本発明は、グリセロール-3-リン酸をアシ� ��化して、リゾホスファチジン酸を生成させ� ��ことを特徴とする、Mortierella属由来の新規� �グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素遺� �子に関する。

 本発明のグリセロール-3-リン酸アシル基� ��移酵素(GPAT)は、グリセロール-3-リン酸をア� ��ル化して、リゾホスファチジン酸を生成す� ��反応を触媒する酵素である。アシル基供与� ��は、通常、アシルCoAであるが、これに限定� ��れない。また、本発明に係るタンパク質が� ��用することによるアシル基転移反応のアシ� ��基受容体は、グリセロール-3-リン酸である� ��、これに限定されない。

  本発明のグリセロール-3-リン酸ア シル基転移酵素をコードする核酸
 本発明のグリセロール-3-リン酸アシル基転� ��酵素(GPAT)には、GPAT2が含まれる。GPAT2をコー ドする核酸のcDNA、CDS、ORF及びアミノ酸配列� �対応関係を以下の表1に整理して記載した。

 つまり、本発明のGPAT2に関連する配列と� �ては、GPAT2のアミノ酸配列である配列番号2� �GPAT2のORFの領域を示す配列である配列番号4� �そして、そのCDSの領域を示す配列である配� �番号3、及びそのcDNAの塩基配列である配列番 号1があげられる。このうち、配列番号3は配� ��番号1の第113-1891番目の塩基配列に相当し、� ��列番号4は配列番号1の第113-1888番目の塩基配 列、及び配列番号3の1-1776番目の塩基配列に� �当する。

 本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のD NAのほか、そのRNA相補体も含み、天然由来の� ��のであっても、人工的に作製したものであ� ��てもよい。DNAには、例えば、ゲノムDNAや、� ��記ゲノムDNAに対応するcDNA、化学的に合成さ れたDNA、PCRにより増幅されたDNA、及びそれら の組み合わせや、DNAとRNAのハイブリッドがあ げられるがこれらに限定されない。

 本発明の核酸の好ましい態様としては、( a)配列番号4で示される塩基配列、(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク� �をコードする塩基配列、(c)配列番号1で示さ� ��る塩基配列等があげられる。

 配列番号4で示される塩基配列及び配列番 号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパ� �質をコードする塩基配列、及び、配列番号1� ��示される塩基配列は、表1に記載したとおり である。

 上記塩基配列を得るためには、GPAT活性を 有する生物のESTやゲノムDNAの塩基配列データ から、既知のGPAT活性を有するタンパク質と� �一性の高いタンパク質をコードする塩基配� �を探索することもできる。GPAT活性を有する� ��物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質� ��産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これ に限定されない。

 EST解析を行う場合には、まず、cDNAライブラ リーを作製する。cDNAライブラリーの作製方� �については、『Molecular Cloning, A Laboratory Ma nual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参 照することができる。また、市販のcDNAライ� �ラリー作製キットを用いてもよい。本発明� �適するcDNAライブラリーの作製方法としては� ��例えば以下のような方法があげられる。す� ��わち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株 を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養す る。この前培養に適する培養条件としては、 例えば、培地組成としては、1.8%グルコース� �1%酵母エキス、pH6.0があげられ、培養期間は3 日間、培養温度は28℃である条件があげられ� ��。その後、前培養物を適当な条件にて本培� ��に供する。本培養に適する培地組成として� ��、例えば、1.8%グルコース、1%大豆粉、0.1%オ リーブ油、0.01%アデカノール、0.3%KH ₂ PO ₄ 、0.1% Na ₂ SO ₄ 、0.05% CaCl ₂ ・2H ₂ O、0.05% MgCl ₂ ・6H ₂ O、pH6.0があげられる。本培養に適する培養条 件としては、例えば、300rpm、1vvm、26℃で8日� �通気攪拌培養する条件があげられる。培養� �間中に適当量のグルコースを添加してもよ� �。本培養中に適時培養物を採取し、そこか� �菌体を回収して、全RNAを調製する。全RNAの� �製には、塩酸グアニジン/CsCl法等の公知の方 法を用いることができる。得られた全RNAから 市販のキットを用いてpoly(A) ⁺ RNAを精製することができる。さらに、市販の キットを用いてcDNAライブラリーを作製する� �とができる。その後、作製したcDNAライブラ� ��ーの任意のクローンの塩基配列を、ベクタ� ��上にインサート部分の塩基配列を決定でき� ��ように設計されたプライマーを用いて決定� ��、ESTを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA  GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でcDNAライ� �ラリーを作製した場合は、ディレクショナ� �クローニングを行うことができる。

 ORFの塩基配列で比較すると、本発明のGPAT 2遺伝子と公知のM. alpina(ATCC #16266)由来のGPAT1 遺伝子との同一性は42.0%である。なお、本発� ��のGPAT2遺伝子をBLASTX解析した結果、最もE-val ueの低かった、すなわち同一性の高かったAspe rgillus nidulans由来の1-アシル-sn-グリセロール- 3-リン酸アシル基転移酵素様の推定タンパク� ��配列(GBアクセッションNo. EAA62242)、及び機� �が明らかにされているタンパク質で最も同� �性の高かったSaccharomyces cerevisiae由来のグリ� ��ロール-3-リン酸アシル基転移酵素であるSct1 p(GBアクセッションNo. CAC85390)、をコードする 塩基配列との同一性は、それぞれ36.9%と36.6%� �ある。

 同様に、本発明のGPAT2と公知のM. alpina(ATC C #16266)由来のGPAT1との間のアミノ酸配列の同 一性は15.7%である。なお、本発明のGPAT2遺伝� �をBLASTX解析した結果、最もE-valueの低かった� ��すなわち同一性の高かったAspergillus nidulans� ��来の1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシ� ��基転移酵素様の推定タンパク質配列(GBアク� ��ッションNo. EAA62242)、及び機能が明らかに� �れているタンパク質で最も同一性の高かっ� �Saccharomyces cerevisiae由来のグリセロール-3-リ� ��酸アシル基転移酵素であるSct1p(GBアクセッ� �ョンNo. CAC85390)、との同一性は、それぞれ17. 0%と15.0%である。

 本発明はまた、上記配列番号4で示される塩 基配列(「本発明の塩基配列」と記載する場� �もある)、並びに、配列番号2で示されるアミ ノ酸配列(「本発明のアミノ酸配列」と記載� �る場合もある)からなるタンパク質をコード� ��る塩基配列を含む核酸と同等の機能を有す� ��核酸を含む。「同等の機能を有する」とは� ��本発明の塩基配列がコードするタンパク質� ��び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク� ��が、GPAT活性を有することを意味する。また 、このGPAT活性に加えて、本発明の塩基配列� �コードするタンパク質、又は、本発明のア� �ノ酸配列からなるタンパク質が発現してい� �宿主の脂肪酸組成において、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸� ��有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ ン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数16の脂肪酸の含有量に対する、炭� �数18の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v) アラキドン酸および/またはジホモγリノ� �ン酸の含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、上記タンパ ク質を発現していない宿主の脂肪酸組成より も高い比率である脂肪酸組成を形成できるよ うな活性を有するタンパク質(以下、「本発� �のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性を有す� ��タンパク質」という場合もある)である場合 も含まれる。

 具体的には、上記本発明の塩基配列等を発� ��ベクターpYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221 -1228, 1995)に挿入したものを、酵母Saccharomyces� �cerevisiae EH13-15株(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30,  515-520, 1989)を宿主として形質転換させ、得� ��れた形質転換体を培養して回収した菌体を� ��以下の実施例6等に記載の方法で脂肪酸解析 をした場合の上記本発明のGPATの脂肪酸組成� �、具体的に、以下の
i) オレイン酸含有量が47%以上、好ましくは48 %以上、49%以上、50%以上、51%以上;
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸� ��有量の比率が8.0以上、好ましくは9.0以上、1 0.0以上、10.5以上; 
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ ン酸及びオレイン酸の含有量の比率が8.5以上 、好ましくは9.0以上、10.0以上、11.0以上、11.5 以上;並びに
iv) 炭素数16の脂肪酸の含有量に対する、炭� �数18の脂肪酸の含有量の比率が1.2以上、好ま しくは1.3以上、1.4以上;並びに
v) アラキドン酸の含有率が、0.47以上、好ま� ��くは0.50以上、0.55以上、0.60以上、及び/また は、ジホモγリノレン酸の含有率が、0.34以上 、好ましくは0.40以上、0.50以上、0.55以上
のうちの少なくとも一つ以上の数値を満たす 脂肪酸組成を形成できるような活性を有する タンパク質をコードしている塩基配列を含む 核酸である。さらに好ましくは、本発明の塩 基配列等は、GPAT活性及び上記本発明のGPATの� ��肪酸組成を形成できる活性を有するタンパ� ��質をコードする塩基配列を含む核酸である� ��

 本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つとして� ��アラキドン酸含有率が高いことがあげられ� ��。アラキドン酸は、化学式C ₂₀ H ₃₂ O ₂ で示される、分子量304.47の物質で、4つの二� �結合を含む20個の炭素鎖からなるカルボン酸 (〔20:4(n-6)〕)で、(n-6)系に分類される。アラ� �ドン酸は、動物の細胞膜中の重要なリン脂� �(特にホスファチジルエタノールアミン・ホ� ��ファチジルコリン・ホスファチジルイノシ� ��ール)として存在し、脳に多く含まれる。ま たアラキドン酸は、アラキドン酸カスケード により生成するプロスタグランジン・トロン ボキサン・ロイコトリエンなど一連のエイコ サノイドの出発物質であり、細胞間のシグナ ル伝達におけるセカンドメッセンジャーとし ても重要である。一方、アラキドン酸は、動 物ではリノール酸を原料として体内で合成さ れる。しかし、動物の種あるいは年齢等によ っては、この機能が十分でないため必要な量 を生産することかできないか、あるいは全く 生産する機能がないため、食物からアラキド ン酸を摂取しなければならず、アラキドン酸 は必須脂肪酸であるといえる。

 本発明の脂肪酸組成物中のアラキドン酸� ��有率は、例えば、以下のように測定するこ� ��ができる。すなわち、本発明のGPAT2のプラ� �ミドを、例えば、実施例8に記載の方法によ� ��pDuraSCやpDura5MCS等のベクターに挿入し、M. al pina株で形質転換して得られた形質転換体を� �現させて、実施例8に記載した培養方法等に� ��って得られた培養菌体を用いて菌体内の脂� ��酸含有率や培地あたりのアラキドン酸の含� ��量等を測定する方法である。アラキドン酸� ��含有量等の分析方法としては、例えば、得� ��れた培養菌体の脂肪酸を塩酸メタノール法� ��より脂肪酸メチルエステルに誘導したあと� ��ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して� ��ら、ガスクロマトグラフィーで行う方法が� ��げられる。これによれば、本発明のGPAT2をM.  alpinaで形質転換させた場合は、菌体内の脂� ��酸含有率も培地あたりのアラキドン酸生産� ��も高いことが示されている。このように、� ��ラキドン酸含有率が高い本発明の脂肪酸組� ��物は、アラキドン酸を効率よく摂取できる� ��め、好ましい。

 また、本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つ� ��して、ジホモγリノレン酸含有率が高いこ� �があげられる。ジホモγリノレン酸(DGLA)は、 化学式C ₂₀ H ₃₄ O ₂ で示される、分子量306.48の物質で、3つの二� �結合を含む20個の炭素鎖からなるカルボン酸 (〔20:3(n-6)〕)で、(n-6)系に分類される。DGLAは� ��γ-リノレン酸(18:3(n-6))が伸張することによ� �て得られる。DGLAの二重結合が1つ増えるとア ラキドン酸が生成される。

 このような本発明の核酸と同等の機能を� ��する核酸としては、以下の(a)~(e)のいずれか に記載の塩基配列を含む核酸があげられる。 なお、以下にあげる塩基配列の記載において 、「本発明の上記活性」とは、上記の「GPAT� �性及び/又は上記本発明のGPATの脂肪酸組成を 形成できる活性」を意味する。

 (a)配列番号2で示されるアミノ酸配列におい て1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換� �しくは付加されたアミノ酸配列からなり、� �つ、本発明の上記活性を有するタンパク質� �コードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2で示されるアミノ酸配列において1若し� �は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは� �加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本� �明の上記活性を有するタンパク質をコード� �る塩基配列を含む。

 具体的には、
(i) 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち1個� �は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1~ 180個、1~150個、1~100個、1~50個、1~30個、1~25個� �1~20個、1~15個、1~10個、さらに好ましくは1~5� �))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち1個� ��は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば1~18 0個、1~150個、1~100個、1~50個、1~30個、1~25個、1 ~20個、1~15個、1~10個、さらに好ましくは1~5個) )のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミ� �酸配列、
(iii) 配列番号2に示すアミノ酸配列において1 個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば 1~180個、1~150個、1~100個、1~50個、1~30個、1~25個 、1~20個、1~15個、1~10個、さらに好ましくは1~5 個))の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配� ��、又は
(iv) 上記(i)~(iii)を組み合わせたアミノ酸配列 からなるタンパク質であって、かつ、本発明 の上記活性を有するタンパク質をコードする 塩基配列である。

 上記のうち、置換は、好ましくは保存的� ��換である。保存的置換とは、特定のアミノ� ��残基を類似の物理化学的特徴を有する残基� ��置き換えることであるが、もとの配列の構� ��に関する特徴を実質的に変化させなければ� ��かなる置換であってもよく、例えば、置換� ��ミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを� ��壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種� ��の二次構造を破壊したりしなければいかな� ��置換であってもよい。

 保存的置換は、一般的には、生物学的合� ��系や化学的ペプチド合成で導入されるが、� ��ましくは、化学的ペプチド合成による。こ� ��場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が� ��まれていてもよく、ペプチド模倣体や、ア� ��ノ酸配列のうち、置換されていない領域が� ��転している逆転型又は同領域が反転してい� ��反転型も含まれる。

 以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ご� ��に分類して例示するが、置換可能なアミノ� ��残基は以下に記載されているものに限定さ� ��るものではない。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン� ��バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノ� �タン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブ� ��ルグリシン、t-ブチルアラニン及びシクロ� �キシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソア� ��パラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノ� �ジピン酸及び2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン及びグルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジ アミノブタン酸及び2,3-ジアミノプロピオン� �
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン及び4-ヒ ドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン及びホモセリン
G群:フェニルアラニン及びチロシン
 非保存的置換の場合は、上記種類のうち、� ��る1つのメンバーと他の種類のメンバーとを 交換することができるが、この場合は、本発 明のタンパク質の生物学的機能を保持するた めに、アミノ酸のヒドロパシー指数(ヒドロ� �シーアミノ酸指数)を考慮することが好まし� ��(Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982))。

 また、非保存的置換の場合は、親水性に� ��づいてアミノ酸の置換を行うことができる� ��

 本明細書及び図面において、塩基やアミ� ��酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Bioc hemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、I mmunology--A Synthesis(第2版, E.S. Golub及びD.R. Gre n監修, Sinauer Associates,マサチューセッツ州サ ンダーランド(1991))等に記載されているよう� �、当業界で慣用されている略語に基づく。� �たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場� �は、特に明示しなければL体を示す。

 D-アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異� �体、α,α-二置換アミノ酸等の非天然アミノ� �、N-アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の 非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパ ク質を構成する要素となりうる。

 なお、本明細書で用いるタンパク質の表� ��法は、標準的用法及び当業界で慣用されて� ��る標記法に基づき、左方向はアミノ末端方� ��であり、そして右方向はカルボキシ末端方� ��である。

 同様に、一般的には、特に言及しない限� ��、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5’ 端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左 方向を5’方向とする。

 当業者であれば、当業界で公知の技術を用� ��て、本明細書に記載したタンパク質の適当� ��変異体を設計し、作製することができる。� ��えば、本発明のタンパク質の生物学的活性� ��さほど重要でないと考えられる領域をター� ��ティングすることにより、本発明のタンパ� ��質の生物学的活性を損なうことなくその構� ��を変化させることができるタンパク質分子� ��の適切な領域を同定することができる。ま� ��、類似のタンパク質間で保存されている分� ��の残基及び領域を同定することもできる。� ��らに、本発明のタンパク質の生物学的活性� ��は構造に重要と考えられる領域中に、生物� ��的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポ� ��ペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的� ��ミノ酸置換を導入することもできる。特に� ��本発明では、図1中に二重下線で示したよう に、本発明のGPATのアミノ酸配列中の第87~93残 基に、グリセロリン脂質アシル基転移酵素(Gl ycerolipid acyltransferase)に必須の保存モチーフ� �ある「HXXXXD(HX ₄ D)」(J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998)に類似の モチーフが存在する(保存されるヒスチジン� �びアスパラギン酸を*で示す)。なお、上記保 存モチーフ中で、Xはいかなるアミノ酸残基� �あってもよいことを示している。このモチ� �フは本発明のGPATにとっても、GPAT活性を維持 するために重要であると考えられる。また、 図1中において*で示した、本発明のGPATのアミ ノ酸配列中の第87残基、第93残基、及び第172� �基は、本発明のGPATの活性に重要であると考� ��られる。さらに、第138残基及び第174残基は� ��本発明のGPATとグリセロール-3-リン酸との結 合に重要であると考えられる。従って、本発 明の変異体は、上記保存モチーフ及び上記に 示した残基が保存されている限り、いかなる 変異体であってもよい。

 当業者であれば、本発明のタンパク質の� ��物学的活性又は構造に重要であり、同タン� ��ク質のペプチドと類似するペプチドの残基� ��同定し、この2つのペプチドのアミノ酸残基 を比較して、本発明のタンパク質と類似する タンパク質のどの残基が、生物学的活性又は 構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ 酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造 -機能研究を行うことができる。さらに、こ� �ように予測したアミノ酸残基の化学的に類� �のアミノ酸置換を選択することにより、本� �明のタンパク質の生物学的活性が保持され� �いる変異体を選択することもできる。また� �当業者であれば、本タンパク質の変異体の� �次元構造及びアミノ酸配列を解析すること� �できる。さらに、得られた解析結果から、� �ンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸� �基のアラインメントを予測することもでき� �。タンパク質表面上にあると予測されるア� �ノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用� �関与する可能性があるが、当業者であれば� �上記したような解析結果に基づいて、この� �うなタンパク質表面上にあると予測される� �ミノ酸残基を変化させないような変異体を� �製することができる。さらに、当業者であ� �ば、本発明のタンパク質を構成する各々の� �ミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基の� �を置換するような変異体を作製することも� �きる。このような変異体を公知のアッセイ� �法によりスクリーニングし、個々の変異体� �情報を収集することができる。それにより� �ある特定のアミノ酸残基が置換された変異� �の生物学的活性が、本発明のタンパク質の� �物学的活性に比して低下する場合、そのよ� �な生物学的活性を呈さない場合、又は、本� �ンパク質の生物学的活性を阻害するような� �適切な活性を生じるような場合を比較する� �とにより、本発明のタンパク質を構成する� �々のアミノ酸残基の有用性を評価すること� �できる。また、当業者であれば、このよう� �日常的な実験から収集した情報に基づいて� �単独で、又は他の突然変異と組み合わせて� �本発明のタンパク質の変異体としては望ま� �くないアミノ酸置換を容易に解析すること� �できる。

 上記したように、配列番号2で表されるアミ ノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ� �が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸� �列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning,� �A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Pr ess (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology 』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988)  Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異� ��変異誘発法等の方法に従って調製すること� ��できる。このようなアミノ酸の欠失、置換� ��しくは付加等の変異がなされた変異体の作� ��は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公� �手法により、部位特異的突然変異誘発法を� �用した変異導入用キット、例えばQuikChange ^TM  Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社� �)、GeneTailor ^TM  Site-Directed Mutagenesis System(インビトロジェ� �社製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan- K、Mutan-Super Express Km等:タカラバイオ社製)等 を用いて行うことができる。

 なお、タンパク質のアミノ酸配列に、そ� ��活性を保持しつつ1又は複数個のアミノ酸の 欠失、置換、若しくは付加を導入する方法と しては、上記の部位特異的変異誘発の他にも 、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝 子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチ ドを除去、置換若しくは付加した後に連結す る方法があげられる。

 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好� ��しくは、配列番号2で示されるアミノ酸配列 において1~10個のアミノ酸が欠失、置換若し� �は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ� �GPAT活性を有するタンパク質をコードする塩� ��配列である。

 また、本発明の核酸に含まれる塩基配列� ��は、配列番号2において1~10個のアミノ酸が� �失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列� �らなり、かつ、本発明の上記活性を有する� �ンパク質をコードする塩基配列も含まれる� �

 本発明のタンパク質におけるアミノ酸の� ��異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の� ��位は、GPAT活性、又は本発明のGPATの脂肪酸� �成を形成できる活性が保持される限り制限� �ない。

 本発明のGPAT活性、又は本発明のGPATの脂� �酸組成を形成できる活性は、公知の方法を� �いて測定することが可能である。例えば、� �下の文献:Biochem. J., 355, 315-322, 2001を参照� �ることができる。

 例えば、本発明の「GPAT活性」は以下の通り 測定してもよい。本発明のGPATを発現させた� �母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に記� ��の方法等によりミクロソーム画分を調製す� ��。そして、反応液である、0.44mM グリセロ� �ル-3-リン酸 、0.36mM アシル-CoA、0.5mM DTT、1m g/ml BSA、2mM MgCl ₂ 、50mM Tris-HCl(pH7.5)に上記ミクロソーム画分を 添加し、28℃で適当な時間反応させ、クロロ� ��ルム:メタノールを添加して反応を停止させ た後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄 層クロマトグラフィー等により分画し、生成 したリゾホスファチジン酸量を定量すること ができる。

 また、本発明の「GPATの脂肪酸組成を形成 できる活性」は、例えば以下のように測定し てもよい。本発明の脂肪酸組成物の製造方法 により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な 比率で調整したクロロホルム:メタノールを� �加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理� �する。さらに遠心分離により菌体を分離し� �、溶媒を回収することを数回繰り返す。そ� �後、適当な方法を用いて脂質を乾固させて� �ら、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質� �溶解する。この試料を適当量分取して、塩� �メタノール法により菌体の脂肪酸をメチル� �ステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し� �ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグ� �フィーで分析を行う。

 (b)配列番号4からなる塩基配列に対し相補的 な塩基配列からなる核酸とストリンジェント な条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明 の上記活性を有するタンパク質をコードする 塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号4からなる塩基配列に対し相補的な塩基配 列からなる核酸とストリンジェントな条件下 でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活 性を有するタンパク質をコードする塩基配列 を含む。配列番号4及びGPAT活性については上� ��のとおりである。

 上記塩基配列は、当業者に公知の方法で� ��当な断片を用いてプローブを作製し、この� ��ローブを用いてコロニーハイブリダイゼー� ��ョン、プラークハイブリダイゼーション、� ��ザンブロット等の公知のハイブリダイゼー� ��ョン法により、cDNAライブラリー及びゲノム ライブラリー等から得ることができる。

 ハイブリダイゼーション法の詳細な手順� ��ついては、『Molecular Cloning, A Laboratory Manu al 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001);特にSe ction 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biolog y』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3- 6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical� �Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);ハイブ� ��ダイゼーション条件については特にSection2.1 0) 等を参照することができる。

 ハイブリダイゼーション条件の強さは、� ��としてハイブリダイゼーション条件、より� ��ましくは、ハイブリダイゼーション条件及� ��洗浄条件によって決定される。本明細書に� ��ける「ストリンジェントな条件」には、中� ��度又は高度にストリンジェントな条件が含� ��れる。

 具体的には、中程度にストリンジェント� ��条件としては、例えばハイブリダイゼーシ� ��ン条件として、1×SSC~6×SSC、42℃~55℃の条件� ��より好ましくは、1×SSC~3×SSC、45℃~50℃の条� ��、最も好ましくは、2×SSC、50℃の条件があ� �られる。ハイブリダイゼーション溶液中に� �例えば、約50%のホルムアミドを含む場合に� �、上記温度よりも5ないし15℃低い温度を採� �する。洗浄条件としては、0.5×SSC~6×SSC、40℃ ~60℃があげられる。ハイブリダイゼーション 及び洗浄時には、一般に、0.05%~0.2%、好まし� �は約0.1%SDSを加えてもよい。

 高度にストリンジェント(ハイストリンジ ェント)な条件としては、中程度にストリン� �ェントな条件よりも高い温度及び/又は低い� ��濃度でのハイブリダイゼーション及び/又は 洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーショ ン条件として、0.1×SSC~2×SSC、55℃~65℃の条件� ��より好ましくは、0.1×SSC~1×SSC、60℃~65℃の� �件、最も好ましくは、0.2×SSC、63℃の条件が� ��げられる。洗浄条件として、0.2×SSC~2×SSC、5 0℃~68℃、より好ましくは、0.2×SSC、60~65℃が� ��げられる。

 特に本発明に用いられるハイブリダイゼ� ��ション条件としては、例えば、5×SSC、1%SDS� �50mM Tris-HCl(pH7.5)及び50%ホルムアミド中42℃の 条件でプレハイブリダイゼーションを行った 後、プローブを添加して一晩42℃に保ってハ� ��ブリッド形成させ、その後、0.2×SSC、0.1%SDS� ��、65℃で20分間の洗浄を3回行うという条件� �あげられるが、これらに限定されない。

 また、プローブに放射性物質を使用しな� ��市販のハイブリダイゼーションキットを使� ��することもできる。具体的には、DIG核酸検� ��キット(ロシュ・ダイアグノス社)、ECL direct  labeling & detection system(Amersham社製)を使� �したハイブリダイゼーション等があげられ� �。

 本発明に含まれる塩基配列としては、好� ��しくは、配列番号4からなる塩基配列に対し 相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃� ��条件下でハイブリダイズし、かつ、GPAT活性 を有するタンパク質をコードする塩基配列が あげられる。

 (c)配列番号4からなる塩基配列と同一性が70% 以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上 記活性を有するタンパク質をコードする塩基 配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号4に示される核酸配列に対して少なくとも 70%以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の 上記活性を有するタンパク質をコードする塩 基配列を含む。

 好ましくは、配列番号4に示される核酸配 列に対して少なくとも75%、さらに好ましくは 80%(例えば、85%以上、より一層好ましくは90%� �上、さらには95%、98%又は99%)の同一性を有す� ��塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発� ��の上記活性を有するタンパク質をコードす� ��塩基配列があげられる。

 2つの核酸配列の同一性%は、視覚的検査� �数学的計算により決定することができるが� �コンピュータープログラムを使用して2つの� ��酸の配列情報を比較することにより決定す� ��のが好ましい。配列比較コンピュータープ� ��グラムとしては、例えば、米国国立医学ラ� ��ブラリーのウェブサイト:http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプロ� �ラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 40 3-10):バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリ� �ム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準 的なデフォルトパラメーターの設定は、以下 のインターネットサイト:http://blast.wustl.eduに� ��載されているものを用いることができる。

 (d)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性 が70%以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、 本発明の上記活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上 のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の 上記活性を有するタンパク質をコードする塩 基配列を含む。本発明の核酸がコードするタ ンパク質は、本発明の上記活性を有するタン パク質と同等の機能を有する限り、GPAT2のア� ��ノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよ� ��。

 具体的には、配列番号2で示されるアミノ 酸配列と75%以上、好ましくは80%以上、より好 ましくは85%、さらに好ましくは90%(例えば、95 %、さらには、98%)以上の同一性を有するアミ� ��酸配列等があげられる。

 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好� ��しくは、配列番号2からなるアミノ酸配列と 同一性が90%以上のアミノ酸配列をコードし、 かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質 をコードする塩基配列である。さらに好まし くは、配列番号2からなるアミノ酸配列と同� �性が95%以上のアミノ酸配列をコードし、か� �、本発明の上記活性を有するタンパク質を� �ードする塩基配列である。

 2つのアミノ酸配列の同一性パーセントは 、視覚的検査及び数学的計算によって決定す ることができる。また、コンピュータープロ グラムを用いて同一性パーセントを決定する こともできる。そのようなコンピュータープ ログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA(Altschu lら、 J. Mol. Biol., 215:403-410(1990))、及びClusta lW等があげられる。特に、BLASTプログラムに� �る同一性検索の各種条件(パラメーター)は、 Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)� �記載されたもので、米国バイオテクノロジ� �情報センター(NCBI)やDNA Data Bank of Japan(DDBJ) のウェブサイトから公的に入手することがで きる(BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Beth esda, MD 20894;Altschulら)。また、遺伝情報処理� ��フトウエアGENETYX Ver.7(ゼネティックス)、DIN ASIS Pro(日立ソフト)、Vector NTI(Infomax)等のプ� �グラムを用いて決定することもできる。

 複数のアミノ酸配列を並列させる特定の� ��ラインメントスキームは、配列のうち、特� ��の短い領域のマッチングをも示すことがで� ��るため、用いた配列の全長配列間に有意な� ��係がない場合であっても、そのような領域� ��おいて、特定の配列同一性が非常に高い領� ��を検出することもできる。さらに、BLASTア� �ゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマト リックスを用いることができるが、選択パラ メーターとしては、以下のものを用いること ができる:(A)低い組成複雑性を有するクエリ� �配列のセグメント(Wootton及びFederhenのSEGプロ� ��ラム(Computers and Chemistry, 1993)により決定さ れる;Wootton及びFederhen, 1996「配列データベー� ��における組成編重領域の解析(Analysis of comp ositionally biased regions in sequence databases)」Met hods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい)、又は 、短周期性の内部リピートからなるセグメン ト(Claverie及びStates(Computers and Chemistry, 1993)� �XNUプログラムにより決定される)をマスクす� ��ためのフィルターを含むこと、及び(B)デー� ��ベース配列に対する適合を報告するための� ��計学的有意性の閾値、又はE-スコア(Karlin及� ��Altschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって 、単に偶然により見出される適合の期待確率 ;ある適合に起因する統計学的有意差がE-スコ ア閾値より大きい場合、この適合は報告され ない。

 (e)配列番号2で示されるアミノ酸配列からな るタンパク質をコードする塩基配列に対し相 補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本 発明の上記活性を有するタンパク質をコード する塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパ ク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩 基配列からなる核酸とストリンジェントな条 件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上 記活性を有するタンパク質をコードする塩基 配列を含む。

 配列番号2で示されるアミノ酸配列からな るタンパク質及びハイブリダイズの条件は上 記のとおりである。本発明の核酸に含まれる 塩基配列としては、配列番号2で示されるア� �ノ酸配列からなるタンパク質をコードする� �基配列に対し相補的な塩基配列からなる核� �とストリンジェントな条件下でハイブリダ� �ズし、かつ、本発明の上記活性を有するタ� �パク質をコードする塩基配列があげられる� �

 また、本発明の核酸には、配列番号4からな る塩基配列において1若しくは複数個の塩基� �欠失、置換若しくは付加された塩基配列か� �なり、かつ、本発明の上記活性を有するタ� �パク質をコードする塩基配列を含む核酸も� �まれる。具体的には、
(i) 配列番号4に示す塩基配列のうち1個又は� �数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1~540個 、1~500個、1~400個、1~300個、1~200個、1~150個、1~ 100個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1 ~10個、さらに好ましくは1~5個))の塩基が欠失� ��た塩基配列、
(ii) 配列番号4に示す塩基配列のうち1個又は� ��数個(好ましくは1個又は数個(例えば1~540個� �1~500個、1~400個、1~300個、1~200個、1~150個、1~10 0個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~1 0個、さらに好ましくは1~5個))の塩基が他の塩 基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号4に示す塩基配列において1個又 は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば1~540� ��、1~500個、1~400個、1~300個、1~200個、1~150個、 1~100個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個� �1~10個、さらに好ましくは1~5個))の他の塩基� �付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)~(iii)を組み合わせた塩基配列であ って、かつ、本発明の上記活性を有するタン パク質をコードしている塩基配列を含む核酸 を用いることもできる。

 本発明の核酸の好ましい態様としては、以� ��の(a)~(c)のいずれかに記載の塩基配列のフラ グメントを含む核酸も含まれる。
(a)配列番号4で示される塩基配列
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からな� �タンパク質をコードする塩基配列
(c)配列番号1で示される塩基配列
 (a)配列番号4で示される塩基配列、(b)配列番 号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパ� �質をコードする塩基配列、(c)配列番号1で示� ��れる塩基配列については、表1に記載したと おりである。上記配列のフラグメントとは、 上記塩基配列に含まれるORF、CDS、生物学的活 性を有する領域、以下に記載するようなプラ イマーとして用いた領域、プローブとなりう る領域が含まれ、天然由来のものであっても 、人工的に作製したものであってもよい。

  本発明のグリセロール-3-リン酸ア シル基転移酵素タンパク質
 本発明のタンパク質は、配列番号2で示され るアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記 タンパク質と同等の機能を有するタンパク質 を含み、天然由来のものであっても、人工的 に作製したものであってもよい。配列番号2� �示されるアミノ酸配列からなるタンパク質� �ついては、上記のとおりである。「同等の� �能を有するタンパク質」とは、上記『本発� �のグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素� �コードする核酸』の項で説明したとおり、� �本発明の上記活性」を有するタンパク質を� �味する。

 本発明において、配列番号2で示されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質としては、以下の(a)又は(b) のいずれかに記載のタンパク質があげられる 。
(a)配列番号2において1若しくは複数個のアミ� ��酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ� ��配列からなり、かつ、本発明の上記活性を� ��するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性� �70%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質� �あり、かつ、本発明の上記活性を有するタ� �パク質
 上記のうち、配列番号2において1若しくは� �数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加� �れたアミノ酸配列、又は、配列番号2からな� ��アミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸� ��列については、上記、『本発明のグリセロ� ��ル-3-リン酸アシル基転移酵素をコードする� ��酸』の項で説明したとおりである。また、� ��記「本発明の上記活性を有するタンパク質� ��は、配列番号4の塩基配列を含む核酸によっ てコードされるタンパク質の変異体、又は、 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1� ��又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しく� ��付加等の多くの種類の修飾により変異した� ��ンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾� ��れている修飾タンパク質、他のタンパク質� ��の融合タンパク質であって、かつ、GPAT活性 を有するタンパク質であるか、及び/又は、� �発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性を� ��するタンパク質も含まれる。

 また、本発明のタンパク質は、人工的に� ��製したものであってもよく、その場合は、F moc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル� �)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の� �学合成法によっても製造することができる� �また、アドバンスドケムテック社製、パー� �ンエルマー社製、ファルマシア社製、プロ� �インテクノロジーインストゥルメント社製� �シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社� �、島津製作所社製等のペプチド合成機を利� �して化学合成することもできる。

  GPATの核酸のクローニング
 本発明のGPATの核酸は、例えば、適切なプロ ーブを用いてcDNAライブラリーからスクリー� �ングすることにより、クローニングするこ� �ができる。また、適切なプライマーを用い� �PCR反応により増幅し、適切なベクターに連� �することによりクローニングすることがで� �る。さらに、別のベクターにサブクローニ� �グすることもできる。

 例えば、pBlue-Script  ^TM  SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco- BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogen)等の� ��販のプラスミドベクターを用いることがで� ��る。また、PCR反応で増幅する場合、プライ� ��ーは、上記の配列番号1等に示される塩基配 列のいずれの部分も用いることができるが、 例えば、配列番号1に対しては、
上流側用プライマーとしてE-1: 5'-CTGACTACCAAAACC AGCTGGACTTC-3'(配列番号6)を、
下流側プライマーとして、E-2: 5'-GGCAATTTCATCCAA GTTGTCCTCC-3'(配列番号7)等を
用いることができる。そして、M. alpina 菌体 から調製したcDNAに、上記プライマー及び塩� �配列ポリメラーゼ等を作用させてPCR反応を� �う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laborato ry Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)) 等に従い、当業者であれば容易に行うことが できるが、本発明のPCR反応の条件としては、 例えば以下の条件があげられる。
変性温度:90~95℃
アニーリング温度:40~60℃
伸長温度:60~75℃
サイクル数:10回以上
 得られたPCR産物の精製には公知の方法を用� ��ることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ )、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE ヘルスケアバイオサイエンス)等のキットを� �いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法 、透析チューブを用いる方法等がある。アガ ロースゲルを用いる場合には、アガロースゲ ル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロー スゲルより切り出して、GENECLEAN(フナコシ)、Q IAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ&� �クイーズ法等により精製することができる� �

 クローニングした核酸の塩基配列は、塩� ��配列シーケンサーを用いて塩基配列を決定� ��ることができる。

  GPAT発現用ベクター構築及び形質� �換体の作製
 本発明はまた、本発明のGPAT2をコードする� �酸を含有する組換えベクターを提供する。� �発明は、さらに、上記組換えベクターによ� �て形質転換された形質転換体も提供する。

 このような組換えベクター及び形質転換� ��は以下のようにして得ることができる。す� ��わち、本発明のGPATをコードする核酸を有す るプラスミドを制限酵素を用いて消化する。 用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI 、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限 定されない。なお、末端をT4ポリメラーゼ処� ��することにより平滑化してもよい。消化後� ��塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動に� ��り精製する。この塩基配列断片を、発現用� ��クターに公知の方法を用いて組み込むこと� ��より、GPAT発現用ベクターを得ることができ る。この発現ベクターを宿主に導入して形質 転換体を作製し、目的とするタンパク質の発 現に供する。

 このとき、発現ベクター及び宿主は、目� ��とするタンパク質を発現できるものであれ� ��特に限定されず、例えば、宿主として、真� ��や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞� ��があげられる。真菌として、脂質生産菌で� ��るM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セ レビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があ げられる。また細菌として、大腸菌(Escherichia  coli)やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等があげられる。さらに植物としては、ナタ ネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧 植物があげられる。

 脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol .XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を 使用することができ、具体的には、モルティ エレラ(Mortierella)属に属する微生物、例えば� �モルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elonga ta)IFO8570、モルティエレラ・エキシグア(Mortier ella exigua)IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフ� ��ラ(Mortierella hygrophila)IFO5941、モルティエレ� �・アルピナ(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、A TCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53� �CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70� �CBS754.68等のモルティエレラ亜属(subgenus Mortie rella)に属する微生物、又はモルティエレラ・ イザベリナ(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336� ��IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884� ��モルティエレラ・ナナ(Mortierella nana)IFO8190� �モルティエレラ・ラマニアナ(Mortierella ramann iana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、I FO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィ� ��セア(Mortierella vinacea)CBS236.82等のマイクロム コール亜属(subgenus Micromucor)に属する微生物� �があげられる。とりわけ、モルティエレラ� �アルピナ(Mortierella alpina)が好ましい。

 真菌類を宿主として用いる場合は、本発� ��の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、� ��しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構� ��であることが好ましい。それと同時に、プ� ��モーター、ターミネーターを含む構成であ� ��ことが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用 する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4 、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモータ� �としては、宿主中で発現できるものであれ� �いかなるプロモーターを用いてもよく、例� �ば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH(グリ� ��ルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ)遺� ��子プロモーター、TEF(Translation elongation facto r)遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来 するプロモーターが用いられる。

 M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの 導入方法としては、例えば、エレクトロポレ ーション法、スフェロプラスト法、パーティ クルデリバリー法、及び核内へのDNAの直接マ イクロインジェクション等があげられる。栄 養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄 養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択 することで、形質転換株を取得することがで きる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺 伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択 培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コ ロニーを得ることができる。

 酵母を宿主として用いる場合は、発現ベ� ��ターとして、例えば、pYE22m等があげられる� ��また、pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販� �酵母発現用ベクターを、用いてもよい。ま� �本発明に適する宿主としては、Saccharomyces ce revisiae EH13-15株(trp1, MATα)等があげられるが� �れらに限定されない。プロモーターとして� �、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモー� �ー、gal10プロモーター等の酵母等に由来する プロモーターが用いられる。

 酵母への組換えベクターの導入方法とし� ��は、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロ� ��レーション法、スフェロプラスト法、デキ� ��トラン仲介トランスフェクション、リン酸� ��ルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフ� ��クション、プロトプラスト融合、リポソー� ��中のポリヌクレオチド(単数又は複数)の被� �、及び核内へのDNAの直接マイクロインジェ� �ション等があげられる。

 大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合� ��、発現ベクターとしては、例えばファルマ� ��ア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモー� ��ーとしては、例えば、trpプロモーター、lac� �プロモーター、PLプロモーター、PRプロモー� ��ー等の大腸菌やファージ等に由来するプロ� ��ーターが用いられる。細菌への組み換えベ� ��ターの導入方法としては、例えばエレクト� ��ポレーション法や塩化カルシウム法を用い� ��ことができる。

  本発明の脂肪酸組成物の製造方法
 本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組� ��物を製造する方法を提供する。すなわち、� ��記形質転換体を培養して得られる培養物か� ��脂肪酸組成物を製造する方法である。具体� ��には、以下の方法で製造することができる� ��しかし、本製造方法に関しては、当該方法� ��限られず、一般的な公知の他の方法を用い� ��行うこともできる。

 GPATを発現させた生物の培養に用いる培地 は、適当なpH及び浸透圧を有し、各宿主の増� ��に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物� ��等の生物材料を含んでいる培養液(培地)で� �れば、いかなる培養液も用いうる。例えば� �酵母を形質転換してGPATを発現させた場合は� ��SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いること ができるが、これらに限定されない。具体的 な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する:1lあ たり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6. 7g、グルコース20gアミノ酸パウダー(アデニン 硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸 3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロイシ� ��1.8g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニル� ��ラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バ� �ン4.5g、スレオニン6g、ウラシル0.6gを混合し� ��もの)1.3g)。

 培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生� ��した酵素が安定に保たれるのに適当な条件� ��あればいかなる条件でもよいが、具体的に� ��、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培� ��又は振盪培養等の個々の条件を調節するこ� ��ができる。培養方法は、同一条件での培養( 1段階培養)でもよく、2以上の異なる培養条件 を用いる、いわゆる2段階培養若しくは3段階� ��養でもよいが、大量培養をする場合には、� ��養効率がよい2段階培養等が好ましい。

 以下に、本発明の脂肪酸組成物の具体的� ��製造方法として、宿主として酵母を用いて2 段階培養を行った場合を例示して説明する。 すなわち、前培養として、上記で得られたコ ロニーを、例えば上記のSC-Trp培地等に植菌し て、30℃で2日間振盪培養を行う。その後、本 培養として、YPD5(2%酵母エキス、1%ポリペプト ン、5%グルコース)培地10mlに前培養液を500μl� �加し、30℃で2日間振盪培養を行う方法であ� �。

  本発明の脂肪酸組成物
 本発明はまた、本発明のGPAT2が発現してい� �細胞における1又はそれ以上の脂肪酸の集合� ��である脂肪酸組成物を提供する。脂肪酸は� ��遊離脂肪酸でもよいし、トリグリセリド、� ��ン脂質等でもよい。特に、本発明の脂肪酸� ��成物は、その脂肪酸組成において、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸� ��有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ ン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、並 びに
iv) 炭素数16の脂肪酸の含有量に対する、炭� �数18の脂肪酸の含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、本発明の組 換えベクターで形質転換されていない宿主を 培養して得られる培養物の前記比率より高い ことを特徴とする。ここで、「本発明の組換 えベクターで形質転換されていない宿主」と は、例えば、本明細書中の「本発明のグリセ ロール-3-リン酸アシル基転移酵素をコードす る核酸」の項目で記載した核酸が組み込まれ ていないベクター(空ベクター)で形質転換さ� ��た宿主である。

 本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸� ��しては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐� ��のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリス� ��ン酸(テトラデカン酸)(14:0)、ミリストレイ� �酸(テトラデセン酸)(14:1)、パルミチン酸(ヘ� �サデカン酸)(16:0)、パルミトレイン酸(9-ヘキ� ��デセン酸)(16:1)、ステアリン酸(オクタデカ� �酸)(18:0)、オレイン酸(cis-9-オクタデセン酸)(1 8:1(9))、バクセン酸(11-オクタデセン酸)(18:1(11) )、リノール酸(cis, cis-9,12 オクタデカジエン 酸)(18:2(9,12))、α-リノレン酸(9,12,15-オクタデ� �ントリエン酸)(18:3(9,12,15))、γ-リノレン酸(6,9 ,12-オクタデカントリエン酸)(18:3(6,9,12))、ス� �アリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン 酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸(イコサン酸)( 20:0)、(8,11-イコサジエン酸)(20:2(8,11))、ミード 酸(5,8,11-イコサトリエン酸)(20:3(5,8,11))、ジホ� ��γ-リノレン酸(8,11,14-イコサトリエン酸)(20:3( 8,11,14))、アラキドン酸(5,8,11,14-イコサテトラ� ��ン酸)(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸( 5,11,14,17-イコサテトラエン酸)(20:4(5,11,14,17)、� ��イコサペンタエン酸(5,8,11,14,17-イコサペン� �エン酸)(20:5(5,8,11,14,17))、ベヘン酸(ドコサン� ��)(22:0)、(7,10,13,16-ドコサテトラエン酸)(22:4(7, 10,13,16))、(4,7, 13,16,19-ドコサペンタエン酸)(22 :5(4,7, 13,16,19))、(4,7,10,13,16-ドコサペンタエン 酸)(22:5(4,7,10,13,16))、(4,7,10, 13,16,19-ドコサヘ� �サエン酸)(22:6(4,7,10, 13,16,19))、リノグリセリ ン酸(テトラドコサン酸)(24:0)、ネルボン酸(cis -15-テトラドコサン酸)(24:1)、セロチン酸(ヘキ サドコサン酸)(26:0)、等があげられるが、こ� �らに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC 生化学命名法で定義された慣用名であり、組 織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数 値を、カッコ内に記載した。

 本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸� ��うち、1またそれ以上の脂肪酸の組み合わせ であれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪 酸からなる組成物でもよい。

 このような本発明の脂肪酸組成物が得ら� ��たこと、つまり、本発明のGPAT2が発現した� �との確認は、公知の一般的な方法を用いて� �うことができる。例えば、酵母でGPATを発現� ��せた場合は、脂肪酸組成の変化として確認� ��ることができる。すなわち、上記本発明の� ��肪酸組成物の製造方法により得られた凍結� ��燥した菌体に、適当な比率で調整したクロ� ��ホルム:メタノールを添加して攪拌した後、 適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分 離により菌体を分離して、溶媒を回収するこ とを数回繰り返す。その後、適当な方法を用 いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等 の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料 を適当量分取して、塩酸メタノール法により 菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後 に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去して から、ガスクロマトグラフィーで分析を行う 。

 その結果、上記の脂肪酸組成を有する脂� ��酸組成物が得られた場合は、本発明の脂肪� ��組成物が得られたと判断することができる� ��なお、本発明のGPATは、公知のGPAT脂肪酸組� �物の脂肪酸組成とは脂肪酸組成が異なるこ� �から、本発明のGPATは公知のGPATと基質特異性 が異なることが示される。

  本発明の脂肪酸組成物を含む食品 等
 また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む� ��品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、� ��法に従って、例えば、油脂を含む食品、工� ��原料(化粧料、医薬(例えば、皮膚外用薬)、� ��鹸等の原料)の製造等の用途に使用すること ができる。化粧料(組成物)又は医薬(組成物)� �剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル� �、固体状、粉末状等任意の剤型をあげるこ� �ができるが、これらに限定されない。また� �食品の形態としては、カプセル等の医薬製� �の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微� �元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発� �の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、� �消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク� �、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。

 さらに、本発明の食品の例としては、栄� ��補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用� ��品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人� ��食品等があげられるが、これらに限定され� ��い。本明細書においては、食品とは、固体� ��流動体、及び液体、並びにそれらの混合物� ��あって、摂食可能なものの総称をいう。

 栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強� ��されている食品をいう。健康食品とは、健� ��的な又は健康によいとされる食品をいい、� ��養補助食品、自然食品、ダイエット食品等� ��含まれる。機能性食品とは、体の調節機能� ��果たす栄養成分を補給するための食品をい� ��、特定保健用食品と同義である。幼児用食� ��とは、約6歳までの子供に与えるための食品 をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比 較して消化及び吸収が容易であるように処理 された食品をいう。乳児用調製乳とは、約1� �までの子供に与えるための調製乳をいう。� �熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月に� ��るまで与えるための調製乳をいう。

 これらの食品としては、肉、魚、ナッツ� ��の天然食品(油脂で処理したもの);中華料理� ��ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加え� ��食品;天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン 、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油 脂を用いた食品;バター、マーガリン、マヨ� �ーズ、ドレッシング、チョコレート、即席� �ーメン、キャラメル、ビスケット、クッキ� �、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又� �加工時に油脂を加えた加工食品;おかき、ハ� ��ドビスケット、あんパン等の加工仕上げ時� ��油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげるこ� ��ができる。しかしながら、本発明の食品は� ��油脂を含む食品に限定されるわけではなく� ��例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類(キャ ンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓 子)、豆腐及びその加工品等の農産食品;清酒� ��薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発� ��食品;ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセ ージ等の畜産食品;かまぼこ、揚げ天、はん� �ん等の水産食品;果汁飲料、清涼飲料、スポ� ��ツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられ� ��。

  本発明のGPATをコードする核酸又� �GPATタンパク質を用いた菌株の評価・選択方� ��
 本発明はまた、本発明のGPATをコードする核 酸又はGPATタンパク質を用いて、脂質生産菌� �評価や選択を行う方法を提供する。具体的� �は以下のとおりである。

 (1)評価方法
 本発明の一態様として、本発明のGPATをコー ドする核酸又はGPATタンパク質を用いて、脂� �生産菌の評価を行う方法があげられる。本� �明の上記評価方法としては、まず、本発明� �塩基配列に基づいて設計したプライマー又� �プローブを用いて、被検菌株である脂質産� �菌株の本発明の上記活性について評価する� �法があげられる。このような評価方法の一� �的手法は公知であり、例えば、国際特許出� �パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公� ��などに記載されている。以下、この評価方� ��について簡単に説明する。

 まず、被検菌株のゲノムを調製する。調� ��方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、� �かなる公知の方法をも用いることができる(� ��えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harb or Laboratory Press, p130 (1990)参照)。

 本発明の塩基配列、好ましくは、配列番� ��4に基づいてプライマー又はプローブを設計 する。上記プライマー又はプローブは本発明 の塩基配列のいずれの部分をも用いることが でき、またその設計は公知の手法を用いて行 うことができる。プライマーとして用いるポ リヌクレオチドの塩基数は、通常、10塩基以� ��であり、15~25塩基であることが好ましい。� �た、挟み込む部分の塩基数は、通常、300~2000 塩基が適当である。

 上記で作製したプライマー又はプローブ� ��用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明� ��塩基配列と特異的な配列が存在するか否か� ��調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列� ��検出は、公知の手法を用いて行うことがで� ��る。例えば、本発明の塩基配列に特異的配� ��の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又� ��上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を� ��むポリヌクレオチドを一つのプライマーと� ��て用い、もう一方のプライマーとしてこの� ��列よりも上流あるいは下流の配列の一部又� ��全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩� ��配列に対して相補的な塩基配列を含むポリ� ��クレオチドを用いて、例えば、PCR法等によ� ��て被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無� ��増幅物の分子量の大きさなどを測定するこ� ��ができる。

 本発明の方法に適するPCR法の反応条件は、� ��に限定されないが、例えば、以下の条件が� ��げられる。
変性温度:90~95℃
アニーリング温度:40~60℃
伸長温度:60~75℃、
サイクル数:10回以上
などの条件である。得られた反応生成物はア ガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によ り分離して、増幅産物の分子量を測定するこ とができる。これにより、増幅産物の分子量 が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当す る核酸分子を含む大きさか否かを確認するこ とにより、被検菌株の本発明の上記活性を予 測又は評価することができる。また、上記増 幅産物の塩基配列を上記方法等で解析するこ とによって、さらに本発明の上記活性をより 正確に予測又は評価することができる。なお 、本発明の上記活性の評価方法は、上記のと おりである。

 また、本発明の上記評価方法としては、� ��検菌株を培養し、配列番号4等の本発明の塩 基配列がコードするGPATの発現量を測定する� �とによって、被検菌株の本発明の上記活性� �評価することもできる。なお、GPATの発現量� ��、被検菌株を適当な条件で培養し、GPATのmRN A又はタンパク質を定量することにより測定� �きる。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の� ��法を用いて行うことができる。mRNAの定量は 、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション や定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は 、例えば、ウエスタンブロッティングによっ て行うことができる(Current Protocols in Molecula r Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。また� �上記活性の評価方法として、本発明のGPATが� ��生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法� ��あげることもできる。脂肪酸組成物の組成� ��測定方法は上記のとおりである。

 (2)選択方法
 本発明の他の態様として、本発明のGPATをコ ードする核酸又はGPATタンパク質を用いて、� �質生産菌の選択を行う方法があげられる。� �発明の上記選択方法としては、被検菌株を� �養し、配列番号4等の本発明の塩基配列がコ� ��ドするGPATの発現量を測定して、目的とする 発現量の菌株を選択することにより、所望の 活性を有する菌株を選択することができる。 また、基準となる菌株を設定し、この基準菌 株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発 現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量 を比較して、所望の菌株を選択することもで きる。具体的には、例えば、基準菌株及び被 検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現 量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が 高発現、又は低発現である被検菌株を選択す ることにより、所望の活性を有する菌株を選 択することができる。所望の活性には、上記 のように、GPATの発現量及びGPATが産生する脂� ��酸組成物の組成を測定する方法があげられ� ��。

 また、本発明の上記選択方法としては、� ��検菌株を培養して、本発明の上記活性が高� ��か若しくは低い菌株を選択することにより� ��所望の活性を有する被検菌株を選択するこ� ��もできる。所望の活性には、上記のように� ��GPATの発現量及びGPATが産生する脂肪酸組成� �の組成を測定する方法があげられる。

 被検菌株又は基準菌株としては、例えば� ��上記の本発明のベクターを導入した菌株、� ��記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、� ��然変異処理が施された菌株、自然変異した� ��株などを用いることができるがこれらに限� ��されない。なお、本発明のGPAT活性及びGPAT� �脂肪酸組成物を形成できる活性は、例えば� �明細書中の「本発明のグリセロール-3-リン� �アシル基転移酵素をコードする核酸」、「� �発明の脂肪酸組成物」の項目で記載した方� �によって測定することが可能である。突然� �異処理としては、例えば、紫外線照射や放� �線照射などの物理的方法、EMS(エチルメタン� ��ルホネート)、N-メチル-N-ニトロソグアニジ� ��などの薬剤処理による化学的方法などがあ� ��られる(例えば、大嶋泰治編著、生物化学実 験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会� ��版センターなど参照)が、これらに限定され ない。

 なお、本発明の基準菌株、被検菌株とし� ��用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又� ��酵母等があげられるが、これらに限定され� ��い。具体的には、基準菌株、被検菌株は、� ��なる属や種や属するいかなる菌株を組み合� ��せて用いてもよく、被検菌株は1又はそれ以 上の菌株を同時に用いてもよい。

 以下、実施例により本発明をさらに具体� ��に説明する。但し、本発明は実施例に限定� ��れるものではない。