente invention, la surexpression de protéine KrsE peut également être contrôlée par un promoteur constitutif tel que le promoteur du gène aphA3 (Trieu-Cuot P, Courvalin P., 1983. Gene 23:331-341 ; Dubois, T., et al., 2012. PLoS Pathog. 8: el002629), par un promoteur préférentiellement activé pendant la phase stationnaire comme le promoteur du gène nprR (Perchât, S., Dubois, T. et al., 2011.. Mol. Mlcrobiol. 82: 619-633} ou encore un promoteur inductible comme le promoteur inductible par le xylose (Slamti, L. and Lereclus, D., 2002. EMBO J. 21: 4550-4559).

En particulier, il est préconisé pour obtenir une souche exprimant fortement la kurstakine en interne et capable de l'excréter dans le surnageant de culture d'introduire une séquence termCrylAc en plus de la surxpression de KrsE.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une souche bactérienne, de préférence une souche Bt, n'exprimant pas de toxine, comportant un stabilisateur d'ARNm et surexprimant le gène krsE.

Une telle souche est par exemple Bt HD-73 Cry

Cette souche peut en outre comporter une séquence termcrylAc comme dans la souche Bt HD73

Afin d'améliorer encore le transport de la kurstakine vers le surnageant de culture, deux autres éléments pouvant être impliqués dans la maturation de la kurstakine peuvent être surexprimés concomitamment à la surexpression du gène krsE : il s'agit des gènes sfp et krsD qui codent respectivement pour une phosphopantéthéinyltransférase et une thioestérase.

La séquence de protéine Sfp correspond à la SEQ ID NO. 5.

La séquence de la protéine KrsD correspond à la SEQ ID NO. 6. Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une souche Bt n'exprimant pas de toxine, comprenant un stabilisateur de l'ARNm de l'opéron krs et la surexpression du gène krsE et comportant en outre une inactivation du gène spoOA. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la souche Bt comprend également un promoteur P^ à la place du promoteur endogène de l'opéron krs et une séquence terminatrice termcrylAc en aval de l'opéron krs, et surexprime les gènes sfp et krsD. En vue de l'industrialisation du procédé, et selon un mode de réalisation préféré de l'invention, une souche d'intérêt est une souche HD1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry et comprenant la construction génétique capable d'Induire la plus forte expression de kurstakine dans le milieu de culture. Un troisième objet de l'Invention consiste en un procédé de production de kurstakine consistant à cultiver une souche bactérienne génétiquement modifiée conformément à l'invention, en milieu liquide et à récupérer la kurstakine produite dans le surnageant

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la souche bactérienne selon l'invention est cultivée dans un milieu de culture liquide et la kurstakine est récoltée dans le milieu de culture. Ce milieu liquide peut être optimisé afin d'augmenter encore la concentration de la protéine dans le surnageant, notamment en diminuant sa dégradation au cours du temps. Il peut s'agir en particulier du milieu AK tel que décrit par Hathout et al. (2000). Le temps de culture est adapté en fonction de la cinétique de production propre à chaque souche, ce qui est à la portée de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de production de kurstakine en milieu liquide consiste à cultiver une souche bactérienne surexprimant KrsE. En effet, les inventeurs ont démontré que la surexpression de KrsE est déterminante pour promouvoir une excrétion efficace de KrsE dans le milieu de culture.

Ainsi parmi les souches génétiquement modifiées selon l'invention, on choisira de préférence une souche exprimant KrsE pour une production de kurstakine en milieu liquide.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de production de kurstakine comprend en outre une étape d'extraction en continu par mlcroffltration. Dans un mode de réalisation préféré, cette étape d'extraction est suivie du transfert de la kurstakine ainsi obtenue dans un milieu dont le pH est inférieur à 4, de préférence Inférieur ou égal à 2. Un tel procédé permet de préserver l'activité de la kurstakine au cours du temps. Il est par exemple possible de conserver l'activité du Hpopeptide pendant plusieurs jours à 37ºC dans un milieu à pH 2, alors que l'activité est perdue si le lipopeptide était conservé dans un milieu dont le pH est supérieur ou égal à 4.

Ce procédé en milieu liquide a l'avantage de ne pas nécessiter d'extraction du lipopeptide à partir des cellules bactériennes. Le lipopeptide est simplement récolté dans le surnageant de culture, puis purifié par deux étapes d'ultrafiltration membranaire, la première sans solvant et la deuxième en présence d'un solvant (par exemple éthanol, méthanol...). L'utilisation d'un procédé de production en milieu liquide permet une montée en échelle afin d'augmenter les quantités de molécules produites en vue de l'industrialisation du procédé.

Ce procédé constitue le premier procédé de production de kurstaklne à visée commerciale.

Un quatrième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstaklne en tant qu'agent anti-fongique à rencontre des souches Galactomyces geotrichum et Botrytis dnerea.

En effet, les inventeurs ont testé f effet anti-fongique de la kurstakine sur différentes souches de champignons. Ils ont ainsi confirmé les propriétés antifongiques de ce lipopeptide sur Stachybotris charatum et démontré son effet sur deux autres souches phytopathogènes : Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea. Un cinquième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstakine en tant que biosurfactant pour améliorer la dispersion de souches de Baclttus thuringiensis utilisées comme biopesticide.

Les bactéries Bt exprimant la toxine Cry (Cry+) constituent le biopesticide de loin le plus utilisé au monde en agriculture. Afin de faciliter la dispersion et augmenter la persistance de ces souches dans la rhizosphère ou la phyilosphère, il est proposé d'utiliser la kurstakine, notamment la kurstakine recombinante telle que produite selon l'invention, en tant que biosurfactant.

Les modes de réalisation décrits dans cette demande et les exemples qui suivent ne sont donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'invention.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Carte des constructions utilisées pour la préparation des souches surproductrices de kurstakine. 1A : insertion de en amont de krsA, et de termcrylAc en aval de

krsD. 1B : carte du plasmide carte du plasmlde

krsD

Figure 2 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine par différentes colonies de B. thuringiensis. 2A Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis HD-73 cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30"C. Une colonie a été reprise dans 20 μL de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs m/z des adduits H*, Na* et K* des différentes formes observées. 2B : Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis Bt407 cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30ºC. Une colonie a été reprise dans 20μί de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs m/z des adduits H*, Na*et K* des différentes formes observées. Figure 3 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC. 3A :

Chromatogramme HPLC de 20μί d'un extrait liquide enrichi en kurstakine produite par Bt HD-73 en milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante selon le protocole décrit par Hathout et al (2000). La kurstakine présente 4 pics à 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes d'analyse. La séparation est effectuée sur une colonne Kinetex C8, avec un gradient de concentration en acétonitrile de 30 à 7096 de 0 à 25 minutes. 3B : Comparaison du profil de chromatogramme HPLC obtenu lors de cette étude pour la production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HD-1 sur milieu AK agar(A) avec l'analyse réalisée lors de la découverte de la kurstakine B (Hathout et al., 2000).

Figure 4 : Analyse par spectrométrie de masse MALOI-TOF de la production de kurstakine. Analyse des pics aux temps de rétention compris entre 9 et 14minutes lors de l'analyse HPLC de l'extrait de kurstakine produit par B. thuringiensis HD-73 sur milieu AK agar.

Figure 5 : Taux de production de kurstakine. Analyse réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante par les souches de Baa ^' Hus thuringiensis HD-1, HD-73 et Bt407. Figure 6 : Croissance de la souche Bt HD-73. Expérience réalisée en milieu liquide LB et AK à 30°C, 160 rpm.

Figure 7 : Mesure de la concentration en kurstakine. Analyse du surnageant de culture de la souche Bt HD-73 cultivée en milieu LB et AK à 24 et 72H.

Figure 8 : Courbe de croissance de la souche Badllus thuringiensis HD-73. Expérience réalisée en fermenteur de 3L en milieu LB.

Figure 9 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC

Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HD-73 après 8H de culture en fermenteur en milieu LB à 30ºC. Figure 10 : Analyse par spectrométrie de masse MALOI-TOF de la production de kurstakine.

Analyse du composé récolté après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de B. thuringiensis HD-73 après 8H de culture en milieu LB à 30ºC

Figure 11 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HD-73 après 9H de culture en férmenteur en milieu LB à 30ºC.

Figure 12 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine.

Analyse des composés récoltés après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de 0. thuringiensis HD-73 après 9H de culture en milieu LB à 30*C. Figure 13 : Cinétique de production de kurstakine. Analyse réalisée en milieu AK agar et LB gélosé (LBg) par la souche Bacillus thuringiensis HD-73.

Figure 14 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine.

Analyse d'une colonie de la souche Bt407AspoOA cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37ºC. Figure 15 : Spectre de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine chez des souches Bt407.

15A : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry+ cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37ºC. 15B : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry- cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37"C.

Figure 16 : Effet de la perte du plasmide portant les gènes cry chez la souche Bt HD-73 sur la production de kurstakine. Le dosage HPLC a été réalisé à partir d'extraits cellulaires de cellules cultivées sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37'C et 3 jours à température ambiante et purifiée surSPE C8.

Figure 17 : Taux de production de kurstakine après insertion d'un stabilisateur de l'ARNm en amont du locus krs. Expérience réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante chez les souches Bt HD-73 Cry- et Bt HD-73 Cry-STAB-SD.

Figure 18 : Effet de la surexpression du gène krsE sur la courbe de croissance de la souche 0. thuringiensis HD73. Expérience réalisée avec la souche Bt HD73 krs STAB-SD pHT1618T- en milieu LB liquide avec ou sans addition de xylose à 20 mM. Figure 19 : Dosage de kurstakine dans les surnageants de culture de la souche Bt surexprimant la protéine KrsE. Dans cette expérience, B.thuringiensis HD73 krs

est cultivée en milieu LB et LBxyl. La concentration du lipopeptide, évaluée par dosage HPLC, est exprimée en mg/L Figure 20 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine.20A : Effet antifongique contre la souche Rhizoctonia solani. 20B: Effet antifongique contre la souche Fusarium oxysporum. Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrite à 3096.

Figure 21 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine.21A : Effet antifongique contre la souche Galactomyces geotrichum après 3 jours (A) et 5 jours d'incubation (B) ; 21B : Effet antifongique contre la souche Botrytis cinerea après 5 jours (A) et 7 jours d'incubation (B). Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrite à 30%.

MATERIELS ET METHODES

1. Souches microbiennes utilisées

1.1 Description des souches

Les souches de Bacillus thuringiensis (Bt) utilisées lors de cette étude ont été fournies par l'équipe MICALIS de l'INRA de Jouy-en-Josas. Ce sont, d'une part des souches sauvages isolées de l'environnement, et, d'autre part, des souches modifiées génétiquement pour l'étude de l'effet de différents facteurs sur la production de kurstakine par Bt.

Tableau 1 : Liste des souches de Bacillus thuringiensls utilisées dans le cadre de l'étude du mécanisme de production de la kurstakine

Les souches sont mises en culture dans 5 mL de milieu de culture LB liquide à 37'C, agitées sur un agitateur rotatif à 160 rpm jusqu'à l'obtention d'une DOexmm de 1. La culture est alors répartie dans des cryotubes de 1 mL selon les proportions suivantes : 0,3 mL de glycérol pour 0,7 mL de culture. Les cryotubes ainsi obtenus sont directement mis au congélateur à -80"C pour le stockage de longue durée des souches bactériennes. 2. Milieux de culture

2.1. Milieu LB

Le milieu de culture Luria Bertani (LB) est un milieu complexe classiquement utilisé pour la mise en culture des souches bactériennes, il est composé de tryptone, 10 g/L ; extrait de levure, 5 g/L ; NaCI, 10 g/L. Les composants sont solubilisés dans 800 mL d'eau déminéralisée, le pH est ensuite ajusté à 7,0 et le volume est complété à 1 L. Ce milieu peut être solidifié (milieu LGg) par l'addition d'agar (15 g /L). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121ºC pendant 15 minutes.

2.2. Milieu 863

Le milieu 863 est un milieu utilisé pour la mise en culture des souches de levures utilisées pour les manipulations de biologie moléculaire. La composition du milieu 863 est la suivante : glucose, 10 g/L ; extrait de levure 10 g/L ; peptone de caséine, 10 g/L. Le milieu géiosé 868 peut être préparé en ajoutant de Pagar (15 g/L). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121'C pendant 15 minutes.

2.3. Milieu AK agar #2

Le milieu AK agar #2 (Beckton, Dickinson, Etats-Unis) est un milieu acheté prêt à l'emploi utilisé pour la sporulation des souches de Bacillus. La composition approximative indiquée par le fournisseur est la suivante : peptone de gélatine, 6 g/L ; peptone de caséine, 4 g/L ; extrait de levure, 3g/L ; extrait de bœuf, 1,5 g/L ; glucose, 1 g/L ; agar, 15 g/L ; sulfate de manganèse II, 0,3 g/L Le milieu est préparé en solubilisant 30,8 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée, et est stérilisé par autoclavage à 121'C pendant 15 minutes. 2.4. Milieu AK liquide

Le milieu AK liquide est identique au milieu AK agar décrit ci-dessus à la différence qu'il ne contient pas d'agar.

2.5. Milieu PDA

Le milieu PDA (Potato Dextrose Agar, Bfokar Diagnostics) est le milieu utilisé pour la mise en culture des souches de moisissures et pour les tests d'activité antifongique. La composition du milieu est la suivante : extrait de pommes de terre, 4 g/L ; glucose, 20 g/L ; agar, 15 g/L Le milieu est préparé en solubilisant 39 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée et est stérilisé par autoclavage à 121"C pendant 15 minutes. 3. Construction des souches surproductrices de kurstakfne

Les différentes étapes pour la construction de souches surproductrices de kurstakine sont les suivantes : délétion du gène spoOA, insertion d'un promoteur fort (Agaisse H. and Lereclus D. 1994, J Bacterioi 176: 4734-4741) et d'un stabilisateur de l'ARNm STAB-SD (Agaisse H. and Lereclus D. 1996, Molecular Microbiology 20: 633-643) en amont du locus krsEABC, insertion d'un terminateur fort (termcrylAc) stabilisant l'ARNm en aval de ce locus, transformation de ta souche par un plasmide permettant la surexpression du gène krsE codant pour le transporteur de la kurstakine KrsE, et des gènes sfp et krsD, dont les produits permettent le recyclage du complexe enzymatique impliqué dans la synthèse du lipopeptide. Les souches 407, HD1 et HD73 sont des souches naturelles. Les souches 407 Cry ^' , HD73 Cry ^" et 407 Cry ^" àspoOA ont été obtenues et publiées précédemment (Du C, Nickerson K.W. 1996, Appl Environ Microbiol 62: 3722-3726 ; Lereclus D. et ai, 1989, FEMS Microbiol Lett 60: 211-217 ; Lereclus D. et ai, 1995, Bio/Technology (N Y) 13: 69-71).

3.1 Délétion de spoOA

La délétion de spoOA dans la souche HD73 Cry est réalisée par insertion dans ce gène d'une cassette de résistance à la kanamycine, selon la méthode publiée précédemment (Yang H., et al. 2012, Appl Environ Microbiol 78: 6466-6474). La souche obtenue est nommée HD73 Cry ^' AspoOA.

3.2. Insertion de et de STAB-SD

L'insertion de et de STAB-SD (SEQ ID NO. 2) en amont de krsEABC (Figure 1) est réalisée par

échange allélique en utilisant une construction génétique portée par le vecteur suicide pMAD. et STAB-SD sont situés en contiguïté sur une même séquence d'ADN, amplifiée par PCR à partir du plasmide pHT7830 (Agaisse H. and Lereclus D., 1994, Molecular Microbiology 13: 97- 107) en utilisant les amorces stabSD-fwd et stabSD-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xmal et EcoRI aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 577pb. Les régions situées en amont et en aval du promoteur de krsE sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fWd, krs-up-rev) pour la région amont (960pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (084pb). Les sites de restriction (Ncol, Xmal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (EcoRI, BamHI) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, Pcry3A-stabSD et aval sont digérés et ligaturés au niveau de Xmal et EcoRI. Cette construction est amplifiée par PCR et traitée par la T4 poK/nucléotide kinase (phosphorylation des extrémités 5* et 3' du fragment en blunt ends). Le fragment phosphorylé est inséré dans le plasmide pMAD au niveau du site Smal, après déphosphorylation par la phosphatase alcaline des extrémités du plasmide ouvert, pour obtenir le plasmide

STAB-SD. Ce plasmide est transféré dans les souches HD73 cry ^" et HD73 cry ^" AspoOA par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30" et 37" pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus 0. et al., 1992, Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de est vérifiée par séquençage. Les souches obtenues sont la HD73 et la HD73

3.3. Insertion de termcrylAc

L'insertion de termcrylAc en aval de krsD (Figure 1} est réalisée par échange allélique en utilisant une construction portée par le vecteur suicide pMAD. La séquence nucléotidique du terminateur 'termcrylAc' du gène crylAc (SEQ 10 NO. 3) est amplifiée par PCR à partir de f'AON du plasmide pHT73 (Liu G., et al. 2013, Génome Announc 1: e0008013), en utilisant les amorces termcry-fwd et termcry-rev (Tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Pstl aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 222pb. Les séquences du gène krsD d'une part, et de la région située en aval de ce gène d'autre part, sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fwd, krs-up-rev) pour la région amont (936pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (I035pb). Les sites de restriction (BamHi, Xbal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (Pstl, Ncoi) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, termcrylAc et aval sont digérés puis ligaturés au niveau de Xbal et Pstl. Cette construction est amplifiée par PCR, digérée par BamHI et Ncol et ligaturé au plasmide pMAO ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide pMAD-termcrylAc, est transféré dans la souche HD73 cry ^' AspoOA krsA::Pcry3A-stabSD par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30 ^* et 37" pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus D. et al., 1992, Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de termcrylAc est vérifiée par séquençage. La souche obtenue est la HD73 Cry ^' AspoOA krsA::Pcry3A-stabSD krsD::termcrylAc.

3.4. Surexpression des gènes krsE, sfp et krsD

La surexpression des gènes krsE, sfp et krsD est obtenue par clonage de ces gènes derrière le promoteur inductible Pxyl, dans les plasmides à haut nombre de copies pHT1618 (Lereclus D. and Arantes 0. 1992, Mol Microbiol 6: 35-46) (figure 1B) et pHT315pxyl (Slamti L and Lereclus D., 2002, EMBO J 21: 4550-4559) (figure 1C). La séquence du gène krsE est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73, en utilisant les amorces krsE-fwd et krsE-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Kpnl aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1250pb. La séquence est ensuite digérée par ces enzymes puis ligaturée dans le plasmide pHT1618T ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide est

sélectionné chez E. coli pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquençage puis transféré par électroporation dans la souche HD73 Cry ^" AspoOA La souche obtenue est la HD73 Cry ^" spoOA pHT1618Tpxylξrsf.

Pour la surexpression des gènes krsE, sfp et krsD, les clonages suivants ont été réalisés : La séquence du gène krsE précédé de son promoteur est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de fa souche HD73, en utilisant les amorces pkrsE-fwd et pkrsE-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites BamHI et Xbal aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1800pb. La séquence des gènes sfp et krsD, organisés en opéron, est amplifiée par PCR à l'aide des amorces sfpkrsD-fwd et sfpkrsD-rev. La séquence amplifiée, de taille 1500pb, possède les sites de restriction Xbal et Hindlll à ses extrémités 5' et 3'. Les deux séquences amplifiées sont digérées par les enzymes BamHI, Xbal et Hindlll puis sont ligaturées dans le plasmide pHT315pxyl ouvert par BamHI et Hindlll. Le plasmide est sélectionné chez E. coli pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquençage puis transféré par électroporation

4. Production de kurstakine

4.1. Production en milieu solide

Les souches de B. thuringiensis ont été cultivées sur milieux solides (AK agar ou LBg) pour la production de kurstakines selon le protocole décrit par Hathout et al. Une pré-culture d'une nuit a été réalisée dans du milieu LB liquide à 30°C, agitée à 160 rpm. Les boites de milieu gélosé sont alors ensemencées par inondation, et le surplus de pré-culture est éliminé. Les boites sont mises à incuber une nuit à 37ºC et 3 jours à température ambiante sur paillasse. Le prélèvement de la culture sur boite est réalisé après 24, 48, 72 et 120 heures de culture pour le dosage des lipopeptides. Le tapis bactérien s' étant développé sur les boites de milieu gélosé est récupéré au moyen d'un râteau, et repris dans une solution à 1 M KCI/0,5 M NaCI. La solution est homogénéisée au vortex, puis centrifugée à 10000 g pendant 10 minutes. Le culot est ensuite lavé 3 fois par un volume équivalent d'eau distillée. L'extraction est réalisée sur ces culots par ajout de solvant ACN/H ₂ 0 90/10 (V/V), suivi d'une homogénéisation au vortex. La suspension est ensuite centrifugée à 3 000 g pendant 10 minutes, afin de séparer le surnageant, contenant les composants récupérés de la surface des spores, et le culot cellulaire. Le surnageant est ensuite directement traité par extraction en phase solide (SPE) pour l'extraction des kurstakines.

4.2. Production en milieu liquide

Pour les cultures bactériennes, une culture de réveil est réalisée dans 10 mL de milieu LB dans un tube à essai à partir d'un cryotube de la souche conservée à -80°C. Les cultures liquides de Bt sont réalisées à partir des cryotubes préparés précédemment. Une préculture est réalisée dans 100 mL de milieu de culture liquide correspondant au milieu utilisé pour la culture, à savoir milieu LB ou AK. La croissance de la pré-culture est réalisée dans les mêmes conditions de température et d'agitation que la culture pour laquelle celle-ci a été préparée. Lorsque la pré-culture atteint une elle est utilisée pour ensemencer la culture pour

atteindre une initiale égale à 0,2.

4.3. Purification

La purification des kurstakines est effectuée par SPE sur colonnes C8 adaptées sur un extracteur sous vide Alltech Vacuum 12-port Manifold, au moyen d'une pompe Savant Gel Pump GP100. Les colonnes SPE C8 (Bond-Elut ir C8 lOOOMg) sont tout d'abord lavées et conditionnées par le passage de 20 mL d'ACN /0,1% TFA, puis 20 mL L'échantillon à analyser (5 mL

d'extrait cellulaire ou de surnageant de culture) est alors déposé sur la colonne et entièrement passé à travers la colonne. Un premier lavage est effectué avec 10 mL d'H ₂ 0/0,l%TFA afin d'éliminer les sels et impuretés hydrophiles contenus dans l'échantillon. Un deuxième lavage est effectué par le passage de Les lipopeptides sont élués

par le passage de d'échantillon ainsi collectés

sont séchés au moyen d'un concentrateur rotatif sous vide. Les culots sont repris dans 300 uL afin d'être analysés en HPLC.

La mise au point de la purification de kurstakine par HPLC a été réalisée afin de permettre la purification du lipopeptide à partir de volumes importants d'extraits cellulaires de Bacillus thuringiensis ne pouvant être réalisée par colonnes SPE de faible volume. La purification a été réalisée au moyen d'une colonne en verre de 15 cm de hauteur pour 2 cm de diamètre remplie au moyen de phase BONDESIL-C8, 40μιη (Agitent Technologies). Les solvants sont pour la voie A de l'acétonitrile additionné de TFA à 0,1% (v/v) et pour la voie B de l'eau ultrapure contenant 0,1% de TFA (v/v). Un volume de 5 à 10 ml d'extrait de kurstakine concentré est injecté dans la colonne. La séparation des kurstakines est réalisée au moyen d'un programme en 4 phases basé sur le programme utilisé en HPLC : 25 minutes à 100% d'eau pour l'élution des contaminants hydrophiles, 20 minutes à 30% d'acétonitrile pour l'élution d'une partie des contaminants présentant une affinité avec ce solvant, 20 minutes de passage de solvant à 70% d'acétonitrile pour l'élution des kurstakines, et enfin 20 minutes à 100% d'acétonitrile pour le nettoyage de la colonne. La récolte de la kurstakine est réalisée au moyen d'un collecteur automatique pendant la phase d'élution à 70% d'acétonitrile.

4.4. Détection et quantification

L'analyse est réalisée au moyen d'une colonne Kinetex C8 (ref) sur un appareillage Waters (Online Degaser, 717 Autosampler, 660S Controller, 626 Pump, 2996 PhotoDiodeArray, Waters Corporation, Milford, MA, U.S.A.). La séparation des kurstakines est effectuée par un gradient linéaire d'acétonitrile additionné de 0,1% de TFA (solvant A) de 30 à 70% sur 25 minutes. La colonne HPLC subit ensuite un lavage pendant 5 minutes avec 100% de solvant A, puis 5 minutes de rééquilibrage à 30% du solvant A pour le passage de l'échantillon suivant. La détection des lipopeptides est effectuée par lecture de l'absorbance des liaisons amides à 214 nm. Le temps de rétention des pics obtenus et leurs dérivées secondes sont analysés au moyen du logiciel EMPOWER 2 Software. La quantification de la kurstakine est réalisée par comparaison avec l'aire de pics obtenus pour un standard de surfactine à 1 g/L analysé dans les mêmes conditions.

La standardisation des dosages de lipopeptides est réalisée en rapportant les quantités de lipopeptides mesurées à la masse sèche biologique à partir de laquelle la kurstakine a été extraite. Dans le cadre des analyses de production en milieu solide, les cellules sont récupérées après l'extraction sur SPE par reprise dans 5 mL d'eau déminéralisée et la suspension obtenue est déposée dans une coupelle en aluminium préalablement pesée et mise à sécher dans une étuve à 95*C pendant 48 h pour l'élimination totale de l'eau de l'échantillon. Après évaporation, la coupelle est à nouveau pesée pour déterminer la masse sèche de l'échantillon. 4.5. Spectrométrie de masse

La recherche des différents peptides synthétisés par S. thuringiensis est réalisée par spectrométrie de masse à partir de colonies bactériennes développées sur AK agar ou milieu LB gélosé pendant 24 et 48h. Une colonie est mise en suspension dans 25 μί de matrice HCCA (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique). La suspension est homogénéisée au vortex pendant 10 secondes, centrifugée rapidement (short spin) à 5000 rpm pendant 5 secondes et le surnageant est déposé sur plaque pour analyse. L'acquisition des spectres de masse est réalisée au moyen d'un instrument MALDI-TOF-TOF UltraFlex II (Bruker Daltonics, Brème, Allemagne), équipé avec un laser Smartbeam, en mode réflectron positif. Un millier de spectres MALDI-MS ont été acquis à chaque position dans un champ de 500 à 2000 Da en utilisant une fréquence de laser de 20 Hz.

L'analyse des surnageants de culture et d'échantillons liquides est réalisée en mélangeant 10 μί d'échantillon avec 10 μί de matrice HCCA. Afin d'identifier les molécules recherchées, les pics correspondants aux adduits H*, Na* et K* de celles-ci sont recherchés.

5. Tests d'activité biologique

5.1. Souches de champignons

Afin d'évaluer le potentiel antifongique de la kurstakine, 4 souches de moisissures phytopathogènes ont été utilisées dans le cadre de tests d'activité. Ces souches ont été fournies par Monica Hôfte (Laboratoire de phytopathologie, Département de protection des cultures de l'Université de Gand, Belgique).

5.2. Test d'activité antifongique

L'activité antifongique des extraits de Bacillus thuringiensis enrichis en kurstakine est évaluée au moyen d'un test d'inhibition de croissance de différentes souches de moisissures et de levures sur boite en milieu solide. Les différentes moisissures à tester sont d'abord cultivées en déposant sur un milieu PDA gélosé un carré de gélose colonisée par ces souches (une souche /boîte de Pétri). Après inoculation, les différentes boîtes sont mises à incuber à 25'C jusqu'à la colonisation complète des boites. Un carré de gélose de chacune de ces souches sert à coloniser les boîtes utilisées pour le test antifongique. Celui-ci est réalisé en boites de Pétri contenant précisément 20ml de PDA. Des carrés de gélose colonisée sont découpés à partir des cultures précédentes et déposés à l'envers au centre des boites. L'incubation s'effectue à 25'C jusqu'à l'obtention d'un disque de culture d'I cm de diamètre. Des disques imprégnés d'extraits purifiés de kurstakines correspondant à 25, 50 et lOOug de lipopeptides sont alors déposés à 1cm du bord de la boite. Un témoin négatif est réalisé en déposant un disque imprégné du solvant dans lequel ont été repris les extraits de kurstakine (ACN/H ₂ O 30/70 (v/v)). Les boites sont incubées à 25*C jusqu'à l'envahissement total de la boite par la souche de moisissure testée. L'effet antifongique de la kurstakine est observé par l'inhibition de la croissance de chaque souche autour des disques imprégnés en lipopeptide.

RESULTATS

1. Analyse de la production de kurstakine

1.1. Détection de la kurstakine produite par Bt HD-73 et Bt407

Afin de confirmer le potentiel de production de kurstakine par les souches Bt HD-73 et Bt407, une analyse en spectrométrie de masse des cellules est réalisée pour détecter le lipopeptide. En effet, la présence de gènes de synthétase ne signifie pas pour autant que la production du peptide ou lipopeptide associé sera effective. Ainsi, plusieurs souches de B. thuringiensis chez lesquelles les gènes de la kurstakine synthétase avaient été détectés ne présentent pas de production du lipopeptide lors d'une analyse par spectrométrie de masse. (Abderrahmani et al., 2011).

La production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HD-73 a été analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF sur colonies cultivées sur milieu LB pendant 24 heures (Figure 2A).

Les différents pics détectés correspondent aux adduits H*, Na* et K* de la kurstakine portant un acide gras à 11, 12, 13 et 14 carbones, indiquant la production de ces 4 formes de lipopeptide par la souche B. thuringiensis HD-73.

L'intensité relative des groupes de pics semblent indiquer la production d'une forte majorité de kurstakine C13.

De la même manière, une analyse des formes de kurstakines produites par la souche B. thuringiensis Bt407 est réalisée par spectrométrie de masse dans les mêmes conditions (Figure 2B). La souche B. thuringiensîs Bt407 présente un profil de pics proche de celui de la souche B. thuringiensîs HD-73. Les addults H*, Na* et K* de la forme C13 sont majoritaires, et les pics des adduits des formes C12 et C14 ne sont que peu visibles. En revanche, seul l'adduit H* de la forme Cil peut être détecté. L'intensité des pics observés étant moins forte que celle obtenue avec ia souche B. thuringiensîs HD-73, le signal des pics correspondant aux autres adduits n'est sans doute pas suffisant pour se dégager du bruit de fond.

Ces expériences montrent que les deux souches analysées produisent un mélange similaire des formes Cil à C14 de la kurstaklne.

1.2. Analyse quantitative de la production de kurstaklne par différentes souches de B. thuringiensîs

Les gènes de la kurstaklne synthétase et la production de kurstakine ayant été observés chez différentes souches, l'identification de la souche présentant le meilleur taux de production en lipopeptide est nécessaire pour la sélection d'une souche d'intérêt blotechnofogique. Afin de déterminer ce potentiel, les taux de production de kurstakine de différentes souches sauvages de B. thuringiensîs et ont été évalués en réalisant le dosage HPLC d'extraits préparés à partir de cultures réalisées en milieu solide AK agar selon le protocole modifié cfHathout et al. décrit dans la section Matériels et Méthodes. Les souches sont cultivées sur le milieu AK agar une nuit à 37ºC et 3 jours à température ambiante. Après extraction et purification des lipopeptides sur colonne SPE C8, les échantillons sont analysés par HPLC permettant la séparation des différentes formes de ia kurstakine par une colonne greffée par de la phase C8 lors d'un gradient de solvant de 30 à 70% d'acétonitriie. La séparation des molécules est suivie par la mesure de rabsorbance à 214 nm. Un exemple de chromatogramme obtenu est présenté à la figure 3A.

L'analyse HPLC permet d'identifier 4 pics aux temps de rétentions 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes. Les trois premiers pics présentent des intensités du même ordre de grandeur. Le pic à 13,12 minutes présente une intensité relativement plus importante.

Cette analyse est comparée avec les données de la littérature. La première analyse d'extraits de spores de Bt par HPLC a été réalisée en 2000 par Hathout et al. Elle a démontré que dans les conditions utilisées, la kurstakine est détectée par HPLC sous la forme de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution (Figure 3B). La comparaison des résultats obtenus avec le premier chromatogramme de séparation des différentes formes de kurstakine avec les résultats obtenus lors de cette étude permet d'observer la présence du même massif de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution.

De plus, une confirmation de la nature des pics observés est réalisée en récoltant le produit de l'élution à (a sortie du système HPLC entre 9 et 14 minutes. Après concentration de l'extrait par évaporation du solvant, le produit séché est repris dans un volume de 20 uJ de matrice HCCA pour une analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 4).

L'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des pics récoltés lors de l'analyse HPLC permet d'identifier les différents adduits H\ Nav et K+ les formes Cil à C14 de la kurstakine, confirmant ainsi que les pics détectés par HPLC correspondent aux différentes formes du lipopeptide.

L'utilisation de la technique HPLC permettant de détecter les différentes formes de kurstakines, le dosage de la production des lipopeptides par les souches B. thuringiensis HD-1, HD-73 et Bt407 a été réalisé selon le même protocole (Figure 5). Aucun standard de kurstakine n'étant disponible à ce jour, un standard de surfactine, possédant le même nombre de liaisons peptidiques que la kurstakine, a été utilisé pour réaliser cette quantification.

La souche B. thuringiensis HD-73 produit environ 6 ug de kurstakine par mg de matière sèche. A titre de comparaison la souche B. thuringiensis HD-1 produit entre 15 et 20 ug/mg de matière sèche. La souche B. thuringiensis Bt407 produit quant à elle lug/mg de matière sèche.

A la vue de ces résultats la souche B. thuringiensis HD-1 présente le taux de production de kurstakine le plus élevé parmi les souches testées, suivi de B. thuringiensis HD-73 et B. thuringiensis Bt407. Néanmoins, lors du début des travaux réalisés dans le cadre de cette étude, seuls les génomes des souches B. thuringiensis HD-73 et Bt407 avaient été séquencés et publiés. La souche HD-73 possédant le meilleur taux de production du lipopeptide entre ces deux souches, elle a été majoritairement utilisée pour l'étude des facteurs limitant potentiellement la production de kurstakine.

Plusieurs mutants réalisés à partir de la souche B. thuringiensis 407 étant également disponibles au début de cette étude, ceux-ci ont été également utilisés pour l'analyse de l'impact de certains de ces facteurs. 1.3. Cinétique de production de la kurstakine

Lors de la découverte de la kurstakine en 2000, ce lipopeptide avait été identifié à partir de spores de B. thuringiensis, obtenues après 4 jours de culture sur milieu de culture AK agar#2, milieu spécifiquement dédié à la production de spores bactériennes (Hathout et al., 2000). L'influence du milieu de culture sur la production de kurstakine a donc été étudiée dans le cadre de production en milieu liquide et en milieu solide.

- Production en milieu liquide

Dans le cadre de l'étude de la production en milieu liquide, la souche BT HD-73 est cultivée en milieu LB et AK liquide pendant 72 heures à 30ºC sous une agitation à 160 rpm. Le suivi de croissance est réalisé par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 6), et la production de kurstakine est réalisée sur chaque échantillon selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes.

La croissance de la souche Bt HD-73 est similaire dans les deux milieux de culture liquides testés. La souche est en phase exponentielle de croissance pendant environ 3 heures, puis est en phase de ralentissement de 3 à 24 heures de culture, moment à laquelle elle entre en phase stationnaire.

La cinétique de production en milieu liquide ne permet pas de quantifier de kurstakine par HPLC, aussi bien au niveau des culots cellulaires qu'au niveau des surnageants de cultures pendant les 8 premières heures de culture. En revanche, une quantification de kurstakine a pu être réalisée de façon plus tardive dans les surnageants de culture après 24h et 48h de culture (Figure 7).

Après 24 h de culture, la production de kurstakine en milieu AK atteint 5 mg/L dans le surnageant de culture. Après 72 h de culture, 3,7 mg/L sont mesurés. En milieu LB, 1 mg/L est mesuré après 24 h, mais la kurstakine n'est plus détectable après 72 h.

La culture en milieu liquide AK permet donc la production d'une quantité de kurstakine supérieure à celle d'une culture en milieu liquide LB.

Quel que soit le milieu de culture utilisé, la production de kurstakine semble suivre le même comportement, avec une impossibilité de détecter la molécule dans le surnageant pendant les premières heures de culture, une production détectable de quelques milligrammes par litre après 24h de culture, puis une diminution de la quantité de lipopeptides mesurée dans le surnageant après 72h. Dans le cadre des travaux réalisés, une première étude de fa production de kurstakine par B. thuringiensis en fermenteur a été menée. La souche B. thuringiensis HD-73 a été cultivée dans 3L de milieu LB pendant 24H en batch. La croissance de la culture a été suivie par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 8). Toutes les heures, un prélèvement de 20mL a été effectué, et le culot et le surnageant ont été analysés séparément après leur séparation par centrifugation.

Bacillus thuringiensis présente en fermenteur une phase de croissance exponentielle de 3 heures, et une phase de ralentissement de 2h.

Le prélèvement réalisé 8h après le début de la culture permet d'identifier par HPLC un pic correspondant à la kurstakine, avec un temps de rétention de 13 minutes environ, et un profil d'absorbance en UV similaire à celui observé lors des quantifications du lipopeptide réalisées précédemment (voir paragraphe 1.2.2) (Figure 9).

Afin de confirmer la nature des peptides élués lors de cette chromatographie, une récolte du pic a été effectuée, et l'échantillon a été concentré par réduction du volume à ΙΟμί final par séchage, puis additionné de ΙΟμί de matrice HCCA pour analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 10).

L'analyse par spectrométrie de masse permet d'observer la présence d'adduits de kurstakine de forme C13.

Après lh de culture supplémentaire, le profil HPLC observé est légèrement différent Deux pics sont observés en HPLC, à respectivement 12,6 et 13,6 minutes. Le profil de l'absorbance en UV est différent de celui du pic observé après 8h de culture (Figure 11).

Une collecte a été réalisée à l'issue de la séparation par HPLC de 12 à 14 minutes d'élution afin d'identifier les composés détectés. Le volume de l'échantillon prélevé est réduit à un volume de ΙΟμί final par séchage, et est mélangé à ΙΟμΙ de matrice HCCA pour l'analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 12). Après analyse par spectrométrie de masse, la présence de pics de rapport m/z 924,71, 946,71 et 962,70 peuvent être observés. Ces pics correspondent aux adduits H+, Na+ et K+ de la kurstakine C13 sous sa forme linéaire, indiquant la linéarisation partielle de la quantité de lipopeptide produit par B. thuringiensis HD-73 entre 8 et 9h de culture. - Production en milieu solide

Pour l'étude de la cinétique de production de kurstaklne en milieu solide, la souche HD-73 a été cultivée en milieu AK agar et LB gélosé pendant 5 jours. L'extraction, la purification et la quantification de kurstakine ont été réalisées selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes (Figure 13).

En milieu de culture solide la production de kurstakine présente également de grande variation en fonction de l'âge de la culture. Ainsi, après 9h de culture, la production de kurstakine atteint 5 μβ/mg de matière sèche en milieu AK agar. Après 24h et 32h de culture, le niveau de production mesuré est de 2 pg/mg de matière sèche environ. Enfin, le niveau de production à 96h et 120h est d'environ 8 ug/mg de matière sèche. Le maximum de production observé est donc atteint après 4 à 5 jours de cultures, soit le temps recommandé par le protocole décrit par Hathout et al.

En milieu LB, la production de kurstakine est d'environ 1 Mg/mg de matière sèche après 9h de culture, et atteint un maximum après 24h de culture, avec 2 ug/mg de matière sèche. La quantité de kurstakine diminue ensuite jusqu'à 0,5 ug/mg de matière sèche après 96h, puis s'établit à 2 ug/mg de matière sèche après 120h. Néanmoins, les imprécisions de mesures liées aux faibles quantités de molécule détectée ne permettent pas d'établir de différence significative des mesures entre les différents temps de culture pour ce milieu.

Ces résultats montrent que la quantité de kurstakine produite est supérieure lorsque les souches Bacillus thurungiensis sont cultivées dans un milieu optimisé AK par rapport à une culture en milieu classique LB également en condition de culture en milieu solide.

1.4. Etude de la relation entre la sporulation de Bt et la production de kurstakine

La production de kurstakine a été, depuis la découverte de cette molécule, associée au phénomène de sporulation de β. thuringiensis. Cela est notamment dû à l'état physiologique des cellules utilisées lors de la découverte du lipopeptide. Afin d'en savoir plus sur la relation entre la production de kurstakine et la sporulation des cellules, la capacité de production du lipopeptide par la souche Bt ACHbspoOA a été étudiée. Cette souche dont le gène spoOA, codant pour un activateur des gènes liés à la sporulation, a été Interrompu est donc incapable de sporuler ou même de s'engager dans le processus de sporulation (Lereclus, et al., }., 199S. Nature Bio/Technology, 13: 67-71). Pour cela, une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a été réalisée sur une colonie cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37*C (Figure 14). L'analyse par spectrométrie de masse F permet d'identifier les adduits H* Na* et K* de

la kurstakine C12 et C13. Les pics correspondants aux formes Cil et C14 ne sont pas détectés. Il est néanmoins difficile de déterminer s'il s'agit d'une réelle absence de production de ces deux formes, ou de l'effet de la limite de détection par l'appareil. Les résultats démontrent que la souche A produit de la kurstakine malgré la délétion

de l'activateur transcriptionnel principal de la sporulation chez S. thuringiensis. Cela indique que la sporulation des cellules de Bt n'est pas nécessaire à la production de kurstakine.

1.5. Effet de l'inactivatîon de la production de toxines de B. thuringiensis sur la production de kurstakine

La production de toxines protéiques sous forme de cristaux est l'une des particularités métaboliques les plus importantes de 8. thuringiensis. Il a été décidé de tester si la suppression de cette activité de synthèse pouvait donc avoir un effet bénéfique sur la production de kurstakine.

L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques par les souches de Bt a donc été étudié au moyen de deux souches modifiées : Bt 407 Cry- et Bt HD-73 Cry-.

- Analyse qualitative

Dans un premier temps, l'analyse des produits des différentes souches a été réalisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF à partir de colonies cultivées sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30*C (Figure 15A). La souche Bt 407 sauvage présente les pics des adduits des kurstakines en Cil, C12, C13 et C14. L'analyse a été réalisée dans les mêmes conditions pour la souche Bt407 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes cry a été supprimé (Figure 15B).

Les kurstakines de forme Cil à C14 sont retrouvées sur les cellules de la souche Bt407 Cry-.

Les souches Bt407 sauvage et Bt 407 Cry- produisent donc les mêmes formes de kurstakine, indiquant que la suppression du plasmide portant les gènes responsables de la production de toxines n'entraine pas de modification qualitative des formes de kursakine produites.

Afin de confirmer ce résultat, les produits de la souche sauvage B. thuringiensis HD-73 et de la souche modifiée B. thuringiensis HD-73 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes de production de toxine a été supprimé ont été analysés dans les même conditions. La perte du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques n'a pas d'effet majeur sur la variété de kurstakine produite par les souches de Bt, les mêmes formes de la molécule étant retrouvées dans la souche sauvage et la souche curée du plasmide.

- Analyse quantitative L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes de production de toxines sur la production de kurstakine par B. thuringlensis a également été analysé quantitativement par un dosage de la production du lipopeptide par HPLC. Ce dosage a été réalisé à partir d'extrait cellulaires réalisés selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes après culture des souches sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37"C puis 3 jours à température ambiante (Figure 16). La souche sauvage Bt HD-73 présente un niveau de production de kurstakine d'environ 6 ug/mg de matière sèche. Après la perte du plasmide, la souche produit environ 18 ug/mg de matière sèche. Pour la souche Bt 407, la perte du plasmide permet l'augmentation de la production de 1 à 5 ug/mg de matière sèche.

L'élimination du plasmide a ainsi un effet positif sur la production de kurstakine d'un point de vue quantitatif, avec une augmentation du taux de production de lipopeptide ramené à la matière sèche d'un facteur 3 à 5 en fonction de la souche.

Dans la perspective de produire la kurstakine à l'échelle industrielle, la meilleure construction sera introduite dans une souche HD1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry.

1.6. Effet de l'augmentation de la stabilité de l'ARNm de la kurstakine synthétase sur la production de kurstakine

La stabilité des ARN messagers issus des gènes de production est essentielle à la production de la synthétase responsable de la production de la kurstakine. Un problème de stabilité des ARNm entraînerait une synthèse très faible du complexe enzymatique produisant le lipopeptide. L'importance de la stabilité de l'ARNm des gènes krsEABC a donc été évaluée ici par le dosage de la kurstakine par les souches Bt HD-73 Cry- STAB-SD et Bt HD-73 Cry- spoOA STAB-SD chez lesquelles la séquence STAB-SD a été intégrée en amont du gène krsE. Cette séquence de type Shine-Dalgarno présente en amont du gène de toxine cry3A a été identifiée chez B. thuringlensis comme agissant en tant que stabilisateur d'ARNm. La séquence STAB-SD minimale permettant de stabiliser l'ARNm situé en aval correspond à la SEQ ID NO. 1. Cette séquence peut être placée entre n'importe quel promoteur et la séquence du gène d'intérêt. L'Insertion de cette séquence en amont de krsE pouvait donc permettre d'augmenter la stabilité de l'ARNm de la kurstakine synthétase. Les différentes souches modifiées ont été cultivées sur milieu AK agar et utilisées pour la préparation d'extraits cellulaires selon la méthode décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Les résultats de production de ces souches et des souches mère correspondantes sont présentés dans la Figure 17. La souche Bt HD-73 Cry- produit 18,2 pg de kurstakine par mg de matière sèche. L'introduction du stabilisateur STAB-SD chez la souche entraîne une augmentation de ia production à 21,7 ug/mg, soit une augmentation d'environ 2096.

L'effet de l'introduction du stabilisateur d'ARNm en amont du locus krs chez S. thuringiensis entraine donc une augmentation de la production chez la souche H073 Cry-. En revanche, cet effet semble proportionnellement plus important chez ta souche HD73 AspoOA.

1.7. Rôle du gène krsE dans le transport de la kurstakine

Le rôle du produit du gène krsE, dont l'analyse bioinformatique démontre une proximité avec la famille des protéines de transport de type Major Facilitator Superfamily (MFS-1), est à ce jour inconnu. Néanmoins, la prédiction de son activité suggère l'implication de la protéine KrsE dans le transport de la kurstakine. Afin de déterminer le rôle joué par cette protéine dans la synthèse de la kurstakine, l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstakine a été étudié lors d'une culture en milieu liquide. Une souche HD73 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylQkrsE a été utilisée pour l'évaluation de l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production et le transport de kurstakine. Cette souche, chez laquelle le promoteur de la kurstakine synthétase est inductible par l'addition de xylose, a été cultivée en milieu LB liquide, en absence ou en présence de xylose à 20 mM (LBxyl), permettant l'induction de la transcription du gène krsE.

Les cultures liquides ont été réalisées dans 100 mL de milieu LB ou LBxyl en erlenmeyer de 500 mL, à 30ºC pendant 24 heures. Un prélèvement de 5 mL a été effectué toutes les heures pendant les 8 premières heures de culture. Un prélèvement de 5 mL a également été effectué après 24, 28 et 32 heures de culture. Pour chaque prélèvement, le culot et le surnageant ont été séparés par centrifugation à 5000g pendant 5 minutes, et l'extraction, la purification et l'analyse de la production de kurstakine ont été réalisés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Les courbes de croissance de la souche H073 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE cultivée en milieu LB en absence ou en présence de xylose à 20mM sont présentés dans la Figure 18. En milieu LB, la souche Bt HD73 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE présente une phase exponentielle de croissance d'environ 3 heures. La souche entre ensuite en phase de ralentissement, jusqu'au début de la phase statlonnaire, à environ 10 heures de culture, atteignant une maximale de 6,0 après 32 heures de culture.

En milieu LBxyl, la souche présente le même profil de croissance au niveau de la phase exponentielle. Néanmoins, là où la souche présente une simple phase de ralentissement en milieu LB, la croissance en présence de xylose voit la de la culture chuter à partir de 6 heures de

cultures, et ce jusqu'à 10 heures, passant de 2,9 à 1,8. A 24 heures de culture, la souche cultivée en présence de xylose présente une plus faible qu'en milieu LB.

La suivi de la concentration de kurstakine présente dans le surnageant de culture de la souche dans les différentes conditions est présentée dans la Figure 19. En milieu LB, la concentration en kurstakine dans le surnageant de culture est relativement faible, voire impossible à évaluer par HPLC, étant inférieure au seuil de détection de l'appareil malgré l'étape de concentration réalisée sur colonne SPE. La concentration maximale mesurée est obtenue après 24 heures de cultures, avec 1,02 mg/L de kurstakine dans le surnageant de culture.

En milieu LBxyl, les concentrations mesurées dès les premières heures de cultures sont de l'ordre de 4,6 et 5,4 mg/L pour la première et la deuxième heure de culture respectivement. La concentration diminue ensuite progressivement jusqu'à la 7*"* heure de culture, avec une concentration de 0,1 mg/L de lipopeptide. A 8 heures de culture, la concentration mesurée augmente à 1,3 mg/L. Après 24 heures de culture, la concentration mesurée dans le surnageant de culture de la souche cultivée en LBxyl est de 18,46 mg/L. Ces résultats montrent une augmentation de la production de kurstatine dans le surnageant d'environ un facteur 18, à 24 heures de culture en milieu LB.

Cette expérience montre l'effet positif de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstatine dans le surnageant en condition de culture en milieu liquide.

1.8. Effet de l'introduction d'une séquence terminatrice termcrylAc en aval du gène krsD

La séquence termcrylAc a été introduite dans différentes souches Bt selon l'invention afin d'étudier l'effet propre à cette séquence sur la production de kurstakine dans le milieu de culture. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Tableau 4 : Production de kurstaklne en milieu AK après 24h de culture

Ces expériences permettent une comparaison relative de la production de kurstakine dans le milieu de culture. Elles mettent en évidence le fait que les souches qui produisent le plus de kurstakine comportent la séquence termcrylAc (a. et b.). Ce résultat est surprenant du fait que ces souches sont meilleures productrices que la souche qui surexprime KrsE (e.) alors même que les inventeurs ont montré par ailleurs que la surexpression de KrsE est déterminante pour une bonne excrétion du lipopeptide dans le surnageant. Ces données mettent donc en évidence que l'introduction de la séquence termcrylAc est une modification génétique particulièrement intéressante pour augmenter la production protéique.

2. Tests d'activités biologiques de la kurstakine

Les lipopeptides de Bocillus possèdent une variété importante d'activités industriellement valorisâmes (antibactérienne, antifongique, surfactant...). A ce jour, une seule activité antifongique a été démontrée chez la kurstakine, contre la seule souche Stachybrotris chartarum. Le but de cette partie est d'évaluer les activités biologiques de la kurstakine, notamment en tant qu'antifongique et antibactérien.

2.1. Test d'activité antifongique

Afin de déterminer le potentiel d'utilisation de la kurstakine en phytoprotection, des tests d'activité antifongique sont réalisés à partir d'extraits purifiés en kurstakine. Chaque souche de moisissure sur laquelle l'effet de la kurstakine est testé est cultivée en milieu PDA à partir du centre de la boite de Pétri, et finoculum est entouré de disques contenant respectivement 25, 50 et lOOug de kurstakine. L'activité antifongique est évaluée par l'inhibition de la croissance des moisissures testées autour des disques contenant le lipopeptide. La souche Rhizoctonia solanii a pu se développer sur toute la surface de milieu gélosé PDA, en recouvrant également les disques imbibés d'extrait de lipopeptide (Figure 20A). La kurstakine n'a donc aucun effet antagoniste sur la croissance de la souche.

Comme pour Rhizoctonia solanii, la souche Fusarium oxysporum a pu croître sur toute la surface de la boite de Pétri et a recouvert les disques d'extrait de kurstakine (Figure 20B). Celle-ci n'a donc pas d'effet antagoniste contre F. oxysporum aux concentrations testées.

La souche Calactomyces geotrichum n'a pas colonisé toute la surface de la boite de Pétri. Trois jours après le dépôt de la moisissure, sa croissance a atteint le disque témoin et a commencé à le recouvrir. En revanche, un halo d'inhibition de croissance est visible autour de tous les disques contenant de la kurstakine. Après 5 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, mais n'a pas recouvert les disques contenant l'extrait de lipopeptide. De plus, une inhibition de croissance est visible du côté des disques opposés au centre (Figure 21 A). La kurstakine possède donc un effet antifongique sur la souche Galactomyces geotrichum.

La kurstakine est aussi active contre la souche Botrytis cinerea. En effet, après 5 jours de culture, un halo d'inhibition est visible autour des disques contenant de la kurstakine. Après 7 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, tandis qu'un halo d'inhibition de croissance d'un diamètre d'environ 1,5cm est visible autour des disques contenant du lipopeptide, et ce à toutes les concentrations testées (Figure 21B).