MELLITUS La presente invención se encuadra en el campo de la terapia génica y celular, específicamente se refiere a secuencias nucleotídicas codificantes para enzimas glucocinasas mutadas que presentan mayor actividad enzimática, a las secuencias aminoacídicas codificadas por ellas, a islotes pancreáticos que las expresan y a sus usos para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El trasplante de islotes pancreáticos es en la actualidad la única terapia celular disponible para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 inestable. Esta terapia ha demostrado ser eficaz en conseguir la normalización y estabilidad de la glucemia en estos pacientes, en la desaparición de hipoglucemias graves y en prevenir las complicaciones crónicas y progresivas de la diabetes. No obstante y desafortunadamente, el objetivo primario de esta terapia, la independencia insulínica a largo plazo, sigue aún sin ser alcanzado. Entre las causas más importantes por las que no se ha conseguido dicho objetivo primario están el estrés, tanto isquémico como mecánico, al que son sometidos los islotes (tan sólo un 10-20% de los islotes sobreviven al procedimiento del implante) y la baja supervivencia y funcionalidad de los islotes trasplantados, dando lugar a que menos de un 15% de los pacientes trasplantados mantengan la independencia a la insulina a los 2 años pos-trasplante (Ryan EA, et al., 2005, Diabetes, 54(7):2060-2069). Otra importante limitación que presenta esta terapia es la ausencia de suficientes órganos para realizarla en el número deseado de pacientes, ya que se necesitan alrededor de 12.000 equivalentes de islotes/Kg de peso corporal para tratar con éxito a un único paciente, lo que implica la necesidad de disponer de 2 a 3 páncreas de donantes cadáveres por paciente. Es por ello que mejorar la supervivencia y función de los islotes trasplantados, junto con poder disminuir el número de islotes necesarios para conseguir un buen control glucémico, son los principales objetivos que deben ser perseguidos y alcanzados para conseguir el objetivo primario del trasplante de islotes pancreáticos.

En estos momentos existen diferentes líneas de investigación encaminadas a resolver el problema de limitación de islotes pancreáticos humanos disponibles, las cuales centran sus esfuerzos en, por ejemplo, incrementar la supervivencia y proliferación de células β. Entre otras, la encapsulación de islotes (O'Sullivan ES, et al., 2010, Diabetologia), la producción de células productoras de insulina a partir de células embrionarias o progenitoras pancreáticas (Aye T, et al., 2010, J. Histochem. Cytochem. ) y la proliferación "in vitro" de las células β pancreáticas para la expansión de islotes humanos (Juhl K, et al., 2010, Curr Opin Organ Transplant., 15(1 ):79-85), son líneas en las que se está trabajando intensamente. Ciertamente, el uso del factor de crecimiento de fibroblastos o el de crecimiento del hepatocito han posibilitado, aunque de forma limitada, una expansión de los islotes humanos (Gao R, et al., 2003, Diabetes, 52(8):2007-2015). En otro estudio se ha observado que la sobreexpresión del factor de crecimiento del hepatocito humano en islotes de primates, mejora tanto el implante como la funcionalidad de estos islotes cuando son trasplantados en ratones diabéticos NOD-SCID. La combinación del péptido gastrina y el factor de crecimiento epidermal también proporciona una expansión de la masa celular β, no obstante las células obtenidas presentan una vida media corta (Suarez-Pinzon WL, et al., 2005, Diabetes, 54(9):2596-2601 ). El uso de otro péptido como el GLP-1 ("glucagon-like peptide-1 ") ha dado también resultados alentadores, y es que debido a su capacidad de promover la proliferación de la célula β e inhibir la apoptosis se ha observado que en ratones diabéticos NOD-SCID, a los que se les había trasplantado islotes humanos con células exocrinas bajo su cápsula renal, el tratamiento con GLP-1 y gastrina daba lugar a una expansión de la masa celular β, especialmente a partir de células del ducto pancreático asociadas con los islotes, mejorando la hiperglucemia de estos ratones (Suarez-Pinzon WL, Lakey JR, Rabinovitch A., 2008, Cell Transplant., 17(6):631 -640).

Por otro lado, la enzima glucocinasa (GK), codificada por el gen glucocinasa (GCK), ejerce un extraordinario control sobre la secreción de insulina y, por lo tanto, en la homeostasis de la glucosa en el humano. Así, GK es considerada como el "sensor de la glucosa sanguínea" de la célula β pancreática, gobernando el metabolismo de la secreción de insulina estimulada por glucosa (SIEG) en dicha célula y definiendo el umbral fisiológico de dicha secreción (UF-SIEG), que en el humano es de 5 mM (Barbetti F, et al., 2009, Mol. Endocrinology., 23(12): 1983-1989).

Otro importante aspecto a considerar es la importante relación existente entre metabolismo y apoptosis celular, y en la que GK juega un papel clave. GK junto con BAD, PKA, PP1 y WAVE-1 forma un complejo que mantiene la proteína proapoptótica BAD en un estado de fosforilación que evita la muerte celular (Danial NN., et al., 2003, Nature, 424(6951 ):952- 956). Además, BAD posee un papel en la regulación de la secreción de insulina por la célula β, estando esta regulación mediada por GK.

En resumen, es deseable poder reproducir islotes pancreáticos que, además de ser altamente eficaces en lo que se refiere a su capacidad de liberación de insulina estimulada por glucosa, eliminen la necesidad de disponer de un elevado número de islotes para poder alcanzar un adecuado control glucémico en el paciente tratado. De este modo, se podría suplir en parte la carencia de órganos que existe en la actualidad. Así mismo, sería deseable que los islotes presentasen una supervivencia mayor, permitiendo una independencia a la insulina de los pacientes trasplantados más duradera y estable. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a secuencias nucleotídicas que codifican para variantes de la enzima glucocinasa (GK), preferiblemente humana, que presentan un aumento en su actividad enzimática, así como a las secuencias aminoacídicas correspondientes a dichas variantes.

La invención demuestra que la activación suprafisiológica de GK en islotes pancreáticos, preferiblemente humanos, mediada por la expresión de las variantes de la GK aquí propuestas, induce un importante aumento en la proliferación de las células β, lo que se traduce en un mayor tamaño de los islotes pancreáticos. Estos islotes además mantienen una citoarquitectura completamente conservada y bien definida. Dichas variantes también contribuyen a aumentar la estabilidad y supervivencia de las células β. Además, se consiguen obtener islotes pancreáticos con una mayor actividad metabólica, ya que éstas variantes de la GK presentan, por ejemplo, 9 veces más afinidad por la glucosa y reducen el umbral fisiológico de secreción de insulina estimulada por glucosa (UF- SIEG), pasando así de 5 mM (establecido en humanos con la GK nativa) a O,96 mM.

Este conjunto de características otorgan al islote que expresa las variantes descritas en la invención: (i) una mayor resistencia para sobrevivir al estrés mecánico que conlleva el procedimiento de trasplante, (ii) una funcionalidad más duradera en el tiempo, (iii) capacidad de proliferación una vez trasplantados, y (iv) debido a su mayor tamaño y mayor tasa metabólica, el número necesario de este tipo de islotes a trasplantar en el paciente para poder alcanzar una glucemia adecuada es menor al que actualmente se necesita.

Por ello, las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas descritas en la presente invención son de utilidad para la creación de islotes pancreáticos de alta eficacia que pueden ser trasplantados a pacientes, durante procedimientos de terapia celular somática, para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus, con las ventajas asociadas anteriormente descritas.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, de ahora en adelante "secuencia nucleotídica de la invención", que codifica para una secuencia aminoacídica de la enzima glucocinasa o GK que presenta al menos una mutación activadora de la actividad de dicha enzima.

Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.

Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica.

El polinucleótido de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos convencionales de clonación y selección, o mediante secuenciación.

El polinucleótido, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo. La "enzima glucocinasa" o "GK" es una hexoquinasa isozima que interviene en la fosforilación de la glucosa para dar lugar a glucosa-e- fosfato. En humanos, al igual que en la mayoría de los vertebrados, se expresa en células del hígado, páncreas, intestino y cerebro, órganos en los cuales juega un importante papel en la regulación del metabolismo de carbohidratos actuando como un sensor de glucosa, provocando cambios en el metabolismo o función de la célula en respuesta al aumento o disminución de los niveles de glucosa.

En la presente invención la "secuencia aminoacídica de la enzima GK" es, preferiblemente, la secuencia aminoacídica de la GK nativa humana (SEQ ID NO: 4) codificada, por ejemplo, aunque sin limitarnos, por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 5 (gen GCK humano), aunque también se encuentran dentro del ámbito de la presente invención las secuencias aminoacídicas de enzimas GK ortólogas a la GK humana procedentes de otros organismos y que cumplen la misma función que la GK humana en el organismo del que proceden, así como las secuencias nucleotídicas que codifican para éstas.

La expresión "mutaciones activadoras de la actividad de la enzima" se refiere a aquellas mutaciones presentes en la secuencia aminoacídica y/o nucleotídica de la GK que dan lugar a una enzima que presenta una mayor actividad enzimática en comparación con la enzima nativa que no presenta dichas mutaciones. Dichas mutaciones pueden ser, aunque sin limitarnos, mutaciones puntuales (de cambio de uno o varios aminoácidos o uno o varios nucleótidos por otro/s), mutaciones de deleción, de sustitución, de adición, etc. La identificación y selección de enzimas que presentan una mayor actividad enzimática, obtenidas mediante la inducción de tales mutaciones, se puede llevar a cabo mediante ensayos de actividad enzimática en presencia de sustrato (en este caso glucosa) conocidos por el experto en la materia, los cuales permiten seleccionar las variantes enzimáticas modificadas de interés que presentan mayor actividad, menor inhibición por sustrato, mayor estabilidad enzimática, mayor rango de pH y/o T ^a a la que la enzima es activa, etc. En la presente invención se utiliza el término "variantes de la invención" para hacer referencia a las enzimas GK que presentan al menos una mutación activadora de la actividad de dicha enzima.

La secuencia nucleotídica de la invención puede ser usada para la obtención de islotes pancreáticos de alta eficacia, mediante su introducción, por métodos de biología molecular conocidos por un experto en la materia, en una célula, preferiblemente pancreática, más preferiblemente en una célula β pancreática, aun más preferiblemente aislada del propio paciente, para que ésta exprese la secuencia aminoacídica de alguna de las variantes de la invención, y se obtenga así "in vitro" una población celular de células β autóloga altamente proliferativa y altamente eficiente en la liberación de insulina en respuesta a glucosa. Por ello, en una realización preferida, la secuencia nucleotídica de la invención es capaz de generar islotes pancreáticos de alta eficacia. Estos "islotes pancreáticos de alta eficacia", aquí denominados también "islotes de la invención" como se verá más adelante, comprenden células pancreáticas modificadas como se ha explicado en este párrafo, preferiblemente células β pancreáticas, las cuales presentan una mayor capacidad proliferativa e inducen una reducción del UF-SIEG, por lo que comienzan a liberar insulina a concentraciones más bajas de glucosa que los islotes que no comprenden células así modificadas. Además, este tipo de islotes presentan un mayor tamaño que los islotes pancreáticos que no comprenden células a las que se les ha introducido la secuencia nucleotídica de la invención. En otra realización preferida, la secuencia aminoacídica de la enzima glucocinasa que presenta al menos una mutación activadora de la actividad de dicha enzima, o "secuencia aminoacídica de la variante de la invención", se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 1 corresponde a la SEQ ID NO: 4 donde el residuo de la posición 64 (S, serina) ha sido sustituido por una fenilalanina (F), a dicha variante se hará referencia también como GCK- S64F. La SEQ ID NO: 2 corresponde a la SEQ ID NO: 4 donde el residuo de la posición 91 (V, valina) ha sido sustituido por una leucina (L), a dicha variante se hará referencia también como GCK-V91 L. La SEQ ID NO: 3 corresponde a la SEQ ID NO: 4 donde el residuo de la posición 214 (Y, tirosina) ha sido sustituido por una cisteína (C), a dicha variante se hará referencia también como GCK-Y214C. Un ejemplo de secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID NO: 1 es, aunque sin limitarnos, la SEQ ID NO: 6.

Por ejemplo, las secuencias nucleotídicas que codifican para la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 se pueden obtener, aunque sin limitarnos, mediante un método que comprende la introducción de mutaciones en el gen de la GK humana (SEQ ID NO: 5) mediante PCR con los cebadores SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (para obtener la secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID NO: 3) y SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (para obtener la secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID NO: 2). Otro aspecto de la invención se refiere, por tanto, a las secuencias nucleotídicas aisladas obtenidas según el procedimiento descrito en este párrafo, las cuales codifican para secuencias aminoacídicas de la enzima GK que presentan al menos una mutación activadora de la actividad de dicha enzima, concretamente para la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética, de ahora en adelante "construcción genética de la invención", que comprende la secuencia nucleotídica de la invención. La construcción genética de la invención puede llevar incluidas secuencias de control unidas operativamente a la secuencia nucleotídica de la invención. El término "secuencia de control", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a secuencias nucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. Ejemplos de secuencias de control son, pero sin limitarse, promotores, señales de inicio de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación o activadores transcripcionales.

La expresión "unidos operativamente", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a un polinucleótido, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del ADN, generalmente "aguas arriba" o "upstream" del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, o tac de E. coli, o el promotor del gen α-amilasa de B. subtilis. Para la expresión de un ácido nucleico en una célula procariota también es necesaria la presencia de un sitio de unión ribosomal situado "upstream" de la secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para la expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica.

En una realización preferida, la construcción genética de la invención es un vector de expresión, de ahora en adelante "vector de la invención". El término "vector de expresión" se refiere a un fragmento de ADN o ARN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y puede servir de vehículo para llevar a cabo la transcripción de una secuencia de interés que haya sido insertada en el mismo. El vector puede ser un plásmido, un cósmido, un fagémido, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas humanos artificiales (HAC), un bacteriófago o un vector viral tal como por ejemplo, aunque sin limitarnos, adenovirus, retrovirus, virus adenoasociados, lentivirus, poxvirus o herpesvirus, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector. Los "lentivirus" son retrovirus no oncogénicos caracterizados por presentar largos tiempos de incubación e infección persistente, son capaces de infectar a todo tipo de células, tanto quiescentes como en división, permiten insertos de tamaño medio y se integran en el genoma de la célula huésped dando lugar a una expresión a largo plazo, sin ser inmunogénicos. Por ello, en una realización más preferida, el vector de la invención es un lentivirus, es decir, un vector lentiviral.

Otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia aminoacídica de la enzima glucocinasa seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Como ya se ha mencionado, la secuencia nucleotídica de la invención o la construcción genética de la invención pueden ser usadas para la obtención de islotes pancreáticos de alta eficacia, mediante su introducción, por métodos de biología molecular conocidos por un experto en la materia, en una célula, preferiblemente pancreática, más preferiblemente en una célula β pancreática, aun más preferiblemente aislada del propio paciente, para que ésta exprese la secuencia aminoacídica de alguna de las variantes de la invención, y se obtenga así "in vitro" una población celular de células β autóloga altamente proliferativa y altamente eficiente en la liberación de insulina en respuesta a glucosa. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula, de ahora en adelante "célula de la invención", que comprende, de forma transitoria o, preferiblemente, de forma estable, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención, o una secuencia aminoacídica de alguna de las variantes de la invención, más preferiblemente una secuencia aminoacídica seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

La célula de la invención puede ser cualquier célula eucariota o procariota, aunque preferiblemente es una célula eucariota. En otra realización preferida, la célula de la invención es una célula pancreática. La "célula pancreática" de la invención puede ser una célula alfa, una célula beta, una célula delta, una célula G o una célula F, aunque preferiblemente es una célula beta (célula β).

Además, la célula de la invención puede ser tanto de origen autólogo, como alogénico o xenogénico. La posibilidad de que la célula de la invención sea de origen autólogo permite que el posterior trasplante de ésta, tras su manipulación "in vitro", para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus pueda realizarse sin que sea necesaria la inmunosupresión del sujeto trasplantado. Por ello, en una realización más preferida, la célula de la invención es de origen autólogo. Se entiende por "origen autólogo" cualquier procedencia de la muestra, tomada de los tejidos o células de un individuo o paciente, que es la misma en un donante y en el receptor de los mismos cuando le son administrados tras su tratamiento o trasplantados tras su modificación. La célula de la invención puede proceder de cualquier mamífero, aunque preferiblemente procede de un humano. Por ello, en una realización aun más preferida, la célula de la invención es de origen humano.

Otro aspecto de la invención se refiere a un islote pancreático, "islote de la invención", que comprende la célula de la invención. En una realización preferida, el islote de la invención es de origen autólogo. En una realización más preferida, dicho islote es de origen humano.

Los "islotes pancreáticos" son acúmulos de células que se encargan de producir hormonas como la insulina y el glucagón, con función netamente endocrina. También secretan inmunoglobulinas. Forman diversos racimos o islotes dispersos por todo el páncreas, encontrándose alrededor de un millón de tales islotes en el páncreas humano. Están formados principalmente por células β, secretoras de insulina, alrededor de las cuales se encuentran en grupos pequeños células de mayor tamaño como las células a, secretoras de glucagón, δ, secretoras de somatostatina, F, productoras de un polipéptido pancreático que inhibe las secreciones exocrinas del páncreas, o G, secretoras de gastrina. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante "composición de la invención", que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención, la secuencia aminoacídica de las variantes de la invención, preferiblemente la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, la célula de la invención o el islote de la invención. En otra realización preferida, la composición de la invención es una composición farmacéutica. En una realización más preferida, la composición de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización aun más preferida, la composición de la invención además comprende otro principio activo. El "vehículo farmacéuticamente aceptable" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes de dicha composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Por otra parte, la composición de la invención comprende opcionalmente otra sustancia o principio activo. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, donde dicha composición farmacéutica puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "principio activo", "sustancia activa" o "ingrediente activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.

En cada caso la forma de presentación de la composición de la invención se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La composición descrita en la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol, para su administración oral, tópica o parenteral. Por otra parte, la composición de la invención también puede ser formulada en forma de liposomas o nanosferas, de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación.

Como se ha explicado anteriormente, los islotes pancreáticos de la invención son islotes de alta eficacia, en el sentido de que presentan un mayor tamaño que los islotes pancreáticos que no comprenden células de la invención, comprenden células, preferiblemente pancreáticas, más preferiblemente células β pancreáticas, con una mayor capacidad proliferativa y que inducen una reducción del UF-SIEG, por lo que comienzan a liberar insulina a concentraciones más bajas de glucosa que los islotes que no comprenden células de la invención. Así, tanto las células como los islotes de la invención son de utilidad en el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus, mediante su administración como medicamento o bien mediante su trasplante al páncreas de un individuo que padezca diabetes mellitus, todo ello con el fin de incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de las células β secretoras de insulina presentes en el páncreas del individuo afectado por la enfermedad. Las ventajas asociadas a dicha aplicación clínica son las que se han descrito anteriormente, a saber, dichas células e islotes de la invención presentan una mayor resistencia para sobrevivir al estrés mecánico que conlleva el procedimiento de trasplante, una funcionalidad más duradera en el tiempo, capacidad de proliferación una vez trasplantados, y debido a su mayor tamaño y mayor tasa metabólica, el número necesario de este tipo de células o islotes a trasplantar en el paciente para poder alcanzar una glucemia adecuada es menor al que actualmente se necesita.

Así mismo, la secuencia nucleotídica de la invención, la construcción genética de la invención, el vector de la invención, la composición de la invención o la secuencia aminoacídica de las variantes de la invención, pueden ser administrados como medicamento a un individuo para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus. Por todo ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la secuencia nucleotídica de la invención, de la construcción genética de la invención, del vector de la invención, de la secuencia aminoacídica de las variantes de la invención, preferiblemente de la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, de la célula de la invención, del islote de la invención o de la composición de la invención, para la elaboración de un medicamento, de ahora en adelante "medicamento de la invención". O alternativamente, a la secuencia nucleotídica de la invención, a la construcción genética de la invención, al vector de la invención, a la secuencia aminoacídica de las variantes de la invención, preferiblemente la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, a la célula de la invención, al islote de la invención o a la composición de la invención, para su uso como medicamento. En una realización más preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus.

El término "diabetes mellitus" se refiere a la enfermedad crónica que cursa con altos niveles de azúcar en sangre y que puede ser causada por una escasa producción de insulina, resistencia a ésta o ambas. Esta patología se puede detectar por métodos diagnósticos conocidos por los expertos en la materia tales como, por ejemplo, aunque sin limitarnos, análisis de orina, test de glucemia en ayunas, análisis de la hemoglobina A1c, prueba de tolerancia a la glucosa oral o análisis de glucosa en sangre. Se engloban dentro de este término, aunque sin limitarnos, la diabetes gestacional, el síndrome metabólico, la diabetes tipo 1 y la diabetes tipo 2. En una realización aun más preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de la diabetes mellitus de tipo 1 o insulinodependiente, la cual se caracteriza porque el páncreas no produce o produce poca insulina, lo que hace necesaria la inyección diaria de esta hormona.

El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

En una realización aun más preferida, el medicamento de la invención es un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo {in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra el resultado del examen histológico de islotes procedentes del páncreas de un paciente cuyas células β expresan la variante GCK-S64F (panel de la izquierda) así como de islotes procedentes del páncreas de un individuo control (panel de la derecha).

FIG. 2. Muestra el resultado del análisis de proliferación de células β en islotes procedentes de tejido pancreático de un paciente cuyas células β expresan la variante GCK-S64F (panel de la izquierda) así como de islotes procedentes de tejido pancreático de un individuo control (panel de la derecha). Mareaje celular realizado con Ki67.

FIG. 3. Muestra islotes de ratón no infectados (control) e islotes de ratón infectados con el vector de expresión vacío (pRRL.cmv.ires.eGFP), el vector que contenía GCK-WT (pRRL.cmv.GCK-WT.ires.eGFP) y la mutación GCK-V91 L activadora de GCK encontrada en un ser humano (pRRL.cmv.GCK-V91 L.ires.eGFP). M.O.I de 2 y n= 8.

FIG. 4. Muestra la incorporación de BrdU en islotes de ratón no infectados. DAPI, BrdU, EGFP. (A) Islote control no infectado. (B) Islotes infectados con EGFP. (C) Islotes infectados con GK natural que presentan un aumento de 1 ,6 veces en la incorporación de BrdU en comparación con A y B. Y (D) islotes infectados con GCK-V91 L que presentan un aumento de 6,8 veces en la incorporación de BrdU en comparación con A y B y un aumento de 5, 1 veces en la incorporación de BrdU en comparación con C. EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de las variantes de GK descritas en la invención para la obtención de islotes pancreáticos de alta eficacia. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1 : Manipulación genética del gen GCK para la obtención de formas activadoras, tanto leves como severas, de GCK capaces de codificar para enzimas glucocinasas con actividad aumentada, y su posterior introducción en islotes pancreáticos humanos aislados.

1.1. Aislamiento de islotes pancreáticos humanos.

Los páncreas de donde procedían los islotes pertenecían a personas donantes de órganos, y eran páncreas que no cumplieron con los criterios necesarios para ser transplantados como órgano sólido. Así mismo existía un consentimiento informado y firmado en el que se permitía el uso en investigación de los islotes pancreáticos aislados en caso de que éstos no pudieran ser transplantados. El proceso de aislamiento de islotes pancreáticos humanos se llevó a cabo siguiendo el método semiautomático de Ricordi (Ricordi et al., 1989, Diabetes, 38:Suppl 1 : 140- 142). El páncreas, una vez limpiado de grasa y tejido adyacente, se perfundió a través del conducto pancreático con una solución de Liberasa (Roche). Posteriormente, se introdujo en la cámara de Ricordi para su digestión. Finalmente, los islotes se purificaron utilizando un gradiente continuo de densidades con Ficoll en una centrífuga COBE. Después de varios lavados con medio de cultivo los islotes se observaron al microscopio. Tras un contaje se distribuyeron en frascos de cultivo y se almacenaron a 37°C y 5% de CO2.

1.2. Desarrollo del sistema adenoviral inducible conteniendo ADNc de GCK-WT, y de los mutantes GCK-E440G, GCK-E442K y GCK-V91 L, para los estudios funcionales "in vitro" de los islotes humanos aislados.

El sistema Adeno-X Tet-ON desarrollado modula y controla la expresión de GK, con el fin de obtener una expresión óptima y no deletérea para la funcionalidad de los islotes. Los ADNc humanos tanto de la GCK nativa (WT), como de las variantes inactivante GCK-E440G, activante leve GCK- E442K y activante severa GCK-V91 L, fueron subclonados en el vector pTRE-Shuttle2 (Clontech laboratorios, Inc); posteriormente, el cassette inducible se transfirió al vector Adeno-X para generar los adenovirus recombinantes: Adv-hGCK-WT nativo, Adv-hGCK-E440G, Adv-hGCK- E442K y Adv-hGCK-V91 L. El protocolo de infección se optimizó en la línea celular INS-1 E para establecer la cantidad de partículas virales y la concentración de doxiciclina necesaria para alcanzar una expresión adecuada de GK. Posteriormente, islotes humanos y de rata se coinfectaron bien con Adv-hGCK nativo, con Adv-hGCK-E440G, con Adv- hGCK-E442K, o con Adv-hGCK-V91 L, además de con la construcción adenoviral con el activador transcripcional para doxiciclina (Ad-X Tet-on). Para determinar los niveles de expresión de la glucocinasa se realizaron ensayos de PCR cuantitativa (qPCR) y de inmunofluorescencia. En islotes de rata se analizaron las glucocinasa humana y de rata, y en islotes humanos la glucocinasa humana. Para ello, se extrajo el RNA de islotes mediante el reactivo Trizol (Invitrogen) y entonces, 2μg de RNA se convirtieron en ADNc por RT-PCR usando primers oligo-(d)T. Para la qPCR, el ADNc se amplificó usando el intercalante Sybr green en una plataforma ABI Prism 7700; los cebadores se diseñaron usando el software Primer 3 Express (applera Europe). Los datos de fluorescencia se extrajeron de la plataforma, y se obtuvieron los valores Ct y la eficiencia mediante el software miner 2.1 . La cuantificación se determinó con el software qBASE. Para los experimentos de fluorescencia, se solubilizaron los islotes humanos y de rata, transducidos y no transducidos, con el tampón RIPA (1 ,25% (peso / vol) NP-40, 1 ,25% (peso / vol) deoxicolato sódico 0,0125; fosfato sódico, pH 7,2 mM EDTA), complementado con inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Roche). Posteriormente, 80μ9 de proteína total fueron fraccionados para realizar un Western Blot usando anticuerpos contra glucocinasa humana/rata (c- 20, Santa Cruz de Biotecnología).

1.3. Construcción de los vectores virales adeno-asociados.

Los DNA complementarios codificantes (cDNAs) de GCK-WT, GCK- E440G, GCK-V91 L y GCK-E442K, fueron clonados en el esqueleto del vector adenoviral asociado subtipo 8 (AAV8), bajo el control del promotor del gen de la insulina de ratón (mlP), resultando los plásmidos AAV8-mlP- GCKX-ires-eGFP. El uso del promotor mlP hace que los vectores AAV8- mlP-der se expresen exclusivamente en las células beta pancreáticas.

1.4. Procedimiento de mutagénesis dirigida. Para la construcción de las diferentes mutaciones de la glucocinasa se utilizó el kit QuikChange I I XL Site-Directed Mutagénesis (Strategene). Las mutaciones se incorporaron por PCR empleando la polimerasa PfuUltra High Fidelity; y mediante la digestión con la endonucleasa Dpnl se digirieron específicamente los ADNs metilados/hemimetilados y no mutados. Los oligonucleótidos diseñados para la introducción de las mutaciones en el gen de la glucocinasa (GCK, SEQ ID NO: 5) se detallan a continuación:

1.5. Transducción celular de islotes pancreáticos humanos con vectores virales anedo-asociados.

Debido a que el sistema adenoviral inducible comentado anteriormente tiene una vida media muy limitada (el control de expresión proteica empieza a disminuir aproximadamente a las 3 semanas de la infección), la transducción de los islotes a trasplantar se realizó con AAVs replicando la expresión óptima de GK obtenida con el sistema Adeno-X Tet-ON, lo cual se realizó mediante el uso de diferentes v.g. de AAV. En paralelo, se valoró la posibilidad de construir AAVs inducibles equivalentes a los adenovirus no-asosciados inducibles comentados anteriormente. Con los AAVs inducibles con doxiciclina se transdujeron los islotes pancreáticos humanos que fueron posteriormente trasplantados. La mezcla de virus y células se centrifugó (1000 x g, 1 h, 37°C), tras lo cual las células fueron resuspendidas en medio RPMI 1640 que contiene 20% FCS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 μ9/ιηΙ gentamicina, y rhlL-2 (50 lU/ml), y se incubaron durante cuatro días. El empaquetamiento de los AAVs, la purificación de los diferentes AAVs mediante ultracentrifugación por gradiente CsCI (Cesium Chloride), la titulación de las partículas de genoma del vector (v.g.), así como la confirmación de su expresión se realizaron en células de la línea I NS-1 E. El proceso de transducción se llevó a cabo en un total de 6 días, hasta la comprobación de la eficiencia del proceso:

Día 1 : se plaquearon 8.105 células en placas de 6 pocilios con 2 mi de medio/pocilio. Las células se dejaron incubar cerca de 48 horas. Día 3: se preparó la mezcla de cultivo con 8μg de polibreno/ml de medio. El polibreno es un polímero se bajo peso molecular, positivamente cargado, que aparentemente es capaz de unirse a las células neutralizando la carga superficial. Esto permite que las glicoproteínas virales se unan más eficazmente a sus receptores, reduciendo la repulsión entre la partícula viral y la célula. Se añadieron 1 ,5ml de medio DMEM al 10% de FBS (BioWhittaker) con polibreno. Se añadió el SN en la proporción deseada (en las infecciones realizadas, se hicieron diluciones 1 :25, 1 :4, 1 :2 y 1 : 1 ) y se centrifugó la placa durante 30 minutos a 37°C a 1000g (proceso denominado espinoculación). Se dejaron en contacto las células con las partículas virales y la mezcla se incubó toda la noche a 37°C y 5% CO2. No se debe dejar la mezcla más de 12 horas o bien se debe reducir la concentración de polibreno. Día 4: se cambió el medio y se incubó hasta el día 5 (aproximadamente unas 62 horas tras dejar puesta la infección).

Día 5: se levantaron las células mediante tripsinización, del modo habitual. Se pasaron las células a tubos eppendorf. Se centrifugaron a 1200 rpm durante 5minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 500μΙ de PBS. Se analizaron las células por citometría de flujo. Una vez analizadas se estimó el tiempo de cultivo necesario durante el cual se deben cultivar las células que han sufrido el proceso de infección, en base al tiempo de duplicación de la línea celular, el porcentaje de células positivas para eGFP, y el número mínimo de células cultivables, para su purificación mediante FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting; Beckman Coulter). Ejemplo 2: Análisis del efecto de la variante GCK-S64F en la proliferación y eficiencia de islotes pancreáticos humanos.

Se encontró una mutación "de novo" que activaba intensamente el gen de la glucocinasa (GCK) natural (SEQ ID NO: 5) en un paciente con hipoglucemia neonatal grave. Se encontró una mutación novedosa sin sentido, (cambio 191 C>T en la SEQ ID NO: 5 para dar lugar a la SEQ ID NO: 6) que da como resultado la sustitución de un residuo S por uno F en el codón 64 del exón 3 de la secuencia aminoacídica de la GK nativa (SEQ ID NO: 4, para dar lugar a la SEQ ID NO: 1 o variante GCK-S64F). El probando era heterocigótico para esta mutación, que no se identificó en el ADN de sus padres. Para determinar si esta mutación era un caso de novo, se llevó a cabo un análisis de microsatélites sobre varios cromosomas, y se excluyó una falsa paternidad. Los estudios funcionales realizados sobre la variante GCK-S64F mostraron una afinidad 9 veces superior por la glucosa (So.s), una eficacia 8 veces superior (Kcat/So,s) y un índice de actividad aumentado de manera importante en comparación con la GK natural (WT-GK) (Tabla 1 ). Esta activación catalítica y estructural del GCK-S64F originó que esta enzima tuviera un umbral de liberación de insulina en respuesta a glucosa (UF-SIEG) de 0,96 mmol/l, muy alejado del valor de 5 mmol/l de la GK-WT y cercano a los valores de 0,8 y 0,9 mmo/l encontrados en otras mutaciones que activaban fuertemente la GK identificadas. La afinidad por la glucosa, notablemente elevada, y el índice de actividad relativa junto al UF-SIEG extraordinariamente bajo encontrado para GCK-S64F explican en su totalidad la grave hipoglicemia observada en el paciente.

Tabla 1. Resultados de los estudios funcionales realizados sobre la variante GCK-S64F (SEQ ID NO: 1 ) en comparación con la GK nativa humana (SEQ ID

NO: 4). En el examen histológico, el páncreas del paciente mostró islotes anormalmente grandes en comparación con un control de la misma edad (Fig. 1 ). También se encontró una proliferación de células beta en los islotes del tejido pancreático obtenidos en las pancreatectomías parciales realizadas en este paciente (Fig. 2). Tras la primera pancreatectomía parcial, el porcentaje de células beta marcadas con Ki67 fue 1 ,56, 2,59 y 4,09%, y tras el segundo procedimiento quirúrgico, el índice Ki67 fue de aproximadamente el 10%. Esto es interesante, ya que sugiere que tras la pancreatectomía se consiguió una "regeneración" de las células beta. Dos de los controles de la misma edad tuvieron 0,2 y 0,98%. Igualmente, el tamaño promedio del islote fue de 4.064, 5.023 y 6.058 micrómetros cuadrados tras el primer procedimiento quirúrgico, y de 9.865 tras el segundo. Esto sugiere que los islotes intentaron compensar la pancreatectomía parcial. Ejemplo 3: Análisis del efecto de la variante GCK-V91 L en la proliferación y eficiencia de islotes pancreáticos de ratón.

La eficacia de infección en todos los casos fue de aproximadamente el 93%, (Figura 3). La liberación de insulina en respuesta a glucosa estuvo significativamente por encima de concentraciones de glucosa de 4 mM en los islotes infectados con GCK-V91 L (p< 0,01 ) en comparación con los islotes de control no infectados y con los islotes infectados con eGFP y GCK-WT. Además, los islotes infectados con GCK-V91 L comenzaron a liberar insulina en respuesta a glucosa a concentraciones de glucosa inferiores (4 mM) (Tabla 2). De manera fascinante, la incorporación de BrdU fue 6,8 veces mayor en los islotes infectados con GCK-V91 L que en los islotes de control no infectados y en los islotes infectados con eGFP; y 5,1 veces mayor en comparación con los islotes infectados con GCK-WT (Figura 4).

Tabla 2. UF-SIEG en islotes de ratón. La liberación de insulina se expresa como pg de insulina^g proteína/60 min ^* p< 0,01 en comparación con el resto de condiciones. 7 ratones estudiados; n= 15 y 3 muestras ELISA se analizaron por triplicado.

Considerando que la "desdiferenciación" de células beta y la carencia de una respuesta correcta a la glucosa son los problemas más importantes para el aumento de la proliferación de células β durante un periodo de tiempo prolongado, de forma sorprendente, la proliferación en los islotes infectados con GCK-V91 L conservaba en su totalidad una sensibilidad correcta a la glucosa y un UF-SIEG correcto tras 15 días en cultivo.

Los resultados confirmaron que la mutación activadora GCK-V91 L aumentaba la liberación de insulina en respuesta a glucosa a la vez que disminuía el UF-SIEG.

La glucosa desempeña un papel crítico en la proliferación de células beta. Por tanto, la disminución en el UF-SIEG lleva a su vez a un aumento en el flujo de glucosa intracelular, que activara directamente rutas posteriores alternativas o de amplificación, algo importante en la regulación de la proliferación de las células beta.

La replicación de estos islotes de alta eficacia puede usarse como una nueva herramienta de terapia celular en la Diabetes Mellitus de Tipo 1 .