Domaine de l’invention

L’invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2. L’invention a également trait à un procédéde production de lactate, ou d’acide lactique, à partir de CO2 utilisant une telle bactérie génétiquement modifiée.

Etat de la technique

L’acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par exemple, l’acide lactique est utilisé comme précurseur de l’acide polylactique (PLA) qui est un polymère entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages alimentaires. L’acide lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu’antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût par l’industrie agroalimentaire. En cosmétique, l’acide lactique est généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling.

Actuellement, la production à l’échelle industrielle de l’acide lactique repose principalement sur la fermentation d’hydrate de carbone, et notamment de glucose, lactose, sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la transformation de ces sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de produire exclusivement de l’acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de plusieurs acides organiques.

En outre, la production d’acide lactique à partir de sucres fermentescibles, tels que le glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l’alimentation et la production de produits de commodité comme l’acide lactique.

En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (CO2) dans l’atmosphère ne cessent de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus métaboliques biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour produire des molécules d’intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de production restent insuffisants et limitent l’intérêt économique de ces systèmes.

De même, des méthodes mettant en oeuvre des cellules bactériennes génétiquement modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules d’intérêt dans des systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayr & al. (2012) décrit la surexpression de la lactate déshydrogénase de Bacillus subtilis dans la cyanobactérie Synechocystis. WO 2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries méthanotrophes dont la source d’énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent plusieurs inconvénients. En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la contamination, ce qui impacte considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec l’alimentation, puisque des sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux négatifs.

Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules, telles que l’acide lactique, en grandes quantités à partir de CO ₂ comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec l’alimentaire tout en réduisant les émissions de gaz à effet de serre.

Résumé de l’invention

En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de forcer des bactéries oxydant naturellement l’hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO ₂ , dans une voie de synthèse de lactate, au détriment éventuellement d’autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n’est pas ou peu exprimée naturellement dans la bactérie, en jouant sur l’expression du ou des gènes associés à cette voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries oxydant l’hydrogène peuvent être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate, afin de produire du lactate à partir de CO ₂ . Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la bactérie Cupriavidus necator (également appelée Hydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ou Wautersia eutropha) peut être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en jouant sur le promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate déshydrogénase notamment, de manière à produire du lactate à partir de CO ₂ . De manière alternative ou complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant un ou plusieurs gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate.

L’invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO ₂ , ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase.

Selon l’invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène.

L’invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour la production de lactate à partir de CO ₂ , préférentiellement pour la production exclusivement de L- lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate. L’invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir de CO ₂ , comprenant les étapes consistant à

- cultiver la bactérie avec du CO ₂ comme seule source de carbone, puis

- récupérer le lactate.

Description des figures

La figure 1 montre une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène selon l’invention apte à produire du lactate à partir de CO ₂ et H ₂ .

La figure 2 montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement chez Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin.

La figure 3 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de L-lactate à partir de CO ₂ .

La figure 4 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de D-lactate à partir de CO ₂ .

La figure 5 est un tableau récapitulant les différentes abréviations utilisées dans la description et les figures 2, 3 et 4.

La figure 6 représente la production de lactate par la bactérie CN0002 à partir de fructose.

La figure 7 représente la production de lactate par la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène CN0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO ₂ .

Description détaillée de l’invention

L’invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO ₂ , ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase

Dans le contexte de l’invention, une bactérie « oxydant naturellement l’hydrogène » désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable, d’utiliser l’hydrogène gazeux comme donneur d’électron et l’oxygène comme accepteur d’électron, et capable de fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries « knallgas ». Les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone comme source de carbone et d’hydrogène comme source d’énergie.

Selon l’invention, la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène est préférentiellement sélectionnée parmi Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp.; Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp., Cupriavidus sp., Couynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodospirillum sp., Rhodococcus sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hydrogenomonas sp., Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogenautresmus sp., Hélicobacter sp., Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobium sp., Alcaligenes sp., Amycolata sp.; Aquaspirillum sp., Arthrobacter sp., Azospirillum sp., Variovouax sp., Acidovouax sp., Bacillus sp., Calderobacterium sp., Derxia sp., Flavobacterium sp., Microcyclus sp., Mycobacterium sp., Paracoccus sp., Persephonella sp., Renobacter sp., Thermocrinis sp., Wautersia sp., et les cyanobactéries telles que Anabaena sp.

Notamment, la bactérie est sélectionnée parmi Rhodococcus opacus, Rhodococcus jostii, Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Couynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas spheroides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus opacus, Rhizobium japonicum, Thiocapsa roseopersicina, Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovoua, , Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas hydrogenothermophila,Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenophilus isleticus, Hydrogenophilus thermoluteolus, Hydrogenautresmus marinus, Hélicobacter pyloui, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Ralstonia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirillum autotrophicum, Arthrobacter strain 1 1/X, Azospirillum lipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax facilis, Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Paracoccus denitrificans, Persephonella marina, Persephonella guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocrinis ruber, Wautersia sp., Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides et Anabaena cylindrica.

Les termes « bactérie recombinante » et « bactérie génétiquement modifiées sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il est entendu que les termes « bactérie recombinante » et « bactérie génétiquement modifiées se réfèrent non seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la descendance ou à la descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.

Selon l’invention, on entend par « surexpression d’un gène » le fait que ledit gène est plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non génétiquement modifiée pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production plus importante de la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate déshydrogénase) et notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l’invention, une telle surexpression s’entend de l’expression d’une lactate déshydrogénase endogène, qui n’est pas ou peu exprimée dans la bactérie non génétiquement modifiée, ou de l’expression d’une lactate déshydrogénase exogène.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possédant une lactate déshydrogénase endogène.

Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi Cupriavidus sp., telle que Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcus opacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogenothermophila

Les termes "endogène" ou "natif désignent un gène qui est normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l’inverse, les termes «exogène» ou « hétérologue » tels qu'utilisés ici en référence à un gène (séquence nucléotidique) désignent un gène qui n’est pas normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée.

Dans le cas d’une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il est possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une surexpression dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d’un promoteur permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à l'extrémité 5 'du gène structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D’une manière générale, selon l’invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d’expression variable en fonction de la présence ou de l’absence de ces stimuli. De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur endogène, par exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est également possible de surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de copies du gène dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant des séquences nucléotidiques à d’autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc.

Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshydrogénase endogène ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène.

Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d’exemples, des séquences codant pour des L-lactate déshydrogénase et des D-lactate déshydrogénase, respectivement, de différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes. Selon l’invention, ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de multiplication, pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate à partir de C0 ₂ .

Tableau 1 : Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27)

Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28)

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérie Cupriavidus necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s) codant pour la L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène, afin de favoriser l’expression de l’un et/ou de l’autre gène. En effet, les inventeurs ont découvert que Cupriavidus necator possède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase (Idh) et une D- lactate déshydrogénase (IdhAI ) endogènes, dont l’expression dépend des conditions de culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments. Selon l’invention, cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de la séquence nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation négative et permettre l’expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il est notamment possible de modifier Cupriavidus necator de manière à associer la ou les séquences codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à un promoteur constitutif ou à un promoteur inductible.

Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous contrôle d’un promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou inductible en présence d’une molécule particulière. A titre d’exemple, il est possible d’utiliser des promoteurs constitutifs tels que pLAC, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), un promoteur inductible tel que le promoteur pBAD, inductible à l’arabinose (Grousseau et al., 2014), le promoteur pPHAP inductible en limitation phosphate (Barnard et al. 2015), le promoteur pCBBL inductible en conditions autotrophes (Lütte et al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible au rhamnose (Sydow ét al., 2017) .

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Dans un autre mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°1 1 (séquence d’une D-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.

De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène, ou hétérologue.

Selon l’invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d’un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l’invention, le génome de la bactérie s’entend de l’ensemble du matériel génétique contenu dans ladite bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c’est-à-dire qui n’existe pas à l’état naturel dans ladite bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome de la bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d’intérêt, placée sous le contrôle d’un ou plusieurs promoteur(s) et d’un ou plusieurs sites de liaison au ribosome. Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d’autres éléments de régulation de la transcription.

Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être dérivé d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure ou d’un mammifère. Préférentiellement, un tel gène est dérivé d’une bactérie et notamment de E. coli, Bacillus coagulans, Pediococcus acidilactici, Streptococcus bovis ( Streptococcus equinus ), d’une bactérie lactique, et notamment de Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactis subsp. lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent également être utilisés pour modifier génétiquement une bactérie selon l’invention.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Pediococcus acidilactici (SEQ ID N°2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Streptococcus equinus (Streptococcus bovis) (SEQ ID N°3), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Bacillus coagulans (SEQ ID N°4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Lactobacillus casei (SEQ ID N°5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID N°12), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Escherichia coli (SEQ ID N°13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase Bacillus coagulans (SEQ ID N°14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue), de manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-lactate seulement.

De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue) de manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-lactate seulement.

Selon l’invention, on entend par « inhibition de l’expression d’un gène » le fait que ledit gène n’est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est réduite, comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber l’expression du gène), conduisant à l’absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l’inhibition peut être totale, c’est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n’est plus du tout produite. L’inhibition de l’expression d’un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique. Selon l’invention, toute méthode d’inhibition d’un gène, connue en soi par l’homme de l’art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par exemple, l’inhibition de l’expression d’un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko ét al., 2000; Lodish et al., 2000) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l’expression d’un gène et/ou l’activité de la protéine encodée (Thomas et al., 1987) ; modification d’une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., 2011 ) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons), d'origine naturelle ou artificielle ou par exemple par insertion d’une cassette antibiotique. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par des techniques knock- out. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interfèrent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d’un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L’inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d’édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l’utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al., 1996), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al. 2016), d’un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites ‘CRISPR’ (Mali et al., 2013), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., 2012). L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome en amont du gène considéré.

En travaillant sur les modifications génétiques à apporter à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO ₂ , les inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible d’inhiber au moins partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit pyruvate.

En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l’hydrogène et susceptible d’être modifiées génétiquement selon l’invention, présentent une voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C’est le cas notamment de Cupriavidus necator (figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition avec la voie de synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie. Aussi, dans un mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour l’Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), l’Acetoacétyl-CoA réductase (EC : 1.1.1.36) et la poly(3-hydroxybutyrate) synthase (EC : 2.3.1.-), préférentiellement l’expression d’au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l’expression desdits trois gènes.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un et préférentiellement des trois gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: CAJ91322.1 ), une phaB (GenBank: CAJ92574.1 ) et une phaC (GenBank: CAJ92572.1 ) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO ₂ comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par la voie de production du PHB.

De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l’expression d’un gène codant pour une phosphoenolpyruvate synthase (EC : 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en phosphoenol pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC : 6.4.1.1 ) et/ou un complexe pyruvate dehydrogenase (EC : 1.2.4.1 ) et/ou une fumarate reductase (EC : 1.3.5.4).

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une ppsa (GenBank: CAJ93138.1 ), une pyc (GenBank: CAJ92391.1 ), une pdhA (GenBank: CAJ92510.1 ) et une sdhABCD (GenBank: CAJ9371 1.1 , CAJ93712.1 , CAJ93713.1 , CAJ93714.1 ) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO ₂ comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.

De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de l’Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-CoA hydrolase (EC : 3.1.2.1 ), une phosphate acétyltransférase (EC : 2.3.1.8), une Acétate kinase (EC : 2.7.2.1 ), une propionate CoA-transferase (EC : 2.8.3.1 ), une succinyl-CoA :acetate CoA- transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC : 1.2.1.10). Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: CAJ96157.1 ), une Phosphate acétyltransférase (pta1 , pta2) (GenBank: CAJ96416.1 , GenBank: CAJ96653.1 ), une Acétate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: CAJ91818.1 , GenBank: CAJ96415.1 ), une Propionate CoA-transferase (GenBank: CAJ93797.1 ), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank: CAJ92496.1 ) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: CAJ92911.1 ) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.

Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possèdent un ou des gènes codant pour une Lactate ferricytochrome C reductase. C’est le cas notamment de Cupriavidus necator qui possèdent trois gènes lldD (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ95257.1 ), lldA (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ96599.1 ), dld (EC :1.1.2.4, GenBank: CAJ94166.1 ) codant pour une telle Lactate ferricytochrome C reductase. Or, les inventeurs ont découvert qu’une telle enzyme est susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en convertissant ledit lactate en pyruvate. Aussi, selon l’invention, dans le cas où la bactérie possède une telle Lactate ferricytochrome C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est avantageusement au moins partiellement inhibé.

L’invention propose avantageusement d’utiliser une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention pour produire du lactate à partir de CO2. Avantageusement, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une L-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du L-lactate. De manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du D-lactate.

L’invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate à partir de CO2, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture continue, une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention en présence de CO2 et on récupère le lactate produit.

Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, une solution de base est ajoutée pendant la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le milieu de fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium, lactate de calcium ou lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour réguler le pH du milieu de fermentation). Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu de fermentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures diverses) et le sel de lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation peut notamment être mise en oeuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu’une centrifugeuse, un dispositif de microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d’une part une biomasse cellulaire concentrée et d’autre part une solution de sel de lactate.

Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de lactate en acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide lactique à partir du milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de l'acide lactique en tant que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide sulfurique.

Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou hydrolyse peut ensuite être réalisée, afin d’obtenir un acide lactique à haut degré de pureté.

Selon l’invention, la source de CO ₂ peut être du CO ₂ pur ou du CO ₂ issu d’émissions des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole, les cimenteries, les productions d’ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO ₂ peut également être un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO ₂ , un gaz CO ₂ au moins partiellement purifié, une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La teneur du gaz total en CO ₂ peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO ₂ peut être injecté directement ou via une étape intermédiaire de capture ou purification du CO ₂ . La purification du CO ₂ peut être réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d’amines, ou par traitement enzymatique mettant par exemple en oeuvre une anhydrase carbonique.

Selon l’invention, la source l’hydrogène peut être un produit du vaporeformage du méthane, de l'électrolyse de l’eau ou être un co-produit (hydrogène « fatal ») des procédés industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du dichlore ou l’incinération des déchets.

Selon l’invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de croissance de la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels que du glucose du fructose ou du glycérol. Il est également possible de cultiver la bactérie en présence de CO ₂ et d’une autre source de carbone lors de l’étape de production de lactate.

EXEMPLES

Exemple 1 - souche productrice de lactate CN0001

Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541 ) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0001 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène Idh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides 1 (5’ GGATCCAAAC TCGAGTAAGG ATCTCC 3’) et 2 (5’ ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJM3 (Müller et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est amplifié à l’aide des oligonucléotides 3 (5’ GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3’) et 4 (5’ CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3’) et de l’enzyme Phusion High- Fidelity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de PCR est digéré par l’enzyme Dpnl (New England Biolabs, Evry, France) : 1 mI de Dpnl est ajouté à 50pL de produit PCR, puis incubé 15-60min à 37°C, l’enzyme est ensuite inactivée 10min à 80°C. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pJM3-ldh. 5mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25pg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey- Nagel), l’insertion correcte du gène Idh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 5 (5’ GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3’) et 6 (5’ CGAACGCCCT AGGTATAAAC GCAG 3’).

Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 par électroporation (protocole adapté de Taghavi et al., 1994). Des cellules Cupriavidus necator sont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3ml dans des tubes 10ml) et incubées une nuit à 30°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1 ml de la culture est transféré dans un erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30°C, 200 rpm jusqu’à atteindre une DO600nm de 0,5-0, 6. Les cellules sont alors récoltées et lavées deux fois avec 25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 90% eau [vol/vol]). Les cellules rendues par ce procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de lavage afin d’obtenir une DO600nm de 50 et aliquotées par 150pL.

Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5mI d’ADN plasmidique (100- I SOng/mI). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5ml est agité par de légers tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré dans une cuvette d’électroporation froide (0.2 cm, 10573463, Fisher scientific, lllkirch). L’électroporation est réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5kV, capacité 25pF, résistance externe 200 W. Immédiatement après l’électroporation les cellules sont mélangées avec 1 mL de milieu SOC (tryptone 2 %, extrait de levure 0,5 %, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCI2 10 mM, MgS04 10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30°C puis étalées sur des boites de pétri maintenue à 30°C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 mg/L de gentamycine et 200 mg/L de kanamycine).

La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pJM3-ldh est récupérée et nommée CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquencçage.

Milieux Pour les précultures, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2P04, 4,0 g/L ; Na2HP04, 4,6 g/L ; K2S04, 0,45 g/L ; MgS04 0,39 g/L, CaCI2, 0,062 g/L ; NH4CI 0.05 % (w/v), trace d’éléments, 1 ml/L (FeS04-7H20, 15 g/L ; MnS04-H20, 2.4 g/L ; ZnS04-7H20, 2.4 g/L ; CuS04-5H20, 0,48 g/L dans HCM 0,1 M).

Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par litre : MgS04,7H20, 0,75 g; phosphate (Na2HP04,12H20, 1 ,5g; KH2P04, 0,25 g); acide nitrilotriacetique, 0,285g; citrate d’ammonium de fer(lll), 0,9 g; CaCI2, 0,015 g; trace d’éléments (H3B03, 0,45 mg; CoCI2,6H20, 0,3 mg; ZnS04,7H20, 0,15 mg; MnCI2,4H20, 0,045 mg; Na2Mo04,2H20, 0,045 mg; NiCI2,6H20, 0,03 mg; CuS04, 0,015 mg); kanamycin, 0,1 g.

Précultures Une colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour ensemencer la première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10 mg/L de gentamycine et 200 mg/L de kanamycine, dans un erlenmeyer baflé de 100 mL. Deux autres étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 mL et 300 mL de milieu minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL et 3 L). Chaque culture est cultivée à 30 °C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur. Cette préculture est utilisée pour inoculer l’étape de culture en bioréacteurs.

Culture en bioréacteurs La culture de la souche CN0001 en fed-batch est réalisée en trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée sur fructose pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0,16 h-1. Après la consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre l'adaptation du métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de 0,22 L/min d’un mélange commercial H2/02/C02/N2 (% molaire: 60:2:10:28, Air Liquide, Paris, France). La troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats gazeux couplée à la production de lactate. Cette phase est initiée par l’ajout de 1 g/L de L-arabinose pour induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à partir d'une solution de 56 g/L de NH3, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de 0,02 h-1. Cette culture est menée dans des bioréacteurs de 1 ,4 L BDCU B. Braun. La température est régulée à 30 °C et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M.

Analyse du lactate et des métabolites Afin de déterminer les concentrations en acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de fermentation est analysé par chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1 mL) est d’abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 pm (Minicart RC4, Sartorius). Le système HPLC utilisé est un Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC, couplé à un réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 pL de chaque échantillon est injecté sur une colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad). L’éluant est une solution aqueuse d’acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du four est de 45°C. Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à une gamme étalon appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués.

Résultat La souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100 mg/L de lactate.

Exemple 2 : Construction d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à partir de C0 ₂ (CN0002).

Souche et constructions génétiques Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541 ) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB).

La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC: 1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène Idh (GenBank: CAJ91814.1 ) est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides 7 (5’ AAGGAGATAT ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3’) et 8 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG GCCGTGGGGA CGGC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1 , le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(cn). 5 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ) et des oligonucléotides 9 (5’ CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3’) et 10 (5’ CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène l.ldh est confirmée par séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11 (5’ CATTGATTAT TTGCACGGCG TCAC 3’).

Le plasmide pBAD-l.ldh(cn) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 10. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541 ) est réalisée comme suit:

Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20 h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia coli sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOeoo _nm ) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1 ,5 ml et centrifugées (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma- Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia coli sont prélevés et mélangés dans un tube 1 ,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000ème et 100 pL de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-ldh(cn) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ) et des oligonucléotides 9 et 10.

La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-ldh(cn) est récupérée et nommée CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en Erlenmeyer d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CN0002)

Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 ( Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l’arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.

Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH ₂ P0 ₄ 2H ₂ 0; 4,6 g/L de Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 0; 0,45 de g/L K ₂ S0 ₄ ; 0,39 g/L de MgS0 ₄ 7H ₂ 0; 0,062 g/L de CaCh 2H ₂ 0 et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeS0 ₄ 7H ₂ 0; 2,4 g/L MnS0 ₄ H ₂ 0; 2,4 g/L de ZnS0 ₄ 7H ₂ 0 et 0,48 g/L de CuS0 ₄ 5H ₂ 0 dans 0,1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH ₄ CI (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.

Chaîne d’inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la souche), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une ϋqboo initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm. Cette seconde préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de milieu MMR en présence de gentamycine (10 mg/L) et de kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la souche). La DOeoo initiale visée a été de 0,05.

Culture en Erlenmeyer La culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de MMR de 50 mL dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL, à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d’une durée de 20h a été réalisée jusqu’à l’obtention d’une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance, une modification de l’aération est opérée (2% air soit 0,4% d’0 ₂ ), une induction du promoteur de la LDH est réalisée par l’ajout de 1 g/L d’arabinose (dépendant de la souche) ce qui conduit à une phase de production de lactate d’une durée de 120 h.

Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de 1 mL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d’être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.

Résultats La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition hétérotrophe atteint p _max = 0,14 h ¹ . Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1 ,3 g/L, a été atteint après 139 h de culture comme représenté à la figure 6. Il est à noter que dans les mêmes conditions de culture, la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 sans surexpression de lactate déshydrogénase ne produit pas de lactate.

Exemple 4 : Production de lactate à partir de CO ₂ par fermentation d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CN0002).

Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 ( Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l’arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.

Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH ₂ P0 ₄ 2H ₂ 0; 4,6 g/L de Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 0; 0,45 de g/L K ₂ S0 ₄ ; 0,39 g/L de MgS0 ₄ 7H ₂ 0; 0,062 g/L de CaCh 2H ₂ 0 et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeS0 ₄ 7H ₂ 0; 2,4 g/L MnS0 ₄ H ₂ O; 2,4 g/L de ZnS0 ₄ 7H ₂ 0 et 0,48 g/L de CuS0 ₄ 5H ₂ 0 dans 0,1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH ₄ CI (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.

Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz (milieu FAME) était constitué de : 0,29 g/L d’acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate d’ammonium ferrique ; 0,75 g/L de MgS0 ₄ 7H ₂ 0; 0,015 g/L de CaCh 2H ₂ 0 et 1 ,5 ml/L de solution de trace élément. La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H ₃ BO ₃ ; 0,2 g/L de C0CI ₂ 6H ₂ O; 0,1 g/L de ZnS0 ₄ 7H ₂ 0; 0,03 g/L de MnCI ₂ 4H ₂ 0; 0,03 g/L de Na ₂ Mo0 ₄ 2H ₂ 0; 0,02 g/L de NiCh 6H2O; 0,01 g/L de CuS0 ₄ ôhhO. (NhU^SCU (1 ,6 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration en biomasse d’environ 2,5 g/L. Le pH a été ajusté à 7 avec 2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile de Na ₂ HP0 ₄ I 2H ₂ O (concentration finale de 1 ,6 g/L) et de KFhPCU (concentration finale de 2,9 g/L) a été ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L de biomasse) ainsi qu’une solution stérile de FeS0 ₄ 7H ₂ O (10,7 g/L; concentration finale 0,032 g/L).

Chaîne d’inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des Erlenmeyers bafflés de 50 mL, à 30°c sous agitation (1 10 rpm). Le milieu de culture a été ensuite centrifugé durant 10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et ont été utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 mg/L de gentamycine et 100 mg/L de kanamycine (dépendant de la souche) dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui ont été incubés durant 20-24 h à 30°C, 1 10 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé durant 5 min à 4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 mL de milieu FAME, et ont été utilisées pour inoculer les 300 mL de milieu FAME (avec si besoin 100 mg/L de kanamycine) dans le bioréacteur gaz. La ϋqboo initiale visée a été de 0,2.

Bioréacteur gaz La culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz avec un volume de travail de 330 mL. La température a été réglée à 30 ⁰ C, le pH à 7. La pression et la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture. Les débits de gaz étaient contrôlés individuellement (CO ₂ , H ₂ , air). Un analyseur de gaz a été utilisé pour l’analyse des gaz de sortie (% O ₂ et CO ₂ ) et un volumètre pour mesurer les débits de gaz de sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/L de biomasse ont été atteint, la concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été produits.

Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons (environ 1 ml) ont été prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un septum avec une seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/HPAIC comme décrit dans l’exemple 1 . Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des échantillons ont été filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.

Fermentation La production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée en bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est représentée à la figure 7. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition autotrophe atteint p _max = 0,14 h ¹ . Un maximum de lactate, c'est-à-dire 160 mg/L, a été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 7. Exemple 5 : Construction et évaluation d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de Streptococcus bovis est surexprimée (CN0003).

Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541 ) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0003 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (Idh, EC: 1.1.1.27) de Streptococcus bovis (ATCC 33317) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène Idh (GenBank: KFN85486.1 ) est recodé selon le biais d’usage de codon décrit pour Cupriavidus necator H16 et synthétisé in vitro (GenScript®). Il est amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 12 (5’ AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3’) et 13 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1 , le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(sb). 5 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ) et des oligonucléotides 9 et 14 (5’ GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène Idh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 9 et 1 1.

Le plasmide pBAD-ldh(sb) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ) et des oligonucléotides 9 et 14. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541 ) est réalisé comme suit :

Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia coli sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DC>6oonm) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1 ,5ml et centrifugé (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia coli sont prélevées et mélangées dans un tube 1 ,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000eme et 100 pi de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- Idh(sb) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14.

La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) est récupérée et nommée CN0003.

Evaluation de la souche CN0003 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) (CN0003) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0003 produit 1 g/L de lactate après 140h de culture.

Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0003 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0002. Exemple 6 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée (CN0004).

Souche Pour la production de lactate, la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) est utilisée. La délétion de l’opéron de voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est inhibée par insertion d’une lactate déshydrogénase endogène.

Constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0004 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose ainsi que les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron phaCAB est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène Idh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 15 (5’ AGACAATCAA ATCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG G AT A AC A ATT TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac (en italique) provenant du pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5’ CCAGGCCGGC AGGTCAGGCC GTGGGGACGG CCA 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 17 (5’ GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 18 (5’ CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la séquence du promoteur pLac et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 19 (5’ CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la séquence du gène Idh de la souche Cupriavidus necator H16 et 20 (5’ TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG GATGTCGATG AAGGCCTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mp-AphaCABQpLac L-Idh. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène Idh, de la séquence de la zone d’homologie amont et de la séquence de la zone d’homologie aval est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3’), 22 (5’ CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3’), 23 (5’ CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3’) et 24 (5’ CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3’).

Le plasmide pJQ200mp-AphaCABQpLac L-ldh est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron phaCAB et d’y insérer pLac L-ldh. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (KGqubb et al., 2009).

La souche Cupriavidus necator H16 AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0004 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0004) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0004 produit 1 ,5 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0004 n’a pas été réalisée à partir de CO ₂ . Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO ₂ tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO ₂ que la souche CN0002.

Exemple 7 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate carboxylase est délétée (CN0005)

Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la pyruvate carboxylase (pyc) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 25 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3 ) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 26 (5’ TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 27 (5’ TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc et 28 (5 ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT CTTCAACACC AGCAGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 31 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Apyc. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5- alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29 (5’ GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3’), 30 (5’ CGCCATATCG GATGCCGTTC 3’) et 31 (5’ TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3’).

Le plasmide pL03-Apyc est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pyc. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen). La souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0005 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0005) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0005 produit 21 % de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0005 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.

Exemple 8 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006)

Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour le composant E1 de la pyruvate déshydrogénase (pdhA2) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 32 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT TCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 33 (5’ CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 1 1 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 34 (5’ GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3 ) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 et 35 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC GATCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- ApdhA2. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5’ TAATCCACTT

CCAGCGCGAT AAG 3’), 37 (5’ CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3’), 38 (5’ GTTCGAAGCC ACCGAGTATG AC 3’) et 29 (5’ GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3’).

Le plasmide pL03-ApdhA2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pdhA2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. Evaluation de la souche CN0006 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0006) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0006 n’a pas été réalisée à partir de CO ₂ . Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO ₂ tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en plus à partir de CO ₂ que la souche CN0004.

Exemple 9 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate synthase sont délétées (CN0007)

Souche et constructions génétiques

La construction de la souche productrice de lactate CN0007 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (pta1 ) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides

39 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA G CAC G 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et

40 (5’ TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3 ) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides

41 (5’ ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 et 42 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT AGTGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Apta1-ackA. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron ackA-pta1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43 (5’ GACTTCCGGC

AGGTCATGC 3’), 44 (5’ CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3’), 45 (5’ GCCAAGCCGG AACGCGTC 3’) et 46 (5’ GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3’).

Le plasmide pL03-Apta1-ackA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron pta1-ackA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. Evaluation de la souche CN0007 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0007) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0007 produit 11 % de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0007 n’a pas été réalisée à partir de CO ₂ . Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0007 produisait 1 1% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO ₂ tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0007 produirait 1 1% de lactate en plus à partir de CO ₂ que la souche CN0004.

Exemple 10 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008)

Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du site actif de la L-Lactate cytochrome c reductase (NdD, 1.1.2.3) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 47 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 48 (5’ AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdD et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 49 (5’ CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdD et 50 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlIdD. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène NdD est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24 (5’ CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3’), 51 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3’) et 52 (5’ GAACAGCTGC ACGCCGAG 3’).

Le plasmide pJQ200mpTet -AlldD est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour NdD. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. Evaluation de la souche CN0008 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0008) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0008 produit 1 ,4 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0008 n’a pas été réalisée à partir de CO ₂ . Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO ₂ tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO ₂ que la souche CN0004.

Exemple 11 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009)

Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour L-Lactate cytochrome reductase (NdA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 53 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 54 (5’ GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA

AAACAAAAAG CTGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 55 (5’ AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdA et 56 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG TAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlldA. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène NdA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3’), 57 (5’ CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3’), 58 (5’

CCATGTGATAGCGTCTATGAGG 3’) et 24 (5’ CTG G CAC G AC AG GTTT C C C GA 3’).

Le plasmide pJQ200mpTet -AlldA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0008 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour NdA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. Evaluation de la souche CN0009 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator (CN0009) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0009 produit 1 ,4 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0009 n’a pas été réalisée à partir de CO ₂ . Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO ₂ tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO ₂ que la souche CN0004.

Exemple 12 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CN0010)

Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0010 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 59 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 60 (5’ ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 61 (5’ AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA et 62 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA GCACGTGCT TGTAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par NEBuilder ^® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- AppsA. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™ ). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5’ ATGAACACCG

GCACCTTCTA CC 3’), 91 (5’ CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3’) et 29 (5’ GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3’).

Le plasmide pL03-AppsA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour ppsA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABQpLAC_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0010. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. RÉFÉRENCES

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