CN201310443498.4的优先权。 本申请引用上述中国专利申请的全文。 技术领域

本发明公开了一种葡聚糖饮料及其制备方法。 背景技术

多糖 （polysaccharide ) 是一种由单糖以糖苷键键合而成大分子聚合物 ， 研究表明，多糖具有免疫调节、抗病毒、抗癌 、降血糖、降血压等益生功能。 自然界中的多糖主要分布于微生物、 高等植物、 动物、 地衣以及藻类中， 其 中， 微生物来源的多糖尤指其胞外多糖， 为某些特定微生物 （如乳酸菌、 土 壤杆菌、 根瘤菌等） 在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类 化合物， 其中， 依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖 ， 而粘液多糖则以渗透 于生长环境中的形式存在。

众所周知， 明串珠菌是一类高产胞外多糖的乳酸菌， 其中， 肠膜明串珠 菌 euconostocmesenteroides 可以合成多种类型的葡聚糖 （一种以葡萄糖 为单糖组成单位， 由 α-1 ,3、 α-1 ,4或 α-1 ,6糖苷键键合而成的葡萄糖高分子 聚合物）， 相关研究证实， 由肠膜明串珠菌合成的葡聚糖具有调节免疫、 抗 癌等临床功效。

然而在目前由明串珠菌制备葡聚糖的工艺中， 发酵基料的组成复杂、 部 分成分来源紧缺， 导致发酵基料成本高昂； 采用这些基料发酵后， 在提取制 备多糖的过程中， 通常为了去除蛋白质等干扰物质而加入氯仿、 正丁醇、 三 氟三氯乙烷、 三氯乙酸等有机溶剂， 这些因素对商业化生产的成本、 多糖的 品质以及多糖在食品、 医疗领域应用的安全性均存在不良影响。 纵观国内饮料市场， 尽管各类功能性饮料丛生， 如红牛 （补充能量）、 脉动 （补充维生素） 等， 但以多糖为主要功能成分的饮料几乎没有。 而且， 现有的含多糖饮料的相关研究报道， 其涉及的多糖来源多为植物多糖， 应用 方式也都是人为添加于饮料中，狭隘的多糖来 源与人为添加的应用方式使这 类产品渐渐缺乏创新性与安全性。

因此， 寻找一种以微生物自身代谢产生的多糖为功能 性成分的发酵型饮 料， 将是未来新型功能性饮料发展的趋势之一。 该问题亟待解决。 发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服了现有多 糖饮料中多糖来源多为 植物， 来源狭隘， 还需经过特定处理方式提取之后， 再人为添加得到产品的 应用方式缺乏安全性，特别对于现有市场以葡 聚糖为主要功能成分的饮料存 在空白的缺陷， 提供了一种生产成本低、 工艺简洁并能广泛工业应用的葡聚 糖饮料及其制备方法。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问 题：

本发明的葡聚糖饮料的制备方法包括如下步骤 ：

( 1 )将肠膜明串珠菌 Leuconostocmesenteroides 发酵菌种接种于发酵 培养基中， 好氧培养， 得发酵液；

( 2 ) 将发酵液与含有甜味料和酸味剂的勾兌液混合 均匀， 均质、 灭菌 即可；

其中， 所述的发酵培养基包括蔗糖和番茄汁水溶液； 所述的番茄汁水溶 液中番茄汁的体积百分比浓度为 40%〜100%；所述的发酵培养基的 pH用碱 调 pH为 6.0〜8.0； 所述发酵液的含量占所述的葡聚糖饮料总量的 体积百分 比为 15.5%〜66.6%。

本发明中， 所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积 比较佳地为 lg:20mL〜lg: 5mL， 更佳地为 lg: 10mL〜lg: 5mL， 尤其更佳地为 3g:20mL。 本发明中， 所述的番茄汁水溶液中番茄汁的体积百分比浓 度较佳地为

100%。

本发明中， 所述的发酵培养基的 pH较佳的用碱调至 7.0。其中， 所述的 碱为本领域常规， 一般为食品级碱， 较佳地为 Na ₂ C0 ₃ 、 NaHC0 ₃ 和 NaOH 中的一种或多种。

本发明中，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁采 用本领域常规制备方法制 得， 一般包括如下步骤： 将成熟番茄洗净、 去皮后， 进行机械破碎， 分离， 取上清液， 即可。 按照该方法制得的番茄汁的主要理化指标为： 固形物含量 3.28g/100mL〜4.04g/100mL， 灰分 0.46g/100mL〜0.59g/100mL， 蛋白质 0.39g/100mL〜0.52g/100mL， 脂肪 0.014g/100mL〜0.020g/100mL， 碳水化合 物 2.42g/100mL〜2.88g/100mL。

其中， 所述的分离为本领域常规分离技术， 较佳地为过滤、 抽滤和离心 中的一种或多种。 所述的过滤的介质为本领域常规， 较佳地为多层纱布或无 纺布。所述的离心为本领域常规操作，较佳地 为 2000g〜3000g， lOmii！〜 20min 离心。

本发明中， 所述的发酵培养基按本领域常规方法制备， 较佳的由下述方 法制得：将所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液 均匀混合溶解后，在 95 °C〜125 °C 灭菌 5mii！〜 30min， 更佳的灭菌的时间为 20mii！〜 30min。

步骤 （ 1 ) 中， 所述的发酵菌种为常规的肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) ， 较 佳 地 为 肠 膜 明 串 珠 菌 ( Leuconostocmesenteroides )LM 57、肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) LM 79、 肠膜明串珠菌 ί Leuconostocmesenteroides LD 106 和保藏号为 CGMCC N0.6432的肠膜明串珠菌 ^ Leuconostocmesenteroides BD 1710中 的一种或多种， 更佳地为保藏号为 CGMCC N0.6432 的肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) BD 1710。

步骤 （1 ) 中， 在所述的接种时， 所述的发酵菌种一般以种子液的形式 接种， 其中活菌数一般为 1.0 X 10 ⁹ 〜3.0 X 10 ⁹ CFU/mL。

步骤 （1 ) 中， 所述的接种为本领域常规操作， 所述的发酵菌种的接种 量较佳地为 0.5%〜4.0%， 更佳地为 2.0%〜4.0%， 尤其更佳地为 2.0%， 所述 的百分比为种子液占发酵培养基的体积百分比 。

步骤 （1 ) 中， 所述的好氧培养为本领域常规操作。 所述的好氧培养的 温度较佳地为 25°C〜34°C， 更佳地为 25°C〜31 °C， 尤其更佳地为 28°C。 所 述的好氧培养的时间较佳地为 121！〜 54h， 更佳地为 301！〜 54h， 尤其更佳地 为 48h。 所述的好氧培养的方式较佳地为摇床培养或发 酵罐通气培养。

步骤 （2 ) 中， 所述的含有甜味料和酸味剂的勾兌液为本领域 常规， 为 甜味料、 酸味剂与水混合后得到的溶液。

步骤 （2 ) 中， 所述的甜味料为本领域常规使用， 较佳的为白砂糖、 糖 浆和甜味剂中的一种或多种； 其中， 所述的甜味剂为本领域常规使用， 较佳 的为阿斯巴甜、 甜蜜素和安赛密中的一种或多种。 所述的甜味剂的用量为本 领域常规使用， 较佳的为使所述的葡聚糖饮料的甜度为折合成 蔗糖甜度 5%〜10%。

步骤 （2 ) 中， 所述的酸味剂为一般使用的常规饮料用酸味剂 ， 较佳的 为柠檬酸、 苹果酸、 酒石酸、 乳酸和醋酸中的一种或多种。 所述的酸味剂的 用量为本领域常规使用， 较佳的为使所述的葡聚糖饮料的滴定酸度 70 °T〜 80。Τ。

步骤 （2) 中， 所述的均质为本领域常规操作， 较佳的为 15〜30MPa压 力下均质。

步骤（2 )中，所述的灭菌为本领域常规操作，较佳的� �件为温度 95°C〜 125 °C ; 时间为 5min〜30min。

本发明还提供前述葡聚糖饮料制备方法制得的 葡聚糖饮料。该葡聚糖饮 料中葡聚糖的质量体积比含量一般 0.5%。

在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明提供的葡聚糖饮料，制备过程采用� �发酵培养基的来源广泛、 成本低廉、 天然安全， 经肠膜明串珠菌 iLeuconostocmesenteroides 发酵菌 种发酵后获得的葡聚糖， 在稀释、 调味后可直接作为功能性饮料来食用， 打 破现有市场上稀缺以葡聚糖作为功能性成分饮 料的现状。

2、 本发明饮料中葡聚糖来自于微生物， 本身存在于发酵基料， 相比现 有的含多糖饮料的相关研究报道的多糖大多来 源于植物，且均人工添加入饮 料，本发明所涉及的多糖来源以及简化的制作 工艺提高了相关产品的创新性 与安全性， 应用前景十分广阔。 附图说明

图 1为实施例 1中葡聚糖饮料中多糖样品糖基组成的色谱图� � 具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但 并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常 规方法和条件， 或按照商品说明书选择。

本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的 温度，一般为 25 °C。下述 实施例中发酵菌种为保藏号为 CGMCC N0.6432 的肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) BD 1710， 或丹尼克斯 （中国） 有限公司提供 的肠膜明串珠菌 （ Leuconostocmesenteroides ) LM 57、 肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides )LM 79、肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) LD 106。

下述实施例中： 番茄汁 XI、 X2、 X3、 X4 的制备： 将成熟番茄清洗、 去皮后， 进行机 械破碎， 分别通过过滤、 抽滤、 分离、 3000g离心 10min、 或者 2000g离心 20min取上清液， 即可。

发酵培养基 Sl、 S2、 S3和 S4的制备： 将蔗糖与番茄汁水溶液按质量体 积比 3g:20mL、 lg:5mL、 lg:10mL、 lg:20mL分别混合， 加热至蔗糖溶解后 冷却至室温， 分别以碱 Na ₂ C0 ₃ 、 NaHC0 ₃ 、 NaOH、 NaOH调节 pH分别至 7.0、 6.0、 7.5、 8.0， 分别在 121°C下灭菌 20min、 95°C下灭菌 30 min、 125 °C 下灭菌 5min、 100°C下灭菌 15min即可。 其中， 所述的番茄汁水溶液中番茄 汁的浓度分别为 100%、 40%、 80%、 60%， 所述的番茄汁分别为番茄汁 XI、 X2、 X3、 X4。

发酵 菌种 （ 种 子液 ） Z1 的 制 备 ： 将肠膜 明 串 珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) BD 1710的冻干粉以少量无菌蒸馏水溶解， 用 接种环挑取一环划线于 M17蔗糖培养基 （以 5.0% (w/v) 蔗糖取代 M17培 养基中 0.5% (w/v) 的乳糖， OXOIDLTD., 英国）上， 28°C好氧培养 24h后 取出， 用接种环挑取单菌落放入 lmL M17蔗糖培养基中， 运用涡旋震荡器 将菌落均匀分散于该液体培养基内， 28°C、 180rpm摇床培养 24h后取出， 以 2.0% (v/v) 接种量接种于 50mL上述 M17蔗糖培养基中， 再置于 28°C、 180rpm摇床培养 24h， 培养物 10,000 g离心 10分钟， 弃去上清， 菌体用无 菌蒸馏水洗涤 2 次后， 用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮， 即可； 活菌数约 2.0 χΐθ ⁹ CFU/mL。

发酵菌种 （种子液） Z2、 Z3、 Z4分别以下述微生物菌制备， 肠膜明串 珠 菌 ( Leuconostocmesenteroides ) LM 57 、 肠 膜 明 串 珠 菌

( Leuconostocmesenteroides )LM 79、肠膜明串珠菌 ( Leuconostocmesenteroides ) LD 106的种子液的制备过程同上； 活菌数分别约 Ι.ΟχΙΟ ⁹ CFU/mL、 2.0χ10 ⁹ CFU/mL、 3.0 lO ⁹ CFU/mLo

效果验证时， 发酵液中葡聚糖的提取： 取发酵液以 4倍于发酵液体积的 无菌水稀释， 15,000 g离心 10 min， 取上清液， 加入 3倍体积于上清液体积 的无水乙醇， 静置过夜， 15,000 g离心 10 min， 收集沉淀物并溶于水， 得葡 聚糖的水溶液， 真空冷冻干燥后即得葡聚糖。

效果验证时，葡聚糖饮料中葡聚糖的提取： 取乳酸菌饮料 15,000 g离心 10 mm, 取上清液 （去除灭活的死菌体）， 加入 3倍体积的无水乙醇， 静置 过夜， 15,000 g离心 10 min， 收集沉淀物并溶于水， 得葡聚糖的水溶液， 真 空冷冻干燥后即得葡聚糖。

实施例 1

1、 制备葡聚糖饮料

( 1 ) 将发酵菌种肠膜明串珠菌 BD 1710种子液 Z1以 2.0% (v/v) 的接 种量接入上述方法制备的发酵培养基中， 所述的发酵培养基 Sl， 其中蔗糖 与番茄汁水溶液的质量体积比为 3g:20mL， 所述的番茄汁水溶液的浓度为 100%， pH为 7.0， 28°C、 180rpm摇床培养 48h， 发酵结束后取发酵液， 经 测定， 该发酵液中葡聚糖含量为 3.22% (w/v)。

(2) 将白砂糖、 柠檬酸完全溶解于 50°C的水中， 即得勾兌液。 将上述 发酵液与勾兌液以 l : 5.44(v/v)充分混合均匀后在 15MPa压力下进行均质， 并于 95°C灭菌 30 mm， 灌装， 得本实施例的乳酸菌饮料产品。

经检测，本实施例生产的富含葡聚糖的乳酸菌 饮料中葡聚糖含量 0.50%， 甜度为含有 10%的蔗糖甜度，酸度 80°T，所述发酵液的含量占饮料总量的体 积百分比为 15.5%。

2、 成分检测

( 1 ) 标准样品配置：

多糖水解：吸取 lOO L浓度为 4m _g /mL~5mg/mL的多糖样品溶液于 5mL 的具塞刻度试管中， 加入 ΙΟΟμΙ^的 4moL/LTFA， 充 N ₂ 封管， 110°C烘箱中 水解 2h; 冷却后打开盖， 加 20(^L甲醇后用N ₂ 吹干， 如此重复加甲醇并用 N ^ 3次， 去除 TFA， 将其残渣用水溶解定容至 5mL， 用 0.45μπι微孔膜过 滤后供进样分析。

(2) 色谱条件

色谱柱： CarboPacPA203mmi.d. 150mm；

流动相： A、 H ₂ 0; B、 250mmol/LNaOH; C、 Imol/LNaAc;

三元梯度洗脱： 流速： 0.5mL/min; 积分脉冲安培检测器；

Au工作电极： Ag/AgCl参比电极；

进样体积： 20μΙ^ 柱温： 30°C。

(3 )按前述方法提取制备葡聚糖饮料的步骤（1 )发酵液中的葡聚糖样 品， 并以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。

肠膜明串珠菌 BD 1710多糖样品糖基组成的色谱分析结果见图 1， 该多 糖在 10.450mm有单一吸收峰， 且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时 间一致。 可见， 肠膜明串珠菌所产多糖是由葡萄糖单一糖基组 成的， 即为葡 聚糖。

实施例 2

( 1 ) 将发酵菌种 （种子液） Z2 以 0.5% (v/v) 的接种量接入上述方法 制备的发酵培养基中， 所述的发酵培养基 S2， 其中蔗糖与番茄汁水溶液的 质量体积比为 4g:20mL，所述的番茄汁水溶液的浓度为 40%， pH为 6.0， 34°C、 发酵罐通气培养 54h， 发酵结束后取发酵液， 经测定， 该发酵液中葡聚糖含 量为 1.05% (w/v) o

(2) 将白砂糖、 柠檬酸、 乳酸完全溶解于 50°C的水中， 即得勾兌液。 将上述发酵液与勾兌液以 1 : 1 (v/v) 充分混合均匀后在 30MPa压力下进行 均质， 并于 100°C灭菌 20 mm， 灌装， 得本实施例的乳酸菌饮料产品。

经检测，本实施例生产的富含葡聚糖的乳酸菌 饮料中葡聚糖含量 0.53%， 甜度为含有 5%的蔗糖甜度， 酸度 70 °T， 发酵液含量占饮料总量的体积百分 比为 50%。

实施例 3 ( 1 ) 将发酵菌种 （种子液） Z3 以 1.0% (v/v) 的接种量接入上述方法 制备的发酵培养基中， 所述的发酵培养基 S3， 其中蔗糖与番茄汁水溶液的 质量体积比为 lg: 10mL，所述的番茄汁水溶液的浓度为 80%，pH为 7.5，31 °C、 180rpm摇床培养 30h， 发酵结束后取发酵液， 经测定， 该发酵液中葡聚糖含 量为 1.68% (w/v

(2 ) 将白砂糖、 柠檬酸、 醋酸完全溶解于 50°C的水中， 即得勾兌液。 将上述发酵液与勾兌液以 1 : 2 (v/v) 充分混合均匀后在 20MPa压力下进行 均质， 并于 110°C灭菌 15 mm， 灌装， 得本实施例的乳酸菌饮料产品。

经检测，本实施例生产的富含葡聚糖的乳酸菌 饮料中葡聚糖含量 0.56%， 甜度为含有 6.8%的蔗糖甜度， 酸度 73 °T， 发酵液含量占饮料总量的体积百 分比为 33.3%。

实施例

( 1 ) 将发酵菌种 （种子液） Ζ4 以 4.0% (v/v) 的接种量接入上述方法 制备的发酵培养基中， 所述的发酵培养基 S4， 其中蔗糖与番茄汁水溶液的 质量体积比为 lg:20mL，所述的番茄汁水溶液的浓度为 60%，pH为 8.0，25 °C、 发酵罐通气培养 12h， 发酵结束后取发酵液， 经测定， 该发酵液中葡聚糖含 量为 0.81% (w/v

(2 )将白砂糖、柠檬酸、酒石酸完全溶解于 50°C的水中， 即得勾兌液。 将上述发酵液与勾兌液以 1 : 0.5 (v/v) 充分混合均匀后在 25MPa压力下进 行均质， 并于 125°C灭菌 5 mm， 灌装， 得本实施例的乳酸菌饮料产品。

经检测，本实施例生产的富含葡聚糖的乳酸菌 饮料中葡聚糖含量 0.54%， 甜度为含有 8.5%的蔗糖甜度， 酸度 77°T， 发酵液含量占饮料总量的体积百 分比为 66.6%。

效果实施例 产品口味与喜好程度测试

以实施例 1〜4的产品为实验对象， 进行产品的口味测试。 测试人数 50 人。 品尝方式： 采用不记名打分的方式进行品尝； 分别对实施例 1〜4 的产 品的色泽、 酸甜比、 风味、 口感、 营养项进行单独打分， 每一项满分是 20 分， 计算平均分及其总分， 统计结果记录于表 1。

同时， 根据对产品的整体喜好程度给出的意见， 统计对每个单品的喜好 人数， 统计结果记录于表 2。

表 1产品口味测试结果数据统计表

表 2产品喜好程度测试结果数据统计表

从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出 ， 总体而言， 本发明的 聚糖饮料在产品风味、 口感、 营养方面可被大部分消费者所接受。

效果实施例 2产品体系稳定性实验

以实施例 1〜4的产品为观察对象， 在常温条件下放置， 观察不同放置 时间内产品的体系稳定性， 观察结果见表 3。

表 3实施例产品体系稳定性统计结果

水析层， 下层无

沉淀析出

上层有 0.2mm 上层有 0.1mm 上层有 0.1mm

75天 水析层， 下层无 水析层， 下层无 状态良好 水析层， 下层无 沉淀析出 沉淀析出 沉淀析出 上层有 0.3mm 上层有 0.2mm 上层有 0.1mm 上层有 0.1mm

90天 水析层， 下层无 水析层， 下层无 水析层， 下层无 水析层， 下层无 沉淀析出 沉淀析出 沉淀析出 沉淀析出 由上表结果可以看出， 本发明的葡聚糖饮料在常温保存 90天期间内， 体系稳定性优良， 没有不可接受的分层与蛋白沉淀现象。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是 本领域的技术人员应当理 解， 这些仅是举例说明， 在不背离本发明的原理和实质的前提下， 可以对这 些实施方式做出多种变更或修改。 因此， 本发明的保护范围由所附权利要求 书限定。