L'invention a pour o jet des glycopeptides, leur obtention, ainsi que leurs applications biologiques.

Elle vise plus particulièrement des glycopeptides présentant notamment des propriétés antibactériennes.

On sait que des peptides antibactériens ont été isolés à partir d'insectes. Certaines espèces d'insectes présentent en effet une résistance efficace contre des bactéries. Des travaux récents ont établi que cette défense est basée, pour une large part, sur la synthèse rapide (2 à 6 h) de plusieurs familles de peptides ou de polypeptides. Cette synthèse peut être induite, notamment, par une blessure septique ou, d'une manière générale, un traumatisme, ou par immunisation, c'est-à-dire par injection d'une faible dose de bactéries.

Parmi les peptides ou polypeptides produits, on peut distinguer les quatre groupes suivants : i) les cécropines qui sont des peptides cationiques de 4 Da formant deux hélices α amphipathiques ; (ii) des peptides cationiques riches en proline, de petite taille (2 à 4 kDa), partiellement caractérisés, comme les apidaecines et les abaecines ; (iii) plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaire (P ) de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines et les coléoptéricines, et (iv) les défensines, peptides non glycosylés, modérément cationiques avec un pi de 8,0 à 8,5, comprenant de 38 à 43 acides aminés et contenant un motif caractéristique de 6 résidus cystéine engagés dans 3 ponts disulfure intramoléculaires.

Les peptides antibactériens évoqués ci-dessus ont pu être induits chez des lépidoptères, des diptères, des hyménoptères et des coléoptères. Des travaux réalisés

jusqu'à présent sur d'autres espèces n'ont pas permis en revanche de détecter leur présence.

On remarquera qu'à ce jour la structure chimique attribuée à ces peptides correspondait à un simple enchaînement d'acides aminés.

Sur la base de cet enseignement, l'homme de l'art, cherchant à élaborer par voie de synthèse des peptides présentant de telles propriétés, n'était donc amené qu'à construire une séquence peptidique par enchaînement d'acides aminés déterminés selon les techniques classiques.

Or, dans le cadre de leurs travaux sur l'étude des bases moléculaires de la réponse immunitaire des insectes, les inventeurs ont constaté que l'activité antibactérienne de certains peptides inductibles chez des espèces particulières d'insectes était liée à la présence de groupes de substitution déterminés sur des acides aminés.

L'élimination de ces groupes conduit à une très forte réduction de l'activité antibactérienne, voire à sa disparition complète. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux peptides substitués ayant un haut niveau d'activité vis-à- vis d'un grand nombre de bactéries.

Elle a de plus pour but de fournir des procédés d'obtention de tels peptides permettant de les obtenir en grande quantité.

L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés biologiques conférées par les groupes de substitutions pour l'élaboration d'agents antibactériens utilisables en thérapeutique humaine et vétérinaire et, d'une manière générale, pour la lutte contre les bactéries. Les peptides selon 1'invention sont caractérisés en ce qu'ils possèdent des propriétés antibactériennes conférées par une séquence en acides aminés renfermant au moins un acide aminé - O - substitué par un groupe glycosyle contenant un ou plusieurs motifs ose et/ou osamine, un poly-ose et/ou-osamine.

L'acide aminé substitué est un acide aminé hydroxylé, tel que la thréonine, la serine ou la tyrosine. La thréonine est particulièrement préférée.

Le groupe de substitution du ou des acides aminés sera désigné dans la description qui suit et les revendications par le terme "glycosyle", les peptides de l'invention étant également appelés glycopeptides.

Le groupe glycosyle est linéaire ou cyclique, substitué ou non, sous forme α ou β. Il comporte avantageusement des motifs ose et/ou osamine de 5 ou 6 atomes de carbone.

Comme groupes ose appropriés, on citera les pentoses, tels que le ribose, le lyxose, le xylose, l'arabinose, et les hexoses, tels que le galactose et le glucose, le fucose, le tallose, l'altrose, le gulose, le mannose et l'allose.

Des groupes osamine sont avantageusement constitués par un radical galactosamine, glucosamine, tallosamine, altrosamine, gulosamine, mannosamine, ou allosamine. Les poly-oses et/ou -osamines comprennent un enchaînement des motifs oses et/ou osamines, notamment de 2 à 10 motifs, en particulier de 2 à 7 motifs.

Selon une variante de l'invention, le groupe glycosyle est substitué. Les substituants des motifs ose et/ou osamine sont alors avantageusement choisis parmi des radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ou, en particulier dans le cas des osamines, parmi les radicaux acyle, plus spécialement acétyle, ces radicaux substituant plus spécialement la fonction aminé.

Ces substituants peuvent également correspondre à au moins un motif ose et/ou au moins un motif osamine. Le groupe glycosyle peut ainsi comprendre un motif osamine portant un ou plusieurs groupes alkyle et/ou acyle et également être substitué par un ou plusieurs motifs ose, notamment 2 ou 3.

Comme exemple de groupe glycosyle substitué, on citera un motif glucosamine ou galactosamine substitué par un ou

plusieurs motifs glucose et/ou galactose, en particulier un motif N-acyl-glucosamine ou N-acylgalactosamine, substitué par un ou plusieurs motifs glucose et/ou galactose, notamment 2 ou 3. D'autres glycopeptides de 1'invention comportent des substitutions plus complexes, concernant les parties N et/ou C terminales, et/ou des substitutions par des radicaux de l'acide sialique.

Comme le montrent les travaux des inventeurs rapportés dans les exemples, les groupes glycosyle évoqués, d'une manière surprenante, apparaissent indispensables pour disposer d'un niveau appréciable d'activité anti¬ bactérienne.

Les glycopeptides selon 1'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils sont du type des glycopeptides tels qu'obtenus chez les arthropodes, et en particulier chez les larves ou les adultes d'insectes, par un procédé comprenant

- l'induction de leur synthèse notamment par injection aux insectes de bactéries en doses suffisantes, ou par blessure septique ou autre traumatisme,

- 1'extraction de manière à recueillir les peptides ayant subi une glycosylation post-traductionnelle et, le cas échéant, - le fractionnement de l'extrait isolé afin de séparer sélectivement les glycopeptides selon le niveau de leur activité antibactérienne.

Selon une variante, l'extraction est réalisée sur l'animal entier préalablement congelé, puis broyé. Selon une autre variante, l'extraction est réalisée sur l'hémolymphe des animaux, et ce de manière classique, afin de séparer les peptides basiques.

L'invention vise les extraits correspondants, les mélanges de glycopeptides et les fractions. Les glycopeptides de l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils présentent une activité antibactérienne contre les germes à Gram négatif et à Gram positif.

Un groupe de glycopeptides tels que définis ci-dessus, est encore caractérisé en ce que leur séquence peptidique responsable de leur activité antibactérienne est contenue dans un domaine comportant au moins 30 % environ de groupes proline.

Cet enchaînement comporte plus spécialement un motif consensus de 0-glycosylation proline-thréonine/sérine Xaal-Xaa2-proline dans lequel les motifs Xaal et Xaa2, identiques ou différents, sont des acides aminés variables. L'enchaînement d'acides aminés de la séquence biologiquement active, c'est-à-dire présentant une activité antibactérienne, comporte, avantageusement, au moins un acide aminé hydrophobe tel que la thréonine, substitué par un groupe glycosyle. Le groupe de substitution glycosyle est plus particulièrement constitué par un motif N-acylhexosamine, plus spécialement N-acétylgalactosamine ou N- acétylglucosamine, le cas échéant lui-même substitué par un ou plusieurs oses, notamment des pentoses et/ou des hexoses, comme le fucose et/ou le galactose et/ou le glucose.

Des glycopeptides préférés sont tels qu'inductibles chez les brachycères.

Un groupe de ces glycopeptides avantageux au regard de ses propriétés antibactériennes est tel qu'inductible chez la drosophile.

L'enchaînement des acides aminés des glycopeptides de ce groupe est notamment compris ou constitué par la séquence (I) suivante telle que déterminée selon la dégradation d'Edman : cette séquence, et les séquences suivantes figurent dans la partie "Liste des séquences" donnée en fin de description avec les identifications SEQ ID n° 1 et suivantes. Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu 5 10

Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr

Pro Gly Lys Pro Arg Pro

25 Pro Thr Ser His Pro Arg

35 Arg Arg Glu Ala Leu Ala

45 Leu Ala Gin Ala Ala Ile

55

Ile Leu Pro Ala 64

Plus particulièrement, ledit enchaînement est compris ou constitué par la séquence (II) suivante (SEQ ID N° 2) en acides aminés.

Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro 5 10

Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val

15 19

Cette séquence correspond à l'enchaînement allant des positions 22 à 40 dans la séquence (I). Dans ces glycopeptides préférés correspondant à ces séquences, les motifs thréonine ou serine sont substitués, par un groupe glycosyle. On citera en particulier les glycopeptides dans lesquels le motif thréonine est substitué par un groupe N-acylhexosamine, tel que N- acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine, ce groupe comportant lui-même un ou plusieurs oses comme le fucose, le glucose ou le galactose.

D'autres glycopeptides préférés de l'invention, sont du type de ceux inductibles chez les diptères et, parmi ceux-ci, notamment chez Phormia terranovae.

De tels glycopeptides comprennent avantageusement ou sont constitués par un enchaînement d'acides aminés, tel que déterminé selon la dégradation d'Edman, répondant à la séquence (III) suivante (SEQ ID N° 3) : Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10

Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val

15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly

25 30

Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys

35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His Ser

45 50

Ile Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin His

55 60

Leu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr

75 80 Asn Glu 82 en particulier à la séquence (IV) suivante (SEQ ID N° 4) :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10

Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly

25 30

Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys

35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser

45 50

Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His

55 60

Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr

75 80 Asn Phe 82 D'autres enchaînements comportent comme partie N- terminale, au moins une partie de la séquence (V) suivante (SEQ ID N ¹ 5) :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser

5 10

Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val

15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly

25 30

Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin Lys

35 40 Val 41 en particulier de la séquence (VI) suivante (SEQ ID N° 6) :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser

5 10

Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly

25 30

Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin Lys

35 40 Val 41 ou de la séquence (VII) suivante (SEQ ID N" 7) :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro Xaa

5 10 Xaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu Val

15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys Xaa

25 30

Xaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala Gin 35 39

D'autres séquences en acides aminés de peptides dotés de propriétés antibactériennes tels qu'inductibles chez Phormia terranovae _f répondent à la séquence VIII suivante (SEQ ID N° 8) : Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10

Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val

15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys

25 r Phe Gly Val Ser Val -Asp Ala His

35 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg

45 Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser

55 Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser 65

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr

75 80

Asn Phe 82 Dans les séquences (III) à (VIII), la thréonine ou la serine en position 10 et/ou celle en position 54 est (sont) substituée(s) par un groupe glycosyle comme défini ci- dessus.

Le groupe glycosyle est avantageusement un motif osamine lui-même substitué par un ou plusieurs motifs ose. Un groupe glycosyle approprié pour disposer de glycopeptides antibactériens correspond à un groupe (N- acylhexosamine)-hexose, en particulier N-acétyl- galactosamine ou N-acétyl glucosamine, ce groupe étant lui- même substitué par un ou plusieurs motifs ose, en particulier fucose et/ou galactose et/ou glucose.

D'autres glycopeptides préférés sont tels qu'inductibles chez les hyménoptères, notamment chez les abeilles. D'autres glycopeptides encore sont du type de ceux inductibles chez les hémiptères, par exemple chez Pyrrhoπoris apterus.

Des glycopeptides particulièrement préférés de ce type comprennent ou sont constitués par un enchaînement d'acides aminés, tel que déterminé selon la dégradation d'Edman, présentant la séquence (IX) suivante (SEQ ID N ^β 9) : Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro

5 10

Thr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg Asn

15 20

Dans cette séquence, le motif thréonine en position 11 est substitué par un groupe glycosyle tel que défini ci- dessus.

L'invention vise également les fragments ou variantes des glycopeptides définis ci-dessus, dès lors que ces fragments ou ces variantes sont reconnus par des anticorps dirigés contre lesdits peptides et/ou possèdent des caractéristiques de charge et/ou d'hydrophobicité ou d'hydrophilie leur conférant une activité antibactérienne contre des germes à Gram négatif, telle qu'observée chez les glycopeptides natifs. Par variantes, on entend des glycopeptides dans lesquels un ou plusieurs acides aminés sont délétés, substitués par un groupe autre qu'un glycosyle, ou remplacés par un autre acide aminé de charge voisine.

Les caractéristiques d ¹ hydrophilie et d'hydrophobicité des acides aminés sont données par Kyte et al dans J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982.

Les anticorps formés contre les glycopeptides et leurs fragments et variantes entrent également dans le champ de l'invention.

Selon un autre aspect, l'invention vise les séquences de nucléotides comportant l'information génétique correspondant aux acides aminés des glycopeptides définis ci-dessus.

Elle vise également les séquences de nucléotides capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec les séquences ci-dessus.

Par conditions stringentes, on entend les conditions définies dans l'ouvrage "Molecular Cloning" de Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. L'invention vise en outre les séquences de nucléotides complémentaires de celles définies plus haut, ainsi que les ARN correspondants.

Les vecteurs d'expression et/ou de clonage comportant au moins un fragment des séquences de nucléotides définies ci-dessus font également partie de l'invention, ainsi que les hôtes transformés par ces vecteurs. A titre d'exemples, des hôtes appropriés pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent des bactéries, telles que E.coli. des levures ou encore des cellules d'arthropodes, de vertébrés ou de plantes.

L'invention concerne également les produits d'expression des vecteurs ci-dessus.

La structure chimique des glycopeptides à activité antibactérienne ayant été caractérisée comme indiqué ci- dessus, l'homme de l'art choisira aisément les techniques les plus appropriées pour leur élaboration. En opérant par voie de synthèse, on a aisément accès aux structures des glycopeptides tels qu'inductibles chez les arthroprodes et à leurs variantes.

On procède avantageusement à la substitution d'un ou de plusieurs des acides aminés de la séquence, avec un groupe glycosyle, puis à l'introduction de groupes de blocage des fonctions à protéger et on forme une chaîne peptidique déterminée, avantageusement à l'aide d'un synthétiseur, le ou les acides aminés substitués étant introduits séquentiellement afin d'occuper la position souhaitée dans la séquence. Les groupes de blocage sont éliminés en fin de synthèse.

En variante, on prépare le peptide avec une protection particulière pour l'acide aminé à substituer par le groupe glycosyle. On procède ensuite à l'élimination du groupe protecteur de cet acide aminé uniquement, puis on introduit le groupe glycosyle protégé. Les groupes protecteurs des autres acides aminés et ceux du glycosyle sont alors éliminés. Selon une variante, ces glycopeptides peuvent être obtenus selon les techniques du génie génétique en introduisant dans un vecteur approprié les séquences de nucléotides capables d'exprimer le squelette peptidique du

glycopeptide recherché, et en réalisant l'expression dans un hôte capable d'assurer une glycosylation post- traductionnelle. En variante, lorsque l'hôte utilisé ne peut assurer cette fonctionnalisation, on a recours aux voies de synthèse chimiques.

Selon encore une autre variante, ces glycopeptides sont obtenus en immunisant des arthropodes renfermant des gènes capables de coder pour le ou les glycopeptide(s) recherché(s), notamment par injection de bactéries, en quantité suffisante pour provoquer leur synthèse, ou par traumatisme, tel qu'une blessure septique. Quelques heures après l'immunisation, ou le traumatisme, les glycopeptides sont extraits puis fractionnés et la ou les fractions correspondant au(x) glycopep ide(s) recherché(s) isolée(s). L'extraction est réalisée dans des conditions permettant d'éviter tout phénomène de dégradation des glycopeptides, tel qu'oxydation ou action de protéases.

Pour la purification des produits, on utilise avec avantage des supports très peu rétensifs et possédant un pouvoir séparateur élevé. Des supports appropriés sont choisis parmi les supports utilisés en phase inverse.

La mise en oeuvre de ces dispositions permet d'isoler des glycopeptides, sous forme pure, à partir d'animaux aussi petits que des adultes de drosophile. On notera de plus que cette technique d'extraction, telle que décrite dans les exemples, permet d'isoler des glycopeptides dont la fragilité est bien connue.

Les propriétés antibactériennes conférées aux peptides de l'invention par le groupe glycosyle ont été mises en évidence dans des tests d*inhibition de croissance de bactéries à Gram négatif et de bactéries à Gram positif. A titre illustratif, des résultats sont donnés dans les exemples. Des cultures bactériennes pathogènes, comme les entérobactéries, effectuées à partir de prélèvements sur des patients ont été mises ensuite en boîte gélosée. Le dépôt de glycopeptides selon 1'invention sur ces bactéries a montré leur grande efficacité bactéricide. Ces propriétés sont mises à profit pour l'élaboration d'agents

antibactériens utilisables en thérapeutique humaine ou animale, ou pour traiter un environnement donné.

L'invention vise donc l'utilisation, pour élaborer des agents et compositions antibactériens, de peptides renfermant au moins un-cacide aminé - 0 - substitué par un groupe contenant un ou plusieurs motifs oses et/ou osamine, un poly-ose et/ou -osamine, possédant une activité antibactérienne conférée par le ou les groupes de substitution glycosyle. Ces compositions sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace des glycopeptides définis ci-dessus, en association avec un véhicule inerte approprié pour l'application envisagée.

Il est avantageux d'incorporer des excipients tels qu'inhibiteurs de protéases, antioxydants et inhibiteurs de multiplication des bactéries.

Les compositions ou agents destinés à la thérapeutique humaine ou vétérinaire se présenteront avantageusement sous forme de solutions injectables, ou sous une forme pour usage externe, telle que pommades, crèmes, poudres, ou solutions.

Ils sont particulièrement indiqués dans le cas de septicémies, ou encore pour le traitement des yeux, des oreilles, des soins buccaux et dentaires et en gynécologie. On a recours avantageusement aux posologies habituelles dans ces domaines.

Les compositions de 1'invention présentent également un grand intérêt en agrochimie comme agents phytosanitaires. Elles sont avantageusement utilisées sous forme de poudres ou de solutions d'épandage.

L'utilisation des compositions et agents antibactériens de . 1'invention dans 1'industrie agro¬ alimentaire permet d'empêcher la contamination par des germes à Gram négatif, pendant la fabrication de produits et leur conservation.

L'invention vise également les génomes de plantes tels que modifiés par la présence de gènes codant pour les glycopeptides antibactériens définis ci-dessus. Ces

cellules végétales et plantes sont choisies parmi celles capables d'assurer la glycosylation des séquences peptidiques de manière à leur conférer une activité antibactérienne. On dispose ainsi de plantes résistant à des agents pathogènes.

A titre illustratif, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.

Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 et 2 qui représentent respectivement la figure 1, la variation de 1'absorbance en fonction du temps d'un peptide élue selon l'invention, et

- la figure 2, des séquences de nucléotides capables de coder pour un peptide de 1'invention. Exemple 1 : Obtention de glycopeptides antibactériens par extraction à partir de la drosophile.

- Méthode d'induction de la synthèse biologique.

Les drosophiles sont anesthésiées au gaz carbonique et immunisées par piqûre au niveau thoracique à proximité de l'insertion alaire à l'aide d'une aiguille plongée avant chaque inoculation dans une suspension bactérienne de icroccocus luteus (Gram positif) et d'Escherichia c-Qli

1106 (Gram négatif). Les insectes sont conservés à 25°C durant 24 heures et tués par congélation dans 1'azote liquide.

Extraction, fractionnement et purification des glycopeptides synthétisés : * extraction Les pattes, les ailes et les têtes d'adultes de drosophiles sont éliminées par tamisage, les thorax et les abdomens sont broyés en présence d'azote liquide durant 30 minutes dans un mortier maintenu au froid. A la poudre ainsi obtenue sont ajoutés 10 volumes d'eau acidifiée [0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA 0,1 %)] contenant de 1'aprotinine (total de 2 mg). Après 30 minutes d'extraction sous agitation, l'extrait est centrifugé à 10.000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant ainsi obtenu est

immédiatement soumis aux différentes étapes de la purification.

*Fractionnement de l'extrait sur cartouches Sep-Pak

C18 Après dépôt de 1'extrait sur un support de phase inverse, tel que commercialisé sous forme de cartouches sous la marque Sep-Pak Ci8 ^B , par Waters Millipore, les molécules à caractère hydrophile sont éliminées par un simple lavage par 5 ml d'eau acidifiée (TFA 0,05 %). L'élution des molécules hydrophobes est réalisée avec des solutions de 10,40 et 80 % d'acetonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05 %).

Les fractions recueillies sont dénommées "Elution 10 %", "Elution 40 %" et "Elution 80 %" et concentrées sous vide. Les fractions sont ensuite reconstituées avec de l'eau Milli Q avant l'analyse en HPLC.

*Purifica ion par HPLC des molécules à activité antibactérienne. a- Première étape de purification La fraction "Elution 10 %" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 Ci8 ^R avec un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 40 % dans 1'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une augmentation de 0,44 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min.

La fraction "Elution 40 %" est analysée sur la même colonne que la fraction "Elution 10 %". L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 2 à 52 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (progression de 0,55 % d'acetonitrile par minute) à un débit de 1 ml/min.

La fraction "Elution 80 %" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore RP 300 Ce. L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 10 à 60 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,55 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min.

La collecte des fractions est réalisée suivant la variation de l'absorption à 225 nm, en tenant compte des épaulements. Chaque fraction ainsi récoltée est attribuable à un pic de densité optique. Toutes les fractions sont évaporées à sec sous vide et reconstituées dans de l'eau Milli Q. L'activité antibactérienne de chaque fraction est détectée par la technique du test d'inhibition de croissance en milieu liquide sur des fractions aliquotes de 10 μl : une telle fraction équivaut à un extrait de 300 adultes de drosophiles. b- Purification finale

Deux étapes supplémentaires sont nécessaires à la purification finale des molécules à activité antibactérienne. Les fractions "Elution 10 %" présentant 1'activité biologique sont analysées sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 Ci8 ^R - L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,22 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 0,8 ml/min.

Les fractions qui présentent une activité antibactérienne, mesurée selon la méthode indiquée ci- après, sont purifiées sur la colonne précédemment décrite dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes pour un débit de 2 ml/min.

On rapporte sur la figure 1, la variation de la densité optique DO à 225 nm en fonction du temps lors de l'étape de purification finale du glycopeptide. La ligne en pointillés correspond à 1'acetonitrile (en %) ajouté pour la purification. La flèche en trait plein { i ) désigne le glycopeptide purifié et celle en pointillés (^) désigne le peptide de synthèse dont il sera question ci-après. La colonne (|) représente l'activité antibactérienne.

La masse molaire mesurée est de 2564,4 daltons. L'analyse de la microséquence est réalisée en procédant à une dégradation d'Edman automatisée du peptide

et à la détection des dérivés de phénylthiohydantoïne sur un séquenceur automatique à liquide puisé (Applied Biosystems) modèle 473 A ou 477 A.

L'analyse des acides aminés est effectuée sur un analyseur 420 A (Applied Biosystems) avec analyseur HPLC et microordinateur.

Le peptide est hydrolyse à 120°C durant 24 heures avec HC1 6N en phase gazeuse (Pico-Tag, Millipore). On forme des dérivés avec le phényl isothiocyanate, puis on détecte les acides aminés à 254 nm.

Le peptide isolé et purifié correspond à la séquence

(II) en acides aminés donnée plus haut et comporte un groupe de substitution N-acétylgalactosamine-galactose sur le motif thréonine, comme démontré par HPLC et spectrométrie de masse.

La mesure de l'activité biologique a été réalisée par la méthode suivante :

*Préparation des souches pour le test antibactérien

Pour chaque souche, une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 30 ml de milieu PB (milieu LB dépourvu d'extrait de levure) et incubée à 30°C pendant une nuit sous agitation lente. Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont ramenées par dilution dans du milieu PB frais à une concentration de 400.000 UFC(unités formant des colonies)/ml pour E.coli et 40.000 UFC/ml pour M.luteus (soit une D0600=0,001).

*Réalisation du test antibactérien

L'échantillon à tester (10 μl) est déposé dans des puits de plaques de microtitration dans lesquels sont ajoutés 100 μl d'une culture bactérienne en phase exponentielle de croissance ramenée à D0600 = 0,002. Après 24 heures d'incubation à 25 ^β C, la croissance bactérienne est mesurée à 600 nm. L'inhibition de croissance des bactéries, qui reflète l'activité antibactérienne, est mise en évidence par la différence de D0600 existant entre les fractions testées et une culture témoin dans laquelle les 10 μl d'échantillon sont remplacés par 10 μl d'eau stérile.

Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après et sont exprimés en UFC/ml x 103.

Ces résultats mettent bien en évidence l'activité bactéricide des produits de l'invention.

A titre de comparaison, on a préparé par voie de synthèse en utilisant un synthétiseur de peptides tel que celui indiqué ci-dessus, un peptide présentant le squelette en acides aminés de l'enchaînement I, mais dans lequel la thréonine en position 11, contrairement au glycopeptide de l'invention, n'est pas glycosyle.

La séquence du peptide synthétique a été vérifiée en effectuant une dégradation d'Edman et en déterminant la masse molaire à l'aide d'un spectromètre de masse VG Biotech Bio Q.

On constate une elution différente du peptide en HPLC, comme le montre la figure 1.

La détermination de la masse molaire donne une valeur de 2199,6 daltons qui diffère de 364,8 daltons de celle du glypeptide de l'exemple 1.

De plus, ce peptide synthétique, dépourvu de groupement glycosyle, présente une activité biologique 10000 fois inférieure à celle du glycopeptide de 1'exemple 1. Afin de prouver que la différence entre le glycopeptide et ce peptide synthétique provient de la 0- glycosylation sur la thréonine en position 11, le glycopeptide purifié de l'exemple 1 a été soumis à l'action de HF anhydre, qui hydrolyse spécifiquement les liaisons 0- glycosyle.

Ce traitement a conduit principalement à un composé de 2199,6 daltons, donc de même masse que le peptide synthétique non substitué et à un composé de 2403,0 daltons. En revanche, le même traitement appliqué au peptide synthétique n'altère pas ce dernier dont la masse molaire reste inchangée.

Le groupe glycosyle est identifié comme étant un groupe N-acétylgalactosamine-galactose.

Exemple 2 : Séquences de nucléotides codant pour des glycopeptides antibactériens.

. Isolement de clones d'ADNc : à l'aide d'une sonde dégénérée 5' TAG GGN CGN GGC TTG

CC 3' et à partir de 30 000 phages contenant l'insert correspondant, on procède au criblage d'une banque d'ADNc de drosophile (l'élaboration de cette banque est rapportée ci-après).

On obtient 30 clones d'hybridation positifs. . Séquençage

Dix de ces clones sont séquences. On constate que les inserts contiennent tous un cadre ouvert de lecture de 65 codons commençant avec une méthionine. Les inserts 1 à 9 ne montrent pas de variation de séquence. Le plus long est représenté sur la figure 2 (SEQ ID N° 10). L'insert 10 (SEQ

ID N° 11) montre des variations de bases qui sont représentées sur la figure 2. Le signal consensus de polyadénylation AATAAA est indiqué en caractères gras. La première ligne de la séquence de nucléotides correspond à celles des clones 1 à 9, la deuxième ligne mentionne les bases différentes du clone 10, les autres bases étant identiques à celles données sur la première ligne ne sont pas indiquées.

La séquence en acides aminés déduite correspond à un précurseur de la séquence peptidique du glycopeptide de l'exemple 1 et présente l'enchaînement I donné ci-dessus. Cet enchaînement I comporte la séquence II de 19 acides aminés et dans la partie N-terminale un signal peptidique potentiel (motifs 1 à 19) et un dipeptide Thr-Pro (en positions 20 et 21). La partie C-terminale comprend un

peptide de 22 acides aminés (occupant les positions 43 à 64 dans l'enchaînement I) séparé de l'enchaînement II par un site de clivage dibasique Arg-Arg (en positions 41 et 42). . Préparation de la banque d'ADNc On prépare une banque d'ADNc de taille sélectionnée en soumettant à un challenge bactérien des larves de drosophile au troisième stade larvaire. L'ARN enrichi en poly (A) est extrait comme décrit par Reichhart et al dans EMBO J. 11, 1469-1477 (1992). Une banque A gt 22 est construite en utilisant le système Superscript lambda commercialisé par Gibco BRL. Les ADNc sont sous-clonés dans Mt3mpl9. Les deux brins sont séquences en utilisant la méthode au didéoxy de Sanger avec le kit de séquençage commercialisé sous la marque Séquanase ^R par USB. Exemple 3 : Obtention de glycopeptides antibactériens par expression chez Saccharomices cerevisae.

En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, on insère dans un vecteur une séquence de nucléotides d'un clone d'ADNc de l'exemple 2 et on réalise l'expression chez Saccharomices cerevisae.

Le glycopeptide produit est récupéré et analysé pour vérifier sa séquence.

Exemple 4 : Obtention par voie de synthèse de glycopeptides antibactériens du type de ceux induits chez Phormia terranovae.

On fait réagir une thréonine avec une N- acétylgalactosamine. On procède au blocage des groupes hydroxyle de la galactosamine à 1'aide de groupes protecteurs utilisés habituellement à cet effet. On utilise par exemple du chlorure de benzoyle pour protéger les groupes hydroxyle avec un radical benzoyle.

L'enchaînement . d'acides aminés de la séquence VI donnée plus haut est réalisé à l'aide d'un synthétiseur de peptides, tel qu'utilisé dans l'exemple 1. L'analyse par spectro étrie de masse du produit obtenu et la dégradation d'Edman permettent de vérifier que le glycopeptide recherché a bien été synthétisé.

Exemple 5 : Obtention de glycopeptides antibactériens par extraction à partir de Phormia terranovae.

- Induction de la synthèse biologique. Des larves de troisième stade de Phormia terranovae sont blessées par piqûre à 1'aide d'une aiguille plongée préalablement dans une suspension bactérienne, par exemple d'Enterobacter-cloacae.

Extraction, fractionnement et purification des glycopeptides synthétisés. Après 24 heures, le sang est prélevé par incision de la cuticule et soumis à centrifugation à 36000 g, pendant 20 min, à 4°C.

Le surnageant est additionné d'acide acétique et chauffé à 100 ^β C, pendant 4 min. Les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation et le surnageant est appliqué sur une colonne échangeuse de cations, équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 40 à 500 mM.

On vérifie 1'activité biologique des peptides obtenus en opérant comme décrit dans l'exemple 1, par exemple en étudiant l'activité vis-à-vis de E.coli. Les peptides actifs obtenus sont filtrés sur cartouche Sep Pack C18 WatersR et purifiés en chromatographie liquide, HPLC phase inverse sur une colonne Baker-Bond C18 WPR. L'élution est effectuée selon un gradient linéaire avec de 1'acetonitrile.

On soumet l'un des peptides actifs fraîchement isolé à la dégradation d'Edman et on détermine sa masse moléculaire.

La séquence en acides aminés obtenue répond à la séquence (VIII) donnée plus haut, sa masse moléculaire est de 9440,4 (± 3). Les résidus thréonine en positions 10 et 54 sont O-glycosylés. Cette O-glycosylation correspond sur chacune de ces positions à un groupe N-acétyl hexosamine- hexose. En particulier, les résidus thréonine sont substitués par des groupes N-acétylgalactosamine-galactose- glucose. Par traitement avec de l'acide fluorhydrique HFA, on observe une diminution de la masse moléculaire à 8692,6 et une perte de l'activité biologique.

Comme pour le peptide de 1'exemple 1, on notera avec intérêt que la O-glycosylation est nécessaire pour l'activité biologique des peptides.

Ces substitutions peuvent être plus complexes que celles déjà indiquées correspondant à un groupe N-acétyl- hexamine-hexose. En effet, les extractions des peptides actifs ont été réalisées en milieu acide et peuvent donc conduire à une altération de la chaîne de substitution.

En opérant dans des conditions plus douces, il est alors possible d'obtenir des peptides actifs comportant un groupe glycosyle substitué en outre par exemple par un radical de 1'acide sialique et/ou un fucose.

Exemple 6 : Obtention de glycopeptides antibaσtériens à partir de Pyrrhocnris apterus. - Immunisation et obtention de 1'hémolymphe.

On recueille les adultes de P.apterus durant 1'été sur des feuilles d'hibiscus. On injecte à 1000 insectes une suspension de 2 μl contenant 2500 cellules de M.luteus (bactéries à Gram positif) et 2500 cellules de E.coli (bactéries à Gram négatif).

A différents intervalles de temps, on recueille 1'hémolymphe (environ 3 μl/insecte) en sectionnant une antenne et en pressant doucement le corps de l'insecte. Les hémolymphes sont rassemblées et placées dans un puits en plastique pré-refroidi en présence d'aprotinine (Sigma A- 62-79, concentration finale : 10 μg/ml d'hémolymphe) comme inhibiteur de protéases, et de phénylthiourée (concentration finale : 1 μg/ml d'hémolymphe) comme inhibiteur de melanisation. L'hémolymphe est centrifugée à 13000 g pendant 1 heure à 4 ^β C.

On observe une forte activité anti-bactérienne dans les 24 heures suivant l'injection. Cette activité est maintenue jusqu'à 72 heures. Le volume total d'hémolymphe collectée est de 2,2 ml. Après l'élimination des cellules sanguines par centrifugation, on applique les surnageants, comme indiqué dans les exemples ci-dessus, sur une cartouche Sep-Pak Cl8 ^R .

L'activité antibactérienne est récupérée par elution avec 50 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,05 % TFA).

Les fractions actives sont rassemblées et appliquées sur une colonne HPLC d'exclusion de taille, puis on effectue une elution isocratique avec 30 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,03 % de TFA).

Les activités antibactériennes des fractions sont vérifiées en dosant des quantités aliquotes et en effectuant des tests d'inhibition de croissance sur plaques vis-à-vis de différents micro-organismes. Une activité anti-E.coli est détectée dans la fraction 1 correspondant à des masses moléculaires de 10 à 30 kDa, et une activité antibactérienne dirigée contre E.coli et M.luteus, dans la fraction 2 avec des masses moléculaires inférieures à 10 kDa.

La fraction 1 est ensuite soumise à une HPLC Ci8 en phase inverse et les molécules actives sont d'abord éluées avec un gradient variant de 2 à 52 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (90 min, débit 1 ml/min). On effectue une nouvelle chromatographie sur la même colonne avec un gradient plus faible de 15 à 35 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (pendant 90 min) avec un débit plus fort (2 ml/min). On récupère un produit apparaissant pur, appelé peptide A.

La fraction 2 est soumise également à une chromatographie HPLC Ci8 en phase inverse avec un gradient de 2 à 52 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,05 % de TFA). Deux zones présentant une activité anti-bactérienne sont récupérées : 1'une correspond à un peptide, appelé peptide B, présentant une activité anti-M.luteus et la deuxième à un peptide appelé peptide C, qui est actif vis- à-vis de E.coli. Le peptide C apparaît constitué par un mélange de composés et est soumis à une purification supplémentaire à l'aide de deux processus successifs de chromatographie (HPLC, gradient de 10 à 30 %, suivi d'un gradient de 5 à

25 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée, 0,05 % de TFA, 90 min pour chaque gradient). On obtient ainsi le peptide C sous forme pure

- Détermination de la structure primaire du peptide C. On soumet le peptide C à la réaction de dégradation d'Edman.

La détermination de la séquence en acides aminés montre que le peptide C comporte 20 résidus et correspond à l'enchaînement IX donné ci-dessus. La mesure par spectrométrie de masse de la masse moléculaire conduit à une valeur de m/z = 2543,3.

Les signaux observés pour le résidu en position 11 sont analogues à ceux observés pour le résidu thréonine du peptide selon 1'exemple 1, tel qu'induit chez la drosophile.

La différence entre la masse calculée du peptide (2340,2 Da) et la masse expérimentale (2543,3 Da) est de 203,1 Da, ce qui correspond à un motif N-acétylhexosamine (221,18 Da) avec une molécule d'eau nécessaire pour la liaison glycane. Le groupe de substitution du motif thréonine est un groupe N-acétylgalactosamine.

Exemple 7 : Formulation utilisable pour traiter des septicémies à entérobactéries.

1) Peptide de 1'exemple 1 : 10 à 100 mg Excipient : eau physiologique.

2) Peptide de l'exemple 6 : 10 à 100 mg Excipient : eau physiologique.

La formulation est administrée par voie injectable 4 fois par jour, pendant une semaine. Dans ces essais, aussi bien que dans les nombreuses autres expériences réalisées selon l'invention, on constate l'effet bactéricide puissant et rapide des peptides de l'invention qui permet un traitement efficace des septicémies.

LISTE DES SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT:

(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE (C N R S)

(B) RUE: 3 rue Michel Ange

(C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75794 CEDEX 16

(ii) TITRE DE L' INVENTION :

GLYCOPEPTIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)

(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE:

NUMERO DE DEPOT: PCT/FR (en attente)

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 64 acides aminés (B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..64

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N": 1:

Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu

5 10

Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr

15 20

Pro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg

25 30

Pro Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val

35 40

Arg Arg Glu Ala Leu Ala Ile Glu Asp His

45 50 Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro

55 60

Ile Leu Pro Ala 64 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 2 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..19

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 2: Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro

5 10 Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val

15 19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 3 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 82 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..82

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 3

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10

Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly

25 30

Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys

35 40

Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His Ser

45 50 Ile Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin His

55 60

Leu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro

65 70

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr 75 80

Asn Glu 82

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 82 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..82

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 4:

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10

Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly

25 30

Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys

35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser

45 50

Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His

55 60

Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr

75 80

Asn Phe

82 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 5 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 41 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..41

(C) AUTRES INFORMATIONS : Xaa signifie acide aminé variable

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N" 5 :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser

5 10 Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val .

15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly

25 30

Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin Lys 35 40

Val 41

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 41 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..41

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N" 6 :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser

5 10

Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly

25 30

Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin Lys

35 40

Val

41

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 7 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 39 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE: (A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..39

(C) AUTRES INFORMATIONS : Xaa signifie acide aminé variable (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 7 :

Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro Xaa

5 10

Xaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu Val

15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys Xaa

25 30

Xaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala Gin

35 39

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 8 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 82 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..82

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N ¹ 8 Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr

5 10 Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val

15 20

Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly

25 30

Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys

35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser

45 50

Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His

55 60

Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70

Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr

75 80

Asn Phe

82

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 9 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 20 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE: Peptide

(B) EMPLACEMENT: 1..20

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 9 :

Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro

5 10

Thr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg Asn

15 20

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 10

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 353 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS : double brin

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARN génomique (iϋ) HYPOTHETIQUE : oui (iv) ANTI-SENS : non

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE:

(B) EMPLACEMENT: 1..353

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 10

TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT TTC CTG 42

Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu -20 -15 CTG CTT GCC TGC GTT TTT GCC ATG GCT GTG GCC ACT CCC 81 Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr Pro

-10 -5

GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC TCC CAT 120 Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His 1 5 10

CCT CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG GCC ATC 159 Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu Ala Ile

15 20 25

GAG GAT CAC CTG GCT CAA GCT GCC ATC AGG CCA CCA CCC 198 Glu Asp His Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro

30 35

ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA CCGCGGAGAA 236

Ile Leu Pro Ala 40 GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC TTTATAAAAA 276

TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA AACAATAAAC 316

ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 353

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 11 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 363 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS : double brin (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARN génomique (iii) HYPOTHETIQUE : oui (iv) ANTI-SENS : non

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:

(A) NOM/CLE:

(B) EMPLACEMENT: 1..363

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 11 ATTTG TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT 41

Met Lys Phe Thr Ile Val -20

TTC CTG CTG CTT GCT TGC GTT TTT GCC ATG GGT GTG GCC 80 Phe Leu Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Gly Val Ala -15 -10 -5

ACT CCC GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC 119 Thr Pro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr

1 5 10

TCC CAT CCC CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG 158 Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu 15 20 GCC ATC GAG GAT CAC CTG ACT CAA GCT GCC ATC AGG CCA 197 Ala Ile Glu Asp His Leu Thr Gin Ala Ala Ile Arg Pro 25 30 35

CCA CCC ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA 231

Pro Pro Ile Leu Pro Ala 40

CCGCGGAGAA GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC 271

TTTATAAAAA TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA 311

AGCAATAAAC ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA 351

AAAAAAAAAA AA 363