Sumário da Invenção

[001] A presente invenção trata do desenvolvimento de vacinas multiepítopos recombinantes, de DNA ou sintéticas, formadas através da junção dos epítopos de células T mais promíscuos da proteína Nucleosídeo hidrolase de Leishmania (L.) donovani (NH36), caracterizados por serem reconhecidos por pelo menos 70% das moléculas de histocompatibilidade HLA de classe II humanas, mas que também se ligam a moléculas HLA de classe I humanas, com uso potencial como vacinas recombinantes de DNA ou sintéticas contra as leishmanioses humanas e animais marcadores antigênicos de diagnóstico e cura das leishmanioses

[002] Estes epítopos são sequências modificadas geneticamente da proteína NH36 através da adição de sequências de aminoácidos compostas por Alanina- Alanina-Alanina (AAA) ou Glicina-Prolina-Glicina-Prolina-Glicina (GPGPG). Desta forma os epítopos ficam separados por sequências de aminoácidos espaçadoras, para evitar a formação de epítopos de junção ou neoepítopos. As proteínas mutiepítopos tem uso potencial em vacinação e imunoterapia das leishmanioses, no imunodiagnóstico das leishmanioses, no controle da cura e no controle do bloqueio da transmissão. A invenção também trata das aplicações das vacinas multiepítopos NH36 na proteção cruzada contra outros microrganismos que tem nas suas Nucleosídeo hidrolases, sequências comuns com a Nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani (NH36).

Descrição do Estado da Técnica

[003] A leishmaniose visceral (LV) é uma doença tropical negligenciada ocasionada por protozoários pertencentes ao complexo Leishmania (L.) donovani, apresenta elevados índices de letalidade quando não tratada e representa um grave problema de saúde pública mundial, pois segundo ALVAR et al. (2012) é a segunda em mortalidade e a quarta em morbidade entre as doenças tropicais negligenciadas. [004] No Brasil a LV é causada pelo parasito Leishmania (L.) infantum chagasi que é transmitida ao homem pela picada do flebotomíneo fêmea Lutzomiya longipalpis. A Leishmania é um parasita intracelular que infecta as células do sistema fagocítico mononuclear, em especial os macrófagos.

[005] A interação inicial entre o parasito e as células do hospedeiro é um dos fatores que determinam se o indivíduo desenvolverá uma resposta imunológica protetora do tipo Th1 caracterizada pela produção das citocinas pró-inflamatórias: IL- 12, IFN-y, TNF-α, ou se desenvolverá susceptibilidade para a doença, onde ocorre o predomínio de citocinas anti-inflamatórias IL-4, IL-10, TGF-[3 (BHATTACHARYA et al. , 2016).

[006] A maioria dos indivíduos infectados não desenvolve a doença. Eles são assintomáticos ou subclínicos (CHAKRAVARTY et al., 2019) e apresentam teste cutâneo de hipersensibilidade tardio positivo (DTH+). Nos indivíduos que apresentam a LV clínica, a doença é caracterizada por febre, anemia, leucopenia, trombocitopenia, hepatoesplenomegalia (SUNDAR & SINGH, 2018) e uma forte supressão da resposta imune celular (ALVAR et al., 2012) com DTH negativo (DTH-). Pode ainda ocorrer, epistaxe, sangramento gengival, petéquias, taquicardia, tosse seca e, menos frequentemente, desconforto abdominal (GRIENSVEN & DIRO, 2012). A doença é grave e tem altas taxas de mortalidade se não tratada, no entanto, após o tratamento, os indivíduos convertem o DTH para positivo e não se infectam novamente e apenas uma minoria apresenta recidiva (BURZA et al., 2018).

[007] O controle epidemiológico da doença se baseia no tratamento dos doentes, controle dos vetores e eliminação de cães infectados. Dessa forma, o desenvolvimento de uma vacina para a prevenção da doença, bem como o desenvolvimento de imunoterapias se faz necessário com o objetivo de melhorar as estratégias de prevenção.

[008] As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças tropicais negligenciadas ocasionadas por parasitos do gênero Leishmania, e ocasionam diferentes manifestações clínicas que variam desde lesões cutâneas tais como: leishmaniose Cutânea Difusa (LCD), leishmaniose cutânea disseminada (LCD), leishmaniose Mucocutânea (LM) ou a forma sistêmica e mais grave da doença que é a leishmaniose Visceral (LV)( BURZA, CROFT, & BOELAERT, 2018; THAKUR et al, 2018; LESTINOVA et al, 2017; LOCKARD et al, 2019).

[009] Os patógenos, hospedeiros e vetores envolvidos no ciclo de transmissão vetorial das leishmanioses são associados com o ecossistema natural (PURSE et al, 2017) e determinarão o desenvolvimento das diferentes formas clínicas das leishmanioses, bem como as diferentes respostas imunológica desenvolvida pelo hospedeiro.

Aspectos Biológicos e Epidemiológicos da Leishmaniose Visceral

[010] A LV, é uma doença parasitária infecciosa de evolução crônica que pode ser fatal quando não tratada (JAIN & JAIN, 2017), sendo ocasionada por um parasito intracelular obrigatório pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, subgênero Leishmania (MURRAY et al., 2005; READY, 2013; GUIMARÃES-E-SILVA et al., 2017). As espécies de Leishmania envolvidas na transmissão da doença são do complexo donovani, do qual fazem parte: Leishmania (L.) donovani de ocorrência no velho mundo (Ásia e África) e Leishmania (L.) infantum no Velho Mundo (Bacia do Mediterrâneo, Oriente Médio, Ásia Central) e Leishmania (L.) infantum chagasi (América do Sul e América Central) (THAKUR et al, 2018; BURZA et al., 2018).

[01 1] A LV, está sofrendo um processo de expansão e urbanização devido a presença de ocupação desorganizada em áreas de periferia com vegetação nativa, (CASARIL et al, 2014), alterações do clima e fatores socioeconômicos (DA SILVA et al, 2017), 3), desmatamento generalizado (PURSE et al, 2017), migração de cães e humanos infectados de áreas endêmicas para áreas onde a doença ainda não foi relatada (SALOMON et al, 2015), e migração de pessoas não imunes em áreas com ciclos de transmissão existentes (WHO, 2020). [012] Outro fator importante associado com a expansão da LV é a comorbidade com outras doenças infecciosas (TOEPP et al, 2019), principalmente com o HIV/AIDS, que tem sido relatada em diferentes estudos realizados na Etiópia (DIRO et al., 2014; DIRO et al, 2019) e Irã (REZAEI et al., 2018). Adicionalmente, no Brasil houve um aumento do número de casos de co-infecção LV/HIV (SOUSA- GOMES et al., 2017).

[013] A LV é endêmica em países tropicais e subtropicais da África, Ásia e América Latina. Estima-se que por ano ocorram entre 200 a 400 mil novos casos da doença (KARAGIANNIS-VOULES et al., 2013) e que 95% destes encontram-se distribuídos em apenas 10 países: Bangladesh, Brasil, China, Etiópia, índia, Quênia, Nepal, Somália, Sudão do Sul e Sudão (WHO, 2020).

[014] Na América Latina o Brasil é responsável por mais de 90% dos casos anuais de LV (BURZA et al, 2018; WHO, 2020) e os casos da doença já foram registrados em 26 estados da federação e no Distrito Federal (KARAGIANNIS- VOULES et al., 2013). A região Nordeste concentra o maior número de casos da doença, seguida pelas regiões sudeste e Centro-oeste (SINAN, 2017).

[015] A nível mundial, a implementação de estratégias para a prevenção e controle da LV permanece insuficiente, resultando na manutenção de alta taxa de mortalidade e expansão geográfica da doença (SANTOS et al, 2019). Como consequência, as estratégias de profilaxia utilizadas são restritas principalmente ao controle de reservatórios potenciais (ANDRADE & TEIXEIRA, 2012), uso de coleiras com piretróides em cães, pulverização de inseticida para reduzir a população de vetores (ROCK et al, 2015), o uso de telas de proteção contra insetos, bem como o uso de cortinas e repelentes (WHO, 2020).

[016] A transmissão da LV é ocasionada por vetores pertencentes à ordem: Diptera; família: Psychodidae; gênero Phlebotomus, e gênero Lutzomyia descritos no Novo Mundo (Lestinova et al, 2017; Sumova et al, 2018; BURZA et al, 2018). No Brasil, o principal vetor do patógeno da LV é o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, seguido de Lutzomyia cruzi (MISSAWA et al, 201 1 ). [017] No Brasil, o agente etiológico da LV é a Leishmania (L.) infantum chagasi, cujo ciclo alterna uma forma promastigota flagelada extracelular que cresce no vetor flebotomíneo, e a forma amastigota intracelular que se desenvolve em cães e raposas (ANDRADE & TEIXEIRA, 2012; RODRIGUES et al, 2016; LOCKARD et al, 2019; DAYAKAR ET AL, 2019).

Imunobioloqia da Leishmaniose Visceral

[018] Na LV experimental a saliva de L. longipalpis induz uma atração significativa de macrófagos mediada por uma elevada expressão de quimiocinas tais como quimiocina CC ligante 2 (CCL2) e proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP- 1 ) (LESTINOVA et al, 2017), que auxiliam no recrutamento de células do sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro, entre eles, os neutrófilos, que internalizam os parasitas na tentativa de combater a infecção (SHARMA et al, 2016). No entanto, a contínua replicação de amastigotas dentro de macrófagos leva a morte celular apoptótica da célula hospedeira (RODRIGUES et al., 2016).

[019] Os macrófagos também podem fazer fagocitose através do reconhecimento de proteínas presentes na membrana de Leishmania, tais como a lipofosfoglicano (LPG) e da glicoproteína gp63 (SHIO et al., 2012), e se ligam a receptores do sistema complemento (CR1 , CR3 e C3b) (SARAH et al., 2004). O aumento da carga parasitária de camundongos infectados também está correlacionado com o aumento de receptores de reconhecimento padrão, por exemplo, os receptores toll-like TLR2, TLR4 e TLR9 (CEZÁRIO et al., 2011 ), presentes no citoplasma e na membrana dos macrófagos.

[020] Mas na tentativa de escapar do sistema imune a Leishmania bloqueia a maturação do sistema complemento atacando a formação do complexo (C5-C9) e modifica a sinalização de receptores toll-like (TLR-2/TLR4), alterando a expressão do perfil de quimiocinas e citocinas (DAYAKAR ET AL, 2019), favorecendo a sobrevivência do parasita. [021] No entanto, quando ocorre a fagocitose da Leishmania, os macrófagos e as células dendríticas, principais células apresentadoras de antígenos (APC), interagem com linfócitos T virgens via complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHCII) e receptor de células T (TCR), além de moléculas co-estimulatórias como B7.1/B7.2-CD28 e CD40-CD40L. A partir dessas interações, as células T virgens sofrem diferenciação em células T auxiliares (do inglês T helper-Th) e produzem citocinas que irão determinar um perfil de resposta imunológica protetora (Th1 ) ou de susceptibilidade (Th2) para a LV (BHATT ACHARYA et al., 2016).

[022] A resposta imune protetora do tipo Th1 está associada com a produção de citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1 |3, IL-6 e IFN-y, induz a ativação dos mecanismos microbicidas dos macrófagos, como a liberação de radicais de oxigênio, (DAYAKAR et al 2019), e o aumento da produção de óxido nítrico (RODRIGUES et al., 2016), culminando na morte do parasita.

[023] Estudos recentes têm mostrado que outra população de células T auxiliam na proteção contra a LV, as células Th17, que têm uma natureza pleiotrópica, frequentemente associada ao recrutamento de neutrófilos (DAYAKAR et al., 2019) e que podem contribuir para ambos aspectos, protetores e de danos (KUMAR E NYLÉN, 2012). Entretanto, quando há uma falha da resposta imunológica protetora do tipo Th1 , ocorre um aumento da susceptibilidade à doença com o predomínio de uma resposta do perfil Th2, que é caracterizada pelo desenvolvimento de uma resposta imune humoral, com o aumento da produção de anticorpos e da prevalência de citocinas anti-inflamatórias tais como: IL-4, IL-10 e TGF-[3 (DAYAKAR ET AL, 2019).

[024] A citocina IL-10, por outro lado, está diretamente relacionada com o processo da patogênese da LV, pois ela reduz a expressão do receptor MHCII e das moléculas co-estimulatórias B7 e CD40 presentes superfície de macrófagos, tornando-os não responsivos para sinais de ativação. Adicionalmente, a IL-10 inibe as funções das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IFN-y que controlam a expressão da óxido nítrico sintase indutível (iNOS), diminuindo assim a produção de NO (DAYAKAR ET AL, 2019), o que facilita a replicação do parasita e a progressão da doença (KUMAR & NYLÉN, 2012). [025] Apesar de bem estabelecido o processo de ativação e diferenciação das células T CD4 ⁺ do perfil Th1 , que atuam no controle da infecção por Leishmania, ocorre paralelamente com a ativação de células T CD8 ⁺ virgens por células dendríticas (DCs). As DCs secretam as citocinas IL-12 e IFN do tipo I e induzem a diferenciação os linfócitos T CD8 ⁺ em células que contribuem ainda mais para a produção de IFN- Y, TNF-α, além de secretar perforina e granzima, que matam as células infectadas (RODRIGUES et al., 2016).

[026] Adicionalmente, as células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ ativadas produzem IFN-y, que em combinação com a IL-1 [3, induz a produção de IL-27 por macrófagos, inibindo a geração de células Th17 e promovendo juntamente com a IL-21 a geração de células T secretoras de IL-10 (KUMAR E NYLÉN, 2012).

Manifestações Clínicas da Leishmaniose Visceral

[027] A LV apresenta diferentes formas clínicas a depender da resposta imunológica e dos sinais e sintomas desenvolvidos pelo indivíduo infectado, podendo ser: a infecção assintomática, oligossintomática ou subclínica e a doença progressiva, que é a LV clássica. A forma assintomática da doença compreende a maioria dos indivíduos que são infectados por L. (L.) donovani ou L. (L.) infantum e nunca desenvolve doença, sugerindo que os fatores genéticos estejam envolvidos na resistência e suscetibilidade (KUMAR E NYLÉN, 2012). Estes indivíduos apresentam positividade para o teste cutâneo de Leishmanina (LST), que é um teste de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH+) (ROCK et al, 2015; CHAPMAN et al., 2018), também conhecido como teste de Montenegro (BURZA et al., 2018).

[028] O restante dos indivíduos infectados desenvolve uma infecção crônica progressiva (MEDINA-COLORADO et al., 2017), que é caracterizada por uma falha da resposta imune celular aos antígenos de Leishmania e uma elevada produção de IL-10 nas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e no plasma, promovendo o desenvolvimento de uma resposta do perfil Th2 (NYLÉN et al., 2007). [029] A doença pode ter início agudo ou insidioso e o período de incubação varia de 2 semanas a 8 meses (BURZA et al, 2018). Os sinais e sintomas clínicos clássicos da LV incluem febre persistente, perda de apetite, caquexia, aumento do tamanho do baço (esplenomegalia) e do fígado (hepatomegalia), palidez, edema (MEDINA-COLORADO et al., 2017; JAIN & JAIN, 2017; PRESTES-CARNEIRO et al.2019; SANTOS et al, 2019), além de outras alterações como taquicardia, petéquias, epistaxe, sangramento gengival e menos frequentemente desconforto abdominal (GRIENSVEN & DIRO, 2012) e diarreia, que ocorre como resultado de parasitismo intestinal e ulceração (KUMAR & NYLÉN, 2012).

[030] Na fase avançada da doença, a trombocitopenia juntamente com depleção de protrombina leva a hemorragia grave da mucosa, icterícia e ascites (RODRIGUES et al., 2016). Além disso, a anemia severa e a perda de leucócitos tornam os indivíduos imunossuprimidos facilitando o desenvolvimento de infecções bacterianas que são comuns causa de morte em casos letais de LV (KUMAR & NYLÉN, 2012; BURZA et al, 2018).

[031] Os achados laboratoriais incluem plaquetopenia, pancitopenia, anemia, trombocitopenia e neutropenia (BURZA et al, 2018; ZIJLSTRA, 2016) que são frequentes e refletem tanto o sequestro esplénico quanto a supressão da função da medula óssea, além de hipergamaglobulinemia policlonal que está associada à presença de células plasmáticas abundantes no baço (RODRIGUES et al., 2016).

Tratamento da Leishmaniose Visceral

[032] Os medicamentos mais comumente utilizados no tratamento da LV são os antimoniais pentavalentes disponíveis nas formulações: estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina (BURZA et al., 2018) e a amphotericina B, que tem sido consideradas as duas drogas de primeira escolha por décadas. Também são empregadas a paramomicina e a miltefosina (VAKILI et al., 2017). [033] Os antimoniais pentavalentes (SbV) como o estibogluconato de sódio, apresentam alta toxicidade associadas com risco de vida, como arritmias cardíacas, prolongamento do intervalo QT (QTc), batimentos prematuros ventriculares, taquicardia ventricular, fibrilação (SUNDAR & SINGH, 2018) mas também, o seu uso prolongado aumentou o número de casos de resistência ao antimonial. Em Bihar, por exemplo, 64% dos casos são resistentes aos antimoniais (MOHAPATRA, 2014; TASLIMI et al, 2018; PURKAIT et al, 2015).

[034] Por outro lado, a anfotericina B convencional foi introduzida para tratamento da LV nos anos 80 (MONGE-MAILLO & LOPEZ-VÉLEZ, 2013) e mais recentemente foi desenvolvida a sua formulação lipossômica AmBisome (Gilead Sciences, EUA), que provou ter muito melhor eficácia terapêutica. Porém a anfotericina B lipossomal é ainda muito cara (MANSURI et al., 2017) e apresenta, assim como a anfotericina B convencional, um perfil de toxicidade que inclui reações à infusão na maioria dos pacientes, nefrotoxicidade, hipocalemia, miocardite e morte ocasional.

[035] Esta alta toxicidade e risco exigem um monitoramento rigoroso (SUNDAR & SINGH, 2018). Atualmente, a anfotericina B lipossomal é recomendada pela OMS como a droga de primeira linha para tratar qualquer forma de LV, não apenas em condições graves ou associadas ao HIV, mas também em crianças e adultos imunocompetentes (SERENO et al, 2019).

[036] Recentemente, a terapêutica multidroga tem sido explorada para o tratamento da LV a partir do uso de drogas com atividade sinérgica ou aditiva, com o intuito de reduzir o tempo e o custo do tratamento, o que reduz também a ocorrência de efeitos adversos (SUNDAR & CHAKRAVARTY, 2015) e aumenta a taxa de eficácia do tratamento mesmo nos casos de co-infecção (SINGH et al, 2016). Porém, estes medicamentos apresentam alto custo, alta toxicidade (JAIN & JAIN, 2017) e seleção de mutantes resistentes (SINGH et al., 2016; SERENO et al, 2019). [037] A maioria dos parasitas do sub-reino Protozoa é deficiente na síntese “de novo” dos sistemas das purinas, e, portanto, dependem exclusivamente da via de salvação (BERENS et al; 1995). A Nucleosideo Hidrolase de L. (L.) donovani (NH36), é uma enzima do metabolismo de DNA que possui 314 aminoácidos (CUI et al., 2001 , SANTANA et al., 2002) e apresenta significante homologia com as sequências de outros organismos tais como: L. (L.) major (95%) (CUI et al., 2001 ), L. (L.) chagasi (99%), L (L.) infantum (99%), L (L.) tropica (97%), L (L.) mexicana (93%), L (L.) braziliensis (84%) (BLAST, 2010), T. brucei (27%) e Crithidia fasciculata (80%) (CUI et al., 2001 ). Tendo ainda 68% de identidade com Haemophylus influenzae e 30% de identidade com Bacillus anthracis (TODD et al., 2003; BLAST, 2010). As Nucleosídeo- Hidrolases hidrolizam a ligação A/-glicosídica das purinas e pirimidinas, resultando em ribose e a base (GOTTLIEB, 1989).

[038] A atividade das Nucleosideo hidrolases tinha sido já identificada em células de Trypanosoma brucei gambiense (SCHMIDT et al., 1975), L. (L.) donovani (KOSZALKA e KRENITSKY 1979; LOOKER et al., 1983), L (L) mexicana (DAVIES et al., 1983), L tropica (GARIN et al., 2001 ), Trypanosoma cruzi (MILLER et al., 1984) e Trypanosoma brucei brucei (PARKIN, 1996). A demonstração da presença constitutiva da Nucleosideo hidrolase em promastigotas de L. (L.) donovani (CUI et al., 2001 ; SANTANA et al., 2002) indica a sua relevância para o desenvolvimento do parasita, visto que a mesma é expressa nos estágios do parasita que infectam o hospedeiro vertebrado (LUKES et al., 2007; MAURÍCIO et al., 2006; SHI et al., 1999; CUI et al., 2001 ; SANTANA et al., 2002).

[039] Os análogos de nucleosídeos sintéticos denominados Imucilina A e Imucilina H demonstraram uma forte atividade inibitória da Nucleosideo Hidrolase (NH36) in vitro (Freitas et al., 2015a) e uma forte inibição do crescimento de promastigotas de Leishmania (L.) donovani e L. (L.) amazonensis in vitro, e uma alta eficácia terapêutica contra a LV causada por L.(L) infantum chagasi in vivo, em hamsters e camundongos com ausência de toxicidade e contra a leishmaniose cutânea por L. (L.) amazonensis em camundongos (da Silva F., 2018), tornando-se excelentes candidatos a novas drogas terapêuticas contra as leishmanioses. Vacinas contra as Leishmanioses

[040] A pesquisa de vacinas contra a leishmaniose foi iniciada há muitos anos. A primeira vacina contra a leishmaniose foi desenvolvida pelo professor Adler da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel (revisado por PALATNIK-de-SOUSA et al. 2008) de Leishmania vivas para provocar uma lesão, na expectativa de gerar proteção. Porém esta prática descontinuou por não ser considerada segura. Atualmente existe apenas uma vacina contra a leishmaniose visceral licenciada no Uzbequistão (revisado por PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008).

[041] A primeira geração de vacinas contra a leishmaniose foi desenvolvida contra a leishmaniose tegumentar (LT) e foi obtida por manipulação de parasitas mortos com ou sem adjuvantes. Estas vacinas foram utilizadas em testes clínicos em populações humanas nas áreas endêmicas contra a forma cutânea da doença principalmente (ANTUNES et al., 1986; CONVIT et al., 1987; VÉLEZ et al., 2000), mas também contra a forma visceral (KHALIL et al., 2000).

[042] A segunda geração de vacinas anti- Leishmania pode ser dividida em três categorias de acordo com sua composição: vacinas vivas contendo genes de Leishmania ou usando Leishmania geneticamente modificadas ou vírus expressando genes de Leishmania (CRUZ, COBURN, BEVERLEY, 1991 ; SOUZA et al., 1994; TITUS et al., 1995; RAMIRO et al., 2003; SELVAPANDIYAN et al., 2004; SELVAPANDIYAN et al. 2006; JAIN & JAIN, 2015), vacinas de frações ou subunidades recombinantes ou sintéticas definidas (RUSSO et al., 1991 ; SKEIKY et al.,1995; GURUNATHAN et al.„ 1997; COLER et al., 2002; RAFATI et al., 2002; GRADONI et al., 2005; BADARÓ et al., 2006; POOT et al., 2006; COLER et al., 2007; MORENO et al., 2007; JAIN & JAIN, 2015) e vacinas com frações nativas parcialmente purificadas (PALATNIK et al., 1989; JAFFE, RACHAMIM, SARFSTEIN, 1990; JARDIM et al., 1991 ; LEMESRE et al., 2005, PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008; PALATNIK- de-SOUSA et al., 2009; PALATNIK-de-SOUSA, et al., 2009; JAIN, & JAIN, 2015). [043] Por fim, as vacinas de terceira geração contêm genes de antígenos clonados em um vetor de promotor eucariótico injetado e traduzido diretamente no músculo (XU & LIEW, 1994; HANDMAN, 2001 ; RAMIRO et al., 2003; AGUILAR-BE et al., 2005; RAFATI et al., 2005; GAMBOA-LÉON et al., 2006; PALATNIK-de-SOUSA, 2012; JAIN, JAIN, 2015). Vacinas de DNA oferecem meios simples e eficazes de induzir a imunidade a longo prazo e fornecer proteção, além disso é uma forma de imunoterapia antígeno-específica confiável, segura, estável e pode ser facilmente produzida (KUMAR & SAMANT, 2016).

[044] Anteriormente, desenvolveu-se uma vacina de DNA baseada no gene da NH36 que foi imunoterapêutica contra a LV canina (BORJA CABRERA et al. , 2012) e que foi base de uma patente concedida no México (Dumonteil E. et al., Instituto Mexicano de la Propriedad Industrial (IMPI). YU/a/2004/000010, Folio:YU/E/2004/000078).

[045] Mesmo com tantos avanços nos estudos baseados em formulações vacinais, ainda não se tem disponível uma vacina contra a LV humana ou a LT americana, utilizada em rotina clínica. Apenas uma vacina de primeira geração foi licenciada para imunoterapia da LT humana no Brasil, em 2001 , e demonstrou a sua eficácia na prevenção da doença (MAYRINK et al., 2013).

[046] Mais recentemente vemos exemplos de diferentes tipos de vacinas desenvolvidos contra a LV, as vacinas podem ser compostas por Leishmania viva atenuada (AVISHEK et al., 2016), vacinas de subunidades e de RNA (DUTHIE et al., 2018), vacinas de DNA (KUMAR & SAMANT, 2016; KAUR et al., 2016), vacinas de peptídeos sintéticos (De BRITO et al., 2018), vacinas de epítopos sintéticos (CAMPOS et al., 2018; PALATNIK-DE-SOUSA, 2019; JOSHI et al., 2019).

Vacinas contra a LV canina

[047] O Laboratório de Biologia e Bioquímica de Leishmania do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da UFRJ vem desenvolvendo vacinas de segunda geração contra a LV murina e LV canina (LVC) usando o antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) (PI1 100173-9), a glicoproteína GP36 e a proteína recombinante NH36 de Leishmania (L) donovani (P 1015788-3) (PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008).

[048] O antígeno FML de L. (L.) donovani é um complexo glicoprotéico, que inibe a infecção de macrófagos (PALATNIK et al., 1989; PALATNIK-de-SOUSA, DUTRA, BOROJEVIC, 1993) e é sensível e específico no diagnóstico da LV (PALATNIK-de-SOUSA et al., 1995) e LVC (CABRERA et al., 1999).

[049] Uma vacina veterinária composta pelo antígeno FML e as saponinas QS21 aciladas e deaciladas da Quillaja saponaria Molina (OLIVEIRA-FREITAS et al., 2006), foi licenciada no Brasil em 2003, sob o nome de Leishmune®, como a primeira vacina registrada para a prevenção da LVC no mundo (PI1 100173-9), (revisado por PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008). Ela é bem tolerada (PARRA et al., 2007) e também é bloqueadora da transmissão (PI 0503187-7, Brasil, MX/a/2007/014375, EP1893640 B1 (EPO), PT1893640E (Portugal), ES2540088T3.0 (Espanha), EPIT1893640 (Itália), EP1893640 (França).

[050] A EP1893640 está atualmente depositada em fases nacionais em Reino Unido, Alemanha, Grécia, Bulgária, Turquia (SARAIVA et al., 2006; PALATNIK-de- SOUSA et al., 2008). A Leishmune® é uma vacina bloqueadora da transmissão porque os anticorpos que ela induz em cães sadios bloqueiam o desenvolvimento do parasita no intestino do vetor flebotomíneo e assim, o inseto não passa a frente a infecção para outros humanos ou cães, e a epidemia se interrompe nas áreas endêmicas (SARAIVA et al., 2006; PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008; é bem tolerada (PARRA et al., 2007) e também é bloqueadora da transmissão (PI 0503187-7, Brasil, MX/a/2007/014375, EP1893640 B1 (EPO), PT1893640E, ES2540088T3.0, EPIT1893640, EP1893640).

[051] Esta vacina profilática demonstrou em campo eficácias vacinais de 76% (da SILVA et al., 2000) e 80% (BORJA-CABRERA et al., 2002). Os ensaios foram realizados em áreas de alta pressão infectante e o cálculo da eficácia vacinai se baseou no número de óbitos e casos clínicos confirmados da doença (da SILVA et al., 2000; BORJA-CABRERA et al., 2002; PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008). [052] A vacinação com Leishmune® deixa os cães não infecciosos para o inseto (NOGUEIRA et al., 2005; PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008) e quando administrada com dupla concentração de adjuvante é imunoterapêutica (BORJA- CABRERA et al., 2004, SANTOS et al., 2007). Quando administrada em conjunto com Glucantime e Alopurinol, a Leishmune® negativa a reação em cadeia polimerase (PCR) para DNA de Leishmania gerando uma proteção estéril (BR 1 1 2012 000872- 2, US 10,172,940 B2) (BORJA-CABRERA et al., 2010).

[053] Evidência muito importante da eficácia da Leishmune®, é a demonstração de que nas áreas endêmicas onde a Leishmune® foi aplicada, se detectou uma significativa redução dos casos caninos, da seroprevalência canina e, consequentemente dos casos humanos e mortalidade humana por LV (SARAIVA et al., 2006; PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008) confirmando que a vacina tem a capacidade de interromper a epidemia.

[054] Uma segunda vacina profilática licenciada no Brasil em 2008, a Leish- Tec®, contém a proteína recombinante A2 de amastigotas de L. (L.) donovani (PI 0603490-0 A2) e mostrou ser protetora contra LV em ensaios com desafios experimentais em camundongos (GHOSH, LABRECQUE, MATLASHEWSKI, 2001 ; COELHO et al., 2003), macacos Rhesus (GRIMALDI et al., 2014) e cães Beagle (FERNANDES et al., 2008). O primeiro ensaio de campo de Leishtec® foi publicado apenas em 2016 e foi realizado em uma área de baixa pressão infecciosa (REGINA- SILVA et al., 2016).

[055] Nesta área, os casos de LV foram definidos, não por óbitos ou sintomas clínicos com confirmações de parasitas como foi usado para a vacina Leishmune® (da SILVA et al., 2000; BORJA-CABRERA et al., 2002; PALATNIK-de-SOUSA et al., 2008), mas sim pela soropositividade confirmada por pelo menos um de três testes parasitológicos, ou pela adição do xenodiagnóstico a ensaios parasitários (REGINA- SILVA et al., 2016). [056] Utilizando esses critérios menos severos, os autores relataram eficácia vacinai de 71 ,4% com base na definição parasitológica dos casos, e de 58,1 % pela adição do xenodiagnóstico. Porém, quando um teste de campo de Leishtec® foi realizado em uma área de alta pressão infecciosa, foi observado um efeito menor na redução da taxa de infecção canina (GRIMALDI et al. , 2017). De fato, a incidência de LV foi de 42 % nos controles e de 27 % nos cães vacinados, representando apenas 35,7 % de eficácia vacinai (GRIMALDI et al., 2017).

[057] As respostas protetoras foram ou “não geradas” ou “não mantidas” em 43% dos cães imunizados que se infectaram e desenvolveram a doença ao longo do tempo. Entretanto, a A2 se mostrou imunogênica uma vez que os níveis de anticorpos IgG anti-A2 específicos foram significativamente maiores em receptores de vacina do que em cães controles infectados (GRIMALDI et al., 2017).

[058] Portanto, em contraste com a Leishmune®, que mostrou eficácia de 76% a 80%, com base em parâmetros finais estritos (óbitos e casos clínicos) (da SILVA et al., 2000, BORJA-CABRERA et al., 2002) e promoveu a diminuição da incidência canina e humana de LV em áreas de alta pressão infecciosa (PALATNIK-de-SOUSA et al., 2009), o segundo ensaio de campo do Leishtec® mostrou que esta vacina pode não reduzir a incidência canina de leishmaniose em áreas de alta transmissão e pode não ter impacto na incidência humana da doença (GRIMALDI et al., 2017).

[059] Um estudo recente sobre cães de caça proprietários infectados com L (L) infantum mostrou que, se usada para imunoterapia, o Leishtec ® reduziu em 25% o risco de progressão para sintomas clínicos, e em 70% a mortalidade (TOEPP et al., 2018). Em contrapartida, foi descrita uma potência mais alta para Leishmune® que, quando utilizada para imunoterapia, reduziu 80% nos casos sintomáticos, 100% nos casos positivos para parasitas e 100% nas mortes e, que quando usada em combinação com quimioterapia, também promoveu uma cura estéril com resultados negativos de PCR (BORJA-CABRERA et al., 2010). [060] Essa evidência explica por que muitos estudos comparativos revelaram resultados de maior eficácia para as vacinas Leishmune® do que para as vacinas Leishtec® e / ou LBsap (FERNANDES et a!., 2014; de MENDONÇA et al., 2016), além de uma indução mais forte da resposta imune e pró-inflamatória (MOREIRA et al., 2016; COSTA PEREIRA et al., 2015, de LIMA et al., 2010) e aprimoramento das proporções de células T CD8 + que secretam IFN-y (ARAÚJO et al., 2009).

[061] Adicionalmente, uma proteína recombinante, denominada Q, formada pela fusão genética de cinco fragmentos antigênicos intracelulares das proteínas ribossômicas ácidas Lip, Lip2b, P0 e histona H2A (CARCELÉN et al., 2009; FERNÁNDEZ-COTRINA et al., 2018) foi licenciada como a vacina Letifend® com a eficácia de 72 % (FERNÁNDEZ COTRINA et al., 2018) (LU93259C).

[062] Finalmente, a vacina CaniLeish®, composta pelas proteínas excretadas de L. (L.) infantum (ESP) e o extrato purificado de Quillaja saponaria (QA-21 ), também mostrou uma resposta imune Th1 dominante que persistiu por um ano inteiro (GRADONI, 2015) (W02002100430A1 ). Um ensaio de campo realizado em áreas de alta endemicidade da bacia do Mediterrâneo usou PCR e culturas de parasitas para confirmação da infecção (OLIVA et al., 2014). Considerando a infecção ativa, foi observada uma eficácia de 63 % da vacina no mês 24 após a vacinação.

[063] Considerando os sintomas da LV, a eficácia da vacina foi de 68,4% (RODRIGUES et al., 2016). De acordo com esses resultados, foi reconhecido que somente duas vacinas, consistindo de frações purificadas pelo parasita com adjuvantes derivados de saponina, mostraram conferir proteção significativa contra doença e morte sob condições naturais, o FML-saponina (Leishmune®) no Brasil, e o LiESP / QA -21 (CaniLeish®) na Europa (GRADONI, 2015).

Vacinas contendo os antíqenos GP36 e Nucleosídeo hidrolase de Leishmania (L.) donovani (NH36)

[064] Em paralelo ao desenvolvimento da vacina Leishmune ^(R) descrevemos que o antígeno principal do complexo FML é a glicoproteína de 36 kDa de L. (L.) donovani, que é reconhecida por soros humanos e caninos de LV (PALATNIK-de- SOUSA et al., 1996; SANTANA et al., 2002; NICO et al., 2014b) e foi clonada em Escherichia coli, revelando ser uma Nucleosídeo hidrolase (NH36), marcador sorológico da LVC (SANTANA et al., 2002).

[065] Quando clonada no vetor VR1012 (AGUILAR-BE et al., 2005) se apresentou como uma vacina de DNA, que assim como as vacinas FML e NH36 formuladas com saponina, protege contra a infecção murina por L. (L.) infantum chagasi, L. (L.) mexicana (AGUILAR-BE et al., 2005) e L. (L.) amazonensis (SOUZA, PALATNIK-de-SOUSA, 2009; NICO et al., 2014a; NICO et al., 2014b). As vacinas FML e VR1012 NH36 geram portanto, a prevenção bivalente contra a LV e LT (AGUILAR- BE et al., 2005; SOUZA; PALATNIK-de-SOUSA, 2009) e a cura imunoterapêutica contra LV murina (GAMBOA-LEÓN et al., 2006) e LVC (BORJA-CABRERA et al., 2009, 2012).

[066] A NH36 de L. (L.) donovani é composta por 314 aminoácidos (CUI, et al., 2001 ) e demonstra alta homologia com as sequências descritas para as NH de L. (L) major (95 %) (CUI et al., 2001 ), L. (L) chagasi (99 %), L (L.) infantum (99 %), L. (L.) tropica (97 %), L. (L.) mexicana (93 %) e L. (V.) braziliensis (84 %) BLAST (2014).

[067] No intuito de identificar os epítopos da NH36, a serem incluídos numa vacina sintética, foram utilizadas duas metodologias combinadas: 1 ) a de clonagem dos fragmentos imunogênicos e 2) a de predição de epítopos por programas cujo algoritmo detecta setores com mais alta frequência de aminoácidos hidrofóbicos e carregados.

[068] Inicialmente foram clonados três fragmentos da sequência da NH36 no vetor pET28b para expressão das proteínas com cauda de histidina: F1 (aminoácidos de 1 a 103); o F2 (a.a. 104 a 198) e o F3 (a.a 199 a 304). O modelo tridimensional revelou que, no tetrâmero da NH36, o domínio F3 é o que apresenta maior área exposta (29507.002 Angstroms ² ). Ele é seguido pelo domínio F1 (N-terminal) com uma área de 27132.781 Angstroms ² . [069] O domínio F2 (central) tem a menor área superficial (19931.451 Angstroms ² ) e é o fragmento menos exposto da proteína. A sequência F3 inclui três epítopos preditos para células T CD4 ⁺ de camundongos e três epítopos para anticorpos, enquanto que o F1 mostra dois epítopos para CD4+, um para CD8+ de camundongos e dois para anticorpos (NICO et al., 2014b, PI 1015788-3).

[070] Na vacinação de camundongos BALB/c com os fragmentos F1 , F2 e F3 e saponina ficou demonstrado que a proteção contra L. (L.) infantum chagasi está relacionada com o seu domínio C-terminal (F3) e é mediada principalmente por uma resposta de células T CD4+ com uma menor contribuição de células T CD8+ (NICO et al., 2010). A imunização com o F3 otimizou e excedeu em 36,73 % a reposta protetora induzida pela proteína cognata NH36. Foram detectados aumentos de anticorpos IgM, lgG2a, IgG 1 e lgG2b, de proporções de células T CD4+, da secreção de IFN-y, das razões de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-y/IL-10 e das porcentagens de inibição da ligação de anticorpos por epítopos sintéticos preditos (NICO et al., 2010).

[071] O aumento na intradermoreação (IDR) e nas razões de células T CD4+ produtoras de TNF-α/IL-10 foram os fortes correlates da proteção, que foi confirmada pelo ensaio de depleção in vivo com anticorpos monoclonais, pelos epítopos para CD4+ e CD8+ preditos pelos programas baseados em algoritmo de Sette e pelo pronunciado decréscimo na carga parasitária (90,5-88,23 %). Esta proteção foi duradoura (NICO et al. 2010, PI 1015788-3).

[072] Devido à alta homologia das sequências das NHs, a proteção gerada contra a LV por L. (L.) infantum chagasi poderia se estender a outras espécies causadoras da LT. Conforme confirmado pelo ensaio de depleção in vivo com anticorpos antiCD4+ e anti-CD8+, observamos que a proteção gerada pela NH36 contra a infecção murina por L. (L.) amazonensis está mediada pela combinação da resposta T CD4+ contra o domínio F3 e da resposta TCD8+ contra o domínio F1 (NICO et al., 2010, 2014a, PI 1015788-3). Portanto, o domínio F3 da NH36 é necessário para a proteção contra a LV e os domínios F3 e F1 para a prevenção contra a LT murinas. [073] O genoma da L. (L.) amazonensis foi posteriormente elucidado e a sequência de aminoácidos da NH36 mostrou 93% de identidade com a da NH A34480 de L. (L.) amazonensis (NICO et al., 2014a). Existem nela, epítopos completamente conservados para células T CD4+ e CD8+ no domínio F1 , e para células T CD4+, mostrando diferenças em um aminoácido apenas, nos domínios F1 e F3. Esta homologia justifica o forte efeito imunoprotetor cruzado desenvolvido pelos fragmentos F1 e F3 na prevenção da LT murina. Adicionalmente, também os peptídeos F1 e F3 determinaram um forte efeito cruzado na imunoterapia da infecção por L. (L.) amazonensis (NICO et al., 2014b).

[074] Adicionalmente, cães infectados com L (L) infantum chagasie tratados por imunoterapia com a vacina de DNA NH36 desenvolveram aumentas significativas nos tamanho e proporções de reações DTH-+- e nas frequências de células T CD4+ NH36 específicas em resposta ao domínio F3, e aumentos nas razões lgG2/lgG1 de anticorpos anti-NH36 e nas contagens de células T CD8+, em resposta ao domínio F1 . A imunoterapia promoveu uma diminuição da carga parasitária e perda de peso, aumentando a sobrevida dos cães (BORJA-CABRERA et al., 2010 b).

[075] Os domínios F1 e F3 foram adicionalmente expressos em tandem em uma quimera recombinante otimizada clonada no vetor pET28b, que foi a formulação mais potente na vacinação contra a L. (L.) infantum chagasi, na geração de anticorpos lgG2a anti-NH36, na IDR ao lisado de Leishmania, na secreção de IFN-y, na indução dos menores níveis de TNF-α com o estímulo do subpeptídeo F3-3 (porção C- terminal do peptídeo F3) e de IL-10, e na mais potente redução do número de parasitas no fígado, compartilhando a sua predominância com o F3 na redução da hepatoesplenomegalia. A quimera superou o efeito protetor gerada pela vacinação com cada peptídeo individualmente, ou pela adição de ambos, sugerindo que a apresentação em tandem e com códons otimizados potencializa muito a eficácia vacinai contra a LV murina (GOMES, 2013). [076] A quimera também promoveu uma proteção maior do que a gerada pelos dois domínios misturados ou por cada domínio independentemente, contra o desafio por L. (L.) amazonensis mostrando a mais alta produção de IgA, IgG e lgG2a anti- NH36, IDR, IFN-Y e IL-10, enquanto TNF-α foi mais secretada por camundongos vacinados com F3 ou com as vacinas contendo F3 (ALVES-SILVA et al., 2017). Além disso, a quimera e a vacina F1 induziram as maiores proporções de células T CD4+ e CD8+ mono produtoras de IL-2, TNF-α ou IFN-y; duplo produtoras de TNF-α e IL-2, TNFa e IFN-y ou IFN-y e IL-2, e de células multifuncionais T CD4+ triplo produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-y. A quimera e os domínios misturados reduziram também o tamanho das lesões cutâneas (84% e 80%, respectivamente) e a carga parasitária (99,8%). Assim, a quimera otimizou também a proteção cruzada contra L. (L.) amazonensis (ALVES-SILVA et al., 2017).

[077] Mas enquanto que a proteção contra a infecção por L. (L.) infantum chagasi e L. (L.) amazonensis requer uma resposta Th1 , é a infecção por L. (V.) braziliensis determina uma resposta inflamatória aumentada com forte secreção de IFN-y e TNF-α (ALVES-SILVA et al., 2019). Além disso, a produção de IL-10 que modula a resposta imune, na infecção por L. (V.) braziliensis é reduzida.

[078] Confirmando o efeito benéfico da vacinação com a quimera F1 F3, observou-se o aumento das respostas IgA, IgG e lgG3 e da IDR, 49% mais forte do que a NH36. No entanto, enquanto que as respostas Th1 foram mais fortes com taxas elevadas de I FN-y/l L-10 e TNF-α/IL-10 no caso das vacinas F3 e F1 , a quimera F1 F3 promoveu a maior secreção de IL-10, o que reduziu a resposta Th1 patológica e caracterizou a indução de uma resposta reguladora mista e / ou de células T (ALVES- SILVA et al., 2019).

[079] Identificou-se então os epítopos responsáveis por essas respostas imunes em camundongos. A vacina F3 induziu a imunidade mais precoce e após o desafio, mas a quimera F1 F3 promoveu as maiores respostas de células T CD4+ e CD8+, secretoras de citocinas, e as frequências predominantes de células TCD4+ e CD8+ IL-2+ e multifuncionais IL-2+TNF-α+IFN-Y+. [080] Também como observado contra a infecção por L. (L.) amazonensis, a quimera F1 F3 promoveu a maior redução no tamanho das lesões de orelha induzida por L. (V.) braziliensis. Os resultados confirmaram o potencial uso da quimera F1 F3 em uma vacina de proteção cruzada multiespécies contra a LV e LT (ALVES-SILVA et al., 2019).

Vacina humana recombinante em desenvolvimento que contém a NH36

[081 ] O decréscimo das proporções de linfócitos T CD4+ totais e dos linfócitos T CD4+ Leishmania- específicos, características da LV, indicam que uma vacina eficaz deve reforçar a resposta imune T CD4+ (KUMAR & NYLÉN, 2012). Neste cenário é importante observar que, recentemente, uma proteína de fusão composta pela NH36 de L. (L.) donovani e uma esterol 24-c-metiltransferase (SMT), adjuvantada por GLA- SE (glucopiranosil lipídeo A estabilizado em emulsão óleo-água), e denominada Leish- F3 (NH36-SMT-GLA-SE) protegeu camundongos contra as infecções por L. (L.) infantum e L. (L.) donovani. Níveis sustentados de IL-2 (contra NH36 e SMT) e de TNF-α (contra NH36) foram encontrados em camundongos vacinados, que exibiram a carga parasitária reduzida (COLER et al., 2015).

[082] Adicionalmente, a Leish-F3 induziu aumentos das frequências de células T CD4+ produtoras de IFN-y, ou IL-2 ou TNF-α em PBMCs de pacientes infectados por L. (L.) donovani de Bangladesh, e de anticorpos IgG NH-específicos, maiores nos indivíduos subclínicos do que em pacientes humanos antes do tratamento (COLER et al., 2015). Finalmente, a Leish-F3 também foi preparada em condições GMP, sendo até o momento, a única vacina humana de subunidades contra a LV humana que chegou a testes de FASE I em adultos humanos não infectados de USA, apesar de não ter sido licenciada ainda. Os PBMCs dos indivíduos vacinados mostraram um aumento da secreção de IFN-y, TNF-α e IL-2 e baixos níveis de IL-5 e IL-10 em resposta a Leish-F3. A vacina foi bem tolerada (COLER et al., 2015). Um pedido de patente foi concedido na USPTO a respeito desta formulação (US20160186158A1 ). Vacinas de epítopos

[083] A produção e o armazenamento de proteínas recombinantes são frequentemente problemáticos e requerem boas instalações, o que limitam seu uso em muitos contextos. Por outro lado, os peptídeos são mais facilmente produzidos e enviados, além de que podem ser armazenados liofilizados (LESTINOVA et al. , 2017).

[084] As novas abordagens de vacinação são baseadas no design racional de epítopos para linfócitos B e T que prometem induzir repertórios de especificidades imunológicas, bem como lidar de forma mais segura com a variação genética tanto dos patógenos como dos seres humanos. Além disso os peptídeos sintéticos são produzidos por síntese química e são vantajosos do ponto de vista de fabricação (OYARZUN & KOBE, 2016).

[085] Mais recentemente foi desenvolvido o conceito de que a resposta imune mais eficaz contra patógenos é derivada de várias células T diferentes que respondem a um conjunto de péptidos curtos derivados dos patógenos chamados epítopos (DE GROOT et al., 2002). A teoria das vacinas baseadas em epítopos, postula que pode- se aumentar a potência e a eficácia de uma vacina se, para otimizá-la, forem usados fragmentos cada vez menores, porém mais imunogênicos, da proteína selecionada.

[086] Desta forma, o mapeamento de epítopos de uma proteína pode ser usado para a concepção de vacinas multiepítopos, poli-epítopos ou politopos (SAYED et al., 2016). Os conjuntos de poli-epítopos são preferidos para substituir o organismo patógeno vivo, cuja utilização estaria sempre ligada ao risco de gerar a doença. Em efeito, os epítopos peptídicos de uma proteína, ou das diferentes proteínas de uma cepa, ou de proteínas conservadas de diferentes cepas de uma espécie ou de um gênero podem ser facilmente hoje reunidos em uma única vacina polivalente ou universal (DE GROOT et al., 2002; SAYED et al., 2016).

[087] Os epítopos são selecionados de acordo com a sua habilidade para ligar nas fendas das moléculas receptoras de histocompatibilidade (MHC em camundongos e HLA em humanos) das células apresentadoras de antígenos (APC). Estas moléculas apresentam os epítopos aos linfócitos iniciando a resposta imune. [088] Os resíduos de ancoragem dos epítopos se prendem aos bolsos da fenda da molécula MHC, e a sequência fica no assoalho dessa fenda de ligação, disponível para ser reconhecida pelos receptores de linfócitos (CHRISTOPHER et al., 2013), o que desencadeará a resposta imune.

[089] A ligação do epítopo ao MHC-II pode ser considerada um fator limitante para a posterior exposição do epítopo na superfície celular. Além da acomodação da cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos nos “bolsos” da fenda de ligação do MHC- II, estudos demonstram que ligações de hidrogênio são responsáveis pela discriminação entre os estados carregado e vazio do MHC-II, sugerindo que a perda de uma única ligação de hidrogênio entre a cadeia principal do epítopo e resíduos conservados do MHC-II é capaz de favorecer a proteólise deste complexo (ARNESON et al., 2001 , PAINTER et al., 2008; YANEVA et al., 2009).

[090] O peptídeo antigênico se liga ao MHC-II de modo distendido, sendo governado pelas ligações de hidrogênio decorrentes da interação entre resíduos conservados presentes nas hélices da fenda do MHC-II e o “esqueleto” do peptídeo. Esta conformação permite a acomodação da cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos nos bolsos P1 , P4, P6/P7 e P9 que são denominados resíduos âncora, responsáveis pela estabilização do complexo.

[091] As propriedades inerentes a esses bolsos determinam a sua especificidade por determinados resíduos definindo os aminoácidos âncora de cada isótipo de molécula de MHC-II (JONES et al., 2006; PAINTER et al., 2008). Fato decorrente, o seu conhecimento implica no desenvolvimento racional de peptídeos ou proteínas para serem usados como alvos vacinais, por exemplo (JAMES et al., 2009). Existem, entretanto, muitos alelos para cada gene que codifica as proteínas dos receptores MHC e HLA, e esta variabilidade gera diferenças estruturais nestas proteínas, que influenciam na ligação com os epítopos (FLERI et al., 2017). Este fator poderia dificultar o desenvolvimento de uma vacina que deve ser protetora para uma população geneticamente heterogênea no que diz respeito às suas moléculas HLA. [092] Entretanto, atualmente, os programas de predição de epítopos in silico identificam sequências mínimas com capacidade de ligar a muitos alelos MHC ou HLA. Estes epítopos, denominados promíscuos (FLERI et al. , 2017), são os melhores candidatos para compor uma vacina multi-epítopos.

NH36, seus domínios e epítopos na resposta imune de pacientes com leishmaniose visceral

[093] Continuando com a busca dos domínios e sequências mais imunogênicos da NH36 para humanos, pesquisou-se os epítopos da NH36 que seriam apresentados por moléculas HLA de Classe II e Classe I humanas, usando os programas de bioinformática preditores de epítopos TEPITOPE e SYFPEITHI. O intuito foi identificar os epítopos que possam ligar a um número maior de moléculas de histocompatibilidade. Uma vacina composta por estes epítopos, denominados promíscuos, poderá gerar proteção mais ampla nas populações humanas sem estar restrita apenas a proteger indivíduos que apresentem alguns alelos específicos de HLA.

[094] Visando então iniciar o desenvolvimento de uma vacina humana contra as leishmanioses, neste estudo identificou-se 3 epítopos preditos na NH36, capazes de se ligarem a pelo menos 19 das 25 moléculas de HLA DR humanas mais frequentes: 1 epítopo no F1 da NH36, e dois no F2, além de 8 epítopos para linfócitos CD8 (3 em F1 , 2 em F2, 3 em F3) (BARBOSA SANTOS et al., 2017). De acordo com a predição, para uma vacina humana, portanto, os domínios F1 e F2 seriam os mais importantes.

[095] A comparação da reatividade de indivíduos doentes de LV, que são imunossuprimidos, com a de indivíduos com infecção assintomática ou indivíduos curados, que tem a resposta imune celular ativa contra Leishmania e são DTH+, nos guiariam na identificação dos epítopos e domínios a incluir numa vacina humana (KUMAR et al., 2012; SANTOS et al, 2017; STOBER et al., 2012). [096] Coincidentemente com as predições in silica, estudando pacientes brasileiros infectados com L. (L.) infantum chagasi, detectou-se como marcadores de resistência natural a LV, o domínio F2, que induziu os níveis maiores de IFN-y, IL-11β e TNF-α e, junto com o F1 , a mais forte secreção de IL-17, IL-6 e IL-10 por PBMCs in vitro de indivíduos DTH+ e curados (BARBOSA SANTOS et al., 2017). O F2 também promoveu as mais elevadas frequências de células T CD4 ⁺ produtoras de IL-2 ou TNF- a, de IL-2 e IFN-y, e multifuncionais produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-y em indivíduos curados e assintomáticos DTH+.

[097] O aumento em IFN-y estava correlacionado com a diminuição do tamanho dos baços e fígados e com o aumento dos hematócritos em resposta a F1 , e com o aumento nos hematócritos e contagens de hemoglobina, em resposta a F2. Adicionalmente, o aumento da secreção de IL-17 em resposta a F1 e F2 estava associado com a diminuição dos tamanhos de baços e fígados.

[098] Em contraposição, os domínios F1 e F3 aumentaram as frequências de células CD8 ⁺ secretoras de IL-2, de IL-2 e TNF-α, e de células CD8 ⁺ multifuncionais secretoras de IL-2, TNF-α e IFN-y em pacientes com LV ativa. Estes aumentos, estavam correlacionados com aumentos nos tamanhos de baços e fígados e diminuição das contagens de hemoglobina e hematócritos (BARBOSA SANTOS et al., 2017).

[099] Foi concluído então que a cura e resistência a LV estão relacionadas com uma resposta CD4+-Th1 e Th-17 aos domínios F2 e F1 e a LV ativa está associada com respostas T CD8+ contra os domínios F3 e F1 , provavelmente envolvidas no controle da infecção inicial (BARBOSA SANTOS et al., 2017). Finalmente, e confirmando o achado de epítopos preditos que ligam a pelo menos 19 dos 25 haplótipos mais comuns das moléculas HLA-DR, HLA-A e HLA-B, descreveu- se que PBMCs de indivíduos DTH+ secretaram IFN-y em reposta ao epítopo preditos sintéticos do domínio F1 , denominado SEQ ID NO:1 , e em maior proporção, em resposta aos epítopos do domínio F2, denominados SEQ ID NO:2 seguida da SEQ ID NO:3 (BARBOSA SANTOS et al., 2017). [100] Foram descritos também que os epítopos SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 de NH36, identificados em 2014 usando os programas TEPITOPE e SYFPEITH, são muito conservados no gênero Leishmania (BARBOSA SANTOS et al., 2017). Adicionalmente, em indivíduos infectados com L. (L.) infantum de Espanha observou-se que a maior resposta linfoproliferativa de pacientes curados de LV é dirigida contra o peptídeo F1 (CARRILLO et al., 2017) e está acompanhada pelo aumento das razões de IFN-y/IL10 e TNF-α/IL-10 e da secreção de IL-17, em indivíduos assintomáticos, e de Granzyme B, em pacientes curados. Concluíiu-se que o domínio F1 , é um indutor da resposta Th1 e Th17 em indivíduos curados e assintomáticos infectados com L. (L.) infantum (CARRILLO et al., 2017).

[101] Confirmando a teoria das vacinas de epítopos, foi possível demonstrar que a utilização de sequências cada vez menores da NH36, porém imunogênicas, potencializa e otimiza a resposta imune e gera maior resposta de proteção, tanto em camundongos e cães, como em humanos. Adicionalmente, confirmando também que 3 dos epítopos preditos pelo programa TEPITOPE, e que ligam a pelo menos 19 dos 25 alelos mais frequentes de moléculas de MHC classe II HLA-DR, estimulam a secreção de IFN-y por PBMC de indivíduos assintomáticos DTH+.

[102] A presente invenção trata da seleção de epítopos geneticamente modificados para a produção de proteínas multiepitopos e formulação de uma composição imunogênica contra as leishmanioses, desenhadas com critérios ainda mais exigentes uma vez que os epítopos componentes foram preditos com algoritmos mais sensíveis, que ligam a mais alelos de mais genes de histocompatibilidade. De fato, a predição considerou 50 dos alelos mais frequentes de moléculas de MHC Classe II HLA-DR, DQ e DP. Estes epítopos promíscuos podem ser reconhecidos pela mais ampla gama de indivíduos.

[103] A invenção combina os epítopos promíscuos e usa como espaçadores uma sequência de AAA (Alanina-Alanina-Alanina) ou uma sequência de GPGPG (Glicina-Prolina-Glicina-Prolina-Glicina) para evitar que o epítopo seja digerido pela célula apresentadora de antígeno, e evitar epítopos justapostos (LIVINGSTON et al., 2002), formando assim as proteínas multiepitopos. Linfócitos T Multifuncionais

[104] O modelo de diferenciação de células T CD4+ efetoras e de memória de (SEDER et al., 2008) se inicia com linfócitos T CD4 virgens, que após contato com uma vacina desenvolvem a secreção precoce de TNF-α seguida de IL-2, de TNF-α e IL-2, e da secreção tardia de IL-2, TNF-α e IFN-y simultaneamente, por células CD4+ denominadas multifuncionais ou polifuncionais, que podem persistir como células T de memória ou efetoras (CARRILLO et al., 2017).

[105] As células T CD4 ⁺ normalmente podem permanecer como células T de memória ou diferenciarem-se em efetoras, ou podem morrer por apoptose logo após sua ativação (SEDER et al., 2008). A existência desses subconjuntos distintos de células T CD4+ de memória/efetora e virgens podem desempenhar um papel importante em diferentes contextos clínicos. Portanto, elas precisam ser consideradas no monitoramento imunológico em estratégias de vacinação e imunoterapia (CACCAMO et al., 2018).

[106] A classificação dos subconjuntos de células T de memória baseia-se na expressão de receptores necessários para extravasamento através de vênulas endoteliais altas para órgãos linfóides secundários, tais como o CCR7+ / CD62L+ (SALLUSTO, 2016) e podem ser divididas em pelo menos três populações diferentes: virgens/(naive) referido como CD45RA + CCR7 +, memória central como CD45RA- CCR7 +, e memória efetora como CD45RA-CCR7- (ORLANDO et al, 2016).

[107] O receptor de Quimiocina CC7 (CCR7) é um receptor de membrana, presente na superfície de linfócitos que está envolvido na organização da arquitetura e função tímicas e no direcionamento de células T virgens e reguladoras para vários órgãos linfóides secundários, como linfonodos e baço, foi demonstrado também que o CCR7 tem capacidade de estimular a maturação das células dendríticas e está envolvido no direcionamento de células T (SEDER et al., 2008).

[108] O estudo de Sallusto e Lanzavecchia (1999) mostrou que células CD4+CCR7+ (de memória central) expressam níveis mais elevados de IL-2, enquanto as células CD4+CCR7- (de memória efetora) produzem mais IFN-y. [109] Além disso, células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ multifuncionais cuja frequência é aumentada em resposta a antígenos têm um papel essencial na proteção contra uma variedade de doenças infecciosas causadas por patógenos intracelulares como já foi demonstrado na hanseníase (SANTOS et al., 2018), e nas leishmanioses tegumentar (NICO et al., 2014) e visceral (NICO et al., 2018).

[1 10] Nesta invenção, a eficácia dos epítopos componentes das proteínas multiepítopos e da composição imunogênica ficou evidente ao estudar a capacidade dos mesmos de induzir a secreção de citocinas, intracelularmente e aos sobrenadantes, por linfócitos T CD4+ e T CD8+ de pacientes assimtomáticos e DTH+ e pacientes curados de Leishmaniose visceral.

Descrição detalhada da Invenção

[1 1 1] Para caracterizar os epítopos para linfócitos T CD4 ⁺ potencialmente promíscuos, que ligam a maioria das moléculas de histocompatibilidade de classe II, a sequência completa da NH36 (Pubmed Databank Protein AAG02281 ) foi inicialmente submetida a análise pelo programa de predição PROPPED (http://crdd.osdd.net/raqhava/propred/) usando um “cut off” de 3%. O PROPRED identificou as sequências de 20-24 aminoácidos mais promíscuas, que ligam a 75- 88% das 51 moléculas humanas mais frequentes HLA DRB1 (Tabela 1 ).

[1 12] Um teste anterior, realizado com o programa TEPITOPE que analisa a ligação a 25 moléculas de HLA DRB1 , havia identificado apenas os epítopos 1 -2014, 2-2014 e 3-2013 (BARBOSA-SANTOS et al., 2017). O programa PROPRED considera a ligação com as 25 moléculas consideradas pelo TEPITOPE e a mais 26 outras moléculas do gene DRB1 apenas.

[1 13] Utilizou-se também o programa do IEDB, inicialmente com 5% percentile rank para identificar na sequência da NH36 os epítopos que ligam aos genes DQA1 VDQB1 * e DPA /DPB1 *. O algoritmo do IEDB confirmou dois epítopos identificados pelo PROPRED e mais 5 novos epítopos. Finalmente, confirmaram-se os resultados prévios, fazendo uma análise dos epítopos identificados para HLA de classe II com o método IEDB recommended 2.22, usando 10% e 20% percentile rank. [1 14] Esta análise fez uma predição da ligação dos epítopos aos 27 alelos mais frequentes de moléculas humanas HLA de classe II, não somente de DRB1 , DQA1/DQB1 e DPA1/DPB1 , mas também de DRB3, DRB4 e DRB5 (Tabela 1).

[1 15] Os peptídeos foram sintetizados pela Genscript e denominados: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 1 1 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NO:10), 15-2018 (SEQ ID NO:1 1 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12), conforme mostra a Tabela 1 . Foram avaliadas as reatividades destes epítopos com anticorpos séricos, na secreção intracelular de citocinas por células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ e na secreção de citocinas nos sobrenadantes de PBMC de pacientes humanos assintomáticos e sintomáticos curados de LV.

[1 16] A predição adicional que usou o programa do IEDB recommended 2.22 para 27 alelos identificou adicionalmente, os epítopos “border line” BL-1 (SEQ ID NO:14) e BL2 (SEQ ID NO:15) (Tabela 1), que foram sintetizados e utilizados junto aos outros no ensaio de interação in vitro com moléculas recombinantes de HLA de Classe II. Finalmente, a sequência dos epítopos 15-2018 e 17-2018, que apresentavam uma alta superposição foram combinadas para formar o novo epítopo 15-17-2018 (SEQ ID NO:13) (Tabela 1) que também foi incluído na análise por imunoinformática.

[1 17] Posteriormente foram preditas, dentro do epítopos para classe II, as sequências que ligam à 27 moléculas de HLA-A e HLA-B da classe I humanas. Foi também feita a análise da cobertura populacional mundial dos epítopos para alelos de HLA de classe II e HLA de classe I. Finalmente, foram também identificados quais dos epítopos para HLA da classe II ligam em alelos de DRB1 e DQA1 considerados associados com suscetibilidade ou resistência a LV humana. Assim, foi feita a tipagem de HLA dos 10 pacientes curados e 10 pacientes DTH+ estudados em Sergipe, no Laboratório HLA-UERJ. [1 18] Finalmente, com todas as informações reunidas foi desenhada uma proteína multiepítopos usando os epítopos geneticamente modificados (sequências artificiais) através da adição de espaçadores de aminoácidos, para ser utilizada em vacinação, tratamento, controle de transfusão e diagnóstico das leishmanioses humanas e animais.

Tabela 1. Predição de epítopos da NH36 para moléculas HLA de Classe II. Sequências dos epítopos contendo os aminoácidos preditos pelos programas PROPRED para moléculas DRB*1 , e IEDB para as moléculas DQA17DQB1 * e DPA17DPB1 *, DRB*1 , DRB*3, DRB*4, DRB*5.

Testes dos epitopos em pacientes humanos de LV

[1 19] Para esta invenção, identificou-se os epitopos preditos da NH36 que podem ligar à moléculas MHC de classe II DR, DB e DQ. Estas moléculas apresentam os antígenos aos linfócitos T CD4+ que estão envolvidos na proteção contra LV, mantendo íntegra a resposta imune celular ao parasita. A LV determina uma perda severa da resposta imune celular à Leishmania. Para guiar a construção de uma composição imunogênica (vacina) multiepítopos preventiva, usou-se então soros e PBMC dos grupos de pacientes que apresentam resitência natural a LV e resposta imune T CD4+ preservada (assintomáticos DTH+) e dos pacientes curados de LV. estas respostas foram comparadas com as de indivíduos controles sadios de área não endêmica.

[120] A antigenicidade dos epítopos foi testada para anticorpos séricos, através de ensaio de ELISA, e as suas capacidades de induzir a produção e secreção de citocinas, através do ensaio de LUMINEX e citometria de fluxo. Amostras de pacientes com LV visceral diagnosticada e o tratados no Hospital Universitário de Sergipe pelo Dr. Roque Pacheco de Almeida foram obtidas. Foram utilizadas amostras de sangue periférico cedidas pelos pacientes curados de Leishmaniose Visceral (n=10), e de familiares dos pacientes que eram assintomáticos mas apresentaram positividade para o teste de Montenegro (DTH+) (n=10) e controles sadios (n=10).

[121] Para a realização desta pesquisa todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), confirmando suas participações. O uso destas células já foi submetido e aprovado pelo comitê de ética do HU/UFS sob o CAAE-0123.0.107.000-1 1 . Os critérios utilizados para a classificação das formas clínicas da LV são descritos abaixo:

[122] Assintomáticos: familiares e contactantes dos pacientes que realizaram o teste de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH+) para antígeno solúvel de leishmania e apresentaram pápula maior ou igual a 5mm na face do antebraço, além disso não apresentam sinais ou sintomas clínicos da LV clássica.

[123] Curados: Indivíduos que concluíram o tratamento da LV e que não apresentaram recidiva num período de 180 dias, na faixa de 12 a 50 anos de idade. Foram excluídos deste estudo pacientes alcoólatras, crianças, co-infecção com HIV, Hepatites e outras patologias de origem infecciosa.

[124] Adicionalmente, para os ensaios sorológicos, amostras controles de área não endêmica obtidas de doadores de sangue sadios do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro foram cedidos. Os soros utilizados mostraram respostas negativas nos testes de HIV, Doença de Chagas, Hepatites B e C, Sífilis, HTLV e Doença de Chagas.

[125] Os “buffy coats" de doadores de sangue soronegativos utilizados para testes de ICS também foram obtidos no Banco de Sangue do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, projeto do Instituto Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro (CAAE 35775014.0.0000.5248), aprovado em 24 de Abril de 2018, com a colaboração da FIOCRUZ, RJ. Os epitopos preditos sintéticos da NH36 são reconhecidos por anticorpos do tipo

IgG, lgG1 , lqG2, lqG3 e lqG4

[126] Os epitopos sintéticos da NH36 foram testados em ensaio de ELISA contra soros de controles sadios de área não endêmica, indivíduos assintomáticos DTH+ e pacientes curados de LV (Figura 1). Foram detectadas diferenças significativas entre as respostas dos controles sadios de área não endêmica e dos indivíduos curados (p <0.0001 ) e DTH+ (p < 0.0001 ). Em geral, as respostas de indivíduos curados foram semelhantes a dos indivíduos DTH+. As maiores absorbâncias de anticorpos IgG foram registradas em resposta aos epitopos 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ) e 2-2014 (SEQ ID NO:2) (Figura 1 ).

[127] A resposta lgG1 também foi forte contra a sequencia 1 -2014 e os epitopos 3-2018 (SEQ ID NO:5) e 5-2018 (SEQ ID NO:6). Entretanto, foi o epítopo 15- 2018 (SEQ ID NO:1 1 ) o predominante na resposta lgG2, seguido do 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8) e 1 -2014. Na resposta lgG3 se sobresaíram os epitopos 3-2018 (SEQ ID NO:5) e 7-2018 (SEQ ID NO:7), seguidos dos demais epitopos de 2018 e da sequencia 2-2014. Finalmente os anticorpos lgG4 estavam mais dirigidos contra os epitopos 3-2014 e 3-2018 seguidos de 7-2018 e 9-2018 (Figura 1).

[128] Adicionalmente, a representação dos resultados da análise por ELISA através do “heatmap” facilitou a distinção gráfica dos epitopos mais potentes e dos tipos de anticorpos em maior concentração que determinaram maiores absorbâncias. Em efeito, na Figura 2 é possível confirmar que as maiores absorbancias foram desenvolvidas pelos anticorpos IgG, seguida de resposta de menor intensidade para as IgG 1 , lgG2 e lgG3. As menores absorbâncias foram detectadas para lgG4.

[129] O heatmap confirma que os epitopos 1 -2014 e 2-2014 são os mais potentes na resposta IgG, sendo que o 1 -2014 também induz forte resposta IgG 1 . Por outro lado, os epitopos 3-2018 e 5-2018 induzem a resposta lgG1 e, junto com o 7- 2018, a lgG3. O predominante na resposta lgG2 foi o epítopo 15-2018 com intensidade semelhante aos epitopos 1 -2014 e 2-2014 para IgG. A resposta lgG4 foi mais potente contra os epitopos 3-2014 e 3-2018 (Figura 2). [130] Os resultados revelam o potencial antigênico dos epítopos da NH36 preditos para o sistema HLA-classe II, no reconhecimento de anticorpos gerados durante a infecção por L.(L.) infantum chagasi. Um dos sintomas da LV é a hipergamaglobulinemia com altos níveis de anticorpos anti-Leishmania circulantes, que porém, não são protetores. Entretanto uma vacina que induza, além de uma resposta celular, uma forte resposta humoral pode trazer o benefício do bloqueio da transmissão pelo inseto vetor em áreas endémicas, conforme descrito para as vacinas TBV contra a Malária (WHO, 1997).

[131] A vacina Leishmune® é por exemplo, uma vacina bloqueadora da transmissão (TBV) e os anticorpos gerados por ela contribuem com a interrupção do ciclo infeccioso na natureza (PALATNIK DE SOUSA et al., 2009, SARAIVA et al., 2006, PALATNIK DE SOUSA et al., 2008). Os níveis elevados de lgG1 anti- Leishmania, estão associados com falência terapêutica ou relapso da doença no calazar pos-dérmico, enquanto que após cura os níveis de lgG1 decrescem (MARLAIS et al. 2018).

[132] Coincidentemente, níveis elevados de anticorpos lgG3 e lgG1 anti- Leishmania (L.) donovani foram descritos nos pacientes com calazar pos-dérmico (SAHA et al., 2005), e considerados marcadores “surrogate” de IL-10 na LV, porque são concomitantes com os elevados níveis de IL-10 (GANGULY et al., 2008) e diminuem com o tempo de cura da leishmaniose tegumentar (FAGUNDES SILVA et al., 2012).

[133] Adicionalmente, ANSARI et al., (2008) descreveram que os anticorpos anti- Leishmania lgG3 e lgG4 estavam significativamente aumentados em crianças com LV enquanto que os níveis de IgG, lgG1 e lgG2 eram comparáveis em casos pediátricos e adultos de LV pos-dérmica. ANAM et al., 1999, definem a lgG3 como a subclasse relacionada como marcador de LV e SAHA et al., (2005) descreveram níveis altos de anticorpos IgG, lgG1 , lgG2, e lgG3 encontrados em pacientes com calazar pos dérmico, mas não com LV da índia (SAHA et al., 2005). [134] Já GOSH et al., (1995) encontraram em pacientes com LV da índia, níveis de anticorpos anti-Leishmania lgG1 > lgG2 > lgG3, e muito pouco lgG4. Adicionalmente, os anticorpos do isótipo lgG3 reagiram com antígenos da faixa de 14 a 34 kDa e persistiram por vários meses após a cura (GOSH et al., 1995).

[135] Em todos estes trabalhos não se detectaram subtipos de anticorpos completamente correlacionados com a cura ou a resistência a LV, o que ressalta a forte imunogenicidade dos epítopos da NH36, que sim são reconhecidos por anticorpos IgG, lgG1 , lgG2, lgG3 e, em menor concentração por anticorpos lgG4 de pacientes curados e assintomáticos (Figura 2).

[136] Neste sentido, vale salientar que a NH36 foi fortemente reconhecida por anticorpos IgG de soros de pacientes de LV e de indivíduos assintomáticos de Bangladesh, enquanto que houve um aumento preferencial de anticorpos IgG, IgG 1 e lgG3 em indivíduos vacinados com uma quimera recombinante que contém a NH36 (COLER et al., 2015). A descrição da diferente afinidade dos epítopos da NH36 por anticorpos de pacientes curados e DTH+ auxiliou no desenho de uma composição imunogênica (vacina) com proteínas multiepítopos com alvo na resposta celular e humoral contra a LV.

Os epítopos preditos sintéticos da NH36 induzem a expressão intracelular de citocinas em linfócitos TCD4+

[137] Para avaliar a produção de citocinas intracelulares pro-inflamatórias em linfócitos TCD4+ e TCD8+ de controles sadios, pacientes curados de LV e indivíduos assintomáticos utilizou-se a técnica de citometria de fluxo multiparamétrica e a análise booleana, que consiste na utilização de diferentes fluorocromos para a detecção de citocinas expressas isoladamente, ou da expressão de duas our três citocinas de forma simultânea.

[138] Principalmente, as chamadas triplo-secretoras ou células T multifuncionais estão relacionadas com a memória imunológica que se deseja conseguir com uma vacina preventiva. Para isso utilizou-se a estratégia de gate conforme pode ser observado na Figura 3. [139] Inicialmente a população de células viáveis foi separada de forma a excluir o excesso de “debris”, bem como de células mortas e dentro dessa população os linfócitos foram selecionados utilizando os parâmetros tamanho por granulosidade (FSC x SSC). A partir dessa população de linfócitos, somente foram selecionados os que eram CD3+ e posteriomente CD3 ⁺ CD4 ⁺ e CD3 ⁺ CD8 ⁺ .

[140] Tendo em vista a avaliação de apenas a população de linfócitos CD3 ⁺ CD4 ⁺ e CD3 ⁺ CD8 ⁺ que tiveram contato com os epítopos, e se tornaram linfócitos efetores e de memória, para refletir uma melhor resposta aos antígenos estudados, a população de linfócitos virgens foi excluída (CCR7 ⁺ CD45 ⁺ ). Dessa forma os linfócitos incluidos na análise são células efetoras (CD45+CCR7-) e /ou de memória (CD45- CCR7+), que foram aqueles que tiveram contato com os antígenos e estão aptos para combater a infecção.

[141] Por fim, analisou-se neles a produção das citocinas IL-2, TNF-α, IFN- Y, e em seguida foi realizada a análise booleana para a detectar a produção simultânea de duas citocinas (IL-2+TNF-α+, IL-2+IFN-Y+ e TNF-O+IFN-Y+) OU de três citocinas, nos linfócitos triplo-secretores ou multifuncionais (IL-2+TNF-α+IFN-Y+) pela população de efetores e de memória.

[142] O percentual de linfócitos TCD3+ estimulados com os epítopos da NH36 (1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 1 1 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NO:10), 15- 2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12), bem como com o antígeno solúvel de Leishmania donovani (SLA) é semelhante nos grupos controle sadio, pacientes curados de LV (D180) e assintomáticos (DTH+). Eles apresentam frequências médias de 70%, sendo que nos pacientes curados (D180) há um discreto aumento (Figura 4 A).

[143] Dentro dessa população de linfócitos T CD3+, o percentual de linfócitos TCD3 ⁺ TCD4 ⁺ é em média 50% (Figura 4 B) e os linfócitos CD3 ⁺ CD8 ⁺ (Figura 4 C) aproximadamente 40%, neste último caso, com discreto aumento nos indivíduos curados. [144] Não existindo diferença no percentual de linfócitos entre os controles sadios, pacientes curados de LV e de indivíduos assintomáticos, realizou-se a avaliação à resposta imunológica através da análise da produção de citocinas intracelulares, após estímulo com os epítopos da NH36.

[145] Com relação à produção intracelular de uma única citocina (Figura 5) vale salientar que as frequências de linfócitos T CD4+ produtores de IL-2, TNF-α ou IFN-y eram predominantemente mais elevadas nos indivíduos DTH+, do que nos curados, e mais altas nestes do que nos controles, com exceção do epítopo 9-2018, que aumentou mais as proporções de linfócitos TCD4+TNF-α+ nos controles (Figura 5B). Também é importante destacar que os todos os epítopos são mais potentes que o antígeno solúvel SLA no aumento de proporções de linfócitos TCD4+ produtores de IL-2 ou IFN-y (Figura 5 A e 5 C). Destacaram-se os epítopos 3, 9 e 11 -2018 no aumento de frequências de linfócitos TCD4+IL-2+ (Figura 5 A); os epítopos 1 , 7 e 13 -2018 para as frequências de células TCD4+-TNF-α (Figura 5 B), e os epítopos 5, 7, 9 e 17-2018 para as proporções de células TCD4+IFN-Y (Figura 5 C).

[146] Adicionalmente, os controles sadios apresentaram frequências maiores de células T CD4+ duplo-produtoras de IL-2 e TNF-α, do que os indivíduos curados ou DTH (Figura 6 A). Isto foi mais notório no caso do epítopo 9-2018 que já mostrara induzir aumentos nos controles nas frequências de células TCD4+ produtoras de TNF-α sozinho. Em contraste, os linfócitos TCD4+ produtores de TNF- a e IFN-y tiveram as suas frequências aumentadas nos indivíduos DTH+, principalmente em resposta aos epítopos 1 -2014 e 5, 7, 9 e 11 -2018 (Figura 6 B).

[147] Unicamente o antígeno SLA elevou estas proporções em pacientes curados. Por último, as frequências dos linfócitos TCD4+ produtores de IL-2 e IFN-y também estavam aumentadas nos indivíduos DTH+, principalmente em resposta aos epítopos 2-014 e de 3 a 17-2018 (Figura 6 C). [148] Finalmente, foi possível detectar aumentos de frequências de linfócitos TCD4+ triplo secretores ou multifuncionais, principalmente nos indivíduos DTH+, promovidos pela maioria dos epítopos, com destaque para os epítopos 9 e 11 - 2018 seguidos das sequências 1 -2014, e 3, 5, 7 e 15 de 2018. A resposta ao antígeno SLA é maior em indivíduos curados (Figura 7), assim como detectado em linfócitos secretores de TNF-α+ e IFN-y+ (Figura 6 B).

[149] Adicionalmente, foi gerado um “heatmap” baseado nos valores das médias das frequências do linfócitos TCD4+ secretores de citocinas (Figura 8) para auxiliar na identificação dos epítopos mais potentes. Utilizamos neste caso um gráfico normalizado por colunas para facilitar a visualização dos epítopos mais potentes, mesmo para o caso de subtipos celulares que aparecem com menor frequência, como por exemplo os triplo-secretores e multifuncionais. As conclusões estão sumarizadas na Tabela 2.

[150] Concluiu-se então que, apesar de que vários epítopos mostraram grande potencial, foram os epítopos 9, 11 , 15 e 3-2018 os que conseguiram elevar a frequência de células multifuncionais provavelmente relacionadas com a memória imunológica ao antígeno NH36 (Figura 8 e Tabela 2).

Tabela 2. Epítopos mais potentes no aumento das frequências de linfócitos T CD4 secretores de citocinas.

Os epítopos preditos sintéticos da NH36 para linfócitos TCD4+ induzem também a expressão intracelular de citocinas em linfócitos TCD8+

[151] Adicionalmente, a resposta de linfócitos TCD3+CD8+ foi estudada após incubação com os epítopos preditos para linfócitos T CD4+ sintéticos da NH36. Com respeito a produção intracelular de uma única citocina, observou-se que as frequências de linfócitos T CD8+ produtores de IL-2 ou IFN-y eram, assim como detectado para células TCD4+, predominantemente mais elevadas nos indivíduos DTH+, do que nos curados e controles. As proporções de células T CD8+ produtoras de IL-2 estavam aumentadas em resposta aos epítopos 9, 1 1 e 17-2018, seguidos de 2-2014, e de 3 e 15-2018 (Figura 9 A). No caso da produção de TNF-α, se destacaram os epítopos 9 e 1 1 que aumentaram em 84% e 60 %, respectivamente, as proporções de células TCD8+TNF-α+ em indivíduos DTH+ (Figura 9 B). Entretanto, os controles também respondiam com baixas frequências contra a maioria dos epítopos. Finalmente as frequências de linfócitos TCD8+IFN-Y+ foram mais pronunciadas em resposta ao epítopos 7, 9 e 17 -2018, seguidas dos epítopos 1 -2014, 3, 5 e 1 1 -2018 (Figura 9 C).

[152] Após, a produção simultânea de duas citocinas nos linfócitos TCD8+ foi estudada (Figura 10). A secreção conjunta de IL-2 e TNF-α, foi maior em pacientes curados e DTH+, com exceção do epítopos 7, 9 e 13-2018 nos quais as frequências dos controles estavam aumentadas (Figura 10 A). Os epítopos mais potentes foram o 3-2014 e 9-2018. Em contraste, os linfócitos TCD8+ produtores de TNF-α e IFN-y (Figura 10 B), e de IL-2 e IFN-y (Figura 10 C) tiveram as suas frequências aumentadas nos indivíduos DTH+, principalmente em resposta aos epítopos 9 e 1 1 - 2018, em células produtoras de TNF-α e IFN-y (Figura 10 B), e aos epítopos 5, 9, 15 e 17-2018, em células produtoras de IL-2 e IFN-y (Figura 10 C).

[153] Finalmente, e assim como foi descrito para os linfócitos T CD4+ (Figura 7), foi possível detectar aumentos de frequências de linfócitos TCD8+ triplo secretores ou multifuncionais, principalmente nos indivíduos DTH+, promovidos pela maioria dos epítopos, com destaque para os epítopos 9 e 11 -2018 seguidos das sequências 1 - 2014, e 3, 7 e 15 de 2018 (Figura 11).

[154] A resposta ao antígeno SLA foi, assim como descrito para linfócitos T CD4+ multifuncionais (Figura 7), maior nos indivíduos curados, tanto nas células CD8+ multifuncionais (Figura 11) como nos linfócitos TCD8+ secretores de IL-2 (Figura 9 A), de IL-2 e TNF-α+ (Figura 10 A) e TNF-α+ e IFN-y+ (Figura 10 B). [155] Confirmando a potência imunogênica dos epítopos vale salientar que o controle de SLA sempre funcionou induzindo respostas menores ou semelhantes aos epítopos, salvo nas células TCD4+ e CD8+ duplo-produtoras de TNF-α e IFN-y, nas que induziu resposta maior que os epítopos, em indivíduos curados.

[156] Foi gerado também um “heatmap” (Figura 12) baseado nos valores das médias das frequências do linfócitos TCD8+ secretores de citocinas (Figura 9-11) para auxiliar na identificação dos epítopos. Utilizamos também para os linfócitos TCD8+ secretores, assim como realizamos para linfócitos TCD4+ (Figura 8), um gráfico normalizado por colunas (Figura 12). As conclusões estão sumarizadas na Tabela 3.

[157] Concluiu-se então que, apesar de vários epítopos mostrarem grande potencial, foram os epítopos 9, 11 , 15 os que conseguiram elevar a frequência de células multifuncionais TCD8+ provavelmente relacionadas com a memória imunológica ao antígeno NH36.

Tabela 3. Epítopos mais potentes para o aumento das frequências de linfócitos T CD8 secretores

Os epítopos preditos sintéticos da NH36 induzem a secreção de citocinas por PBMC

[158] Foi observado que o grupo DTH+ foi o que obteve melhor resposta para a produção de linfócitos T multifuncionais. Então avaliou-se a secreção de citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias e regulatórias nos sobrenadantes de PBMC estimulados com os epítopos da NH36 do grupo de indivíduos DTH+.

[159] Para tal fim, o sobrenadante da cultura do PBMC foi coletado 72 horas e os níveis das citocinas IL-2, TNF-α, IFN-y, IL-12p70, IL-1 β, IL-4, IL-6, TGF-p, IL-22, IL-10 foram dosados utilizando o sistema Luminex. Vale salientar que como controle basal células de cada indivíduo DTH+ foram utilizadas, sem estímulo, como parâmetro de comparação. Os resultados estão sumarizados na Figura 13.

[160] No que diz respeito à indução de resposta pró-inflamatória, foi possível observar que os epítopos da NH36 induzem um aumento significativo da produção da citocina IL-113 em resposta ao no epítopo 1 1 -2018, bem como aos epítopos 13-2018, 9-2018, 2-2104 e 1 -2018, com níveis maiores do que àqueles observados no controle basal (33 pg/ml) e no antígeno SLA (108 pg/ml) (Figura 13). Também foi observado um aumento de secreção de TNF-α em resposta ao epítopo 9-2018 (265 pg/ml) quando comparado com o controle basal (136 pg/ml) (Figura 13). Quanto à produção de IL-12p70, houve discreto aumento na produção dessa citocina em resposta ao epítopo 3-2014 (1 ,3 pg/ml) quando comparado com os demais epítopos e com o controle basal (0.5pg/ml) (Figura 13). Finalmente, a produção das citocinas IFN-y e IL-2 foi observada somente no estímulo com o antígeno SLA. Apenas o epítopo 3- 2014 promoveu aumentos na secreção de IFN-y e IL-2, porém a níveis similares ao controle basal (Figura 13).

[161] A secreção da citocina anti-inflamatória IL-6 foi mais elevada em resposta ao epítopo 11 -2018 (1600 pg/ml), enquanto que os controles secretaram aproximadamente 400 pg/ml (Figura 13). Adicionalmente, houve também um aumento da produção de TGF-[3 para os epítopos 1 -2014, 2-2014 e 13-2018 (49 a 61 pg/ml), o dobro dos valores encontrados para SLA e para o controle basal (aproximadamente 20 pg/ml) (Figura 13).

[162] Por outro lado, a produção de IL-10 observada apenas com estímulo com SLA e no grupo controle basal, enquanto que IL-22, foi apenas secretada pelo antígeno SLA. Não houve produção da citocina IL-4 em resposta aos epítopos da NH36 (Figura 13).

[163] Em conclusão, no que tange à resposta pro-inflamatória se destacam o epítopo 9 na secreção de TNF-α, e o epítopo 11 junto com os 9, 7, 1 , 3, 13 e 15 de 2018 e 2, 3 de 2014 na secreção de IL1 β. Além de IL1 β, o epítopo 11 de 2018 também promove a produção de IL-6. Adicionalmente, o epítopo 13 de 2018, junto ao 1 e 2 de 2014 promovem a produção de TGF-[3. [164] A Nucleosídeo hidrolase (NH36) é um importante marcador filogenético do gênero Leishmania que apresenta domínios altamente conservados entre as diferentes espécies (NICO et al., 2017). Estudos in vivo em modelo murino utilizando a imunização com a proteína NH36 recombinante e suas frações peptídicas sugerem uma associação com uma resposta imune protetora na LV (AGUILAR-BE et al., 2005; GAMBOA-LEÒN et al., 2006; NICO et al., 2017; NICO et al., 2018) e uma resposta imune preventiva cruzada contra a infecção por Leishmania (L.) amazonensis (NICO et al., 2014, ALVES-SILVA et al., 2019) e por Leishmania (V.) braziliensis (ALVES- SILVA et al., 2019).

[165] Em estudo prévio desse grupo de pesquisa, SANTOS et al. (2017) descreveram em pacientes brasileiros infectados com L. (L.) infantum chagasi, como marcadores de resistência natural a LV, o domínio F2 induziu os níveis maiores de IFN-y, IL-1 p e TNF-α e, junto com o F1 , a mais forte secreção de IL-17, IL-6 e IL-10 em indivíduos DTH+ e curados (SANTOS et al., 2017). O F2 também promoveu as maiores frequências de células T CD4 ⁺ IL-2 ⁺ , CD4 ⁺ IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ , CD4 ⁺ IL-2 ⁺ IFN-y ⁺ e CD4 ⁺ IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ em indivíduos curados e assintomáticos.

[166] Em contraposição, os domínios F1 e F3 aumentaram as frequências de células CD8 ⁺ IL-2 ⁺ , CD8 ⁺ IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ e CD8 ⁺ IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ IFN-y ⁺ de pacientes com LV ativa. Nesse estudo, Santos et al. concluíram que a cura e resistência a LV estão relacionadas com uma resposta CD4+-TM e Th-17 aos domínios F2 e F1 e a LV ativa está associada com respostas T CD8+ contra os domínios F3 e F1 , provavelmente envolvidas no controle da infecção inicial.

[167] Utilizando os epítopos preditos pelo programa TEPITOPE, que liga a 25 moléculas em HLA-DR, e SYFPEITH HLA-A e HLA-B, PBMC, os indivíduos DTH+ secretaram mais IFN-y em reposta aos epítopos sintéticos 2-2014 e 3-2014 do domínio F2 seguido do epítopo 1 -2014 localizado no domínio F1 [26].

[168] Na presente invenção, utilizamos os epítopos 1 , 2 e 3-2014, mas também incluímos no estudo, os epítopos sintéticos 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17-2018, preditos pelos Programas Propred e os algoritmos do IEDB que incluem 50 haplótipos de moléculas MHC de classe II DR, DP e DQ. [169] Nesta invenção, portanto, utilizou-se um número maior de epítopos que representam toda a sequência da NH36 e que puderam ser considerados mais promíscuos.

[170] Os epítopos da NH36 induziram um fenótipo protetor do tipo Th1 mediado pela produção das citocinas isoladas IL-2, que está relacionada com proliferação celular, bem como TNF-α e IFN-y, que estão envolvidas no controle da infecção por Leishmania, além de estarem relacionados com a capacidade de gerar memória imunológica através do desenvolvimento de linfócitos TCD4+ e TCD8+ de memória efetora e memória central.

[171] Resultados semelhantes foram observados por CARRILLO et al., (2017) onde o domínio F1 da proteína NH36 sugeriu o desenvolvimento de uma resposta protetora do tipo Th1 mediante a secreção de citocinas pró-inflamatórias em PBMCs de pacientes curados de LV e em indivíduos assintomáticos. Assim mesmo Santos et al, descreveram uma resposta robusta de IL-2 e TNF-α gerada pelos domínios da NH36.

[172] De acordo com SEDER (2008), embora a IL-2 tenha pouca função efetora, ela promove a expansão das células T de maneira autócrina ou parácrina, o que poderia aprimorar a função de memória de células T CD8+, bem como para amplificar as respostas das células T multifuncionais.

[173] No presente estudo, tanto os PBMCs de indivíduos assintomáticos quanto os pacientes curados (D180) produziram um elevado percentual de citocinas pró-inflamatórias quando estimulados com os epítopos da NH36, o que indica que o contato prévio com parasito potencializa o desenvolvimento de uma resposta protetora.

[174] Demonstrou-se nesse estudo que os epítopos da NH36: 3-2018, 9- 2018, 1 1 -2018 e 15-2018 foram os mais imunogênicos na análise multiparamétrica de ICS, pois induziram uma potente resposta de linfócitos TCD4+ multifuncionais CD3 ⁺ CD4 ⁺ IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ IFN-Y, principalmente em indivíduos assintomáticos, seguido pelo grupo de pacientes curados de LV. [175] Adicionalmente, os epítopos 9-2018, 11-2018 e 15-2018 também aumentaram a resposta de linfócitos TCD8+ multifuncionais CD3 ⁺ CD8 ⁺ IL-2 ⁺ TNF- a ⁺ IFN-y em pacientes DTH+ e curados.

[176] Vale salientar que o percentual desses linfócitos foi duas vezes maior que os valores encontrados por BARBOSA SANTOS et al., (2017) ao utilizar os domínios da NH36 como antígenos. Com isto, comprovou-se que a identificação e utilização dos epítopos mais imunogênicos potencializa a resposta acima da gerada pela proteína total ou seus domínios (PALATNIK de SOUSA, SOARES & ROSA, 2018, DE GROOT et al., 2002, SEYED et al., 2016).

[177] Isso pode ser explicado pelo fato de os epítopos possuírem sequências menores de aminoácidos que são, porém, as mais restritas ao receptor HLA de classe II, gerando assim uma resposta mais potente. Este efeito já foi confirmado com a vacina NH36 em camundongos (NICO et al, 2010, 2014; Alves-Silva et al. 2017, 2019; PALATNIK de SOUSA, 2019). Assim, os epítopos 3, 9, 1 1 e 15-2018 devem ser incluídos numa vacina sintética que vise a indução de uma resposta imune celular Th1 e TCD8. De acordo com OYARZUN & KOBE (2016), à versatilidade para arranjar geneticamente grandes combinações de epítopos de células B e T capazes permite induzir robustas respostas imunes humorais e celulares.

[178] Foi observado inicialmente uma elevada produção TNF-α e /ou TNF-α e IL-2 em alguns controles sadios. Isto não era esperado em controles sadios de área não endêmica com teste sorológico de doença de Chagas negativo. Essas elevadas frequências de linfócitos TCD4+ e TCD8 que produzem TNF-α e TNF-α e IL-2 foram detectadas principalmente em resposta ao epítopo 9-2018, que foi um dos mais potentes na indução de células multifuncionais em pacientes curados e DTH+.

[179] É possível que o epítopo 9 detenha uma capacidade extremadamente forte de indução de TNF-α sozinho e /ou TNF-α e IL-2 e assim observemos esta manifestação nos controles. Este resultado pode ser justificado pela alta qualidade dos antígenos, com capacidade para induzir TNF-α nesse grupo. [180] Também é possível que os alelos de MHC classe II DR, DQ, ou DP e HLA de alguns dos indivíduos controles sadios tenham uma maior afinidade pelo epítopo 9 determinando esta resposta em indivíduos que não tiveram contato com o parasita. A amostra de indivíduos utilizada neste estudo é relativamente pequena e eles não foram ainda tipados para HLA.

Afinidade dos epítopos da NH36 por moléculas HLA DR, DQ e DP in silico e in vitro

[181] A predição da afinidade dos epítopos da NH36 pelas 27 moléculas humanas mais frequentes dos genes DRB*1 , DRB*3, DRB*4, DRB*5, DQA*1/DQB*1 e DPA*1/DPB*1 está sumarizada na Figura 14. Numa análise mais restrita (< 10% percentil rank), os epítopos 15-17-2018, 1 1 -2018 e 17-2018 são os que se ligam a um número maior de moléculas e são, portanto, considerados como os mais promíscuos. A análise mais ampla (< 20 % percentil rank) confirma estes epítopos e incorpora também as sequências 2-2014, 5-2018, 9-2018 e 15-2018 (Figura 14).

[182] Além da predição por imunoinformática (Figura 14), afinidade dos epítopos da NH36 por receptores MHC foi estudada in vitro, com base na sua capacidade de inibir a ligação de uma sonda peptídica radiativa, a moléculas MHC purificadas (Sidney et al. , 2013. Curr Protoc Immunol. 2013 Chapter 18 :U n it 18.3. doi: 10.1002/0471142735. im1803s100). Incluímos nesta análise os epítopos 1 , 2 e 3 de 2014; 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15 e 17 de 2018 e dois epítopos adicionais “Border Line” (BL1 e BL2), que não foram incluídos nos ensaios imunológicos anteriores.

[183] A Figura 15 representa os valores IC50 ηM desenvolvidos pelos epítopos quando se ligam a 27 moléculas diferentes de HLA Classe II DPA1 / DPB1 , DQA1 / DQB1 e DRB1 , DRB3, DRB4 e DRB5. As concentrações de IC50 < a 1000 M, representadas em negrita, indicam as afinidades mais altas de um epítopo para cada receptor HLA. Os signos negativos indicam valores IC50>30000 ηM (Figura 15).

[184] É importante notar que a maioria dos epítopos são promíscuos e se ligam a, pelo menos, sete (25%) das 27 moléculas de HLA classe II testadas (Figura 15). Apenas o alelo DRB1 * 12: 01 não se ligou a nenhum epítopo. [185] Em contraste, 5 epítopos (11 -2018, 1 -2014, 5-2018, 13-2018 e BL1 ) ligam-se a 13 (48% dos alelos) e 1 epitopo (2-2014) se liga à 17 moléculas HLA (63%). Segundo essa abordagem, os epitopos 17-2018 e 15-2018, que se ligam apenas a 2 e 5 alelos, respectivamente, poderiam ser excluídos da vacina, por não serem promíscuos.

[186] A tabela 4 mostra a soma das frequências de todas as células T CD4+ e CD8+ secretoras de citocinas e as frequências das células multifuncionais triple— secretoras em resposta aos epítopos. As maiores frequências de todos os tipos celulares foram observadas em resposta ao epítopo 1 1 -2018, seguido do 9-2018. O epítopo 1 1 -2018 seria, portanto, não somente mais promíscuo (Figura 14 e 15) se não também, mais imunogênico (Tabela 4).

Tabela 4. Número de alelos HLA de classe II aos que ligam os epítopos da NH36, soma das frequências de todas as células T CD4 e CD8 secretoras de citocinas e das triplo secretoras de IL-2TNF-olFN-y, em resposta aos epítopos

[187] Na Tabela 5 é possível comparar o número de alelos preditos para a ligação de cada epítopo, com 10 % e 20 % de percentil rank, e o número de alelos efetivamente ligados in vitro. Existem semelhanças entre os resultados da predição e do ensaio in vitro para os epítopos 1 1 -2018, 2-2014, 5-2018, 13-2018 e BL1 , que são os mais promíscuos. Por outro lado, os epítopos 15-2018 e 17-2018, apesar de terem sido preditos como ligadores de 1 1 e 21 alelos, ligaram efetivamente a apenas 5 e 2 alelos, respectivamente. Este resultado pode estar baseado na alta hidrofobicidade destes epítopos, que poderia interferir com a sua capacidade de ligação in vitro. Tabela 5. Predição da ligação de alelos por imunoinformática e alelos ligados in vitro

[188] Por outro lado, o epítopo 17-2018 poderia ser considerado não essencial, uma vez que se liga ao alelo DQA1 * 05: 01 / DQB1 * 02: 01 , ao qual também se ligam outros 10 epítopos (9-2018, 1 1 -2018, 15 -2018, 2-2014,1 -2018, 5- 2018, 13-2018, 7-2018, BL1 e BL2), e ao alelo DRB3 * 01 : 01 , ao qual também, outros 4 epítopos se ligam (1 1 -2018, 2-2014, 13-2018, BL1 ) (Figura 15). Portanto, nada seria perdido ao excluir o epítopo 17-2018. No entanto, a análise da resposta imune de PBMC humanos previamente estudados revelou que, ambos os epítopos 15-2018 e 17-2018 aumentaram as frequências totais de células T CD8 secretoras de citocinas, e o epítopo 15-2018, foi um dos quatro mais potentes no aumento de CD4 + e frequências de células T multifuncionais CD8 + (Tabela 4).

[189] É importante considerar, no entanto, que as sequências dos epítopos 15-2018 e 17-2018 se sobrepõem em 16 aminoácidos. Desta forma, é possível desenhar um novo epítopo estendendo a sequência do epítopo 15-2018 para incluir também os quatro últimos aminoácidos do epítopo 17-2018 (RIGD). Isso não aumentará a cobertura, mas poderá aumentar a redundância da cobertura, o que pode ser importante se ocorrer algum escape. Assim, na composição imunogênica (vacina) com proteínas multiepítopos, os epítopos 15-2018 e 17-2018 serão substituídos por um novo epítopo denominado 15-17-2018, que é composto pela sequência QVAVKLDFDKFWCLVIDALKRIGD (Tabela 1 ). Seleção dos epítopos de acordo com sua cobertura de moléculas HLA de classe

[190] Na Figura 15 é possível observar que o epítopo 13-2018 é o único que se liga ao alelo DRB1 *03:01 e, junto com BL1 , são os únicos dois que se ligam ao alelo DRB3*02:02. Assim, ambos os epítopos 13-2018 e BL1 , que se ligam a 13 alelos, também são essenciais na composição imunogênica (vacina). Na verdade, 6 alelos se ligam a 3 epítopos simultaneamente, 7 alelos a 4 epítopos, 2 alelos a 5 epítopos, 1 alelo a 7 epítopos, 2 alelos a 9 epítopos, 1 alelo a 10 epítopos, 1 a 1 1 epítopos e 1 alelo a 13 epítopos.

[191] Com relação às suas atividades antigênicas, os epítopos 9-2018, 1 1 - 2018, 7-2018, 5-2018 e 3-2018, em ordem decrescente, induziram as maiores somas de frequências de células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ secretoras de citocinas (Tabela 4). Em concordância, os epítopos 9-2018 e 1 1 -2018, seguidos por 15-2018 e 3-2018, e em menor grau, por 1 -2014, 5-2018 e 7-2018 (Tabela 4), em ordem decrescente, foram os promotores mais potentes das frequências de células T multifuncionais CD4 ⁺ e CD8 ⁺ (Tabela 4).

[192] Outro critério para estimar os melhores epítopos candidatos é a cobertura potencial da população, isto é, sua capacidade de se ligar a uma ampla gama de alelos de moléculas HLA de classe II. Na Figura 15, as colunas com dois alelos mostram as cadeias alfa e beta para moléculas DQ e DP, porque para DQ e DP a cadeia alfa é polimórfica. Em contraste, DRA é amplamente monomórfica (cerca de 98% DRA1 *01 :01 ) e esta variante não influencia a ligação. Por isso é comum ignorar a anotação da DRA e apenas anotar a variante da cadeia beta a respeito de DR (DRB).

[193] Para DQ, a cadeia alfa definitivamente pode afetar a especificidade de ligação, por isso é importante a sua anotação. Ou seja, DQA1 *0301 /DQB1 *0301 tem uma especificidade diferente de DQA1 *0501 /DQB1 *0301 . Ao mesmo tempo, a ligação DQA e DQB é bastante estreita, então você geralmente pode inferir qual será a cadeia alfa se conhecer o DQB, com algumas exceções (como DQB1 * 0301 ). [194] Para os receptores DP, por outro lado, a cadeia alfa ajuda a formar o sulco de ligação, mas não é muito polimórfica e não tem muito efeito na especificidade de ligação. Na verdade, do ponto de vista de ligação do peptídeo, não é possível dizer a diferença entre, por exemplo, DPA1 *0103/ DPB1 *0402 e DPA1 *0301/ DPB1 *0402. No entanto, como o polimorfismo pode afetar o reconhecimento do TCR, o DPA geralmente também é anotado. Por exemplo, a correlação entre DPA1 *0103/DPB1 *0402 e DPA1 *0301 /DPB1 *0402 para uma proteína hipotética é de 0,99, tanto para IC50 nM quanto para o rank, sugerindo que não há impacto na variação de DPA.

[195] Com relação às moléculas DP, o DPB1 *04:01 e DPB1 *04:02 são os dois alelos mais prevalentes em todas as populações do mundo e em todos os principais grupos étnicos e geográficos (AFND; www.allelefrequencies.net; Requena et al. 2020, Front. Immunol.1 1 , 2008, doi: 10.3389 / fimmu.2020.02008). Para algumas populações, 0401 é o mais prevalente, enquanto para outras, 0402 é o mais frequente. Um deles ou outro estão presentes em mais de 60% da população humana. Ambos correm cerca de 35-40%, em média, na população em geral, quase o dobro do próximo DP mais comum. Em comparação, o DR mais comum terá uma frequência média de cerca de 20%. No entanto, embora a cobertura populacional desses alelos DP seja prevista para ser muito alta, é importante notar que a expressão de DP na superfície celular é considerada um pouco mais baixa do que a de DQ e DR. Talvez por esta razão, DP está em geral associado a menos epítopos de células T restritos a HLA definidos do que DQ e DR.

[196] Os epítopos 3-2018, 11 -2018 e 15-2018, que são fortemente antigênicos se ligam a DPA1 *01 :03/DPB1 *04:01 (Figura 15), indicando que uma vacina que contenha esses epítopos poderia ser usada em todo o mundo, não somente por ligar em DPB1 *04:01 , se não por ligar também em DPA1 *01 :03, que é o alelo de DPA mais frequente em todo o mundo, e é prevalente em 71 ,70% da população brasileira (Requena et al. 2020, Front. Immunol.1 1 , 2008, doi: 10.3389/ fimmu.2020.02008). Coincidentemente DPA1 *01 :03, está presente exatamente em 7/10 pacientes analisados (3 curados e 4 DTH+) (Figura 20). [197] Adicionalmente, DPA1 *01 :03 e está combinado com DPB1 *04:01 , em cinco deles e com DPB1 *04:02 em 2 deles, coincidindo com a descrição da de que desses dois alelos estão presentes em 60% da população humana.

[198] Por outro lado, o alelo DPB1 *04:02, ao qual os epítopos 3-2018, 1 1 - 2018 e 2-2014 também se ligam (Figura 14), foi recentemente descrito como prevalente em 64,98% da população brasileira (Requena et al., 2020). Portanto, uma vacina contendo esses epítopos poderia gerar alta eficácia. No entanto, a ligação a apenas esses alelos altamente prevalentes podem não ser interessante, uma vez que a promiscuidade também é importante e otimiza a eficácia da vacina.

[199] Em contrapartida, com relação ao DR, o alelo DRB1 *03:01 , liga-se apenas ao epítopo 13-2018, e está presente em 6,49% da população brasileira. Por outro lado, o alelo DRB1 *07:01 , que se liga aos epítopos 3-2018, 9-2018, 1 -2014, 2- 2014, 5-2018, 13-2018 e BL1 , está presente em 9,58%; e o alelo DRB1 *11 :01 , que se liga a 3-2018, 1 -2014, 5-2018, em 5,91 % da população brasileira (Requena et al. 2020, Front. Immunol.1 1 , 2008, doi: 10.3389/ fimmu.2020.02008) (Figura 15). Os resultados revelaram para os epítopos da NH36 um perfil interessante de cobertura dos alelos de moléculas HLA classe II.

Identificação de sequências liqadoras de moléculas HLA de classe I dentro do epítopos para classe da NH36.

[200] No ensaio biológico de ICS foi evidenciado que os epítopos da NH36, apesar de terem sido preditos como ligadores de moléculas MHC de classe II, também podem ser ligadores de moléculas MHC de classe I. Em efeito, eles aumentaram as frequências de linfócitos T CD8+ que expressam citocinas (Figura 9-12). Para confirmar esta hipótese, submeteu-se as sequências dos epítopos para MHC Classe II da NH36 à análise pelo programa “MHC Class I Binding predictions” do IEDB Database, usando como base o programa NetMHCpan EL 4.1 (Figura 16). Quantificou-se a presença das possíveis sequências ligadoras de moléculas de HLA- A e HLA-B. [201] Foram obtidos: 1 ) o número predito de sequências ligadoras em cada epítopo, 2) o número de alelos associados com essas sequências e 3) o número de sequências ligadoras promíscuas dentro de cada epítopo (Figura 16). Adicionalmente, a Figura 16, mostra a predição de, com quais dos 27 alelos estudados (16 alelos de HLA-A* e 11 alelos de HLA-B*) essas sequências ligadoras podem se associar. É notória a predominância dos epítopos 11 -2018 e 13-2018 nesses 3 parâmetros, seguidos do 15-17-2018, BL2 e 5-2018.

Análise de promiscuidade e cobertura populacional

[202] Finalmente, foi feita a análise da cobertura populacional mundial dos epítopos para alelos de HLA de classe I e de classe II (Figura 17). Esta figura sumariza a cobertura populacional para alelos dos loci de classe I A e B para a população mundial, dada por cada epítopo estudado. Observou-se que 1 1 dos 15 epítopos estudados apresentam a capacidade de se ligar a mais do que 50% dos alelos de classe I da população mundial (Figura 17).

[203] Os epítopos 11 -2018 e 13-2018, são os de maior cobertura para moléculas de classe I, e junto com os epítopos 2-2014, 5-2018, 7-2018 e BL1 , os de maior cobertura para moléculas de classe II (Figura 17). Em efeito, a cobertura populacional mundial do epítopo 11 -2018 é 93,9 % e 92,7 % para classe I e classe II, respectivamente (Figura 17). A do epítopo 13-2018 é 77,8 % e 85,9 % para classe I e classe II, respectivamente (Figura 17). As curvas da cobertura populacional mundial dos epítopos para Classe I e Classe II estão representadas nas Figuras 18 e 19, respectivamente.

[204] Abaixo das curvas, uma tabela menor mostra a cobertura para o grupo inteiro de 15 epítopos. Os epítopos individuais tem uma ampla margem de eficácia, com coberturas para os loci de Classe I que oscilam entre 7,8 e 93,9% (Figura 17). Como um todo, o painel inteiro fornece cobertura para >98% dos indivíduos (Figura 18), com uma média individual que reconhece aproximadamente 11 combinações de epítopos/moléculas HLA diferentes. [205] Este número é, porém, subestimado, uma vez que epítopos múltiplos de Classe I preditos para o mesmo alelo dentro de um mesmo epítopo para CD4 não são quantificados. De fato, cada alelo é somente quantificado uma vez.

[206] O epítopo 1 1 , por exemplo, tem uma cobertura populacional para Classe I de 93,9% (Figura 17). Isso significa que é esperado que 93,9% dos indivíduos tenham pelo menos um alelo de Classe I predito para ligar numa sequência incluída no epítopo 1 1. Porém, a predição para a ligação de moléculas MHC, não necessariamente significa a capacidade de induzir uma resposta de células T. Além da sua cobertura populacional impressionante, é também possível que outros alelos possam ligar em outras sequencia contidas no epítopo 1 1 .

[207] Este resultado é muito bom, uma vez que o painel não apenas fornece coletivamente uma cobertura ampla, ou seja, que os epítopos todos ligam uma alta porcentagem de indivíduos, mas também fornece uma cobertura "profunda" (Figura 17). Por profundidade entende-se que não apenas o indivíduo é coberto, mas que ele é coberto por epítopos múltiplos diferentes. Isso é importante nos casos em que, por exemplo, um epítopo dominante para A*02: 01 sofre uma mutação que provoca que o patógeno agora possa evitar a resposta imune. Se houver uma cobertura profunda, a probabilidade de evitar a detecção e a resposta imune é minimizada, pois é improvável que vários epítopos que ligam ao alelo A*02:01 , por exemplo, sofram ao mesmo tempo uma mutação semelhante.

[208] Na Figura 18 observa-se a curva de cobertura populacional para Classe I. Cada indivíduo em uma população reconhecerá um certo número de epítopos aninhados em um epítopo para CD4 da NH36. Por exemplo, alguém que é A * 02: 01 , A * 03: 01 , B * 07: 02 e B * 40: 01 pode reconhecer 4, 2, 1 e 5 epítopos restritos a essos alelos, respectivamente; no geral, eles reconheceriam 12 combinações diferentes de HLA / epítopo (4 para A * 02: 01 , 2 para A * 03: 01 etc.). O gráfico de barras mostra o número de combinações "reconhecidas" por diferentes frações da população. Aqui, um pouco mais de 5% dos indivíduos (eixo y 1 ) reconhecerão 6 combinações (eixo x, barras), 7,5% reconhecerá 14, e cerca de 2,5% reconhecerá 20, etc. [209] Cumulativamente, adicionando da direita para a esquerda, em 90% dos indivíduos, espera-se que pelo menos 3,19 epítopos serão reconhecidos (PCgo, Figura 18). Da mesma forma, cerca de 75% da população reconheceria 6 ou mais, 50% cerca de 12 ou mais, etc.

[210] Na Figura 17 observa-se também a cobertura populacional para Classe II (última coluna cinza). É importante salientar, porém, que a cobertura para a predição de moléculas de classe II é subestimada porque os alelos DRB3/4/5 não têm sido incluídos. Não existem dados confiáveis sobre estes alelos. A cobertura está baseada em DRB1 , DQB1 e DPB1. Como alternativa, pode estimar-se a cobertura adicional com base no vínculo. Ou seja, DRB4 está sempre associado com DRB1 *04, 07 e 09. Então, por exemplo, podem se adicionar na cobertura os peptídeos que ligaram DRB1 *04, assumindo que os indivíduos que apresentam DRB1 *04 vão expressar DRB4*. O mesmo vale para DRB3 e DRB1 *03, 11 , 12, 13 e 14, e para DRB5 e DRB1*15 e 16.

[21 1] Na Figura 19 observa-se qual é a proporção de indivíduos da população que reconhecerá um epítopo para molécula de classe II. A barra 16 (eixo x) mostra que 5,9 % dos indivíduos são preditos para reconhecer 16 diferentes combinações de peptídeos/moléculas HLA classe II. Além disso, 5,25 % irão reconhecer 10 combinações, 6 % reconhecerão 13 combinações, etc. A soma de todas as colunas chegará a 100%, mas é possível que haja um arredondamento, e que parte dos estudos populacionais descritos em AFND não necessariamente correspondem a todos os alelos da população.

[212] Os 57 % de cobertura cumulativa (eixo y 2) associados com a coluna 16 significam que 57% da população vão reconhecer 16 ou mais combinações de peptídeos/moléculas HLA classe II; 84 % reconhecerão 10 ou mais, e 10 % reconhecerão 28 ou mais, etc. A distribuição, especialmente, na população mundial, é Gaussiana. Populações menores e menos diversas podem ter uma cobertura pequena, menos diversa que pode ser enviesada, mas usualmente é normal. Adicionalmente, espera-se que pelo menos 7,67 dos epítopos serão reconhecidos por 90 % da população mundial (PC ₉₀ , Figura 19). [213] A cobertura para os epítopos da NH36 é ligeiramente mais alta para Classe II (99.44, PC 7,67, Figura 19) do que para a Classe I (98,55, PC 3,19, Figura 18). Porém a cobertura é muito boa em ambos os casos.

[214] Consequentemente, os resultados da análise da cobertura populacional justificam a seleção dos epítopos da NH36 para produção de proteínas vacina multiepítopos potencialmente promissoras para inclusão em uma composição imunogênica contra a Leishmaniose visceral que poderá ser usada universalmente.

Identificação dos epítopos com capacidade de ligação a moléculas de HLA correlacionadas com a suscetibilidade ou resistência à LV

[215] Este tipo de abordagem privilegia os epítopos que se ligam aos alelos HLA que estão altamente associados aos fenótipos naturalmente resistente/protetor, de alto risco ou de risco intermediário de contrair LV. leishgen et al., (2013) e SINGH et al., (2018) descreveram que os alelos DRB1 *15:01 e DRB1 *01 : 01 estão associados ao fenótipo protetor (Figura 15 e Tabela 5). Observamos que 1 1 epítopos se ligam, in vitro, a DRB1 *01 :01 e 10 aos alelos DRB1 *15: 01. Os epítopos 1 1 -2018, 1 -2018, 5-2018, 13-2018, 7-2018, 3-2018 e BL1 ligam-se a ambos os alelos. Além disso, os epítopos 1 -2014, 2-2014 e BL2 se ligam a DRB1 *15:01 , enquanto os epítopos 3-2014 e 9-2018 também se associam à DRB1 *01 :01 .

[216] Por outro lado, seis epítopos (1 -2014, 2-2014, 7-2018, 9-2018, 1 1 -2018 e 13-2018) também se ligam ao alelo DQB1 *05:01 , que está associado ao risco intermédiário de LV. Por último, onze epítopos (9-2018, 1 1 -2018, 15-2018, 2-2014, 1 - 2018, 5-2018, 13-2018, 17-2018, 7-2018, BL1 , BL2) ligam-se, in vitro, ao alelo DQB1 *02:01 , que está associado a alto risco de LV (LEISHGEN et al., 2013; SINGH et al., 2018) (Tabela 6 e Figura 15).

Tabela 6. Epítopos da NH36 que ligam a alelos associados com risco e proteção contra a LV (LEISHGEN et al., 2013)

[217] Mais recentemente, em 2018, a correlação dos alelos de DRB1 com risco ou proteção contra a LV foi melhor detalhada (Singh T et al. The Journal of Immunology, 2018, e Singh B et al Immunology 2018). Os dados estão sumarizados na tabela 7. Na primeira linha da Tabela 7, foram observados os alelos de DRB1 relacionados com PROTEÇÃO, RISCO INTERMEDIÁRIO ou ALTO de LV. Na segunda linha observamos os alelos, com marcação de 4 dígitos, que ligaram in vitro aos epítopos da NH36.

Tabela 7. Epítopos da NH36 que ligam a alelos DRB1 associados com risco e proteção contra a LV (Singh T et al., 2018)

[218] Os resultados da literatura indicam que os epítopos da NH36 estudados se associam tanto à moléculas de HLA de Classe II associadas com resistência ou proteção, quanto com risco alto ou intermediário de desenvolvimento da LV. De acordo com Singh et al., 2018, alguns epítopos estão associados apenas com proteção, como por exemplo o epítopo 11 -2018 enquanto outros, como o 1 -2014, 2- 2014 estão associados a proteção, risco intermediário ou alto de LV. Por outro lado, de acordo com LEISHGEN et al., 2013, o epítopo 11 -2018 liga a alelos associados com proteção, risco intermediário ou alto de LV.

[219] Esta análise reforça a importância da utilização dos epítopos estudados da NH36 para a formação de proteínas multepítopos para produção de uma composição imunogênica (vacina) que possa proteger, não somente indivíduos com perfil fenotípico em HLA de resistência natural ou proteção, mas também, aqueles com perfil de suscetibilidade ou risco de contrair LV.

Tipaqem de HLA dos pacientes estudados

[220] Amostras de DNA de 8 pacientes doentes e curados e dos 10 indivíduos assintomáticos DTH+ foram obtidas. A tipagem dos alelos de 1 1 Loci de HLA (HLA- A*, HLA-B*, HLA-C*, DRB1 *, DBQ1 *, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1 *, DPA1 *, DPB1 *) foi realizada pelo método de sequenciamento maciço em paralelo, no Laboratório de HLA-UERJ, pela equipe do professor Luiz Cristóvão de Moraes Sobrino Porto. Os resultados obtidos de pacientes doentes que curaram (curados) e assintomáticos DTH+ (DTH+) estão sumarizados na Figura 20.

[221 ] Quantificou-se então as vezes em que cada alelo aparece para cada um dos loci de HLA e comparamos, por ensaio de x ² com correção de Yates (biblioteca scipy.stats. chy.square contingency em Phyton), se as frequências para um determinado alelo eram significativamente diferentes em pacientes curados e em indivíduos assintomáticos DTH+.

[222] Observou-se que o alelo HLA-C*04:01 se encontra em 6 de 8 indivíduos curados, que representam indivíduos que ficaram doentes, mas em nenhum dos DTH+. Esta diferença foi altamente significativa (p = 0.0043) indicando que o alelo HLA-C*04:01 está correlacionado com suscetibilidade para a LV humana. Este resultado é muito relevante considerando que a amostra de indivíduos curados e DTH+ estudada é pequena. Esta correlação não tinha sido descrita na literatura antes.

[223] Por outro lado, os estudos de Leishgen, (2013) e Singh et al., (2018) revelaram que gene DRB1 concentra a base da suscetibilidade e resistência natural a LV. De fato, os alelos DRB1 *1501 , DRB1 *1502, DRB1 *01 :01 e DRB1 *16 estão associados com proteção contra LV, os alelos DRB1 *03:01 , DRB1 *04, DRB1 *07:01 e DRB1 *1202 tem perfil neutro e os alelos DRB1 *10:01 , DRB1 *14:04, DRB1 *1 1 , DRB1 *13:01 , DRB1 *13:02 e DRB1 *09:01 com o alto risco de contrair LV (Tabela 7).

[224] Apesar da amostra de pacientes estudada ter sido relativamente pequena, foi possível observar que os alelos associados com proteção DRB1 *0101 e DRB1 *1501 se considerados juntos, estão presentes em 4 dos 10 pacientes DTH+, porém não são achados em nenhum dos 8 pacientes curados (x ² one tailed P value = 0.0023) (Figura 20).

[225] Assim, mesmo o alelo DRB1 *1301 ligado a alto risco de contrair LV, está presente num paciente e o DRB1 *1302, em outro paciente curado, porém nenhum deles aparece nos indivíduos DTH+ (Figura 20). Em contraposição os alelos DRB1 *10:01 e DRB1 *1 1 , também associados a alto risco aparecem em 1 individuo curado, cada um, porém também em 2 e 3 indivíduos DTH+ respectivamente.

[226] É interessante observar que 3 pacientes DTH+ (CY:5, CY:7, CY:9) apresentam no seu fenótipo o alelo DRB1 *01 :01 , relacionado com a proteção contra a LV (Tabela 6) mas também, o alelo DQB1 *05:01 , apontado pelo trabalho do Leishgen (2013), como relacionado com risco intermediário. O paciente CY:5 respondeu, conforme esperado, aos epítopos 1 a 1 1 , 15 e 17 de 2018, elevando as frequências de células TCD4 multifuncionais IL-2 ⁺ TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ .

[227] O paciente CY:7 respondeu mais intensamente ao epítopo 9-2018, e o paciente CY:9, ao epítopo 1 1 -2018. Em contraposição, os pacientes BY10 e BY:9, do grupo infectado e curado, apresentaram o fenótipo DQB1 *02:01 associado com alto risco. O paciente BY:10 e respondeu aos epítopos 2-2014, 17-2018, além do 3-2018 enquanto que o paciente BY:9 respondeu aos epítopos 1 1 -2018, 9-2018 e 13-2018. Assim, foram selecionados os epítopos mais relevantes para a sequência do estudo.

Modificação genética dos epítopos, proteínas multiepítopos e composição imunogênica

[228] Considerando a forte antigenicidade dos epítopos da NH36, a sua capacidade de ligar anticorpos, induzir a secreção de citocinas por linfócitos T CD4 e CD8, promover o aumento das frequências de linfócitos de memória central e efetora, a sua promiscuidade predita por bioinformática e comprovada in vitro, as suas amplas coberturas populacionais sobre moléculas HLA de classe II e de classe I e a sua forte ligação predita à alelos mais específicos associados com respostas de proteção, alto risco e risco intermediário contra a LV humana, foram então incluídos todos os epítopos estudados, em duas formulações. [229] Apesar de que alguns deles terem se destacado como mais potentes indutores de memória imunológica, promovendo maiores frequências de linfócitos T multifuncionais, decidiu-se incluir todos os epítopos, privilegiando a sua promiscuidade e ampla cobertura populacional que permitirá que protejam a populações mais amplas e diversas e que exerçam uma proteção universal contra as leishmanioses.

[230] Mesmo considerando que os epítopos identificados são realmente muito imunogênicos, os diferentes tipos de arranjos que os epítopos podem sofrer dentro da vacina multiepítopos, podem afetar as suas potências. Por exemplo, eles poderiam ser menos eficientes ao gerar epítopos juncionais. A criação de epítopos juncionais é uma preocupação ao desenhar polipeptideos lineares. Um epítopos juncional é definido como um neoepítopo, que surge pela justaposição de dois epítopos autênticos.

[231] O novo epítopo está composto pelo setor C-terminal de um epítopo e o setor N-terminal de um epítopo posterior na sequência. A presença de um epítopo juncional pode criar efeitos de imunodominância indesejada, redirecionando a resposta imune contra epítopos irrelevantes e, em algumas ocasiões, até suprimindo a indução de uma resposta contra os epítopos mais desejados (Livingston et al. J Immunol 2002; 168:5499-5506). Para evitar o surgimento dos neoepítopos se coloca entre os epítopos preditos uma sequência espaçadora.

[232] A sequência GPGPG foi desenhada por Livingston et al. (2002). Ela permitiu a restauração da imunogenicidade de epítopos para HLA de classe II, ao romper os epítopos juncionais que tinham se formado. A sequência GPGPG foi considerada então como um espaçador universal. Por outro lado, Kolla et al. (2021 ) usaram os espaçadores AAY para unir epítopos de linfócitos T citotóxicos (CTL). O espaçador AAY é o sítio de clivagem no proteosoma em células de mamífero. Kolla et al., (2021) também usaram a sequência GPGPG para unir linfócitos T helper e o espaçador KK para unir epítopos de linfócitos B, respectivamente, em uma vacina contra Staphylococcus aureus. [233] Os estudos de imunoinformática demonstraram que a vacina seria capaz de aumentar a resposta de anticorpos, os níveis secretados de IL-2, IFN-y, TGF-[3 e as respostas de células T e B, e de induzir respostas imunes primárias, secundárias e terciárias (Kolla et a!., 2021 ). O espaçador KK foi também usado para aumentar a resposta de anticorpos numa vacina nasal (Yano et al. , 2003).

[234] Sequências de KK são o ponto de corte de catepsina, uma das enzimas importantes do processamento de antígenos dentro do contexto HLA classe II. Adicionalmente, Moradi et al., (2017) desenharam uma vacina de DNA contra tuberculose murina, baseada em epítopos preditos para MHC de classe I, ligados por AAY, e epítopos para HLA de classe II ligados por motivos GPGPG, unidos em tandem [162], Finalmente, no pedido de patente de Mc Leod R et al., 2017 (WO 2017/184456 Al) que trata de uma vacina multiepítopos contra a toxoplasmose foram utilizados, além do epítopo PADRE, as sequências de três alaninas (AAA ou KAAA) e de GPGPG como espaçadores.

[235] Na presente invenção, as vacinas multiepítopos estão compostas, por epítopos geneticamente modificados a partir da sequência da NH36. Os epítopos estudados originalmente forma preditos para MHC Classe II portanto deveriam ser separados por sequências GPGPG. Porém, eles contêm dentro de cada um, sequências importantes para MHC de Classe I que deveriam ser separadas por sequências derivadas de AAA. Para não alterar a estrutura destes importantes e potentes epítopos a estratégia compreendeu a utilização dos epítopos geneticamente modificados a partir da sequência da NH36 com a inclusão dos espaçadores AAA e GPGPG, representados pelas SEQ ID NO:16 a SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:46, respectivamente.

[236] A partir desses epítopos, foi possível construir as proteínas multiepítopos geneticamente modificadas MultiAAA e MultiGPGPG. A formação da proteína MultiAAA se deu pela junção dos epítopos de SEQ ID NO:16 a SEQ ID NQ:30 e está representada na SEQ ID NO:31. A formação da proteína MultiGPGPG se deu pela junção dos epítopos de SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO:46 e está representada pela SEQ ID NO: 47. [237] A composição imunogênica (vacina multiepítopo) é constituída por pelo menos uma das proteínas multiepítopos e adjuvante saponina em solução salina NaCI 0.9% estéril.

[238] No caso da vacina MultiAAA (SEQ No ID :31 e Figura 21 ), as sequências artificiais que a compõem estão modificadas pela adição de três resíduos de Alanina na extremidades C-Terminal, conforme descrito na Tabela 8. Apenas o epítopo 15-17- 2018 que está modificado pela adição de KRIGD, não requer três alaninas por se encontrar no final da sequência, e será seguido pela cauda de 6 Histidinas que facilita a purificação do peptídeo expresso. Conforme explicado, os epítopo 15-17-2018A (SEQ NO:28) substitui os epítopos 15-2018A (SEQ ID NO:26) e 17-2018A (SEQ ID NO:27) na vacina MultiAAA.

Tabela 8. Epítopos geneticamente modificados e sintéticos para compor a vacina MultiAAA

[239] O programa Protparam-Expasy revelou que a vacina MultiAAA está composta por 310 aminoácidos e tem um peso molecular de 32205,23 Daltons e um pl teórico de 6.15. Ela possui 29 resíduos de aminoácidos carregados negativamente (Asp+Glu) e 23 resíduos carregados positivamente (Arg+Lys). Adicionalmente, a vacina multiAAA tem uma vida média estimada de 20 h, em reticulócitos de mamífero in vitro, 30 minutos em leveduras in vivo e acima de 10 horas em Escherichia coli in vivo. O seu índice de instabilidade é 24,38, o que a classifica como uma proteína estável. O seu índice alifático é 107,13 e o seu índice médio hidropatico (GRAVY) é 0,422.

[240] No caso da vacina MultiGPGPG (SEQ No ID:47 e Figura 22), as sequências artificiais que compõem esta vacina multiepítopos estão modificadas pela adição dos resíduos GPGPG na extremidades C-Terminal, conforme descrito na Tabela 9. Apenas o epítopo 15-17-2018G (SEQ NO:44) que está modificado pela adição de KRIGD, não requer a adição de GPGPG por se encontrar no final da sequência, e será seguido pela cauda de 6 Histidinas que facilita a purificação do peptídeo expresso. Conforme explicamos, o epítopo 15-17-2018G (SEQ NO:44) substitui os epítopos 15-2018G (SEQ ID NO:42) e 17-2018G (SEQ ID NO:43) na vacina MultiGPGPG.

Tabela 9. Epítopos geneticamente modificados e sintéticos para compor a vacina multiGPGPG

[241] O programa Protparam-Expasy revelou que a vacina multiGPGPG está composta por 334 aminoácidos e tem um peso molecular de 34031 ,06 Daltons e um pl teórico de 6,15. Ela possui 29 resíduos de amino ácidos carregados negativamente (Asp+Glu) e 23 resíduos carregados positivamente (Arg+ Lys). Ela tem um tempo de vida média estimado em reticulócitos de mamífero in vitro de 20h, em leveduras in vivo de 30 min e em Escherichia coli in vivo, maior que 10h. O seu índice de instabilidade é 20,96, o que a classifica como uma proteína estável. O seu índice alifático é 88,65 e o seu índice médio hidropatico (GRAVY) é 0,039.

[242] As proteínas MultiAAA e MultiGPGPG forma clonadas em E. coli BL21 (DE3) e a sua expressão induzida em diversas concentrações de IPTG, conforme representado na Figura 25. Quando comparadas com o lisado de bactérias não induzidas a expressão da proteína multiAAA é bem nítida, nas três concentrações de IPTG, mostrando uma banda intensa correspondente ao pm = 32.6kDa. Por outro lado, a proteína MultiGPGPG também mostrou-se como uma banda bastante intensa, em resposta à indução com as três concentrações de IPTG no peso molecular de 34,5 kDa.

[243] As proteínas multiepítopos AAA (SEQ NO:31 ) e GPGPG (SEQ NO:47) são incubadas com PBMC de pacientes com LV antes do tratamento, pacientes assintomáticos DTH+ e pacientes curados assim como PBMC de controles sadios. Será analisada a resposta imune celular gerada nestes pacientes através da análise da marcação de citocinas intracelulares por citometría de fluxo e da secreção de citocinas nos sobrenadantes. A resposta humoral de anticorpos no soro também será analisada. Estes dados permitirão avaliar a imunogenicidade e antigenicidade das vacinas MultiAAA e MultiGPGPG contra a leishmaniose visceral humana.

[244] Análise da resposta imune celular de PBMC de pacientes assintomáticos à proteína multiepítopos MultiAAA

[245] PBMC de pacientes assintomáticos foram encubados, na ausência de estímulo ou na presença da proteína MultiAAA recombinante purificada, nas concentrações de 12,5 pg/ml, 25 pg/ml ou 50 pg/ml, ou com SLA na concentração de 10 pg/ml (Figura 26). Foi possível observar uma dose resposta das frequências de linfócitos T CD4+ secretores de IL-2 sejam estes mono-secretores ou frequências totais. Por outro lado, as frequências de linfócitos T CD4+ mono-secretores, ou frequências totais de secretores de IFN-y são máximas em resposta à concentração de 25 pg/ml da proteína (Figura 26). É notória as frequências muito aumentadas, próximas a 12 %, em resposta a concentração de 50 pg/ml. Estes resultados indicam que o desenho da vacina multiepítopos potencializou em cerca de 60 vezes a imunogenicidade observada para os domínios da NH36 e para os epítopos da NH36, por separado. Assim mesmo, se observa que a resposta induzida pela proteína multiepítopos AAA é muito superior à do controle positivo de SLA.

[246] Adjuvantes para a composição imunoqênica e ensaios de Fasel e 2

[247] O termo adjuvante é oriundo do latim adjuvare que significa ajudar, constituindo-se em compostos adicionados a antígenos imunogênicos que potencializam a resposta imune contra os mesmos. Esses compostos vêm sendo usadas para melhorar a eficácia de vacinas desde a década de 1920. A pesquisa por novos adjuvantes tem sido crescente nos últimos anos, uma vez que eles aumentam a eficácia de antígenos purificados, recombinantes ou sintéticos.

[248] Para as composições imunogênicas de proteínas multiepítopos utiliza- se como adjuvante a saponina QS21 sozinha ou em combinação com o Monofosforil Lipídio A de Salmonella minessota (MPL), ou os adjuvantes particulados ISCOMs do tipo ISCOMATRIX, que também são baseados na saponina QS21 .

[249] A saponina QS21 é a saponina mais utilizada e é um produto da Quillaja saponaria Molina. São moléculas complexas de alto peso molecular, que se apresentam sob a forma de conjugados naturais de triterpenos, esteróides ou glico- alcalóides esteroidais com uma ou mais cadeias de açúcares. O termo saponina faz referência à sua propriedade clássica detergente, que por sua vez, está relacionada com a natureza antipática da molécula (uma porção glicídica que é hidrofílica e uma aglicona ou sapogenina que é hidrofóbica). São substâncias bastante utilizadas em vacinas veterinárias e humanas.

[250] O adjuvante da vacina Leishmune® contém saponinas aciladas e desaciladas QS21 como componente ativo. Destacam-se pela capacidade de induzirem potente resposta Th1 , aumentarem os níveis de lgG2a, IFN-y e IL2. Um dos mecanismos de ação propostos é que as saponinas se intercalam nas membranas celulares através da sua fração hidrofóbica ocasionando a formação de poros, o que facilita a apresentação do antígeno pela via MHC-1 e assim, promovem o aumento da resposta CTL. Também foi descrito que a presença do grupo aldeído no C-4 permite que a saponina mimetize o ligante B7 aumentando o estímulo de APCs sobre linfócitos helper CD4 (TH1 ).

[251] As saponinas de Quillaja saponaria que são conjugados de duas porções glicídicas associadas aos C-3 e o C-28 de um núcleo triterpênico, apresentam duas características peculiares que as tornam muito potentes: a presença de um grupo aldeído (CHO) no C-4 e a presença de normoterpenos no C-28 do triterpeno. Na superfície de células apresentadoras de antígenos o grupamento aldeído da molécula co-estimulatória B7 interage com aminas da superfície de linfócitos formando bases de Schiff. Essa interação desencadeia a transmissão de um sinal que estimula a resposta TH1.

[252] Assim, foi proposto que os aldeídos das saponinas Quillaja saponaria agem como análogos da família de moléculas co-estimulatórias, ligantes B7, na superfície de células apresentadoras de antígenos, formando também e de forma independente bases de Schiff. Por outro lado, o normonoterpeno ligado ao C-28 é responsável pela toxicidade e pela resposta citotóxica (CD8) induzida pelo tratamento com as saponinas (Lacaille-Dubois, 2019). A saponina QS21 também age através da ativação do inflamosoma e a liberação consequente de citocinas dependentes de caspase-1 , como a IL-1 β e a IL-18 que são importantes para a resposta Th1 . Existem atualmente cerca de 50 analogos sintéticos da QS21. Ela foi utilizada em vacinas humanas em doses de 50 pg ou 100 pg.

[253] Adicionalmente a QS21 apresenta efeito sinergístico quando administrada como MPL-A em um lipossomo (AS01 ). Lipossomos são nanoesferas sintéticas que consistem e bicamadas de fosolipídeos, que encapsulam os antígenos e atuam como sistema de liberação. O MPL é um derivado detoxificado do LPS de Salmonella minnesota, induz ativação da imunidade inata através de TLR-4 e pode ser classificado como um PAMP. Assim como LPS, age no receptor Toll-4 das células apresentadoras de antígenos profissionais, que promovem a liberação de citocinas IL2, IFN-Y que induzem resposta TH1. Foram gerados vários derivados sintéticos de acordo com o estudo da função-estrutura do MPL, entre eles o RC-529 (Singh & O’Hagan, 2003).

[254] Vários testes de imunizações incluindo Leishmania, malária, papillomavirus humano (HPV), vírus Hepatitis B (HBV), tuberculose e HIV com diferentes formulações de MPL tem sido seguras e eficazes com este adjuvante (Reed et al., 2009). Esta série de adjuvantes foi desenvolvida pela Glaxo Smith Kline e é utilizada em vacinas profiláticas contra malária, Herpes zoster, tuberculosis, AIDS e em vacinas terapêuticas contra câncer e doença de Alzheimer's. De fato a QS21 dentro do adjuvante AS forma parte da vacina contra Herpes Zoster (HZ/su) (Shingrix™) que foi licenciada em 2017 pelo FDA e recebeu autorização para comercialização em 2018, e da vacina RTS,S/AS01 Mosquirix™ contra a Malaria que foi aprovada pelo EMA em 2015 para implementação no Sub-Sahara. Em crianças, a Mosquirix se usa contendo 62.5 pg de antigeno com 50 pg de MPL e 50 pg de Q21 numa emulsão óleo-água finalmente diluída em 250 pl de salina.

[255] Finalmente, os ISCOMs são partículas de 40 qm compostas de colesterol, fosfolipídios e saponinas de Quillaja saponaria Molina. Para vacinas os ISCOMs também contém o antígeno desejado. Essa preparação reduz a toxicidade destas saponinas, diminuindo sua ação hemolítica. No ISCOM a saponina encontra- se ligada ao colesterol e não interage livremente com as membranas celulares. Está estabelecido que os ISCOMs induzem resposta Th1 e Th2 e de citocinas pró- inflamatórias e têm sido estudados em vários modelos animais e uma vacina contra Influenza eqüina, usando ISCOMs, está licenciada na Suíça. Os ISCOMs podem ser usados através das vias oral, respiratória e vaginal e são administrados como adjuvantes de vacinas da Merck Sharp and Dohme.

[256] Em conclusão, nas vacinas humanas, a saponina QS21 sozinha é usada em doses de 50 pg, e os ISCOM do tipo ISCOMATRIX em doses de 100 pg a 120 pg (Bigaeva et al., 2016) sendo que o adjuvante ASO1 contém 50 pg de QS21 e 50 pg de MPL-A (Regules et al., 2016). Ambos adjuvantes foram formulados com doses variáveis de antígenos. Vale lembrar que na vacina Leishmune® contra a leishmaniose canina, o adjuvante contém 156 pg de QS21 por dose (Oliveira-Freitas et al., 2006).

[257] Sendo assim, a composição imunogênica (vacina) de proteínas multiepítopos ótima, objeto desta invenção, é caracterizada por conter pelo menos uma proteína multiepítopo (multi AAA ou multi GPGPG) em concentrações de 10 a 200 pg formuladas com 50 pg de QS21 , ou 100 pg a 120 pg de ISCOMATRIX, ou com adjuvante ASO1 composto por 50 pg de QS21 e 50 pg de MPL-A. Cada formulação será hidratada em 0,2 a 0,5 ml de solução salina NaCI 0,9% estéril.

[258] Nos ensaios de Fase 1 e 2, as formulações contendo o as proteínas multiepítopos MultiAAA e MultiGPGPG serão preparadas 1 hora antes do uso e mantidas a 4°C até o momento da aplicação. A ausência de LPS das preparações será confirmada usando o kit LAL QCL-1000 (Lonza). Para os testes de segurança e tolerabilidade_as vacinas serão aplicadas em três doses subcutâneas a intervalos de 28 dias (dia 0, dia 28 e dia 56). A segurança das vacinas será avaliada 1 h, 2 dias e 7 dias após cada injeção.

[259] Os indivíduos serão monitorados para detecção de efeitos adversos por até um ano após a aplicação das vacinas. Entre os efeitos adversos incluímos dor no local da injeção, inchaço, vermelhidão e endurecimento, febre, mialgia, malestar, fadiga, dor de cabeça, diarreia, anorexia, rash cutâneo e reações alérgicas. Será estabelecido um score de efeitos adversos de grau 1 : leves e que não limitam atividade, 2: que afetam a função mas não as atividades da vida diária, 3: severos, que afetam as atividades da vida diária, 4: graves, que ameaçam a vida ou provocam incapacidade. Sinais vitais serão avaliados a cada retorno para avaliação e 30 min após cada injeção.

[260] Para o teste de toxicidade serão colhidas amostras de sangue para obtenção de soros, 1 h antes e 6h, 12h e 24 h após a injeção. Nesses soros serão determinados os valores de fosfatase alcalina, gama glutamil transferase, Sódio, Potássio, lipase, amilase uréia, creatinina, tempo de protrombina, IMR, albumina/globulinina, proteina C reativa e seão realizados Eletrocardiogramas. Adicionalmente serão colhidos soros antes das injeções e 30 dias após para dosar anticorpos anti-núcleo e fator reumatoide, como indicativa de possível aparecimento de autoimunidade.

[261] Finalmente, para o teste de imunogenicidade; amostras de sangue e soros serão colhidas nos dias 0, antes da injeção das vacinas, e nos dias 30, 60 e 150 após a primeira dose vacinai. Os soros serão evaluados por Ensaio de Elisa contra as proteínas multiAAA e multiGPGPG e o lisado de Leishmania (L.) infantum (2 pg/poço), usando anticorpos anti-lgG, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4 para revelação. PBMC serão purificados em gradiente de Fycoll no dia 0, antes da injeção das vacinas e nos dias 30, 60 e 150 após a primeira dose.

[262] Os PBMC serão plaqueados com as vacinas multiepítopos e o lisado de promastigotas e incubados por 72 h a 30 °C e 5% de CO2. A secreção de citocinas nos sobrenadantes será avaliada com o kit Human Th17, 9 plex (IFN-g, TNF-αlfa, IL- 1 B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A) - HTH17MAG-14K-09 e analisada usando o software Milliplex Analist 5.1 (Merck Millipore, Billerica, EUA) e com o kit Multi- species TGF[3 - Single Plex (TGF[31 ).

[263] Adicionalmente, será realizada a marcação intracelular de citocinas, cultivando os PBMCs in vitro com 10 pg / ml de lisado de promastigotas, ou proteínas multiAAA ou multiGPGPG, durante 6 h, seguido da adição de Brefeldin A e uma incubação adicional durante 12 h. As células serão coradas para marcadores de superfície CD3, CD4, e CD8, e posteriormente para a expressão intracelular de citocinas IL-2, TNF-α e IFN-y. Os eventos serão adquiridos em um citometro de fluxo BD FACSCanto II ™ e os dados analisados com o software FlowJo (boolean gain).

[264] Aos 150 dias após a primeira injeção, após a coleta de sangue e soro, será aplicada uma IDR com lisado de Leishmania nos indivíduos vacinados e nos tratados com placebo de solução salina, e o tamanho do endurecimento avaliado até 72h após injeção. Os testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney serão utilizados para comparação o teste de correlação bicaudal de Spearman será utilizado para análise de correlação usando o software Graph Pad Prism 9.

Breve descrição das Figuras

[265] Figura 1. Análise da resposta humoral sérica aos epítopos da NH36. Os níveis de anticorpos anti-lgG, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4 contra os epitopos 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID N0:3), 1 -2018 (SEQ ID N0:4), 3-2018 (SEQ ID N0:5), 5-2018 (SEQ ID N0:6), 7-2018 (SEQ ID N0:7), 9-2018 (SEQ ID N0:8), 11 -2018 (SEQ ID N0:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID N0:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO: 12) foram avaliados através de um ensaio de ELISA usando soro de indivíduos curados de LV (n=10), assintomáticos DTH+ (n=10) e de controles sadios de área não endêmica (n=7). Os asteriscos representam diferenças significativas entre as absorbâncias dos pacientes e dos seus respectivos controles sadios (ANOVA) com o teste de Sidak para comparações múltiplas.

[266] Figura 2. Análise da resposta humoral sérica aos epítopos da NH36. “Heatmap” representando as médias das absorbâncias de cada tipo e subtipo de anticorpo em resposta aos epítopos: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13- 2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12). Avaliou- se a resposta de anticorpos anti-lgG, IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4 de soros de indivíduos curados de LV (n=10), assintomáticos DTH+ (n=10) e de controles sadios de área não endêmica (n=7).

[267] Figura 3. Estratégia de gate para análise dos linfócitos T CD4+ e TCD8+ multifuncionais. Inicialmente pode-se observar a população de células viáveis (a), a partir dessa população selecionou-se a população de linfócitos totais utilizando os parâmetros FSC x SSC (b), dentro dessa população selecionamos somente os linfócitos T CD3+ (c), e em seguida os linfócitos TCD3+ CD4+ e TCD3+TCD8+ (d), a partir dessas populações de linfócitos CD4+ e CD8+ excluiu-se aqueles que foram duplo positivos para CCR7+ CD45RA+ (células T virgens) e selecionou-se somente linfócitos efetores e de memória (e), e dentro dessa população avaliamos a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-2, TNF-α e IFN-y (f) e suas possíveis combinações através da análise do Boolean Gate.

[268] Figura 4. Percentual de linfócitos CD3+ (a), CD3 ⁺ CD4 ⁺ (b) e CD3 ⁺ CD8 ⁺ (c). Estas frequências foram avaliadas em PBMC de controles sadios (n=10), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com os epítopos da NH36 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13- 2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID N0:12) (25pg/ml), e o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) 10|_ig/ml.

[269] Figura 5. Frequências de linfócitos T CD4+ secretores de uma única citocina (IL-2, TNF-α ou IFN-y). Estas frequências foram avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com os epítopos sintéticos da NH36 1 -2014 (SEQ ID NO: 1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 - 2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO: 12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[270] Figura 6. Frequências de linfócitos T CD4+ secretores de duas citocinas (IL-2 e TNF-α; TNF-α e IFN-y ou IL-2 e IFN-y). Estas frequências foram avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com os epítopos sintéticos da NH36 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO: 12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[271] Figura 7. Frequências de linfócitos T CD4+ secretores de três citocinas (IL-2, TNF-α e IFN-y). Estas frequências foram avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com epítopos sintéticos da NH36: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 - 2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO: 12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[272] Figura 8. Análise da resposta multiparamétrica de ICS dos linfócitos TCD3+CD4+ secretores de citocinas após incubação com os epítopos da NH36. “Heatmap” representando as médias das frequências de células T CD4+ secretoras de uma, duas ou três citocinas de indivíduos curados de LV (n=10), assintomáticos DTH+ (n=10) e de controles sadios de área não endêmica (n=7).

[273] Figura 9. Frequências de linfócitos T CD8+ secretores de uma única citocina (IL-2, TNF-α ou IFN-y). Estas frequências foram avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com epítopos sintéticos da NH36: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 - 2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO: 12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[274] Figura 10. Frequências de linfócitos T CD8+ secretores de duas citocinas (IL-2 e TNF-α, TNF-α e IFN-y e IL-2 e IFN-y). Estas frequências forma avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) frente ao estímulo com epítopos sintéticos da NH36: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9- 2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[275] Figura 11. Frequências de linfócitos T CD8+ secretores de IL-2, TNF-α e IFN-y. Estas frequências foram avaliadas em PBMC de indivíduos sadios (n=6), pacientes curados de LV (D180) (n=10) e indivíduos DTH+ (n=10) forma encubados na presença de epítopos sintéticos da NH36: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NQ:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12) (25pg/ml) e SLA (10pg/ml). Os resultados estão representados como médias + SE. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Intervalo de confiança 95%.

[276] Figura 12. Análise da resposta multiparamétrica de ICS dos linfócitos TCD3+CD8+ secretores de citocinas após incubação com os epítopos da NH36. “Heatmap” representando as médias das frequências de células T CD4+ secretoras de uma, duas ou três citocinas de indivíduos curados de LV (n=10), assintomáticos DTH+ (n=10) e de controles sadios de área não endêmica (n=7).

[277] Figura 13. Níveis de citocinas produzidas por PBMC’s de indivíduos DTH+ estimulados in vitro com os epítopos da NH36. Os PBMCs de indivíduos assintomáticos (n=6) foram incubados com 25pg/ml dos epítopos da NH36: 1 -2014 (SEQ ID NO:1 ), 2-2014 (SEQ ID NO:2), 3-2014 (SEQ ID NO:3), 1 -2018 (SEQ ID NO:4), 3-2018 (SEQ ID NO:5), 5-2018 (SEQ ID NO:6), 7-2018 (SEQ ID NO:7), 9-2018 (SEQ ID NO:8), 11 -2018 (SEQ ID NO:9), 13-2018 (SEQ ID NO:10), 15-2018 (SEQ ID NO:11 ) e 17-2018 (SEQ ID NO:12), com o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) ou sem estímulo (controle) por um período de 72 horas e a secreção de citocinas foi mensurada no sobrenadante utilizando o ensaio Luminex. Para análise estatística foi utilizado o teste de IC 95%.

[278] Figura 14. Predição das moléculas de HLA de classe II que ligam aos 27 alelos mais comuns dos genes DRB*1 , DRB*3, DRB*4 e DRB*5, DQA*1/DQB*1 e DPA*1/ DPB*1 humanos. Os epítopos da NH36 preditos para moléculas de HLA de classe II humanas foram analisados pelo programa IEDB recommended 2.22 com percentil rank < 10% (em amarelo) e < 20 % (em laranja). Os resultados mostram os menores valores de percentile rank com os quais as sequências ligadoras dentro dos epítopos se ligam as moléculas de HLA.

[279] Figura 15. Teste da afinidade in vitro dos epítopos para HLA-classe II da NH36 pelas moléculas dos 27 alelos mais comuns dos genes DRB*1 , DRB*3, DRB*4 e DRB*5, DQA*1/DQB*1 e DPA*1/DPB*1 humanos. Este teste analisa a capacidade dos epítopos de inibir a ligação de uma sonda peptídica radiativa, a moléculas MHC purificadas. As concentrações de IC50 < a 1000 ηM, representadas em negrito, indicam as afinidades mais altas de um epítopo para cada receptor HLA. Os signos negativos indicam valores IC50 > 30000 ηM. A cor verde nos alelos DRB1 *01 :01 e DRB*1 15:01 mostra a sua associação com o fenótipo PROTETOR; a cor rosa no alelo DQB1 *05:01 mostra a sua associação com o fenótipo de RISCO INTERMEDIÁRIO e a cor vermelha no alelo DQB1 *02:01 mostra a sua associação com o RISCO ELEVADO para LV.

[280] Figura 16. Identificação das sequências ligadoras de moléculas HLA de classe I, dentro do epítopos para classe II da NH36. As sequências dos epítopos para MHC Classe II da NH36 foram analisadas pelo programa “MHC Class I Binding predictions” do IEDB Database, NetMHCpan EL 4.1. Obtivemos: 1 ) o número predito de sequências ligadoras em cada epitopo, 2) o número de alelos associados com essas sequencias e 3) o número de sequencias ligadoras promíscuas dentro de cada epitopo.

[281] Figura 17. Cobertura populacional dos epítopos mundial para moléculas HLA de classe I e II. As predições foram realizadas usando a ferramenta do IEDB Database http://tools.iedb.org/population, considerando as frequências de alelos na população mundial baseada no “Allele Frequencies database” (http://www.allelefreguencies.net/). As colunas a direita mostram os valores das coberturas populacionais mundiais para cada epitopo.

[282] Figura 18. Cobertura populacional mundial para moléculas HLA de classe I. As predições foram realizadas usando a ferramenta do IEDB Database Population coverage Class I separate (http://tools.iedb.org/population,) considerando as frequências de alelos na população mundial baseada no “Allele Frequencies database”. O gráfico de barras mostra o número de combinações de sequencias e moléculas HLA "reconhecidas" por diferentes frações da população. Em 90% dos indivíduos, espera-se que pelo menos 3,19 epítopos serão reconhecidos (PC90).

[283] Figura 19. Cobertura populacional mundial para moléculas HLA de classe II. As predições foram realizadas usando a ferramenta do IEDB Database As predições foram realizadas usando a ferramenta do IEDB Database Population coverage, Class II separate (http://tools.iedb.org/population). As barras mostram qual é a proporção de indivíduos da população que reconhecerá um epitopo para molécula de classe II. A soma de todas as colunas chegará a 100%. Adicionalmente, espera- se que pelo menos 7,67 dos epítopos serão reconhecidos por 90 % da população mundial (PC90).

[284] Figura 20. Tipagem do DNA dos pacientes estudados pra os genes HLA- A,B,C, HLA DQA e DQB, HLA-DPA e DPB e HLA-DR1 , DR3, DR4 e DR5. Amostras de DNA dos pacientes DTH+ ou curados de LV foram extraídas de sangue e/ou medula óssea. Os alelos estão descritos com 4 dígitos e forma identificados pelo método de sequenciamento maciço em paralelo. Alelos em verde são associados a proteção e resistência natural contra LV. Alelos em vermelho estão associados com alto risco de contrair LV. [285] Figura 21. Modelo molecular da vacina multiepitopos multiAAA. A vacina é composta pelos epítopos geneticamente modificados através da adição de espaçadores de AAA (SEQ NO ID:31 ). O modelo molecular foi obtido com os programas Swiss modeler e Pymol, usando como base o modelo pdb 1 EZR (Crystal Structure of Nucleoside hydrolase from Leishmania major. doi: 10.2210/pdb1 EZR/pdb). A sequência da proteína MultiAAA com os espaçadores AAA em vermelho. A tabela atribui cores a cada sequência artificial ou epitopo modificado pela adição de três Alaninas.

[286] Figura 22. Modelo molecular da vacina multiepitopos multiGPGPG. A vacina é composta pelos epítopos geneticamente modificados através da adição de espaçadores de GPGPG (SEQ NO ID:47). O modelo molecular foi obtido com os programas Swiss modeler e Pymol, usando como base o modelo pdb 1 EZR (Crystal Structure of Nucleoside hydrolase from Leishmania major. doi: 10.2210/pdb1 EZR/pdb). A sequência da proteína MultiGPGPG com os espaçadores GPGPG em vermelho. A tabela atribui cores a cada Sequência artificial ou epitopo modificado pela adição da sequência Glicina-Prolina-Glicina-Prolina- Glicina.

[287] Figura 23. Representação esquemática da vacina multiepítopos MultiAAA. A vacina é composta por 12 sequências geneticamente modificadas pela adição do espaçador AAA e um último epitopo ligado a uma cauda de 6 Histidinas. Cada sequência representa um epitopo para células T CD4+ “helper”, que também contém epítopos para células T CD8+.

[288] Figura 24. Representação esquemática da vacina multiepítopos MultiGPGPG. A vacina é composta por 12 sequências geneticamente modificadas pela adição do espaçador GPGPG e um último epitopo ligado a uma cauda de 6 Histidinas. Cada sequência representa um epitopo para células T CD4+ “helper”.

[289] Figura 25. Expressão das proteínas MultiAAA e MultiGPGPG clonadas em E coli BI21 (DE3). Os resultados de SDSPAGE representam o perfil dos lisados bacterianos sem indução ou com indução à expressão com 0,5 mM, 0,75 mM ou 1 mM de IPTG.

[290] Figura 26. Frequências de linfócitos T CD4+ mono-secretores de IL-2, ou IFN-y, e duplo-secretores de IL-2 e IFN-y. Estas frequências foram avaliadas em PBMC de um indivíduo assintomático frente ao estímulo com a proteína multiepítopos recombinante MultiAAA da NH36, composta, do extremo N ao extremo C-terminal, pela sequência de epítopos 1 -2018A(SEQ ID NO: 19), 3-2018A (SEQ ID NO:20), BL1A (SEQ ID NO:29), 1 -2014A (SEQ ID NO:16), 2-2014 (SEQ ID NO:17), 5-2018A (SEQ ID NO:21 ), BL2A (SEQ ID NO:30), 3-2014A (SEQ ID NO: 18), 7-2018A (SEQ ID NO:22), 9-2018A (SEQ ID NO:23), 11 -2018A (SEQ ID NO:24), 13-2018A (SEQ ID NO:25) e 15-17-2018A (SEQ ID NO:28) nas concentrações de 12,5 pg/ml, 25 pg/ml e 50 pg/ml). Como controle, os PBMC foram encubados na ausência de estimulo antigénico ou com SLA (10pg/ml).