本发明涉及蛋白质药物的纯化领域。 尤其涉及含有治疗不孕症的糖蛋白 的干燥方法。 背景技术

治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质， 包括绒毛膜促性腺激素 ( HCG ) 、 绝经期促性腺素 （HMG ) 、 卵泡剌激素 （FSH ) 、 黄体生成素 （LH ) ， 其中绝经期促性腺素是含有卵泡剌激素和黄体 生成素且两者成一定比例 （1 : 0. 1 - 1 ) 的混合物。

HCG、 FSH, LH都是由 a链和 β链两个亚基通过非共价键的形式结合， 其 中它们的 α亚基完全相同， 具有 92个氨基酸， 分子量约为 14500D , 第 52和 78位置上的天冬酰胺是发生 Ν-糖基化的氨基酸。 HCG的 β亚基有 145-147个 氨基酸，分子量 22200-39000D ,其中第 13、 30位置上的天冬酰胺以及第 121、 127、 132、 145 位置是发生糖基化的地方。 FSH 的 β亚基由 1 1 1 个氨基酸组 成， 分子量约为 18000D , 其中第 7和 24位置上的天冬酰胺是发生 Ν-糖基化 的氨基酸。 而 LH的 β亚基由 121个氨基酸组成， 分子量约为 14800D。

临床上 HCG、 HMG, FSH, LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。 它 们可以从特定妇女 （孕期或绝经期） 的尿液中提取出来， 也可通过 DNA重组 技术而制备。

治疗不孕症的糖蛋白的第一代产品是上世纪 60 年代 Serono 公司的 Profas i (HCG)、 Pergonal (HMG) , 它们的纯度都较低， 含有大量杂质。 上世 纪 80年代之后， Serono 公司分别推出了 Metrodi n-HP， 它是一种杂质含量 很低的高纯度的 FSH 制剂； 后来又推出利用 DNA 重组技术生产的 Gonal- F (rFSH)、 Luveri s (rLH)等， 另夕卜， Ferring公司也推出了高纯度绝经 期促性腺素一 Menopur。

由此可见， 目前市场上都在致力于高纯度糖蛋白的开发和 应用， 来替代 普通的低纯度产品， 以克服普通低纯度产品中的杂蛋白造成的过敏 反应。

CN1309567A公开了含有 FSH或其变体的液体制剂。 但是， 因为液体形式 必须保存在 -20 °C以下， 否则糖蛋白容易失活， 液体形式不容易保存和运输； 液体形式由于会遇到冻结 -溶解过程， 甚至是反复的冻结 -溶解过程， 更容易 导致糖蛋白失活； 液体形式还会遇到包装容器在低温下接近脆性 点容易破裂 的危险等。 而对于制剂成品来说， 液体形式除了不容易运输外， 还遇到液体 形式的糖蛋白药物的稳定性较差， 而且必须要加防腐剂才能保证在有效期内 微生物不会滋生， 给临床应用带来安全性的隐患。

因此， 固体形式的糖蛋白组合物更适合工业化生产。 而固体形式的获得 主要是通过冷冻干燥和真空干燥的手段， 但高纯度的糖蛋白在冷冻干燥的过 程中很容易发生变性失活， 其变性失活主要表现为完整分子降解成 α链和 β 链两个亚基， 而这些亚基也是杂质， 它们是没有疗效或可能产生副作用的异 构物， 在投料时都要多加 10— 30%的量， 以抵消冷冻干燥过程的失活情况， 而且成品中还会产生一定量的亚基， 降低了产品的纯度。 CN101347613A公开 了一种制备糖蛋白组合物的冻干方法可以制备 高纯度的几乎不含亚基的糖 蛋白冻干组合物， 但是用此法去除有机溶剂的效果并不理想。

而真空干燥通常是将有机溶剂与糖蛋白溶液充 分混和， 形成沉淀后再脱 水， 然后将沉淀进行真空干燥， 这种方法虽然可以减小糖蛋白变性失活， 但 是干燥后的糖蛋白中的有机溶剂含量较高， 质量百分含量超过 1%。 有机溶剂 大多都对人体有害， 2010年中国药典明确规定药品中乙醇限度为 0. 5%。

因此， 本领域迫切需要开发出一种能降低糖蛋白中有 机溶剂残留的真空 干燥方法， 并由此获得低有机溶剂残留的糖蛋白组合物。 发明内容

本发明旨在提供一种低有机溶剂残留的糖蛋白 组合物， 以及获得上述糖 蛋白组合物的真空干燥方法。

本发明一方面提供了一种低有机溶剂含量的糖 蛋白组合物， 其中有机溶 剂质量百分含量不超过 0. 5%， 优选不超过 0. 3%， 更优地不超过 0. 1% 。

其中， 所述有机溶剂为乙醇， 丙酮或甲醇。

其中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、 绝经期促性腺素、卵泡剌激素、 黄体生成素、 或其混合。

其中， 所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和 /或重组的人绒毛膜促性腺激 素、 或其变体； 所述绝经期促性腺素是人尿来源和 /或重组的人绝经期促性腺 素、 或其变体； 所述卵泡剌激素是人尿来源和 /或重组的人卵泡剌激素、 或 其变体； 所述黄体生成素是人尿来源和 /或重组的人黄体生成素、 或其变体。 本发明的另一方面， 提供了一种简易制备得到低溶剂残留的糖蛋白 组合 物的方法。 发明人经过深入研究， 发现在将糖蛋白组合物与水系统共同真空 干燥， 能有效去除有机溶剂， 得到具有良好稳定性的低溶剂残留的糖蛋白组 合物。 低溶剂残留的糖蛋白的组合物的干燥原理

由于糖蛋白类物质在高温下易变性失活， 故不宜采用喷雾干燥或其它加 热的方式进行干燥， 而冷冻干燥的方式也存在一定的失活现象， 并且冷冻干 燥设备昂贵， 干燥量小， 能耗大。 采用真空干燥法（不加水体系干燥）产品降 解失活不明显， 但有机溶剂残留高。 发明人对其溶剂残留超标的原因进行了 深入分析， 在样品真空干燥的前期有机溶剂和水以一定的 比例共同挥发， 但 随着样品中有机溶剂以及水含量的降低， 挥发的量越来越小， 当样品中的水 含量不再降低时， 有机溶剂的量也不再降低。 因此有机溶剂的残留量与样品 中的水含量有关。 发明人惊人地发现在真空干燥器中放置能释放 出水蒸汽的 物质， 不但能够得到低溶剂残留的糖蛋白的组合物， 而且样品不存在降解失 活现象。

发明人在获得低溶剂残留的糖蛋白的组合物后 对其干燥原理进行了深入 研究。 在真空干燥器中放置能释放出水蒸汽的物质， 目的是为了控制真空干 燥过程中样品中的有机溶剂与水的挥发比例。 真空干燥过程中有机溶剂与样 品中的水共同挥发， 在真空干燥箱内， 有机溶剂和水蒸气各占一定比例的， 但随着干燥的进行， 水分含量有限， 为了维持这一平衡， 我们在干燥体系中 放入能释放水蒸汽的物质， 人为增加真空干燥箱内水气压， 可以抑制样品中 的水的挥发， 同时又能促进样品中有机溶剂的挥发。 从而有效的降低了样品 中有机溶剂的残留， 并且样品中的水含量也维持在较低水平， 故样品不存在 降解失活现象。

发明人在获得低溶剂残留的糖蛋白的组合物后 对其干燥过程又再次进行 了深入研究， 又惊人地发现， 当有机溶剂干燥合格后， 再撤去释放出水蒸汽 的物质， 继续真空干燥一定时间， 能将样品中的水分真空干燥到合格范围内， 并且有机溶剂还能进一步降低， 样品在这一水份范围内稳定性良好。 因此本 发明的干燥过程分为两阶段， 第一阶段是将样品与水体系共同真空干燥除去 有机溶剂， 第二阶段是撤去水体系真空干燥到样品含水量 合格为止。 制备方法

本发明提供了一种制备低有机溶剂含量的糖蛋 白组合物的方法， 所述方 法包括以下步骤：

(a) 将有机溶剂与含有糖蛋白的组合物原料的溶液 充分混合沉淀， 收 取沉淀物 （1) ， 用有机溶剂脱水后， 继续收取糖蛋白的组合物沉淀， 获得 含有糖蛋白组合物的沉淀物 （2) ； 和

(b) 将含有糖蛋白组合物的沉淀物 （2) 与水系统共同真空干燥， 得到 本发明提供的低有机溶剂残留的糖蛋白组合物 。

在另一优选例中， 在步骤 ) 中， 所述有机溶剂温度 -20至 25°C， 优选 - 20至 0°C。

在另一优选例中， 步骤 （a) 中， 所述有机溶剂选自乙醇， 丙酮或甲醇。 在另一优选例中， 在步骤 （a) 中， 所述脱水用有机溶剂量为湿沉淀物 (1) 重量 0至 10倍，优选 1至 4倍。

在另一优选例中， 在步骤 （b) 中， 所述干燥温度在 0至 25°C， 优选 0至 20 °C。

在另一优选例中， 在步骤 （b) 中， 所述水系统包括固态、 液态或气态 的自来水、 去离子水、 反渗透水、 纯水和注射用水， 能释放水蒸汽的物体， 以及水溶液， 优选纯化水。

在另一优选例中， 在步骤 （b) 中， 所述干燥时间为 1至 48小时， 优选 10 至 24小时。

在另一优选例中， 步骤 a所述的含有糖蛋白组合物原料的溶液可以由� � 下步骤制备：

将含有糖蛋白组合物的原料溶解在水或缓冲液 中， 制备含有糖蛋白组合 物原料的溶液。

在另一优选例中， 所述的含有糖蛋白组合物的原料为固体。

在另一优选例中， 所述的缓冲液选自： pH值缓冲范围在 3至 11的缓冲液； 优选自； 磷酸盐缓冲液， Tris缓冲液， 醋酸钠缓冲液。

在另一优选例中， 所述溶解温度在 5至 20°C， 优选 10至 16°C。

在另一优选例中， 所述含有糖蛋白组合物原料的溶液的 pH值为 3至 11， 优选 4至 10。 在另一优选例中， 在步骤 （b) 后面还可以含有以下步骤：

(c) 撤去水系统后继续真空干燥得到本发明提供的 低溶剂残留的糖蛋 白的组合物。

在步骤 （c) 中， 所述干燥时间为 0至 48小时， 优选 5至 24小时。 在本发明的一个优选例中， 制备低有机溶剂含量的糖蛋白组合物的方法 包含以下步骤：

(a' ) 用 -20〜0°C的有机溶剂与含有糖蛋白的组合物原� �的溶液充分 混合沉淀， 收取沉淀物 （1) ；

(b' ) 将沉淀物 （1) ， 用有机溶剂脱水后， 继续收取糖蛋白的组合物 沉淀， 获得含有糖蛋白组合物的沉淀物 （2) ；

(c' )将糖蛋白的组合物沉淀物（2)与水系统在 0〜25°C共同真空干燥 1〜 48小时， 得到具有良好稳定性的低溶剂糖蛋白的组合物 ； 和

(d' ) 在步骤 （c' ) 后， 撤去水系统， 于 0〜25°C继续真空干燥步骤 (c' )制得的低溶剂糖蛋白的组合物 0〜48 小时， 得到更低溶剂残留的糖蛋 白的组合物。 如本文所用， "糖蛋白" 选自下述的一种或多种混合： 绒毛膜促性腺激 素 ( chorionic gonadotropin, CG) 、 卵泡剌激素 ( foil icule- stimulating hormone, FSH) 、 黄体生成素 ( luteotropic hormone, LH) 、 绝经期促性 腺素 ( human menopausal gonadotropin, HMG) 。 如本文所用， "糖蛋白组合物原料" 是指含有糖蛋白的组合物， 其中包 括糖蛋白， 或者包括糖蛋白和药学上 /食品学上可接受的载体。 可以使用本领 域现有的制备糖蛋白组合物的方法所获得的糖 蛋白组合物作为原料， 可以为固 体或液体， 例如但不限于， 中国专利 CN1246332C 公开的制备方法获得的高纯 度的 HMG;中国专利 CN1958603B公开的制备方法获得的 HCG;以及 CN101317103A 公开的方法获得的 FSH。

以上糖蛋白组合物原料的获得仅是举例， 本发明所述的糖蛋白组合物原 料应当不受此限制。

在本发明提供的获得低溶剂残留的糖蛋白组合 物的方法中， 所述的 "将 含有糖蛋白组合物的沉淀物 （2) 与水系统共同真空干燥" 是指将含有糖蛋 白组合物的沉淀物 （2 ) 放置在真空干燥器通常放置样品的地方， 并在真空 干燥器周围 （例如底部） 放置盛着能释放水蒸汽的物质的敞开的容器， 所述 的能释放水蒸汽的物质选自自来水、 纯水、 或冰水混合物。

在本发明提供的获得低溶剂残留的糖蛋白组合 物的方法中， 所述的 "撤 去水体系" 是指将盛着能释放水蒸汽的物质的敞开的容器 移往真空干燥的环 境之外。 本发明的主要优点在于：

1、 本发明提供了一种新的低溶剂残留的糖蛋白的 组合物。

2、 本发明提供了一种新的低溶剂残留的糖蛋白的 组合物的制备方法。

3、 本发明具有条件温和、 操作过程简单、 降解失活现象小， 产品稳定 性好， 能耗低， 在很大程度上减轻了工艺操作难度系数， 降低了生产成本。 附图说明

图 1显示了乙醇含量为 0. 5%的标准品的 GC图谱； 其中溶剂的保留时间 峰面积和质量含量如下表所列： 图 2 显示了对比例 2 中 HMG样品中的乙醇含 GC图谱； 其中溶剂的保

图 3 显示了实施例 6中 HMG样品中的乙醇含 GC图谱； 其中溶剂的保

图 4 显示了实施例 9 中 HCG样品中的乙醇含量 GC图谱； 其中溶剂的保 保留时间 （分钟） 峰面积 质量含量 (％) 溶剂种类

3.175 414.1 0.20 乙醇

具体实施方式

糖蛋白的组合物有机溶剂残留测定

在本发明的实施方式中， 采用 GC 测得本发明方法制备的样品的残留溶 剂， 所述的 GC检测方法如下：

色谱柱： Varian CP-Select 624 (94%氰丙基苯基 -6%二甲基聚硅氧烷） 柱规格： 30mX0.32mmX 1.8μηι

进样口温度： 20CTC

检测器温度： 26CTC

流速： 2.5ml/分钟， 恒流

炉温：

30°C/分

40°C， 2°C/分钟 5°C/分钟 250°C，

45 °C 80 °C 钟

5分钟 2分钟 载气： 氮气

分流比： 1 ： 1 (工作站） ， 实际分流比： 17:1 (皂膜流量计测定值） 检测器气体： 空气流量： 400ml/分钟

氢气流量： 40ml/分钟

尾吹气流量： 25ml/分钟 （氮气）

顶空进样器条件

加热平衡温度： 80°C; 定量环温度： 85°C; 传输线温度： 90°C; 平衡时 间： 20分钟； 加压时间： 0.5分钟； 充样时间： 0.2分钟； 定量环平衡时间： 0.10分钟； 进样时间： 1 分钟； 整个运行时间： 30分钟； 进样体积： 1ml; 振摇模式： 轻微振动。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实 验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件， 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所 熟悉的意义相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法基材料皆 可应 用于本发明方法中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。

下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实 验方法， 通常按照常规条件、 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所 熟悉的意义相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应 用于本发明中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 对比例 1

FSH的冷冻干燥

配制 45mL 0. 01M磷酸二氢钠溶液（用 NaOH调 pH约 6. 5)，加入 5ml乙醇， 加入 2g乳糖， 搅拌溶解后， 用 0. 22 μ ηι过滤器过滤。 取 10mL滤过液， 加入 10. Omg上述高纯度 FSH (上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价为 8817 国际单位 /mg ) ， 完全溶解后， 装盘放入冻干机 （购自 Virt i s ) 中， 按 CN101347613A实施例 1 的方法进行冷冻干燥， 出箱， 得 391mg冻干粉末。

经测定， FSH的生物效价结果如下：

对比例 2

传统真空干燥法制备 HMG

配制 10ml 0. lmol/L的醋酸钠溶液， 用醋酸调节 pH6. 5， 冷却至 10 °C， 加入 250mgHMG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价以 FSH 计 405 IU/mg ) ， 搅拌溶解。 加入 -20 °C乙醇 50ml， 搅拌混匀， 离心得湿沉 淀 931mg， 用 3ml 乙醇脱水， 离心得 HMG湿沉淀 901mg， 在 20 °C下真空干燥 96小时， 得到 249mgHMG样品。 经测定， 生物效价 （以 FSH计） 以及溶剂含 量结果如下：

实施例 3

制备低溶剂残留 HMG

配制 10ml 0. lmol/L的醋酸钠溶液， 用醋酸调节 pH4. 0， 冷却至 16 °C， 加入 250mgHMG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价以 FSH 计 405 IU/mg ) ， 搅拌溶解。 加入 -20 °C乙醇 100ml， 搅拌混匀， 离心得 HMG 湿沉淀 936mg， 在 20 °C下与放有冰水混合物的水体系一起真空干燥 10小时， 得到 257mgHMG样品。 经测定， 生物效价 （以 FSH计） 以及溶剂含量结果如 下：

结果如下:

实施例 4

制备低溶剂残留 HMG

配制 10ml 0. lmol/L的醋酸钠溶液， 用醋酸调节 pH6. 5， 冷却至 10 °C， 加入 250mgHMG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价以 FSH 计 405 IU/mg ) ， 搅拌溶解。 加入 -20 °C乙醇 50ml， 搅拌混匀， 离心得湿沉淀 956mg， 用 10ml 乙醇脱水， 离心得 HMG湿沉淀 916mg， 在 10 °C与放有冰水混 合物的水体系一起真空干燥 24小时， 得到 252mgHMG样品。 经测定， 生物效 结果如下:

实施例 5

制备低溶剂残留 HMG

配制 10ml 0. lmol/L的醋酸钠溶液， 用醋酸调节 pH10， 冷却至 15°C， 加入 250mgHMG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价以 FSH 计 405IU/mg) ， 搅拌溶解。 加入 -10°C乙醇 100ml， 搅拌混匀， 离心得 HMG 湿沉淀 953mg， 在 0°C与放有纯化水的水体系一起真空干燥 24小时， 撤去水 系统， 0°C继续干燥 5小时， 得到 246mgHMG样品。 经测定， 生物效价（以 FSH 计） 以及溶剂含量结果如下：

结果如下:

实施例 6

制备低溶剂残留 HMG

配制 10ml 0. lmol/L的磷酸二氢钠溶液， 用 NaOH溶液调节 pH7.0， 冷却 至 10°C， 加入 250mgHMG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效 价以 FSH计 405IU/mg) ， 搅拌溶解。 加入 0°C乙醇 50ml， 搅拌混匀， 离心得 湿沉淀 952mg， 用 3ml 乙醇脱水， 离心得 HMG湿沉淀 932mg， 在 0°C与放有纯 化水的水体系一起真空干燥 24小时， 撤去水系统， 20°C继续干燥 24小时， 得到 244mgHMG样品 定， 生物效价 （以 FSH计） 以及溶剂含量结果如 下：

结果如下：

实施例 7

制备低溶剂残留 HCG

配制 10ml 0. lmol/L的 Tris溶液， 用盐酸调节 pH7.5， 冷却至 10°C， 加入 300mgHCG原料 （由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价 5702 IU/mg) ， 搅拌溶解。 加入 0°C乙醇 50ml， 搅拌混匀， 离心得湿沉淀 1172mg， 用 11ml 乙醇脱水， 离心得 HCG湿沉淀 1022mg， 在 10°C与放有冰水混合物的 水体系一起真空干燥 24小时， 撤去水系统， 20°C继续干燥得 24小时， 得到

295mgHCG样品。

结果如下：

实施例 8

制备低溶剂残留的 FSH

取 10°C含有 FSH原料的溶液 1000ml (由上海天伟生物制药有限公司提 供， 生物效价 1958 IU/ml) ， 加入 -20°C乙醇 5000ml， 搅拌混匀， 离心得湿 沉淀 15820mg， 用 48ml 乙醇脱水， 离心得 FSH湿沉淀 14958mg， 在 0°C与放 有纯化水的水体系一起真空干燥 24小时， 撤去水系统， 20°C继续干燥 24小 时， 得到 3995mg FSH样品。

实施例 9

制备低溶剂残留的 HCG

取 16 °C含有 HCG原料的溶液 10L (由上海天伟生物制药有限公司提供， 生物效价 68319 IU/ml )，加入 -10 °C乙醇 50L，搅拌混匀，离心得湿沉淀 620g， 用 4L乙醇脱水， 离心得 HCG湿沉淀 560g， 在 20 °C与放有纯化水的水体系一 起真空干燥 20小时， 撤去水系统， 20 °C继续干燥 20小时， 得到 122g的 HCG 样品。

经测定， HCG的生物效价以及溶剂含量结果如下：

实施例 10

制备低溶剂残留 HCG

按照实施例 7的步骤操作， 区别是用甲醇替代实施例 7中的乙醇对原料 进行沉淀、 脱水制备湿沉淀， 得到 298mgHCG样品。 经测定， 生物效价以及 溶剂含量结果如下：

结果如下： 单位效价 总效价 效价得率 甲醇含量 水含量

(IU/mg) (万 IU) (%) ( % ) ( % )

HCG原料 5702 171 1. 4 1. 5

HCG湿沉淀 59. 5 6. 2

HCG样品 5623 168 98 0. 08 1. 1

实施例 11

制备低溶剂残留 HMG

按照实施例 6的步骤操作， 区别是用丙酮替代实施例 6中的乙醇对原料 进行沉淀、 脱水制备湿沉淀， 得到 240mgHMG样品。 经测定， 生物效价 （以

FSH计） 以及溶剂含量结果如下:

结果如下：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并非用以限定本发明的实质技 术内容范围， 本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的 权利要求范围 中， 任何他人完成的技术实体或方法， 若是与申请的权利要求范围所定义的 完全相同， 也或是一种等效的变更， 均被视为涵盖于该权利要求范围之中。