ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原� ��、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。

 C ₁ ~C ₆ のアルキル基とは、炭素数1~6の直鎖若しくは 分岐鎖のアルキル基又は炭素数3~6の環状アル キル基であり、例えば、メチル基、エチル基 、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、 イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、 シクロプロピル基、シクロブチル基などを挙 げることができる。

 C ₁ ~C ₆ のアルコキシ基とは、炭素数1~6の直鎖若しく は分岐鎖のアルコキシ基又は炭素数3~6の環状 アルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、 エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ 基、ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブト� �シ基、tert-ブトキシ基、シクロプロポキシ基 、シクロブトキシ基などを挙げることができ る。

 C ₁ ~C ₆ のアルキルスルファニル基とは、炭素数1~6の 直鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルファニル 基であり、例えば、メチルスルファニル基、 エチルスルファニル基、プロピルスルファニ ル基、イソプロピルスルファニル基、ブチル スルファニル基、イソブチルスルファニル基 、sec-ブチルスルファニル基、tert-ブチルスル ファニル基などを挙げることができる。

 C ₁ ~C ₆ のアルキルスルフィニル基とは、炭素数1~6の 直鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルフィニル 基であり、例えば、メチルスルフィニル基、 エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニ ル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチル スルフィニル基、イソブチルスルフィニル基 、sec-ブチルスルフィニル基、tert-ブチルスル フィニル基などを挙げることができる。

 C ₁ ~C ₆ のアルキルスルホニル基とは、炭素数1~6の直 鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルホニル基で あり、例えば、メチルスルホニル基、エチル スルホニル基、プロピルスルホニル基、イソ プロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基 、イソブチルスルホニル基、sec-ブチルスル� �ニル基、tert-ブチルスルホニル基などを挙げ ることができる。

 ヘテロアリール基は、環の構成原子とし� ��硫黄原子、酸素原子、窒素原子から選ばれ� ��1~3のヘテロ原子を含む5員若しくは6員芳香� �複素環であって、該芳香族複素環は任意に� �ンゼン環又は5員若しくは6員芳香族複素環と 縮合環を形成してもよい。好ましいヘテロア リール基としては、該芳香族複素環が硫黄原 子、酸素原子、窒素原子から選ばれる1~3のヘ テロ原子を含み、そのうち1個のヘテロ原子� �結合環原子に隣接する窒素原子である基が� �げられる。なお、結合環原子とは、アミド� �の窒素原子との結合にあずかる環内原子を� �味し、このような結合環原子としては炭素� �子が好ましい。

 好ましいヘテロアリール基としては、チ� ��ゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル� ��、ピリジニル基、ピラジニル基、ピリミジ� ��ル基、ピリダジニル基、オキサゾリル基、� ��ミダゾリル基、トリアジニル基、ベンゾチ� ��ゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾ� ��ミダゾリル基、ピリドチアゾリル基、キノ� ��ニル基などが挙げられる。更に好ましくは� ��アゾリル基、ピリジニル基、ピラジニル基� ��ピラゾリル基、チアジアゾリル基又はピリ� ��チアゾリル基である。

 Aの「置換基を有してもよいヘテロアリール 基」としては、無置換又はモノ置換のヘテロ アリール基が好ましく、置換基としてはハロ ゲン原子、C ₁ ~C ₆ のアルキル基、C ₁ ~C ₆ のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、式
 -(CH ₂ ) _m C(O)OR ³
(式中、R ³  は水素原子又はC ₁ ~C ₆ のアルキル基を示し、mは0~2の整数を示す。)� ��表される基が挙げられる。

 本発明の化合物は、かかる立体構造をとる� ��とにより、優れたGK活性化作用を有する。� �た、Aが無置換又はハロゲン原子若しくはC ₁ ~C ₆ のアルキル基でモノ置換されたヘテロアリー ル基では、優れた薬物動態特性に基づく血中 移行性を実現し、優れた血糖降下作用を示す 。例えば、後述するように、シクロペンチル 基とこれに結合したフッ素原子の立体構造及 び/又は*を付した炭素原子の立体配置が異な� ��(+)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ ル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-N-(チア� ��ール-2-イル)プロピオン酸アミド(S配置)、(-) -3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]- 2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾー ル-2-イル)プロピオン酸アミド、(+)-3-[(1β,3α,4 α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチ� �スルホニル)フェニル)-N-(チアゾール-2-イル)� ��ロピオン酸アミドでは本発明のような優れ� ��血糖降下作用は示さない。

 なお、本発明において旋光度(-)とは、特� ��規定しない限りクロロホルムを溶媒として� ��トリウムD線で測定した旋光度が(-)であるこ とを意味する。

 また、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ ペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-N -(チアゾール-2-イル)プロピオン酸アミドは、 (R)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ� �]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾ ール-2-イル)プロピオン酸アミドや(R)-3-((1r,3R, 4S)-3,4-ジフルオロシクロペンチル)-2-(4-(メチ� �スルホニル)フェニル)-N-(チアゾール-2-イル)� ��ロピオン酸アミドと、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジ フルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホ� ��ル)フェニル)-N-(5-フルオロチアゾール-2-イ� �)プロピオン酸アミドは、(R)-3-[(1α,3α,4α)-3,4- ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� ��ニル)フェニル)-N-(5-フルオロチアゾール-2-� �ル)プロピオン酸アミドや(R)-3-((1r,3R,4S)-3,4-ジ フルオロシクロペンチル)-2-(4-(メチルスルホ� ��ル)フェニル)-N-(5-フルオロチアゾール-2-イ� �)プロピオン酸アミドと、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4- ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� ��ニル)フェニル)-N-(1-メチルピラゾール-3-イ� �)プロピオン酸アミドは、(R)-3-[(1α,3α,4α)-3,4- ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� ��ニル)フェニル)-N-(1-メチルピラゾール-3-イ� �)プロピオン酸アミドや(R)-3-((1r,3R,4S)-3,4-ジフ ルオロシクロペンチル)-2-(4-(メチルスルホニ� ��)フェニル)-N-(1-メチルピラゾール-3-イル)プ� ��ピオン酸アミドと、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフ ルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニ� ��)フェニル)-N-(ピリド[3,2-d]チアゾール-2-イル )プロピオン酸アミドは、(R)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-� ��フルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� �ニル)フェニル)-N-(ピリド[3,2-d]チアゾール-2-� ��ル)プロピオン酸アミドや(R)-3-((1r,3R,4S)-3,4-� �フルオロシクロペンチル)-2-(4-(メチルスルホ ニル)フェニル)-N-(ピリド[3,2-d]チアゾール-2-� �ル)プロピオン酸アミドと、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3 ,
4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルス� �ホニル)フェニル)-N-(3-メチルチアジアゾール -5-イル)プロピオン酸アミドは、(R)-3-[(1α,3α,4 α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチ� �スルホニル)フェニル)-N-(3-メチルチアジアゾ ール-5-イル)プロピオン酸アミドや(R)-3-((1r,3R, 4S)-3,4-ジフルオロシクロペンチル)-2-(4-(メチ� �スルホニル)フェニル)-N-(3-メチルチアジアゾ ール-5-イル)プロピオン酸アミドと命名する� �とができる。

 薬学的に許容されるその塩とは、塩酸、� ��化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、クエン酸� ��ギ酸、マレイン酸、酢酸、コハク酸、酒石� ��、などのような無機又は有機の酸との任意� ��塩などである。

 本発明の一般式(1)で示される化合物群は� ��一般式(3)で表される化合物を中間体として� ��えば下記の製造工程に従って製造すること� ��できる。

(式中、*、R ¹ 、R ² 及びAは前記定義に同じ)
 本工程は、前記一般式(3)で表される化合物� ��ヘテロアリールアミンを適当な試薬存在下� ��反応させ、前記一般式(1)で表される化合物� ��製造するものである。

 本反応は、一般的な縮合剤を用いる方法� ��、活性エステル法、混合酸無水物法、酸ハ� ��ゲン化物法、又はカルボジイミド法等を適� ��採用して行うことができる。このような反� ��の場合に用いられる試薬としては、例えば� ��化チオニル、塩化オキザリル、N,N’-ジシク ロヘキシルカルボジイミド、N,N’-ジイソプ� �ピルカルボジイミド、1-メチル-2-ブロモピリ ジニウムヨーダイド、N,N’-カルボニルジイ� �ダゾール、ジフェニルリン酸クロリド、ジ� �ェニルリン酸アジド、N,N-ジスクシニミジル� ��ーボネート、N,N’-ジスクシニミジルオキザ レート、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピ� ��)カルボジイミド塩酸塩、クロロギ酸エチル 、クロロギ酸イソブチル、ベンゾトリアゾ-1- イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホ� �ウムヘキサフルオロホスフェイト、N-ブロモ スクシンイミド/トリフェニルホスフィン等� �挙げられる。本工程においては、上記試薬� �共に塩基や縮合補助剤を用いてもよい。こ� �場合に用いられる塩基としては、反応に関� �しない限りいかなる塩基も用いることがで� �るが、例えばナトリウムメトキシド、ナト� �ウムエトキシドのようなアルカリ金属アル� �キシド、水素化ナトリウム、水素化カリウ� �のようなアルカリ金属水素化物、n-ブチルリ チウム、リチウムビス(トリメチルシリル)ア� ��ド、ナトリウムビス(トリメチルシリル)ア� �ド、カリウムビス(トリメチルシリル)アミド のようなアルカリ金属有機塩基、トリエチル アミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリ ジン、N-メチルモルホリン、イミダゾール、N -メチルピロリジン、N-メチルピペリジン、1,5 -ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザ ビシクロ[5.4.0]ウンデ-7-セン等の三級有機塩� �、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等の� �機塩基の存在下で行うことができる。また� �合補助剤としては、例えばN-ヒドロキシベン ゾトリアゾール水和物、N-ヒドロキシスクシ� ��イミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジ カルボキシイミド、3-ヒドロキシ-3,4-ジヒド� �-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアゾール、ペンタ� ��ルオロフェノール等を用いることができる� ��反応溶媒としては、反応に関与しない限り� ��かなる溶媒も用いることができるが、例え� ��ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベ� ��ゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素系� ��媒、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、 クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭 化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒ ドロフラン、1,4-ジオキサン等のエーテル系� �媒、アセトニトリル、プロピオニトリル、� �トロメタン、ニトロエタン、N,N-ジメチルホ� ��ムアミド、N-メチルピペリドン、スルホラ� �、またはジメチルスルホキシド等の非プロ� �ン性極性溶媒が好適に用いられる。反応は� �通常-78°C~200°Cで円滑に進行する。

 また、本発明の一態様は、式(1)で表され� ��化合物又は薬学的に許容されるその塩を有� ��成分とする医薬に関する。本発明の医薬は� ��GK活性化作用又は血糖降下作用を有するこ� �から、1型糖尿病、2型糖尿病、高脂血症(高LD Lコレステロール血症、高トリグリセライド� �症及び低HDLコレステロール血症)、肥満、イ� ��スリン抵抗性、耐糖能異常、メタボリック� ��ンドロームなどの治療又は予防に有用であ� ��。

 本発明の医薬は、経口又は直腸内、皮下� ��静脈内、筋肉内、経皮等の非経口投与する� ��とができる。

 本発明の化合物又は薬学的に許容される� ��の塩を医薬として用いるためには、固体組� ��物、液体組成物、及びその他の組成物のい� ��れの形態でもよく、必要に応じて最適のも� ��が選択される。本発明の医薬は、本発明の� ��合物に薬学的に許容される担体を配合して� ��造することができる。具体的には、常用の� ��形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、� ��衣剤、pH調整剤、溶解剤、又は水性若しく� �非水性溶媒などを添加し、常用の製剤技術� �よって、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤� �粉剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤� �などに調製することができる。

 本発明化合物又は薬学的に許容されるその� ��の投与量は、疾患、症状、体重、年齢、性� ��、投与経路等により異なるが、成人に対し� ��経口投与の場合、好ましくは約0.01~約1000mg/k g体重/日であり、より好ましくは約0.5~約200mg/ kg体重/日であり、これを1日1回又は数回に分� ��て投与することができる。
 本発明の化合物又は薬学的に許容されるそ� ��塩は、必要であれば1種以上のGKの活性化物� ��以外の化合物と併用することができる。例� ��ば、スルホニル尿素類、ビグアニド類、グ� ��カゴンアンタゴニスト、α-グルコシダーゼ� ��害剤、インスリン分泌促進物質、インスリ� ��増感剤等を含む1またはそれ以上の抗糖尿病 剤若しくは抗高血糖剤又は抗肥満剤との組合 せで適宜用いられ得る。
 スルホニル尿素類としては、グリブリド、� ��リメピリド、グリピリド、グリピジド、ク� ��ルプロパミド、グリクラジド、グリソキセ� ��ド、アセトヘキサミド、グリボルヌリド、� ��ルブタミド、トラザミド、カルブタミド、� ��リキドン、グリヘキサミド、フェンブタミ� ��、トルシクラミド等が挙げられ、ビグアニ� ��類としては、メトフォルミン、フェンフォ� ��ミン、ブフォルミン等などが挙げられ、グ� ��カゴンアンタゴニストとしては、ペプチド� ��たは非ペプチドグルカゴンアンタゴニスト� ��挙げられ、α-グルコシダーゼ阻害剤として� ��、アカルボース、ボグリボース、ミグリト� ��ル等が挙げられ、インスリン増感剤として� ��、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオ� ��リタゾン、シグリタゾン等が挙げられ、抗� ��満剤としては、シブトラミン、オルリスタ� ��ト等が挙げられる。本発明の化合物又は薬� ��的に許容されるその塩は、他の抗糖尿病剤� ��抗高血糖剤又は抗肥満剤と、同時、連続ま� ��は分割して投与することができる。

実施例1
(±)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� ��ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� ��)プロピオン酸

 N,N-ジメチルプロピレン尿素(3.92 mL)を含む� �チウムジイソプロピルアミド(10.2 mmol)のテ� �ラヒドロフラン溶液(20 mL) に、4-メチルス� �ホニルフェニル酢酸(1.04 g)のテトラヒドロ� �ラン溶液(7 mL)を-78℃にて滴下し、-45~-30℃で 2時間撹拌した。(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチルメチルヨーダイド(1.20 g)を-78℃� �て滴下して、撹拌しながら室温まで徐々に� �温した。水(15 mL)を加えてテトラヒドロフラ ンを減圧留去した。残渣に6 mol/L塩酸を加え� ��pH2として酢酸エチルで抽出し、有機層を無� ��硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、濃縮した� ��得られた残渣をシリカゲルカラムクロマト� ��ラフィーで精製して、(±)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-� �フルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホ ニル)フェニル)プロピオン酸(956 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):
calcd, 333.0972; found, 333.0997.

実施例2
(4R)-4-ベンジル-3-[3-[(1α,3α,4α)-3,4-� ��フルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� �ニル)フェニル)プロパノイル]オキサゾリジ� �-2-オン

 (±)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペン� �ル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロピ� ��ン酸(931 mg)のテトラヒドロフラン溶液(12 mL )にトリエチルアミン(975 mL)を加え、食塩氷� �下でピバロイルクロライド(362 mL)を滴下し� �、1時間撹拌した。反応液に(R)-4-ベンジルオ� ��サゾリジノン(494 mg)およびリチウムクロラ� ��ド(130 mg)を加えて室温で4時間撹拌した後、 不溶物を濾去した。濾液を濃縮して得られた 残渣の酢酸エチル溶液を、飽和炭酸水素ナト リウム水溶液および飽和食塩水で洗浄した後 、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、濃縮 した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィー(Si60NS,関東化学製,溶出溶媒:� �ルエン:酢酸エチル=3:1)で精製して、(4R)-4-ベ� ��ジル-3-[3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プ� �パノイル]オキサゾリジン-2-オンである、後� ��ら溶出する高極性異性体A(521 mg)および先に 溶出する低極性異性体B(433 mg)を得た。
異性体A:
MS (EI) m/z: 491 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 491.1578; found, 491.1557.
異性体B:
MS (EI) m/z: 491 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 491.1578; found, 491.1578.

実施例3
(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)プロピオン酸

 (4R)-4-ベンジル-3-[3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオ� �シクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フ� �ニル)プロパノイル]オキサゾリジン-2-オンの 異性体A(250 mg)のテトラヒドロフラン溶液(5 m L)に、30%過酸化水素水(206 μL)を含む水酸化リ チウム(24.0 mg)の水溶液(1.3 mL)を氷冷下で加� �て1時間撹拌した。反応液に1 mol/L亜硫酸ナ� �リウム水溶液および飽和炭酸水素ナトリウ� �水溶液を加え、酢酸エチルにて洗浄した。� �層を1 mol/L塩酸にてpH2とし、酢酸エチルで抽 出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、濃縮した。 得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄して 、(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペン� �ル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロピ� ��ン酸(159 mg)を得た。 ¹ H
NMR (CDCl ₃ ) δ 1.62-2.33 (m, 7H), 3.06 (s, 1H), 3.71 (t, J=7 .9 Hz,1H), 4.71-4.93 (m, 2H), 7.53 (d, J=8.6 Hz, 2H ), 7.93 (d, J=8.6 Hz, 2H).
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):
calcd, 333.0972; found, 333.0974.

実施例4
(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)-N-(チアゾール-2-イル)プロピオン酸アミド(� ��明化合物1)

 トリフェニルホスフィン(120 mg)のジクロロ� ��タン溶液(1.4 mL)にN-ブロモスクシン酸イミ� �(81.9 mg)を氷冷下で加えて30分間撹拌した後� �(-)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ� ��]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロピオ ン酸(90.6 mg)を加えて、室温で40分間撹拌した 。反応液に2-アミノチアゾール(67.8 mg)を加え て、室温で1.5時間撹拌した。反応液を酢酸エ チルで希釈して、水、1 mol/L塩酸、5% 炭酸水 素ナトリウム水溶液、および飽和食塩水で順 次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後 、濾過、濃縮した。得られた残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィーで精製して、(-) -3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]- 2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾー ル-2-イル)プロピオン酸アミド(106 mg)を得た� �
¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 1.65-2.49 (m, 7H), 3.04 (s, 3H), 3.74(t, J=7.3  Hz, 1H), 4.73-4.90 (m, 2H), 7.08 (d, J=3.7 Hz), 7 .48-7.51 (m, 3H),7.88 (d, J=8.6 Hz, 2H), 10.65 (brs,  1H).
MS (EI) m/z: 414 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 414.0883; found, 414.0890.

実施例5
 発明化合物2~99を実施例4と同様な操作によ� �製造した。なお、表中の旋光度は、発明化� �物7、15はDMSOを溶媒とし、発明化合物17、32、 44、45、47~50、54~58、72~75、78はDMFを溶媒とし、 残りはクロロホルムを溶媒として測定した。

(*を付した炭素原子の立体配置はR配置)

参考例1
(+)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)プロピオン酸
 実施例3と同様の方法により、(4R)-4-ベンジ� �-3-[3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ� ��]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロパノ イル]オキサゾリジン-2-オンの異性体B(202 mg)� ��ら、(+)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プ� �ピオン酸(118 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ )
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):calcd, 333.0972; found, 333.0983.

参考例2
(+)-3-[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)-N-(チアゾール-2-イル)プロピオン酸アミド
 実施例4と同様の方法により、(+)-3-[(1α,3α,4� �)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチル スルホニル)フェニル)プロピオン酸(90.8 mg)お よび2-アミノチアゾール(67.8 mg)から、(+)-3-[(1 α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-( メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾール-2- イル)プロピオン酸アミド(104 mg)を得た。
MS (EI) m/z: 414 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 414.0883; found, 414.0885.

参考例3
(±)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� ��ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� ��)プロピオン酸
 実施例1と同様の方法により、4-メチルスル� ��ニルフェニル酢酸(1.04 g)および(1β,3α,4α)-3, 4-ジフルオロシクロペンチルメチルヨーダイ� ��(1.20 g)から、(±)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオ� �シクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フ� �ニル)プロピオン酸(1.24 g)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):
calcd, 333.0972; found, 333.0986.

参考例4
(4R)-4-ベンジル-3-[3-[(1β,3α,4α)-3,4-� ��フルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスル� �ニル)フェニル)プロパノイル]オキサゾリジ� �-2-オン
 実施例2と同様の方法により、(±)-3-[(1β,3α,4 α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチ� �スルホニル)フェニル)プロピオン酸(1.15 g)お よび(R)-4-ベンジルオキサゾリジノン(613 mg)か ら、(4R)-4-ベンジル-3-[3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフル� ��ロシクロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)� ��ェニル)プロパノイル]オキサゾリジン-2-オ� �の、低極性異性体A’(139 mg)および高極性異� ��体B’(207 mg)を得た。
異性体A’:
MS (EI) m/z: 491 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 491.1578; found, 491.1562.
異性体B’:
MS (EI) m/z: 491 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 491.1578; found, 491.1560.

参考例5
(-)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)プロピオン酸
 実施例3と同様の方法により、(4R)-4-ベンジ� �-3-[3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ� ��]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロパノ イル]オキサゾリジン-2-オンの異性体A’(150 m g)から、(-)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ ペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)� �ロピオン酸(85.9 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):
calcd, 333.0972; found, 333.0934.

参考例6
(+)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)プロピオン酸
 実施例3と同様の方法により、(4R)-4-ベンジ� �-3-[3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチ� ��]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)プロパノ イル]オキサゾリジン-2-オンの異性体B’(110 m g)から、(+)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ ペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)� �ロピオン酸(67.3 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 333 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₅ H ₁₉ F ₂ O ₄ S(MH ⁺ ):
calcd, 333.0972; found, 333.0952.

参考例7
(-)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)-N-(チアゾール-2-イル)プロピオン酸アミド
 実施例4と同様の方法により、(-)-3-[(1β,3α,4� �)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチル スルホニル)フェニル)プロピオン酸(66.6 mg)お よび2-アミノチアゾール(49.0 mg)から、(-)-3-[(1 β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-( メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾール-2- イル)プロピオン酸アミド(60.3 mg)を得た。
MS (EI) m/z: 414 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 414.0883; found, 414.0891.

参考例8
(+)-3-[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ� �ロペンチル]-2-(4-(メチルスルホニル)フェニ� �)-N-(チアゾール-2-イル)プロピオン酸アミド
 実施例4と同様の方法により、(+)-3-[(1β,3α,4� �)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-(メチル スルホニル)フェニル)プロピオン酸(45.3 mg)お よび2-アミノチアゾール(33.9 mg)から、(+)-3-[(1 β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペンチル]-2-(4-( メチルスルホニル)フェニル)-N-(チアゾール-2- イル)プロピオン酸アミド(40.6 mg)を得た。
MS (EI) m/z: 414 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₂₅ H ₂₇ F ₂ NO ₅ S(M ⁺ ):
calcd, 414.0883; found, 414.0844.

参考例9
(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチルメチルヨーダイド
第一工程
安息香酸 [(1α,3β,4β)-3,4-ジヒドロ キシシクロペンチル]メチル

 N-メチルモルホリン N-オキシド(50%水溶液、 22.0 mL)及び四酸化オスミウム(2.5% t-ブタノー ル溶液、1.90 mL)をアセトン(190 mL)に溶解し、 攪拌しながら安息香酸 (3-シクロペンテン-1-� ��ル)メチル(特表平7-506816)(20.2 g)のアセトン(1 25 mL)溶液を105分かけて滴下した後、室温で� �らに15時間攪拌した。反応混合物にクロロホ ルム(310 mL)及び水(190 mL)を加えて有機層を分 取した。分取した有機層を1 mol/L塩酸(2×90 mL )、水(90 mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (60 mL)の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで� ��燥後、減圧濃縮した。残渣にトルエン(120 m L)を加えて析出晶を濾取し、安息香酸 [(1α,3� �,4β)-3,4-ジヒドロキシシクロペンチル]メチル (16.9 g)を得た。
¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 1.71-1.78 (m, 2H), 1.95-2.02 (m, 2H),2.27 (br,� �2H), 2.75-2.87(m, 1H), 4.19-4.23 (m, 4H), 7.43-7.47  (m, 2H),7.55-7.59 (m, 1H), 8.01-8.04 (m,2H).
 濾液を減圧濃縮し、安息香酸 [(1α,3β,4β)-3, 4-ジヒドロキシシクロペンチル]メチルと安息 香酸 [(1β,3β,4β)-3,4-ジヒドロキシシクロペン チル]メチルの混合物(4.23 g、 ¹ H NMRの積分比から約1:2の混合物)を得た。
¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 1.58-1.65 (m, 1.3H), 1.71-1.78 (m,0.7H), 1.96-2. 17 (m, 2H), 2.75-2.85 (m, 1H), 4.09-4.32 (m, 4H), 7 .42-7.46 (m,2H), 7.54-7.59 (m, 1H), 8.01-8.06 (m, 2H) .

第二工程
安息香酸 (3aα,5α,6aα)-(テトラヒ� �ロ-4H-シクロペンタ-1,3,2-ジオキサチオール-5- イル)メチルエステルS,S-ジオキシド

 安息香酸 [(1α,3β,4β)-3,4-ジヒドロキシシク� ��ペンチル]メチル(5.00 g)を四塩化炭素(75 mL)� ��懸濁し、塩化チオニル(1.90 mL)を加え、攪拌 しながら1.5時間加熱還流した。反応混合物に 塩化チオニル(0.50 mL)を追加し、攪拌しなが� �さらに1時間加熱還流した。反応混合物を減� ��濃縮し、残渣にトルエン(25 mL)を加えて減� �濃縮後、減圧乾燥して安息香酸 (3aα,5α,6aα) -(テトラヒドロ-4H-シクロペンタ-1,3,2-ジオキ� �チオール-5-イル)メチルエステルS-オキシド(6 .09 g)を得た。得られた安息香酸 (3aα,5α,6aα) -(テトラヒドロ-4H-シクロペンタ-1,3,2-ジオキ� �チオール-5-イル)メチルエステルS-オキシド(4 .27 g)、アセトニトリル(30mL)及び四塩化炭素(3 0 mL)を混合し、過よう素酸ナトリウム(6.46 g) 、塩化ルテニウム水和物(31.3 mg)次いで水(30  mL)を加え、室温で30分攪拌した。反応混合物� ��ジクロロメタン(50 mL)を加え、不溶物を濾� �した後、濾液の有機層を分取し、水層をジ� �ロロメタン(50 mL)で抽出した。有機層とジク ロロメタン抽出液を合わせ、1 mol/Lチオ硫酸� ��トリウム水溶液(2×40 mL)、次いで水(2×40 mL) で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減 圧濃縮した。残渣を減圧乾燥し、安息香酸 ( 3aα,5α,6aα)-(テトラヒドロ-4H-シクロペンタ-1,3 ,2-ジオキサチオール-5-イル)メチルエステルS, S-ジオキシド(4.35 g)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 299 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₃ H ₁₅ O ₆ S ( MH ⁺ ):
calcd, 299.0589; found, 299.0593.

第三工程
安息香酸 [(1α,3α,4β)-3-フルオロ-4 -ヒドロキシシクロペンチル]メチル

 テトラブチルアンモニウムフルオリド水和� ��(571mg)を脱水アセトニトリル(5mL)に溶解し、� ��圧濃縮した。同様の操作をあと2回繰り返し た後、残渣を40℃で45分間減圧乾燥した。こ� �残渣を脱水アセトニトリル(5 mL)に溶解し、� ��息香酸 (3aα,5α,6aα)-(テトラヒドロ-4H-シク� �ペンタ-1,3,2-ジオキサチオール-5-イル)メチル エステルS,S-ジオキシド(500 mg)を加え、攪拌� �ながら45分間加熱還流した後、反応混合物を 減圧濃縮した。残渣をエタノール(5 mL)に溶� �し、硫酸(0.15 mL)を加え、攪拌しながら10分� �熱還流した後、反応混合物を減圧濃縮した� �残渣を酢酸エチル(40 mL)に溶解し、飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液(5 mL)次いで飽和食塩� �(5 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥� ��、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム( 溶出溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=1:1)で精製し� �安息香酸 [(1α,3α,4β)-3-フルオロ-4-ヒドロキ� ��シクロペンチル]メチル(342 mg)を得た。
MS (EI) m/z: 238 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₁₃ H ₁₅ FO ₃ (M ⁺ ):
 calcd,238.1005; found, 238.1046.

第四工程
安息香酸 [(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオ ロ-シクロペンチル]メチル

 安息香酸 [(1α,3α,4β)-3-フルオロ-4-ヒドロキ シシクロペンチル]メチル(326 mg)を脱水テト� �ヒドロフラン(5 mL)に溶解し、ビス(2-メトキ� ��エチル)アミノ硫黄トリフルオリド(455 mg)の 脱水テトラヒドロフラン(2 mL)溶液を加え、� �拌しながら1.5時間加熱還流した。反応混合� �を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 mL)中に あけ、酢酸エチル(2×30 mL)で抽出した。酢酸� ��チル抽出液を合わせ、飽和食塩水(2×10 mL)� �洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減� �濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(溶出溶� ��:ヘキサン/酢酸エチル=4:1)で精製し、安息香 酸[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロ-シクロペンチル] メチル(233 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 241 ( MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₃ H ₁₅ F ₂ O ₂ (MH ⁺ ): calcd, 241.1040; found, 241.1043.

第五工程
[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ� �ンチル]メタノール

 安息香酸 [(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ� ��ンチル]メチル(221 mg)をエタノール(3 mL)に� �解し、炭酸カリウム(191 mg)の水(1 mL)溶液を� ��え、攪拌しながら4時間加熱還流した。反応 混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラ ム(溶出溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=1:2)で精製� ��、[(1α,3α,4α)-3、4-ジフルオロシクロペンチ� ��]メタノール(123 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 137 (MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₆ H ₁₁ F ₂ O (MH ⁺ ):
calcd, 137.0778; found, 137.0801.

第六工程
(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチルメチルヨーダイド

 イミダゾール(64.5 mg)およびトリフェニルホ スフィン(124 mg)のジクロロメタン溶液(2.0 mL) に氷冷下でヨウ素(120 mg)を加えて室温で30分� ��撹拌した後、[(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシク ロペンチル]メタノール(43.0 mg)のジクロロメ� ��ン溶液(0.5 mL)を加えて室温で4時間撹拌した 後、不溶物を濾去した。濾液を濃縮して得ら れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ ィーで精製して、(1α,3α,4α)-3,4-ジフルオロシ クロペンチルメチルヨーダイド(28.0 mg)を得� �。
MS (EI) m/z: 246 ( M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₆ H ₉ F ₂ I (M ⁺ ):
 calcd,245.9717; found, 245.9741.

参考例10
(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチルメチルヨーダイド
第一工程
安息香酸 (3aα,5β,6aα)-(テトラヒ� �ロ-4H-シクロペンタ-1,3,2-ジオキサチオール-5- イル)メチルエステルS,S-ジオキシド
 参考例9の第一工程で得た安息香酸 [(1α,3β, 4β)-3,4-ジヒドロキシシクロペンチル]メチル� �安息香酸 [(1β,3β,4β)-3,4-ジヒドロキシシク� �ペンチル]メチルの混合物(4.23 g)と四塩化炭� ��(75 mL)を混合し、塩化チオニル(2.00 mL)を加� ��、攪拌しながら30分加熱還流した。反応混� �物を減圧濃縮し、残渣にトルエン(75 mL)を加 えて減圧濃縮後、残渣を減圧乾燥した。この 残渣とアセトニトリル(35 mL)及び四塩化炭素( 35 mL)を混合し、過よう素酸ナトリウム(7.66 g )、塩化ルテニウム水和物(37.1mg)、次いで水(35  mL)を加え、室温で30分攪拌した。反応混合� �にジクロロメタン(60mL)を加え、不溶物を濾� �した後、濾液の有機層を分取し、水層をジ� �ロロメタン(60 mL)で抽出した。有機層とジク ロロメタン抽出液を合わせ、1 mol/Lチオ硫酸� ��トリウム水溶液(2×50 mL)、次いで水(2×50 mL) で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減 圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(溶出� �媒:ヘキサン/酢酸エチル=1:1)で精製し、安息� ��酸 (3aα,5β,6aα)-(テトラヒドロ-4H-シクロペ� �タ-1,3,2-ジオキサチオール-5-イル)メチルエス テルS,S-ジオキシド(2.43 g)と安息香酸 (3aα,5α ,6aα)-(テトラヒドロ-4H-シクロペンタ-1,3,2-ジ� �キサチオール-5-イル)メチルエステルS,S-ジオ キシド(1.33 g)を得た。
MS (EI) m/z: 298 (M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₁₃ H ₁₄ O ₆ S (M ⁺ ):
calcd, 298.0511; found, 298.0493.

第二工程
安息香酸 [(1β,3α,4β)-3-フルオロ-4 -ヒドロキシシクロペンチル]メチル
 安息香酸 (3aα,5β,6aα)-(テトラヒドロ-4H-シ� �ロペンタ-1,3,2-ジオキサチオール-5-イル)メチ ルエステルS,S-ジオキシド(1.00 g)を用い、参� �例9の第三工程と同様に反応を行い、安息香� �� [(1β,3α,4β)-3-フルオロ-4-ヒドロキシシクロ ペンチル]メチル(660 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 239 ( MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₃ H ₁₆ FO ₃ ( MH ⁺ ):
calcd, 239.1083; found, 239.1040.

第三工程
安息香酸 [(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオ ロ-シクロペンチル]メチル
 安息香酸 [(1β,3α,4β)-3-フルオロ-4-ヒドロキ シシクロペンチル]メチル(644 mg)を用い参考� �9の第四工程と同様に反応を行い、安息香酸� �[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロ-シクロペンチル]� �チル(365 mg)を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 241 ( MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₁₃ H ₁₅ F ₂ O ₂ (MH ⁺ ):
 calcd, 241.1040; found, 241.1012.

第四工程
[(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロ� �ンチル]メタノール
 安息香酸 [(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロ-シクロ ペンチル]メチル(349 mg)を用い、参考例9の第� ��工程と同様に反応を行い、[(1β,3α,4α)-3、4-� ��フルオロシクロペンチル]メタノール(184 mg) を得た。
MS (CI ⁺ ) m/z: 137 ( MH ⁺ ).
HRMS (CI ⁺ ) for C ₆ H ₁₁ F ₂ O ( MH ⁺ ):
calcd, 137.0778; found, 137.0754.

第五工程
(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオロシクロペ ンチルメチルヨーダイド
 (1β,3α,4α)-3、4-ジフルオロシクロペンチル]� ��タノール(3.46 g)を用い、参考例9の第六工程 と同様に反応を行い、(1β,3α,4α)-3,4-ジフルオ ロシクロペンチルメチルヨーダイド(4.72 g)を 得た。
MS (EI) m/z: 246 ( M ⁺ ).
HRMS (EI) for C ₆ H ₉ F ₂ I (M ⁺ ):
 calcd,245.9717; found, 245.9749.

試験例1 GK活性測定
 GK活性は酵素反応により生成するグルコー� �6リン酸を直接測定するのではなく、グルコ� ��ス-6-デヒドロゲナーゼによる共役反応によ� ��て生成するNADH量を測定することによって調 べた。

(リコンビナントGKの調製)
ヒト肝臓型、膵臓型GKのクローニング及び組� ��え蛋白の取得
 GeneBank上に登録されているヒト肝臓型GKの配 列Accession Number;NM_033507、ヒト膵臓型GKの配列A ccession Number;NM_000162を参考にして、それぞれ� ��ト肝臓cDNA(Clontech社製)、ヒト膵臓cDNA(Clontech� ��製)を鋳型としてPyrobest DNA Polymerase(TaKaRa社� ��)によりPCRクローニングを行った。さらにC� �端側に(His)6標識してHisタグ融合蛋白として� �腸菌内で可溶性画分に発現させた。菌体を� �音波破砕したのち、遠心分離を行い上清を� �収した。回収した上清を金属キレートアフ� �ニティークロマトグラフィーで精製した。

 精製後、この酵素を、12.5mM HEPES(pH7.3)、75mM� �KCl、0.5mM MgCl ₂ 、0.5mM DTT、2.5mM Glucose、50% Glycerolにて-80℃� �保存した。

(GK活性測定)
 アッセイはCostar製の平底の2分の1エリア96穴 プレートを用いて25℃で行った。インキュベ� ��ション混合液は、最終的に25mM HEPES緩衝液(p H7.1)(Invitrogen社製)、25mM KCl(和光純薬製)、2mM  MgCl ₂ (和光純薬製)、5mMD-グルコース(和光純薬製)、 1mM ATP(Roche社製)、1mM NAD(Sigma製)、1mMジチオス レイトール(和光純薬製)、5Unit/mL G6PDH(Sigma製) 、0.1% BSA(Sigma社製)試験化合物或いは5%DMSO及� �GKが含まれるように調製した。

 被験化合物は予めDMSOに溶解し、2μLをHEPES緩 衝液(pH7.1)、KCl、MgCl _2、 D-グルコース、ATP、NAD及びジチオスレイトー� ��を含む溶液20μLに添加した。次に、G6PDH、BSA 及びリコンビナントGKを含む溶液を18μL加え� �応を開始させた。GKは5%DMSO存在下で1分間あ� �りの吸光度増加分が0.002から0.003の間になる� ��うに加えた。反応開始後、SPECTRAmax190マイク ロプレート分光光度計(モレキュラーデバイ� �社製)を用いて、340nmにおける吸光度の増加� �15分間測定し、始めの10分間の増加分を用い� ��活性を評価した。

 発明化合物11、14は、それを含まないウェ ルと比較して10μMで150%以上のヒト肝臓GK活性� ��作用が認められ、発明化合物1~10、12、13、15 ~17、20、21、23、25、27、30、31、33~36、43~46、48� ��50、54、55、60、61、68、69、71、73~75、79~82は10 μMで200%以上のヒト肝臓GK活性化作用が認めら れた。

試験例2 血糖降下試験
 ICRマウス(雄性、7-9週齢;日本チャールズリ� �ー社)を使用し、被験化合物による血糖値へ� ��作用を測定した。各々の化合物をGelucire44/14 (商品名、Gatefosse社製):PEG400=60:40の混合液に溶 解させ、餌を2時間抜いたマウスに経口投与(3 0mg/kg、10mL/kg)した。投与直前(Pre値)および投� �後0.5、2および4時間のポイントで尾静脈より エチレンジアミン四酢酸2カリウムをコーテ� �ングした採血管で採血し、遠心分離(4℃、3,6 00×g、3分間)して血漿サンプルを得た。

 各サンプルを生理食塩水で5倍希釈してグ ルコースCII-テストワコー(商品名、和光純薬� ��)を用いて血糖値を測定した。96穴平板プレ� ��トにサンプル、生理食塩水およびブドウ糖� ��準液100mg/dL(ブドウ糖標準液200mg/dLを生理食� �水で2倍希釈した)の各々10μL/穴をセットして 発色液を150μL/穴添加後、37℃に5分間静置し� �発色させた。測定はLucy2ルミネッセンス・リ ーダー(商品名、Aloka社製)を使用しOD492nmで測� ��した。各採血ポイントのPre値に対するグル� ��ース低下率からσグルコース低下率(各採血� ��イントのPre値に対するグルコース低下率の� ��均)を算出した。

 発明化合物1、2、3、17、27、30、35、36、46� ��54、55、74は、30%以上のσグルコース低下率� �認められた。一方、参考例2、7、8の化合物� �は15%超えるようなσグルコース低下率を示す ものはなかった。

試験例3 in vivo薬物動態評価
 ICRマウス(雄性、試験時6週齢;日本チャール� ��リバー社)を使用し、経口バイオアベイラビ リティを評価した。被験化合物をあらかじめ ジメチルスルホキシド(DMSO、Sigma社製)に溶解� ��、1/15Mの濃度に調製したリン酸2水素ナトリ� ��ム(和光純薬製)水溶液へ200μMとなるように� �加し、DMSOを最終30%になるように追加したも� ��を投与溶媒とした。静注群として、一晩絶� ��したICRマウスに尾静脈内投与した(1μmol/kg、 5mL/kg)。静脈内投与後5、15、30分、1、2、4、8� �24時間後にヘパリンコーティングした毛細管 を用いて眼底採血を行い、遠心後血漿を得た 。また、経口投与群として同溶液を強制経口 投与し(2μmol/kg、10mL/kg)、投与後15、30分、1、2 、4、8、24時間に眼底採血を行い、遠心分離� �同様に血漿を得た。分離血漿10μLを生理食塩 水100μL及びジメチルスルホキシド(Sigma社製)10 μLによって希釈し、液体クロマトグラフィー 付トリプル四重極質量分析装置(アプライド� �イオシステム社、API-3000)にて血漿中未変化� �濃度を測定した。血漿中濃度時間曲線下面� �(AUC)を台形法にて算出し、投与量補正後の経 口投与群の平均AUCを静脈内投与群の平均AUCで 除することによってバイオアベイラビリティ を求めた。発明化合物1は、50%以上の経口バ� �オアベイラビリティを示した。

試験例4 in vitro肝ミクロソーム代謝安定性評 価
(方法1)
 ガラス試験管内で、ヒト(XENOTECH社)、マウス (雄性、7週齢、ICRを用いた自社調製;日本チャ ールスリバー社)肝ミクロソーム溶液と被験� �合物を37℃にて5分インキュベートし、代謝� �定性評価を行った。インキュベーション混� �液には、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4、和 光純薬製)、3mMMgCl ₂ (和光純薬製)、5mMグルコース6リン酸(Roche社製 )、1mM EDTA(東京化成製)、1I.U.グルコース6リン 酸デヒドロゲナーゼ(Roche社製)、1mg/mLの肝ミ� �ロソームが含まれる。被験化合物をあらか� �めDMSOへ溶解し、反応液へ終濃度1μMとなるよ うに添加した。代謝反応は終濃度1mMとなるよ うにNADPH(Roche社製)溶液を添加することで開始 し、5分後、反応液と等容積のアセトニトリ� �(フィッシャー社製)を添加することで反応停 止した。反応停止後、遠心上清を液体クロマ トグラフィー付質量分析装置(島津製作所、Sh imadzu2010A)にて未変化体濃度を測定した。発明 化合物1、2、3のヒト及びマウスにおける代謝 固有クリアランスは、いずれにおいても0.06
mL/min/mg protein以下であった。

 (方法2)
 ガラス試験管内で、ヒト(XENOTECH社)、マウス (雄性、7週齢、ICRを用いた自社調製;日本チャ ールスリバー社)肝ミクロソーム溶液と被験� �合物を37℃にて25分インキュベートし、代謝� ��定性評価を行った。インキュベーション混� ��液には、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4、� �光純薬製)、3mMMgCl ₂ (和光純薬製)、5mMグルコース6リン酸(Roche社製 )、1mM EDTA(東京化成製)、1I.U.グルコース6リン 酸デヒドロゲナーゼ(Roche社製)、0.2mg/mLの肝ミ クロソームが含まれる。被験化合物をあらか じめDMSOへ溶解し、反応液へ終濃度1μMとなる� ��うに添加した。代謝反応は終濃度1mMとなる� ��うにNADPH(Roche社製)溶液を添加することで開� ��し、25分後、反応液と等容積のアセトニト� �ル(フィッシャー社製)を添加することで反応 停止した。反応停止後、遠心上清を液体クロ マトグラフィー付質量分析装置(島津製作所� �Shimadzu2010A)にて未変化体濃度を測定した。発 明化合物1、17、27、30、35、36、46のヒト及び� �ウスにおける代謝固有クリアランスは、い� �れにおいても0.05
mL/min/mg protein以下であった。