一种 β -葡萄糖苷酶及其表达基因与应用 技术领域

本发明涉及一种 β -葡萄糖苷酶及其表达基因与应用，特别是一� � β -葡萄糖苷酶及其表 达基因与利用该酶生产寡糖的方法， 属于生物技术和生物化工技术领域。

背景技术

寡糖是一种由 2-10个单糖组成的低聚糖， 其有着非常广泛的应用价值。 如目前广泛应 用于食品、 保健品、 饮料、 医药、 伺料添加剂等领域。 美国、 日本、 欧洲等地均有规 模化生产， 我国低聚糖的开发和应用起于 90年代中期， 近几年发展迅猛。 常见的寡糖 包括麦芽低聚糖葡萄糖（α— 1， 4糖苷键结合）， 龙胆二糖葡萄糖 （ β— 1， 6糖苷键结 合）， 低聚糖木糖 （ β—1， 4糖苷键结合） 等。 目前制造龙胆二糖的技术方法主要包 括以下两种： 1、 从天然原料中提取， 但这种方法提取产量低， 价格昂贵， 无法满足工业化 生产。 2、 酶法生产龙胆二糖， 不过目前酶法生产龙胆二糖存在着酶活性效率 低下， 酶生产 费用高昂等不便因素。

目前酶法生产寡糖， 是将单糖作为底物， 利用糖苷酶生产寡糖。 如中国专利文献 CN101492661A (申请号 200910029055. 4) 公开了一种 β _葡萄糖苷酶基因的克隆、 表达及用 于龙胆低聚糖的制备，该发明由黑曲霉 WX-07总 RNA逆转录合成 β -葡萄糖苷酶基因（BGL) SEQ ID N0 : 1 , BGL的 CDNA以质粒 PPIC9K为表达载体， 以毕赤酵母（P. PAST0RIS)为表达宿主，实 现 BGL基因在胞外的可溶性表达； BGL的 CDNA全长 2523个核苷酸， 编码 841个氨基酸， 构 建的 BGL/PPIC9K转化 P. PASTORIS KM71可表达 BGL酶。 BGL酶具有转糖苷活性， 能将葡萄 糖转糖苷生成龙胆低聚糖。 但是该文献公开的酶生产寡糖所用时间过长， 产物得率过低， 无 法满足生产要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足， 提供一种 β -葡萄糖苷酶及其表达基因的高效生产与利用 该酶生产寡糖的方法。

发明概述

本发明通过对里氏木霉菌株中产生的 β -葡萄糖苷酶进行相关改造，发现其改造后的 β - 葡萄糖苷酶的作用产物的产量提高了 3. 3倍。而且与报道的同类技术相比， 产生相同产量寡 糖所需的时间缩短了 4. 8倍， 最终产物得率提高了 25%。

发明详述

本发明技术方案如下：

一种 β -葡萄糖苷酶， 氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。

一种 β -葡萄糖苷酶的表达基因， 核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2所示。 一种重组表达载体， 是将如 SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列插入表达载体获得。

根据本发明优选的， 所述表达载体为 PET-32A表达载体。

一种重组细胞， 是将上述重组表达载体转化入细胞中获得。

根据本发明优选的， 所述细胞为大肠杆菌 BL21 (DE3)。

一种利用 β -葡萄糖苷酶生产寡糖的方法， 步骤如下：

将核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2所示的基因片段导入到 PET-32A质粒载体中， 然后转入大 肠杆菌 BL21 (DE3)中， 通过亲和层析色谱分离纯化制得 β _葡萄糖苷酶， 然后将 β _葡萄糖苷 酶加入以葡萄糖为底物的反应液中， 在温度为 30度， ρΗ为 6. 0的条件下反应， 获得寡糖。

有益效果

1、 利用本发明所述的 β _葡萄糖苷酶生产寡糖， 与现有 β _葡萄糖苷酶相比， 反应速度 明显加快。

2、 本发明所述的 β _葡萄糖苷酶的最佳酶活温度更接近常温， 在实际工业化生产中， 有 利于降低生产耗能。

3、 本发明所述的 β _葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高， 纯化过程简单， 易于大规模工 业化生产。

附图说明

图 1亲和层析纯化蛋白结果 SDS-PAGE图谱；

其中： M、 marker, 1、 大肠杆菌细胞破碎液， 2、 镍亲和层析柱洗脱峰， 3、 阴离子交换 层析洗脱峰， 4、 阴离子交换层析洗脱峰。

图 2薄层层析分析寡糖产物成分；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步 的阐述， 应该说明的是， 本说明的保护范 围不仅限于此。

里氏木霉（trichoderma reesei ) QM6a购自美国标准生物品保藏中心， 菌种保藏号 ATCC No. 13631；

Pet-32A质粒载体购自 Novagen公司。

实施例 1：

(1)里氏木霉 QM6a总 RNA的提取：

里氏木霉 QM6a菌株在加有 2wt%微晶纤维素的匪培养基中培养 2天， 用滤纸过滤收集菌 丝。 将收集的菌丝放入预冷的研钵中研磨， 其中研磨时加入一定的液氮。 将研磨成的菌丝粉 末移至 1. 5ml离心管中， 并加入 1ml RNAiso (购自生工生物工程有限公司 B6402-1 ) 于振 荡器中震荡均匀， 室温放 5min。 然后 12000rpm离心 10min。 然后将上清吸到干净的 1. 5ml 离心管中。然后加入 160 μ 1氯仿，震荡 15s混匀，室温放置 5min， 12000rpm, 4度离心 5min。 然后吸上清至新的 1. 5ml离心管。然后再加入 800 μ 1异丙醇，上下颠倒 5次。室温放置 lOmin, 12000rpm, 4度离心 10min。 弃上清。 加入 lml预冷的 75%乙醇清洗 RNA， 震荡后 7500rpm离 心 5min。 加入 50 μ 1 DEPC处理过的水， 溶解 RNA。

匪培养基组分如下： 硫酸铵 3g， 磷酸二氢钾 4.5g, 硫酸镁 0.18g， 二水氯化钙 0.24g 尿素 1.5g， 1000 X微量元素（七水硫酸铁 5g/L， 一水硫酸锰 1.6g/L， 七水硫酸锌 1.4g/L， 氯化钴 2g/L) 30μ 1, 用水补足到 300ml。

(2) β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

以里氏木霉 QM6a总 RNA为模板， 利用逆转录合成 cDNA (购自 takara反转录试剂盒 BK1201):

①基因组 DNA的去除反应

按以下比例配制反应液：

5XgDNA Eraser Buffer 2μ 1

gDNA Eraser 1 μ 1

Total RNA 0.5 g

RNAase Free dd¾0 up to 10 1

将上述反应液在 42度条件下反应 2min。

②反转录反应：

按以下比例配制反应液：

5XPrimeScript Buffer 2 4μ 1

PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 1

RT Primer Mix 1 μ 1

步骤①配制的反应液 10 μ ΐ

RNase Free dd¾0 up to 20 1

将上述反应液在 37度反应 15min， 接着在 85度反应 5s。

以 F， R为上下游引物扩增出 bgl基因：

引物 F： CCGGAATTCATGCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC；

引物 R： CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC；

PCR反应在 50μ 1体系中进行： 2XPCR Buffer 25 μ 1， 2mM dNTPs 10μ 1, 引物 F 1.5 l， 引物 R 1.5μ 1, 模板 DNA 1μ 1， K0D FX聚合酶 1μ 1， 加双蒸水补足到 50 μ 1。

PCR反应体系： 在 94度变性 2min后开始循环， 然后 98度变性 10s, 60度退火 30s， 68 度延伸 90s， 共 35个循环后， 再于 68度延伸 lOmin, 扩增得到 PCR片段， 割胶回收， 回收 片段连接在 PET32A质粒载体上，连接位置在质粒载体的多克 隆位点 EcoRl和 Hindlll之间。 连接产物转化大肠杆菌 DH5 α， 转化产物涂布于含 lOOmg/L氨苄青霉素的 LB平板， 经 37度 培养过夜， 挑选菌落， 接入 LB液体培养基， 10个小时后提取质粒。

(3) β_葡萄糖苷酶基因的改造

将上述重组质粒中的 β-葡萄糖苷酶基因进行定点突变， 突变位点为 I177S, I174S。 首先突变位点 I 177S。 以 Fl， R1 为反向引物进行定点突变 （试剂盒来源于东洋纺公司 KOD-PLUS-Mutagenesis Kit 167300)， 序列如下：

F 1： AGCTATGGATATGCCACCGGCAGCAACGC；

R 1： GGCCTGAATCCAGGGTTCGTTGATGGTG；

①反向 PCR

按以下比例配制 PCR反应液：

10 X Buffer 5 μ 1

2mM dNTPs 5 μ 1

Fl 1. 5 μ 1

Rl 1. 5 μ 1

重组质粒 （PET32A-BGL) 1 μ 1

KOD-PLUS-Mutagenesis Kit 1 μ 1

dd¾0 up to 50 1

PCR反应体系： 在 94度变性 2min后开始循环， 然后 98度变性 10s， 65度退火 30s， 68 度延伸 7min， 共 5个循环。

② DPN I对模板质粒的消化

在上述反应后的反应液中加入 1 μ 1DPN I， 在 37°C条件下反应 1个小时；

③ PCR产物的自身环化

按以下比例配制反应液

Ligation high 5 μ 1

dd¾0 7 μ 1

②中的反应液 2 μ 1

Τ4 Kinase 1 μ 1

将上述反应液在 16度条件下反应 1小时

反应后转化大肠杆菌 DH5 α， 转化产物涂布于含 lOOmg/L氨苄青霉素的 LB平板， 经 37 度培养过夜， 挑选菌落， 接入 LB液体培养基， 10个小时后提取质粒。 将此质粒进行序列测 定。 挑选出突变正确的质粒。

以上述突变位点 I 177S突变正确的质粒为模板， 突变 I 174S位点， 设计反向 PCR引物 F2和 R2， 按上述同样的方法挑选出突变正确的质粒。

F2： AGTCAGGCCAGCTATGGATATGCCACCG

R2： CCAGGGTTCGTTGATGGTGATCCAGTTCT

制得的 β _葡萄糖苷酶表达基因经华大基因生物工程公� �测序验证， 核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2所示。

接着将重组质粒导入大肠杆菌 BL21 (DE3)中。 将得到的含有重组质粒的大肠杆菌扩大培 养，培养至 0D ₆ 。。为 0. 6时加入千分之一含量为 100 mM的 IPTG, 16度条件下诱导 16个小时。 然后在 7000rpm条件下离心， 收集菌体， 用 pH为 6. 0， 50mM PBS缓冲液洗涤菌体两遍。 通 过超声破碎后， 用镍离子亲和层析和阴离子交换色谱的方式纯 化出目的蛋白， 然后分别将破 碎后的液体、 镍离子亲和层析后的洗脱峰溶液及阴离子交换 色谱纯化后的洗脱峰溶液经 SDS-PAGE电泳后， 结果如图 1所示， 将其与反应液按每 1ml反应液添加 0. 35mg的酶量进行 反应。 反应条件为 30°C， pH为 6. 0， 反应液成分为 10ml体系中加入 40%葡萄糖， 500 μ 1叠 氮化钠， lmL的 pH6. 0的 50mM磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲溶液。 反应 10小时后， 样品沸 水浴 lOmin灭酶活。 然后通过 HPLC和薄层层析（图 2)鉴定产物浓度和种类。 其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1所示。

实施例 2：

将纯化出来的 β -葡萄糖苷酶和野生型 β -葡萄糖苷酶分别取 ΙΟΟμΙ加入到含 5mM 的 p-nitrophenyl glucoside的 50mM的磷酸氢二钠 /憐酸二氢钠缓冲溶液中 (；加入 10%甘油）， pH 为 7.4，温度为 30°C，反应 30分钟。用 10%碳酸氢钠 150μ1终止反应。取适量的体积在 420nm 光波长处测定 OD值，得出其水解酶活。使用 Bradford试剂盒（上海生工生物工程 SK3041-1 ) 测定其蛋白质浓度。酶活定义如下： 每分钟转化产生 ImM pNP为一个酶活单位 (U)。 结果如 表 1所示。

表 1

实施例 3：

将实例 2中的条件进行优化，使转糖基活性达到较高� �平.分别设定不同的温度， pH值优 化本发明 β -葡萄糖苷酶的转糖基作用.通过实验得出在条� ��为 ΡΗ5. 0, 温度为 30度时， 转 糖基活性最高，并在 72小时左右达到最高值.在此条件下分别以 60%， 70%, 80%葡萄糖浓度 为底物， 得到 72小时的最高点， 如表 2所示。

表 2 实施例 4：

将纯化后目的蛋白与反应液按每 1ml反应液添加 0. 35mg的酶量进行反应。 反应条件为 30°C， pH为 6. 0，反应液成分为 10ml体系中加入 40%葡萄糖， 500 1叠氮化钠， lmL的 pH6. 0 的 50mM磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲溶液。 反应阶段定时取样， 样品沸水浴 lOmin灭酶活。 结果如表 3。

表 3