BARRO LOSADA, Francisco (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
ATIENZA PEÑAS, Sergio Gustavo (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
RAMÍREZ ALCANTARA, Mª Carmen (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
MARTÍN RAMÍREZ, Azahara Carmen (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
MARTÍN MUÑOZ, Antonio Pedro (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
BARRO LOSADA, Francisco (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
ATIENZA PEÑAS, Sergio Gustavo (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
RAMÍREZ ALCANTARA, Mª Carmen (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
MARTÍN RAMÍREZ, Azahara Carmen (Instituto de Agricultura Sostenible, C/ Alameda del Obispo s/n, ias Córdoba, E-14004, ES)
| REIVINDICACIONES 1. Semilla de trigo caracterizada por que su material genético comprende: d. un fragmento del cromosoma 1 Hch de Hordeum chilense, e. una doble monosomía para 6Hch y 6D, f. Ia traslocación 6HchS/6DL, o cualquiera de sus combinaciones. 2. Célula de trigo caracterizada por que su material genético comprende: a. un fragmento del cromosoma 1 Hch de Hordeum chilense, b. una doble monosomía para 6Hch y 6D, c. Ia traslocación 6HchS/6DL, o cualquiera de sus combinaciones. 3. Semilla de trigo según Ia reivindicación 1 , o célula de trigo según Ia reivindicación 2, donde el cromosoma 1 Hch y el brazo corto del cromosoma 6HchS comprenden genes restauradores de Ia fertilidad. 4. Planta de trigo que comprende células de trigo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y/o producida tras el crecimiento de Ia semilla de trigo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3. 5. Cultivo de células de trigo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, capaz de regenerar Ia planta de trigo según Ia reivindicación 4. 6. Cultivo de células de trigo según Ia reivindicación anterior, donde las células proceden de embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, raíz inclina, antera, pistilo, flor, semilla, vaina o vastago de Ia planta de trigo según Ia reivindicación 5. 7. Grano de polen cuyo material genético es un derivado haploide del material genético de Ia célula de trigo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 8. Método para producir semillas de trigo híbrido que comprende: a. obtener una línea euplásmica formada por plantas híbridas entre Hordeum chilense y Triticum sp. b. obtener una línea aloplásmica formada por plantas de trigo con androsterilidad génico-citoplasmática. c. obtener una línea restauradora androesteril formada por plantas de trigo según Ia reivindicación 5. d. cruzar Ia línea obtenida en b) con Ia línea obtenida en c). |
TRIGO
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biotecnología y, concretamente dentro de Ia mejora genética vegetal. Se refiere a una célula vegetal con androesterilidad génico-citoplasmática que incorpora genes restauradores de Ia fertilidad procedentes de cromosomas de
Hordeum chilense. Dichas células dan lugar o son parte de plantas que forman Ia línea restauradora, e integran en su material genético un fragmento del cromosoma 1 H ch , una doble monosomía para 6H ch y 6D , y/o Ia traslocación 6H ch S/6DL
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Uno de los métodos de Mejora Genética Vegetal (MGV) más eficaces, que ha revolucionado Ia industria de las semillas gracias principalmente a Ia ingeniería genética y química, y objeto de numerosas patentes (EP 0,771 ,523 B2; EP 0,923,283 B1 ; EP 0,630,403 B1 ; US 7,164,058 B2), ha sido Ia producción de células vegetales que den lugar a líneas de plantas androesteriles. Dichas líneas androesteriles permitirían el establecimiento, junto con otras líneas, de sistemas que permiten Ia obtención de variedades híbridas. Las variedades híbridas de este tipo se denominan también híbridos F1 y son, además de más productivas (un alto rendimiento de las partes de Ia planta que pueden comercializarse, tales como frutos y similares), debido a Io que se denomina "vigor híbrido", más homogéneas (uniformidad en el color, sabor, tamaño y similares), resultando en un mayor rendimiento del cultivo y en una calidad uniforme del mismo.
El híbrido comercial es el producto del cruzamiento entre dos líneas puras que se han seleccionado por su capacidad para expresar heterosis. La combinación óptima ha sido resultado de un proceso costoso y, como siempre en MGV, largo, de evaluación en campo de decenas de miles de cruzamientos. En el desarrollo del híbrido y en su producción comercial, salvo en contados casos, Ia castración no es rentable hacerla manualmente (castración mecánica o eliminación de las anteras, llamada también emasculación). Los procedimientos que se utilizan son: Ia castración química (sustancias que eliminan o inactivan los gametos masculinos), Ia genética (nuclear) y Ia génico-citoplásmica. Esta última es Ia que ha tenido mayor éxito comercial.
Existen dos tipos principales de esterilidad masculina genética que pueden ser explotados para Ia producción de semillas híbridas en trigo: esterilidad masculina citoplasmática ("CMS") en líneas de substitución nuclear o aloplásmicas, causada por Ia interacción incompatible de un citoplasma extraño con el núcleo del trigo común, y esterilidad masculina génica ("GMS") en líneas euplásmicas, causada por una mutación recesiva o una deleción de un gen(es) nuclear(es) que normalmente confiere esterilidad masculina en el citoplasma del trigo común. La CMS, que implica a un citoplasma extraño, normalmente reduce Ia capacidad de rendimiento del híbrido, mientras que Ia GMS, que implica a un citoplasma nativo, debería permitir una expresión normal del genoma y, por ello, una capacidad total de rendimiento del híbrido.
En el año 1962 Wilson and Ross describen que Ia transferencia del núcleo del trigo harinero al citoplasma de Tríticum timopheevii (aloplasmia) induce esterilidad masculina citoplasmática (CMS) manteniendo el resto de características del trigo. Este descubrimiento provocó Ia búsqueda de genes restauradores y fuentes alternativas de androestrilidad génico- citoplásmica, con el objetivo último de producir híbridos comerciales de trigo. La línea aloplásmica se denomina Línea A, Ia línea portadora de los genes restauradores es Ia Línea R y se denomina Línea B a Ia línea genéticamente idéntica a A pero en el citoplasma original, que es por tanto autofértil. La semilla híbrida se obtiene sembrando próximas las líneas A y R, y recogiendo Ia semilla híbrida en Ia línea A. La línea A se mantiene polinizándola con Ia línea B.
La revisión más completa sobre trigo híbrido que existe es Ia de Pickett (Adv. Plant Breed., Suppl. J. Plant Breed., 15, 1-259, 1993). En esta revisión se describen los efectos sobre el trigo de 20 citoplasmas de los géneros Tríticum, Aegilops, Haynaldia y Sécale. La conclusión es Ia misma que Ia propuesta con anterioridad por otros autores; el citoplasma más útil para producir semilla híbrida de trigo es el de Tríticum timopheevii, fundamentalmente por Ia ausencia de efectos deletéreos frecuentes en otros sistemas (Virmani & Edwards, Advances in Agronomy 36, 1983).
Las líneas con esterilidad masculina citoplasmática (CMS) tienen una mutación en su genoma mitocondrial y Ia esterilidad masculina se hereda como un carácter dominante, transmitido por línea materna. La CMS puede ser empleada para Ia producción de semillas híbridas solo si:
1- Están disponibles mutantes CMS en un cereal dado,
2- Están disponibles los genes de restauración (nucleares) para restaurar Ia fertilidad de las líneas CMS cuando las semillas son el producto cosechado, 3- La mutación CMS no está asociada a una penalización.
Por tanto, el desarrollo de un sistema de androesterilidad génico- citoplásmica en trigo implica Ia obtención de una línea euplásmica, Ia obtención de líneas androestériles de trigo (líneas aloplásmicas), y Ia obtención de líneas restauradoras (Líneas R) seleccionando para Ia presencia de los genes restauradores de Ia fertilidad en Ia F1 , Io que implica el descubrimiento e incorporación de genes restauradores (genes Rf).
Existe una larga lista de genes Rf en trigo distribuidos en los tres genomas (ABD) del trigo, casi siempre procedentes de Ia especie donante del citoplasma (tabla 1 ), por Io que abundan los procedentes de T. timopheevii y es frecuente que estén localizados en los brazos cortos de los cromosomas del grupo 1 y 6. Se han descrito varios brazos cromosómicos en el trigo común que llevan genes que afectan a Ia fertilidad masculina, por ejemplo brazos cromosómicos del grupo 4: el brazo largo del cromosoma 4A (4AL), el brazo corto del cromosoma 4B (4BS) y el brazo corto del cromosoma 4D (4DS), que llevan los genes normales de fertilidad masculina Ms - AI, Ms - B1 y Ms - D1, respectivamente, y los brazos largos de los cromosomas del grupo 5: 5A, 5B y 5D (5AL, 5BL y 5DL, respectivamente), que llevan los genes Ms - A2, Ms - B2 y Ms - D2, respectivamente. Sin embargo, hasta ahora, sólo encontraron o introdujeron en el locus Ms - BI , en Ia región distal del brazo cromosómico 4BS (antes 4AS) había tres alelos recesivos que causan esterilidad masculina. Se dijo que estos alelos, a saber, ms - B1 - a, ms - B1 - b y ms - B1 - c (con frecuencia también llamados ms1a, ms1b y ms1c, respectivamente), no causaban efecto alguno, más allá de Ia esterilidad masculina, sobre el rendimiento de Ia planta (revisado por Wilson & Driscoll, 1983).
Tabla 1. Lista de genes Rf, distribución en los cromosomas y origen.
Hordeum chilense (2n=2x=14, H ch H ch ) es una cebada silvestre sudamericana que ha sido utilizada como parental femenino para Ia síntesis de anfiploides llamados tritórdeos (Martín, Journal of Cereal Science, 30, 85-95, 1999). Estos tienen por tanto citoplasma de cebada. Retrocuzado el tritórdeo octoploide (H ch H c AABBDD) repetidamente con trigo harinero (2n=6X=42, AABBDD) se genera una línea aloplásmica androestéril, su núcleo tiene Ia constitución genómica AABBDD del trigo y el citoplasma de Ia cebada, parental femenino del anfiploide. En el proceso de obtención, antes de Ia eliminación total de los cromosomas de Ia cebada, algunas líneas son fértiles. Recientemente se ha descubierto que el brazo corto del cromosoma 6H ch S es responsable de esta restauración (Martín et al. 2008. Australian Journal of Agricultura/ Science 59 (3): 206 - 213). Sin embargo, en hemiciqosis esta adición no es un restaurador efectivo, por Io que en principio no parece interesante.
Es necesario, por tanto, encontrar un mecanismo efectivo que permita Ia obtención de una línea restauradora de Ia fertilidad en trigo que permita Ia producción de semillas híbridas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención han desarrollado una línea restauradora de Ia fertilidad en trigo, construida mediante Ia introgresión en trigo de los factores restauradores procedentes de H. chilense. Aunque en hemicigosis Ia adición del brazo corto del cromosoma 6H ch S no es un restaurador efectivo, se ha visto que plantas doble monosómicas 6H ch 6D son fértiles, así como aquellas que presentan Ia traslocación 6H ch S/6DL.
Además, un cromosoma 1 H ch con una delección casi de Ia totalidad del brazo largo también restaura Ia fertilidad y es efectivo en hemicigosis.
Esta línea permite Ia producción de semillas híbridas de trigo mediante el establecimiento de tres líneas: una línea euplásmica, es un trigo harinero normal, Ia línea aloplásmica de trigo en citoplasma de H. chilense (obtenida cruzando tritórdeo ó anfiploide Hordeum chilense-\.ñgo por trigo, hasta Ia eliminación de todos los cromosomas de cebada, y Ia línea restauradora. La línea aloplásmica se propaga mediante polinización con Ia línea mantenedora, por Io que toda Ia progenie presenta esterilidad masculina, puesto que el citoplasma se deriva del parental femenino. Estas plantas con esterilidad masculina pueden por tanto, ser empleadas como parentales femeninos en los cruzamientos híbridos con Ia línea restauradora, sin Ia necesidad de Ia emasculación física de las partes reproductivas masculinas del parental femenino. La presencia de un gen restaurador de Ia fertilidad masculina en Ia línea restauradora, da lugar a una progenie híbrida F1 completamente fértil. Si en el parental masculino no hay ningún gen restaurador de Ia fertilidad, se obtienen híbridos con esterilidad masculina, útiles si los tejidos vegetativos de Ia planta fueran los más apreciados, pero no cuando Ia semilla es Ia parte más valorada de Ia planta. Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a una semilla de trigo, de aquí en adelante semilla de trigo de Ia invención, caracterizada por que su material genético comprende: a. un fragmento del cromosoma 1 H ch de Hordeum chilense, b. una doble monosomía para 6H ch y 6D, c. Ia traslocación 6H ch S/6DL, o cualquiera de sus combinaciones.
La presencia en el material genético de Ia semilla de más de uno de estos factores (el fragmento del cromosoma 1 H ch de Hordeum chilense, una doble monosomía para 6H ch y 6D o Ia traslocación 6H ch S/6DL) hace que se obtenga una línea restauradora mucho más efectiva que si sólo se encuentra presente uno de estos factores.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el material genético de Ia semilla de Ia invención comprende Ia introgresión del fragmento del cromosoma 1 H ch responsable de Ia restauración en hemicigosis y el brazo corto del cromosoma 6H ch .
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una célula de trigo, de ahora en adelante célula de trigo de Ia invención, caracterizada por que su material genético comprende: a. un fragmento del cromosoma 1 H ch de Hordeum chilense, b. una doble monosomía para 6H ch y 6D, c. Ia traslocación 6H ch S/6DL, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el material genético de Ia célula de Ia invención comprende Ia introgresión del fragmento del cromosoma 1 H ch responsable de Ia restauración en hemicigosis y el brazo corto del cromosoma 6H ch . Se entiende por "trigo" en esta memoria, la especie aestivum del Género Triticum, Tribu Triticeae, Subfamilia Pooideae, Familia Poaceae, Orden Poales, Clase Liliopsida, Phylum Streptophyta, Reino Viridiplantae. Por "traslocación" se entiende el intercambio entre dos o más cromosomas.
En otro aspecto de Ia invención se proporciona una planta de trigo, de ahora en adelante planta de trigo de Ia invención, que comprende una pluralidad de células de trigo de Ia invención, y/o producida tras el crecimiento de Ia semilla de trigo de Ia invención.
Otro aspecto se refiere a un cultivo de células de trigo de Ia invención, capaz de regenerar Ia planta de trigo de Ia invención. En una realización preferida de este aspecto, las células del cultivo de Ia invención proceden de embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raices, raíz inclina, antera, pistilo, flor, semilla, vaina o vastago de Ia planta de Ia invención.
El término "cultivo de células" en esta memoria, hace referencia a un cultivo de células aisladas del mismo o diferente tipo de tejido, o una colección de tales células organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo, cultivos de protoplastos, calli (grupo de callus o células vegetales indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y células vegetales que están aisladas de plantas o partes de las plantas, tales como embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen, hojas o anteras.
En otro aspecto de Ia invención, se proporciona un grano de polen cuyo material genético es un derivado haploide del material genético de Ia célula de trigo de Ia invención.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye un método para producir semillas de trigo híbrido que comprende: a. obtener una línea euplásmica formada por plantas híbridas entre Hordeum chilense y Triticum sp. b. obtener una línea aloplásmica formada por plantas de trigo con androsterilidad génico-citoplasmática. c. obtener una línea restauradora androesteril formada por plantas de trigo de Ia invención, d. cruzar Ia línea obtenida en b) con Ia línea obtenida en c).
Los híbridos entre Hordeum chilense y trigo pueden obtenerse emasculando espigas de H. chilense y polinizándolas con polen de trigo, al día siguiente de Ia polinización se aplica una solución de ácido giberélico a 75 ppm y a las tres semanas se rescata el embrión y se cultiva in vitro, obteniéndose el híbrido. La duplicación cromosómica de éste da lugar al anfiploide, el tritórdeo octoploide.
La línea aloplásmica se obtiene retrocuzando el tritórdeo octoploide (H ch H ch AABBDD) repetidamente con trigo harinero (2n=6X=42, AABBDD. La entrada de Hordeum chilense a utilizar debe ser Ia línea H1 de Ia colección del Instituto de Agricultura Sostenible. Otras entradas de Ia colección pueden no producir androesterilidad de Ia línea aloplásmica.
La línea restauradora se podría obtener, pero sin limitarnos, retrocuzando el tritórdeo octoploide (H ch H ch AABBDD) repetidamente con trigo harinero (2n=6X=42, AABBDD) y seleccionando con marcadores moleculares, como los descritos en las figuras, para Ia presencia de los cromosomas 1 H ch y 6H ch .
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Productos de amplificación por PCR usando el marcador ETS k01062 que amplifica específicamente el cromosoma 6H ch S en H. chilense y no produce un producto de amplificación en trigo. La adición ditelosómica T21 de 6HchS (T21AH1-11 ) se usa como control positivo. La linea restauradora T593 es amplificada por este par de cebadores, confirmando que el brazo del cromosoma 6HchS es responsable de Ia restauración de Ia fertilidad.
Fig. 2. Hibridación in situ de las células de los ápices de las raíces en metafase, de Ia línea restauradora T593 (42 + 6H ch S 6H ch S). (a) GISH usando una sonda de ADN genómico de H. chilense H1 (detectada con antidigoxigenina-FITC). El ADN de los cromosomas de trigo se detecta por tinción DAPI. (b) Señales doble FISH usando Ia sonda pTa71 (detectada con streptavidina-Cy3) y una sonda de ADN genómico de H. chilense H1 (detectada con antidigoxigenina-FITC). Los cromosomas 6H ch S muestran un intenso brillo y también son detectados por las sondas pTa71 (se encuentran indicados con flechas).
Fig. 3. Productos de amplificación por PCR usando el par de cebadores consenso de cloroplasto SSR-4. Se distingue un polimorfismo de 25 pb entre los genomas cloroplásticos del trigo harinero y del H. chilense. Fragmentos de amplificación de Ia línea de esterilidad masculina aloplásmica T218 y de Ia línea restaurada fértil T593 confirman que llevan el citoplasma H1 y que no hay transmisión del citoplasma parental.
Fig. 4. Desarrollo de Ia gametogénesis del polen en las líneas fértiles T21 T593 (A1-A5) y en Ia línea estéril masculina T218 (B1-B5). (A1 , B1) Estado de tetrada normal después de Ia meiosis Il en plantas con esterilidad y fertilidad masculina. (A2, B2) Se observan microsporas uninucleadas tempranas normales tanto en los genotipos de esterilidad como en los de fertilidad masculina. (A3) Microsporas uninucleadas tardías normales durante Ia vacuolación de microsporas en líneas fértiles. (B3) Microspora uninucleada tardía mostrando primeros síntomas de degeneración. (A4) Granos de polen binucleados con núcleos vegetativo y generativo perfectamente formado en genotipos fértiles. (B4) Diferentes estados de generación de microsporas del genotipo de esterilidad masculina en una sola antera. (A5) Granos de pollen trinucleados normales en antesis. (B5) Ejemplos de diferentes estados de degeneración al final de Ia microgametogénesis en Ia línea de esterilidad masculina.
Fig. 5. desarrollo del polen androestéril (parte superior) y el fértil (parte inferior).
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A continuación se ¡lustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto el valor de los cromosomas 1 H ch y/o 6H ch S, y de Ia traslocación 6H ch S/6DL) como restauradores de Ia fertilidad de Ia línea aloplásmica.
EJEMPLO
Desarrollo de Ia línea aloplásmica
Se obtuvo el tritordeo HT21 (2n = 8x = 56, H ch H ch AABBDD) después de Ia hibridación de H. chilense H1 (2n = 2x = 14, H ch H ch ) con T. aestivum cv. Chínese Spring, renombrado como T21 (2n = 6x = 42, AABBDD). Dos espigas de H. chilense fueron emasculadas y justo antes de Ia polinización los vastagos se introdujeron en un cultivo con una solución nutriente a Ia que se ha añadido ácido giberélico en una proporción de 75 p.p.m. Las espigas fueron polinizadas con polen de T. aestivum cv. Chínese Spring y posteriormente mantenidas en un ambiente controlado a 2O 0 C y luz continua. La solución del cultivo fue renovada en intervalos de 2 días con Ia solución stock sin ácido giberélico. Las espigas de cebada fueron protegidas con bolsas de polietileno ventiladas.
Se desarrolló un único grano en cada espiga. 16 días después de Ia polinización el grano fue extraído y se cultivó el embrión del mismo por el procedimiento estándar en agar orquídea. El conteo de los cromosomas en Ia raíz mostró que Ia planta tenía 28 cromosomas, como era de esperar de un híbrido de cebada - trigo.
Las espigas de Ia planta híbrida son esencialmente como las del trigo, pero más largas y más laxas que las de Ia variedad Chínese Spring y, como en H. chilense, con aristas cortas tanto en las glumas como en las lemas. El híbrido fue tratado con colchicina al 0.3% por Ia técnica del decapitado y algunas espigas dieron granos por autofecundación.
El anfiploide así obtenido, HT21 , fue recurrentemente cruzado con el parental de trigo T21 , obteniendo una línea aloplásmica llamada T218 (AABBDD). Esta línea portaba el citoplasma de H. chilense, siendo totalmente estéril.
Identificación de los cromosomas restauradores
T218 fue polinizado y cruzado con el set de líneas de cromosomas de adición en Chínense Spring. El híbrido derivado del cruzamiento T218 x
T21 de adición disómioca de 6H ch S (brazo corto del cromosoma 6H ch ) fue retrocruzado de nuevo como parental materno para Ia adición disómica de 6H ch S. La adición ditelosómica de 6H ch S en T218 fue seleccionada y denominada T593 (AABBDD + 6H ch S 6H ch S).
Cruzamientos con las líneas restauradoras
Con el fin de investigar si otros genes restauradores de Ia fertilidad eran capaces de restaurar Ia fertilidad de Ia línea aloplásmica, T218 fue cruzado con 25 líneas restauradoras de tres fuentes USDA, ARS, Aberdeen (Pl 473558, Pl 473559, Pl 591553, Pl 591554, Pl 591555, Pl 591556, Pl 554584, Citr 17452, Pl 383343, Pl 383344, Pl 473548, Pl 473549, Pl 473551 , Pl 473552, Pl 473553, Pl 473555 y Pl 473556), CIMMYT (337405, 332258, 332231 y 332197) y líneas proporcionadas por el Dr. Chen, School of Biological Technology and Engineering, Guizhou Normal University, China (QR720, QR715, QR650 y QR3). Los híbridos se crecieron durante dos años sucesivos y nunca se observó restauración de Ia fertilidad.
Observaciones citológicas
Para el conteo de los cromosomas somáticos, se recolectaron porciones de 1cm de longitud de las raíces de semillas germinadas y pretratadas durante 4 horas en una solución acuosa de colchicina (0.05%) a 25°C. Fueron fijadas en una mezcla recién hecha de 3 partes de etanol absoluto: 1 parte de ácido acético glacial (v/v) y teñida por Ia técnica convencional de Feulgen.
Se estudió Ia microesporogénesis en diferentes estados de desarrollo. Las espigas cortadas se introducen en una mezcla de 3 partes de alcohol absoluto : 1 parte de ácido acético glacial con unas gotas de cloruro de hierro (1 mi de una solución acuosa saturada de cloruro de hierro por 200 mi de Ia mezcla 3:1 ). El material fue transferido a alcohol de 90, tras 1 - 2 horas y guardado a 4 0 C. Las anteras fueron teñidas con acetocarmin al 0.1 %.
Análisis molecular
Se extrajo el ADN de plantas de 5 a 6 semanas, de las líneas T218, T593, T21 y H1 , de acuerdo con el protocolo de Doyle and Doyle (1990). Para verificar Ia presencia del citoplasma de H. chilense en las líneas aloplásmicas se emplearon las secuencias consenso de cloroplastos ccSSR-4 desarrolladas por Chung & Staub (2003). Se llevó a cabo Ia PCR (polymerase chain reaction) en 25 μl de mezcla de reacción como se describe en Chung & Staub (2003). Se empleó el marcador ETS (expressed sequence tag) k01062 (Hagras et al. 2005; Nasuda et al. 2005) para identificar el cromosoma en Ia línea restauradora. La PCR se llevó a cabo como se describe en Nasuda et al. (2005). Todos los productos de amplificación fueron resueltos por electroforesis en gel de agarosa y visualizados con bromuro de etidio.
Hibridación in situ (FISH)
Los extremos de las raíces fueron preparados como se describe en Ia sección de observación citológica. Las preparaciones se hicieron como se describe por Prieto et al. (2001 ). La sonda pTa7, que contiene una unidad de 18S-5.8S-26S rDNA (8.9 kb) de T. aestivum (Gerlach & Bedbrook 1979) fue marcada por transcripción con biotin-11-dUTP (Roche Corporate, Basel, Switzerland) y mezclada en Ia solución de hibridación hasta Ia concentración final de 5 ng/μl. Tras el examen de los núcleos hibridados con su sonda de ADN respectiva, las preparaciones fueron re- sondadas usando el genoma total de H. chilense como sonda. El ADN total de H. chilense fue marcado por trascripción con digoxigenina-11-dUTP. El protocolo de hibridación in situ fue el de Cabrera et al. (2002). Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina fueron detectadas con antidigoxigenina-FITC (Roche Corporate) y conjugados de streptavidina- Cy3 (Sigma, St. Louis, MO, USA), respectivamente. Los cromosomas fueron teñidos y contados con DAPI (4 ' , 6-diamidino-2-fenilindol) 339 y montados en Vectashield (Vector Laboratories, Inc.). Se visualizaron usando un microscopio de epifluorescencia Leica. Las imágenes se capturaron con una cámara SPOT CCD usando el software SPOT 2.1 (Diagnostics Instruments, Inc., Sterling Heights, Ml, USA) y procesado con el software Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc., San José, CA, USA).
Experimentos en invernadero
Se diseñó un experimento con diseño al azar con 5 repeticiones en condiciones de invernadero, para evaluar Ia morfología y fertilidad de Chínese Spring (T21 ), Ia adición ditelosómica de 6H ch S T21 , Ia línea aloplásmica T218 y Ia línea restauradora T593. Se cultivaron 5 plantas de cada fenotipo en invernadero de diciembre a abril. Se mantuvo Ia temperatura en invernadero entre 7 y 25 0 C (noche/día), y se suplemento Ia luz para mantener un fotoperiodo de 13 horas diarias. Se tomaron los datos de Ia altura de Ia planta, aristas por planta, espiguillas por espiga y semillas por planta, y se llevó a cabo un análisis de Ia varianza usando el método de Ia diferencia menos significativa (l.s.d.) (P ≤ 0.05)
Identificación de los cromosomas de H. chilense responsables de Ia restauración de Ia fertilidad masculina
Durante el proceso de obtención de Ia línea aloplásmica T21 en el citoplasma de H1 , algunas plantas con cromosomas remanentes de H. chilense llegaron a ser parcialmente autofértiles. Con el fin de identificar los cromosomas de H. chilense responsables de Ia restauración de Ia fertilidad masculina, Ia línea T218 fue polinizada y cruzada con el set de cromosomas de adición de las líneas de H1 en Chínese Spring (T21 ). Se observó alguna fertilidad del polen en el híbrido de adición ditelosómica de 6H ch S derivado del cruzamiento de T218 x T21. Este híbrido fue retrocruzado de nuevo con el ditelo 6H ch S T21 y se seleccionó Ia adición ditelosómica de 6H ch S en T218, que se llamó T593. Esta línea fue completamente fértil.
Con el fin de verificar que el cromosoma responsable de Ia restauración de Ia fertilidad fue 6H ch S, seleccionamos el marcador ETS k01062. La PCR con este marcador da un amplificado diferente en trigo harinero y cebada (H. vulgare cv. Betzes) (Nasuda et al. 2005), y es asignado al brazo corto del cromosoma 6H en cebada. Más aún, se ha demostrado también amplificado en el cromosoma 6H ch en H. chilense (Hagras et al. 2005). EST k01062 fue amplificado para el propósito del presente trabajo en líneas T21 , H1 , T218, T593, y Ia adición disómica de 6H ch en T21 (llamada T21AH1-11 ) (Fig. 1 ). No se obtuvo ningún producto de amplificación cuando se uso T21 y T218 como patrón, mientras que se obtuvo un producto de unos 370 pb cuando se amplificaron las líneas 6H ch S ditelo H1 , T593 y T21. Este resultado confirma que Ia adición del brazo del cromosoma 6H ch S es responsable de Ia restauración, y podría implicar que el brazo del cromosoma 6H ch S lleva al menos un gen restaurador de Ia fertilidad.
Caracterización citogenética
La línea fértil T593 también se caracterizó mediante técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación in situ genómica (GISH) en T593, usando el ADN genómico de H. chilense H1 como sonda, claramente detectó Ia adición ditelosómica de los cromosomas de H. chilense. (Fig. 2). La sonda pTa71 , que contiene una unidad de 18S-5.8S- 26S rDNA (localizada en Ia región organizadora nuclear de los cromosomas (NORs)) combinada con Ia sonda de ADN genómico de H. chilense se empleó para confirmar Ia presencia de Ia adición ditelosómica 6H ch S en Ia línea restauradora T593 (Fig. 2). La NOR en Hordeum se localiza en los segmentos cromosómicos 5HS y 6HS, por Io que Ia presencia de Ia señal de Ia sonda pTa71 en los cromosomas de H. chilense confirma los resultados de los marcadores moleculares en identificar Ia adición ditelosómica 6H ch S .
Caracterización molecular citoplásmica
Para comprobar que Ia restauración de Ia fertilidad es consecuencia de Ia adición cromosómica 6H ch S, y no como resultado de Ia pérdida de aloplasmia (transmisión del citoplasma paternal a Ia línea T593), se emplearon varios pares de primers ccSSR, que detectan polimorfismos entre H. chilense y Chínese Spring, que son fácilmente visualizables en electroforesis en agarosa. Se ha visto que el cebador ccSSR-4 es polimórfico, amplificando productos de 200 bp en trigo, y 225 bp en el citoplasma H1 (Atienza et al. 2007c). La línea T593 fue amplificada con esta pareja de primers, confirmando que era una línea aloplásmica (Fig. 3).
Caracterización morfológica: morfología, fertilidad y medioambiente
La CMS de Ia línea aloplásmica T218, así como Ia fertilidad de Ia línea restauradora T593, fueron estables bajo diferentes condiciones ambientales: cámara de crecimiento, invernadero y campo abierto.
Cuando se compara con el trigo común, las líneas aloplásmicas T218 y
T593 tuvieron un retraso de 3 - 4 días en Ia anthesis cuando se crecieron en el invernadero y en Ia cámara de crecimiento bajo condiciones de días largos, aunque Ia diferencia fue de 7 días cuando se creció en campo abierto. Aparte de Ia carencia de polen viable en Ia linea de esterilidad masculina, las plantas no exhibieron otras anormalidades florales o del desarrollo. Ninguna arruga o defecto de germinación se observó en las semillas de las líneas aloplásmicas.
Los datos de Ia tabla 2 muestran los resultados de comparar las líneas T21 , T218, Ia adición ditelosómica de 6H ch S a T21 y T593, en términos de morfología y fertilidad en condiciones de invernadero. El ditelo 6H ch S T21 fue incluido en el cuadro para comparar T593 vs ditelo 6H ch S T21 , por ejemplo, los mismos genotipos en los citoplasmas de H1 y T21 , respectivamente. Por esta comparación es posible un mejor análisis del efecto del citoplasma H1. Se ha visto que Ia línea T218 era alrededor de 18 cm más corta (en altura) que Ia T21. Sin embargo, aunque se observó que Ia línea restauradora T593 era unos 10 cm más corta que Ia T21 , en este cuadro no se encontró diferencias significativas, ni con Ia T21 ni con el ditelo 6H ch S T21. El número de aristas por planta no fue estadísticamente significativo entre los genotipos. El número de espiguillas por espiga fue menor en Ia línea con esterilidad masculina T218 que en cualquier otro genotipo, mientras Ia línea restauradora T593 mostraba un valor intermedio entre el T21 y el ditelo 6H ch S T21. El número de vastagos por planta no fue significativamente diferente entre los genotipos. El número de espiguillas por espiga fue menor en Ia línea con esterilidad masculina T218 que en cualquier otro genotipo, mientras que Ia línea restauradora T593 muestra un valor intermedio entre el T21 y el ditelo 6H ch S T21. El grado de esterilidad en Ia línea con esterilidad masculina T218 fue de un 100%, y Ia línea restauradora T593 mostró aproximadamente un 68% de granos viables comparado con T21 , y un 77% comparado con el ditelo 6H ch S T21.
Cruzamientos con 25 genes restauradores de Ia fertilidad conocidos La línea estéril aloplásmica T218 se cruzó con 25 líneas restauradas de diferentes sistemas CMS de trigo para testar su habilidad de restaurar Ia fertilidad. Ninguna de las plantas F1 mostró ningún grado de fertilidad cuando se crecieron en campo abierto. Se llevó a cabo un segundo experimento empleando 25 líneas en condiciones de invernadero, pero de nuevo, ninguna de las plantas F1 mostró ningún grado de fertilidad.
Tabla 2. Comparación de las líneas T21 , T218, y Ia adición ditelosómica de 6H ichS a T21 y T593, en términos de morfología y fertilidad en condiciones de invernadero.