Titre : Inhibiteurs glycosidiques de levure

Domaine technique

[0001] La présente divulgation se rapporte à un procédé d'obtention d'une composition de polysaccharides pariétaux de levures et à son utilisation pour le traitement de pathologies gastrointestinales ou pour la préparation de compléments alimentaires visant à améliorer le confort intestinal.

Technique antérieure

[0002] Un déséquilibre du microbiote en espèces bactériennes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires, tout comme la prédominance de certaines familles de bactéries (Entérobactéries, Fusobactéries), ou la raréfaction d'autres espèces ( Clostridies , Faecalibacterium) ont été décrits chez des personnes atteintes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI). Des souches spécialisées de Escherichia coli ( E . coli) sont également responsables de diarrhées, de toxi- infections alimentaires, d'infections urinaires, de septicémies et de méningites (Kaper J.B., Nataro J. P., Mobley H.L. — Pathogenic Escherichia coli, Nature Review Microbiology, 2004, 2, 123-140). En outre, de nombreuses études soutiennent maintenant le concept selon lequel le microbiote intestinal serait un facteur environnemental majeur pouvant moduler le risque de cancer colorectal. Ainsi, des bactéries commensales du microbiote pourraient être directement pro-oncogènes. C'est le cas par exemple, de certaines souches de E. coli produisant in vivo dans la lumière intestinale, une génotoxine dénommée colibactine, qui induit des dommages à l'ADN des entérocytes similaires à ceux induits par une irradiation de rayons ionisants gamma (Cuevas-Ramos G et al., « Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells ». PNAS. U S A, 2010, 107, 11537-11542).

[0003] De nombreux microorganismes ont déjà été décrits dans la littérature pour leurs applications bénéfiques chez l'homme sur le tractus digestif et pour leur intérêt nutritionnel, comme décrit, par exemple, dans WO 2006/021965. Ces microorganismes sont communément désignés alors par le terme probiotique qui correspond à des microorganismes vivants capables d'apporter à l'hôte un bénéfice sur la santé lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513-0).

[0004] Plus particulièrement, l'utilisation de levures Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pour traiter les pathologies associées aux entérobactéries est connue. Ainsi, la demande antérieure FR 2 928 652 enseigne que la souche de levure S. cerevisiae (CNCM I-3856, ScProl) présente un intérêt thérapeutique et prophylactique pour le traitement de pathologies gastro-intestinales associées aux microorganismes pathogènes en limitant notamment la colonisation et/ou l'invasion intestinale de ces microorganismes. En particulier, l'administration de cette levure entraîne une diminution des entérobactéries au niveau du colon. Les résultats montrent que les fractions riches en mannoprotéines extraites de souches de levure (ScProl et/ou SCB1 ) sont capables d'inhiber in vitro l'adhésion et l'invasion de cellules épithéliales humaines par des souches de E. coli associées à la Maladie de Crohn, une des principales MICI (souches AIEC, Adhèrent Invasive E. Coli). L'étude de Sivignon et al. (Inflamm Bowel Dis. 2015; 21 (2):276-286) enseigne également que des composés pariétaux issus de la souche CNCM I-3856 diminuent la colonisation intestinale par les bactéries AIEC ainsi que les symptômes de colites associés dans un modèle murin mimant la maladie de Crohn. La conséquence de l'inhibition de l'adhésion des AIEC sur la paroi intestinale est une diminution importante de l'invasion des AIEC dans les tissus intestinaux et donc de leur pouvoir infectieux.

[0005] Ces dernières années, une attention croissante a été accordée aux glucanes isolés de la paroi cellulaire des levures. Les glucanes pariétaux de levures ont ainsi été utilisés pour renforcer ou amorcer la réponse immunitaire chez les humains et les animaux dont la fonction immunologique est normale ou diminuée (G. Hetland. Curr. Med. Chem. - Anti-infective Agents 2003, 2:135; P.J. Rice, B.E. Lockhart, L.A. Barker, E.L. Adams, H.E. Ensley, D.L. Williams. Int. Immunopharmacol. 2004, 33:829). La demande WO 2009/103884 enseigne plus particulièrement, que les béta-glucanes pariétaux de levure (notamment la souche CNCM I-3856) limitent l'inflammation intestinale. Jawahara et al., (PLoS One 2012; 7(7):e40648) divulgue en outre, que les fractions béta-glucanes de levures S. cerevisiae (notamment la souche LYSC 318.2) sont capables d'inhiber l'action pathogène de Candida albicans. Enfin, Pengkumsri et al., (Food Sci Technol, Campinas 2017, 31 (1 ): 124- 130) divulgue que les fractions béta-glucanes ont des propriétés d'immuno- modulation qui pourraient être utiles dans le traitement des colites humaines.

[0006] Il n'existe toujours pas actuellement, à la connaissance des inventeurs, de traitement curatif satisfaisant des MICI. La chirurgie, avec exérèse des parties lésées de l'intestin grêle, est parfois envisagée, mais il s'agit une opération handicapante dont les récidives sont fréquentes. On traite ainsi généralement uniquement les symptômes, tels que l'inflammation (par le biais d'anti- inflammatoires stéroïdiens ou non et d'anticorps dirigés contre des cytokines inflammatoires) et la douleur chronique (par le biais typiquement d'analgésiques tels que les cannabinoïdes). Chez les patients dont la maladie est évolutive, les médecins instaurent rapidement un traitement immunomodulateur, pour stopper les crises, éviter l'apparition de nouvelles lésions et prévenir les risques d'évolution tumorale liés aux états inflammatoires chroniques. Néanmoins ces traitements impliquent également des effets secondaires importants à moyen et long terme. Ainsi les corticoïdes sont de moins en moins utilisés. Il est donc essentiel d'une part de développer et de perfectionner les traitements prophylactiques existants, permettant d'améliorer le confort intestinal chez les sujets sains, et d'autre part de prévenir le développement de pathologies chez des sujets à risque et d'autre part développer des thérapies efficaces mieux tolérées pour les patients souffrant de pathologies gastro-intestinales comme les MICI.

[0007] Il reste donc important de poursuivre l'effort d'innovation pour identifier de nouvelles solutions ayant une efficacité augmentée sur l'amélioration de la condition de vie des patients souffrant de pathologies gastro-intestinales notamment les pathologies impliquant des agents infectieux. En particulier, il serait tout à fait pertinent d'identifier de nouveaux ingrédients actifs ou compositions dont l'efficacité en termes d'action anti-adhésion et/ou anti-invasive est supérieure. Résumé

[0008] Il est proposé une composition de polysaccharides de levure comprenant des β-glucanes et/ou des α-glucanes et/ou des mannanes, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides de levures sont extraits de parois de levures. Typiquement, les β-glucanes sont des β(1,6)-glucanes . Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre des mannanes et des α-glucanes. En particulier la présente demande propose une composition comprenant de 5 à 25 %, notamment de 10 à 20 %, d'α-glucanes ; de 30 à 50 %, notamment de 35 à 45 %, de β-glucanes (en particulier de β6-glucanes ; et de 30 à 55 %, notamment de 40 à 50 %, de mannannes. Typiquement, les levures sont choisies parmi les levures du genre Saccharomyces. Elles peuvent ainsi être choisies parmi le groupe comprenant les souches déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous les numéros CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, et CNCM I-5269 et la souche déposée auprès de la Collection des levures industrielles DBVPG 6763.

[0009] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé d'obtention d'une composition de levure comprenant : a) au moins une étape de fractionnement (typiquement par incubation à chaud) d'une composition pariétale de levure(s) et de récupération (extraction) d'une fraction insoluble (appelée « fraction insoluble a ») ; et b) au moins une étape d'extraction d'une fraction soluble (appelée « fraction soluble b ») à partir de la fraction insoluble a), ladite fraction contenant des β-glucanes (en particulier des β6-glucanes), de préférence également des mannanes et généralement des α-glucanes - cette étape comprend typiquement au moins une étape d'incubation de la fraction soluble a) dans une solution d'acide faible, et de récupération (extraction) d'une fraction soluble (« fraction soluble b »).

[0010] Typiquement, le procédé comporte une étape préliminaire d'obtention d'une fraction pariétale insoluble de levure(s).

[0011] Le procédé comprend de préférence une étape a1) d'incubation de la fraction insoluble a) dans une solution de base forte, à l'issue de laquelle la fraction insoluble (appelée fraction insoluble a1) est récupérée. Lorsque cette étape intermédiaire est mise en œuvre, la fraction (ou composition) incubée dans la solution d'acide faible de l'étape b) décrite ci-dessus est alors la « fraction insoluble a1 ».

[0012] La présente divulgation se rapporte également à une composition de polysaccharides de levure comprenant des β-glucanes, des mannanes et des a- glucanes telle que décrite dans la présente demande, notamment telle qu'obtenue selon le procédé ici décrit, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention des pathologies gastro-intestinales.

[0013] La présente invention se rapporte enfin à une utilisation non thérapeutique d'une composition telle que définie dans la présente divulgation, et notamment obtenue selon le procédé ici décrit, pour la préparation d'une composition alimentaire destinée à améliorer le confort gastro-intestinal et/ou à améliorer et maintenir l'homéostasie du microbiote intestinal.

[0014] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres.

Brève description des dessins

[0015] D'autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l'analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

[0016] [Fig. 1] : Schémas illustrant les différents protocoles mis en œuvre. Le schéma du haut (A) illustre l'extraction des différentes fractions de polysaccharides de levure à partir de levure entière ou d'écorces de levures. Le schéma du bas (B) correspond au procédé de l'invention dans laquelle les différentes fractions polysaccharidiques de levure sont extraites à partir d'écorces de levures.

Fig. 2 [0017] [Fig. 2] Schéma du protocole de préincubation sur cellules épithéliales intestinales T84 et Caco-2. Les fractions extraites de levures sont incubées dans un premier temps avec les bactéries AIEC puis ajoutées aux cultures de cellules épithéliales intestinales organisées en épithélium. Le niveau d'adhésion résiduelle de la souche bactérienne AIEC LF82 est ensuite estimé pour des concentrations décroissantes de fractions de levure (1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,1 mg/mL).

Fig. 3

[0018] [Fig. 3] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de « fraction soluble a » (appelée également Fehling mannanes en raison du protocole d'extraction des phospho-peptidomannanes) (fraction 1, aussi nommée fraction soluble a »), ou de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenus à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 (moyennes ± sem; ^** :p<0,01, ^*** :p<0,001, test t).

Fig. 4 [0019] [Fig. 4] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC

LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de β3-glucanes- phosphate (fraction 6) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 (moyennes ± sem; ^** :p<0,01 , test t).

Fig. 5 [0020] [Fig. 5] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC

LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou à partir d'écorces de levure CNCM I-3856 - (moyennes ± sem; ^* :p<0,05 ; ^** :p<0,01 ; ^*** :p<0,001 ; test t). Fig. 6

[0021] [Fig. 6] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir d'écorces de levure CNCM I-3856 ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem; ^* :p<0,05 ; ^** :p<0,01 ; ^*** :p<0,001 ; test t).

Fig. 7

[0022] [Fig. 7] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) des cellules AIEC LF82 aux cellules T84 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3), α-glucanes (fraction 5), ou β6-glucanes (fraction 4) provenant d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem; ^* :p<0,05 ; ^*** :p<0,001 ; test t).

Fig. 8

[0023] [Fig. 8] Niveaux d'adhésion résiduelle (pourcentages) de la souche AIEC LF82 aux TC7/Caco-2 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble a » (fraction 1 ) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou de la souche de levure LV04, ou de la « fraction soluble b » (fraction 3) obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856, ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268 (moyennes ± sem. ; ^** :p<0,01 , ^*** :p<0,001 , test t).

Fig. 9

[0024] [Fig. 9] Niveaux d'invasion résiduelle (pourcentages) des cellules TC7/Caco- 2 par la souche bactérienne AIEC LF82 (protocole de préincubation) en présence de la « fraction soluble b » (fraction 3) provenant d'écorces de levure CNCM I-5268.

Fig. 10

[0025] [Fig. 10] Graphique représentant le protocole d'administration des fractions de levure (FL : fraction de levure) in vivo chez la souris (modèle murin de colonisation par les AIEC). L'administration des fractions de levures est réalisée à la dose de 5mg/souris par voie orale. Fractions testées : « soluble a » (fraction 1 ), obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856 ou « soluble b » (fraction 3), obtenue à partir de la souche de levure entière CNCM I-3856, ou à partir d'écorces de levure CNCM I-5268.

Fig. 11 [0026] [Fig. 11] Estimation du nombre de bactéries AIEC LF82 dans les fèces de souris 2 ou 3 jours après infection des animaux en fonction de la fraction de levure administrée. Les résultats sont donnés en nombre de bactéries AIEC/g de fèces (box and whiskers, min. to max.) (FP : fraction pariétale).

Fig. 12

[0027] [Fig. 12] Quantification des bactéries AIEC LF82 associées à la muqueuse intestinale de souris traitées ou non, avec les fractions de levures, 4 jours après l'infection. Les résultats sont donnés en nombre de bactéries AIEC/g de tissus (box and whiskers, min to max) (FP : fraction pariétale).

Description des modes de réalisation

[0028] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

[0029] Par « environ », il est entendu dans la présente demande une variation de 20 %, notamment de 15 %, de 10 % ou de 5 % par rapport à la valeur numérique indiquée. À titre d'exemple, l'expression « une température d'environ 100 °C » doit être entendue comme une température comprise entre 80 et 120 °C, notamment entre 85 et 115 °C, notamment entre 90°C et 110 °C et de préférence entre 95 °C et 105°C.

[0030] Les inventeurs de la présente demande ont mis au point un procédé nouveau, permettant d'obtenir une composition de fragments pariétaux de levure, dont l'efficacité, notamment sur l'inhibition de l'adhésion et de l'invasion bactérienne, en particulier des bactéries E coli adhérentes et invasives (AIEC), est significativement augmentée par rapport aux levures entières ou aux dérivés décrits dans l'art antérieur.

[0031] Plus particulièrement, les inventeurs ont mis en évidence de façon totalement surprenante, qu'une composition de polysaccharides de levure extraits à partir de fragments pariétaux de levure (également appelés écorces ou parois de levure) présente une activité inhibitrice de l'adhésion et de l'invasion bactérienne très supérieure à des compositions de polysaccharides de levures, dont lesdits polysaccharides sont obtenus à partir de levures entières. De façon surprenante également, les compositions de polysaccharides de levure(s) selon l'invention contenant notamment des β1 ,6-glucanes, et éventuellement des mannanes et des α-glucanes présentent également une activité supérieure aux fractions mannanes précédemment décrites. Ce résultat est inattendu, dans la mesure où il était considéré, que les structures mannosidiques exposées par des glycoprotéines exprimées à la surface des entérocytes étaient exclusivement responsables de l'attachement aux cellules bactériennes via des structures fimbriales (FimH) exposées à la surface des pili de type 1 (Barnich et al. JCI, 2007).

[0032] Ainsi la présente divulgation porte sur une composition de polysaccharides pariétaux de levure comprenant des β-glucanes. Typiquement, les β-glucanes comprennent des β(1 ,6)-glucanes (également appelés β6-glucanes ci-après, notamment dans les exemples). Typiquement ladite composition comprend en outre des mannanes et/ ou des α-glucanes.

[0033] Une cellule de levure est schématiquement composée d'une enveloppe, également dénommée écorce ou paroi et d'un contenu. Dans la présente demande, les termes « pariétaux », « écorce » ou « paroi » qualifiant les polysaccharides ou les fragments de levure ici décrits sont ainsi utilisés de façon synonyme. On entend ainsi par « polysaccharides pariétaux » les polysaccharides constituants de la paroi (ou l'écorce) de la levure.

[0034] Trois groupes principaux de polysaccharides forment la paroi de levure, notamment de levure Saccharomyces cerevisiae : les polymères de mannose (ou mannanes), représentant environ 40% de la masse sèche de la paroi de levure, les polymères de glucose (β-glucane et α-glucane), représentant environ 60% de la masse sèche de la paroi cellulaire et les polymères de N-acétylglucosamine (chitine), représentant environ 2% de la masse sèche de la paroi cellulaire.

[0035] Les glucanes sont des polysaccharides composés de monomères de glucose qui peuvent être ramifiés ou non. Ils peuvent être séparés en différents sous-types selon le mode de liaison du glucose. Les α-glucanes sont des polymères de monomères de glucoses principalement liés entre eux par des liaisons a (1-4).

[0036] Les β-glucanes de levure sont des polysaccharides composés de monomères de glucose et peuvent être divisés en deux sous-types selon le mode de liaison du glucose : les chaînes longues d'environ 1500 unités de β-1,3-glucose qui représentent environ 85% des β-glucanes de levure, et les chaînes courtes d'environ 150 unités b-1 ,6-glucose qui représentent environ 15% des β-glucanes de levure (Klis, F., Mol, P., Hellingwerf, K. and Brui, S. (2002) « Dynamic of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae ». FEMS Microbiology Reviews 26, 239- 256).

[0037] Les chaînes courtes de b-1 ,6-glucanes sont impliquées dans des liaisons covalentes avec le β-1,3-glucane, les mannoprotéines et la chitine. Ces liaisons transversales peuvent également contribuer à la structure modulaire de la paroi cellulaire (Kollar, R et al. (1995) “Architecture of the yeast cell wall. b-(1,6)-glucan interconnects mannoprotein, b-(1 ,3)-glucan, and chitin”. Journal of Biological Chemistry 270, 17762-17775).

[0038] Les mannanes sont des polymères ou des oligomères de mannoses associés via un noyau de type N-glycanes. En particulier, les mannanes de levure Saccharomyces cerevisiae sont des polymères de mannoses a1,6 branchés en a1 ,2 avec des a1 ,3 terminaux (voir notamment Sendid et al., Med Sci (Paris). 2009; 25(5):473-482). Une fraction enrichie en mannanes selon la présente demande comprend au moins 30 % de mannanes, notamment au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de mannanes.

[0039] On entend par fraction β6-glucane une fraction enrichie en polysaccharides β-1,6-glucane. Typiquement une telle fraction comprend au moins 30 % de b-1 ,6- glucanes, notamment au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères b-1 ,6-glucanes.

[0040] On entend par fraction β3-glucane une fraction enrichie en β 1,3-glucanes. Typiquement une telle fraction comprend au moins 30 % de polymères b-1,3- glucane, notamment au moins au moins 35 %, 40%, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères b-1 ,3-glucane.

[0041] On entend par fraction a-glucane (ou glycogène) une fraction enrichie en a1 ,4 a1 ,6 glucanes. Typiquement une telle fraction comprend au moins 60 % de polymères a1 ,4 a1 ,6 glucanes, notamment au moins 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de polymères a1 ,4-a1 ,6 glucanes.

[0042] Les compositions de polysaccharides de levures décrites dans l'art antérieurs et typiquement obtenues à partir de levures entières comprennent typiquement de 60 à 80 % d'α-glucanes, classiquement de 65 à 75 % d'α-glucanes, de 5 à 25 % de β-glucanes, classiquement de 10 à 20 % de β-glucanes et de 5 à 25 % de mannanes, classiquement de 10 à 20 % de mannanes.

[0043] Les inventeurs ont montré que les compositions de polysaccharides obtenues à partir de fraction(s) pariétale(s) de levure(s) sont enrichies en b- glucanes, typiquement en b6 glucanes, et de préférence également en mannanes. Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs estiment que les compositions obtenues à partir d'une fraction pariétale de levure(s) comprennent des polymères hétérogènes associés par les liaisons fortes, non dissociables et typiquement covalentes, composés d'alpha-glucanes, de beta-glucanes (en particulier de beta-6 glucanes), et de mannanes, tels que décrits ci-dessus.

[0044] Ainsi, les compositions de polysaccharides de levures de l'invention comprennent typiquement au moins 30 % de β-glucanes, notamment de 30 à 50 % de β-glucanes, de préférence de 35 à 45 % de β-glucanes, en particulier de b(1 ,6)- glucanes.

[0045] De préférence, les compositions de polysaccharides de levures de la présente divulgation comprennent en outre des mannanes. Typiquement, les compositions de la présente demande sont enrichies en mannanes et peuvent comprendre de 30 à 55 % de mannanes, notamment de 40 à 50 % de mannanes.

[0046] De préférence, les compositions de polysaccharides de levures selon la présente divulgation comprennent des α-glucanes, notamment de 5 à 25 %, notamment de 10 à 20 % d'α-glucanes. [0047] Dans certains modes de réalisation, lesdites compositions comprennent les proportions suivantes de polysaccharides :

- de 5 à 25 % d'α-glucanes, de préférence de 10 à 20 % d'α-glucanes,

- de 30 à 50 % de β-glucanes, de préférence de 35 à 45 % de β-glucanes, en particulier de b(1 ,6)-glucanes

- de 30 à 55 % de mannanes, de préférence de 40 à 50 % de mannanes.

[0048] Les parois (ou écorces) de levures mises en œuvre dans la présente demande peuvent être issues d'un ou plusieurs types de levure. Les levures sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires appartenant au règne des champignons. Des levures particulièrement adaptées à la mise en œuvre de la présente divulgation sont notamment les levures du genre Saccharomyces. Ces levures constituent un genre taxonomique d'ascomycètes ne formant pas de mycélium et comprenant plusieurs espèces utilisées dans l'industrie alimentaire comme agents de fermentation. Classiquement, les levures appartenant au genre Saccharomyces peuvent être choisies parmi les levures alimentaires comme S. cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus ou S. pasteurianus. De préférence la levure est une souche de l'espèce Saccharomyces cerevisiae (levures de brasserie, ou de distillerie, ou de boulangerie, S. cerevisiae var. boulardii ). A titre d'exemple, les souches de levure Saccharomyces cerevisiae déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les numéros CNCM I-3799, CNCM I-3856, CNCM I-4407, CNCM I-4563, CNCM 1-4812, CNCM I-4978, CNCM 1-5128, CNCM 1-5129, CNCM I-5268, et CNCM I-5269, sont particulièrement bien adaptées à la présente divulgation.

[0049] Les compositions de la présente divulgation peuvent être obtenues à partir d'une ou plusieurs levures de souches différentes, ou d'espèces différentes.

[0050] Les compositions de la présente divulgation sont typiquement obtenues à partir de préparations de parois de levures ou de fragments de parois de levure séparés du contenu cellulaire (cytoplasme), en particulier par extraction des polysaccharides pariétaux à partir de fragments de paroi de levures. Les procédés d'obtention de parois de levure ou de fragments de parois de levure sont très connus dans le domaine technique de la présente divulgation. On pourra à ce titre consulter l'ouvrage de référence (« Yeast Technology », 2 ^ème édition, 1991 , G Reed et T.W. Nagodawawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, New York, ISBN 0-444- 31892-8).

[0051] Brièvement, les fragments de parois de levure ou fragments d'écorce de levure peuvent être obtenus par lyse chimique (solvants, acides, bases), physique (sonication, haute pression), enzymatique (typiquement emploi de protéases et nucléases) ou autolyse (enzymes endogènes) des cellules de levure suivie d'une séparation des parties soluble et insoluble, par exemple par des moyens physiques comme la centrifugation et de la récupération de la fraction (ou partie) insoluble. Typiquement, la centrifugation de la biomasse de cellules de levure lysées permet d'obtenir un surnageant et un culot de centrifugation. Le surnageant est constitué principalement d'acides aminés libres et de peptides issus de la dégradation des protéines et de nucléotides issus de la dégradation des acides nucléiques (ARN, ADN). Le culot de centrifugation contient les parois de levures intactes ou partiellement dégradées sous forme de cellules de levure vidées de leur contenu.

[0052] L'autolyse des levures est une hydrolyse du contenu cellulaire de la levure par ses propres enzymes. Elle est typiquement obtenue en plaçant une suspension de cellules de levures dans certaines conditions physiques de milieu et/ou en contact avec des activateurs provoquant l'apoptose des cellules de levure et la libération de ses enzymes dans le corps cellulaire. L'hydrolyse du contenu cellulaire produit des composés solubles. La fraction insoluble récupérée après l'étape de séparation constitue le produit dénommé écorces, ou parois de levure et comprend le cytosquelette des levures et les membranes et composants non solubilisés par l'autolyse ou l'hétérolyse. Cette fraction insoluble est souvent récupérée sous forme d'une suspension aqueuse (ou composition) d'écorce de levures.

[0053] Les écorces de levure peuvent se présenter sous forme liquide (15-20% de matière sèche), sous forme sèche (plus de 85% de matière sèche) ou sous forme pâteuse (25 à 85% de matière sèche). Les écorces de levure sont de préférence présentées sous forme sèche. Dans certains modes de réalisation, on utilise à titre d'exemple dans les compositions et/ou les procédé ici décrits des fragments pariétaux de levure CNCM I-5268. [0054] Pour la mise en œuvre de l'invention ici décrite, on peut utiliser des parois, ou écorces de levure(s) ou toute composition en contenant provenant d'un même type de levure ou des levures de types (souches) différents ou d'espèces différentes.

[0055] La présente divulgation se rapporte également à un procédé d'obtention d'une composition de polysaccharides pariétaux de levure(s) telle que décrite précédemment. De façon préférée, ledit procédé comprend notamment :

(a) au moins une étape de fractionnement d'une composition d'écorces de levures et de récupération d'une fraction insoluble, en particulier, au moins une étape d'extraction à chaud, à partir d'une composition d'écorces de levure(s) d'une fraction insoluble (également appelée « fraction insoluble a » dans les exemples de la présente demande) , et

(b) au moins une étape d'extraction dans une solution d'acide faible, typiquement une étape d'incubation de la « fraction insoluble a » dans une solution d'acide faible, à l'issue de laquelle la fraction soluble (appelée « fraction soluble b ») est récupérée.

[0056] Typiquement, ledit procédé comprend une étape préliminaire, consistant à récupérer une fraction pariétale de levure(s). En pratique, cette étape est typiquement réalisée par l'obtention d'une fraction insoluble à partir d'un hydrolysat (notamment d'un autolysat) de levure(s), telle que décrite précédemment. Cette étape vise notamment à éliminer tout ou partie (au moins 60 %, notamment au moins 75 %, notamment au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % et plus particulièrement au moins 95 %) des composés, non associés, ou faiblement associés à la paroi (voir à ce titre la méthode d'obtention d'une fraction pariétale de levure décrite précédemment).

[0057] L'étape a) d'extraction à chaud, (ou d'hydrolyse à chaud) peut être réalisée par une incubation à chaud des fragments pariétaux de levure(s) dans une solution, typiquement tamponnée à pH neutre, à une température supérieure à 75°C, notamment comprise entre 80 et 180 °C, notamment entre 90 et 150 °C, notamment entre 95 et 145 °C. Typiquement à une température d'environ 120 °C. Par pH neutre on entend un pH d'environ 7, notamment un pH compris entre 6 et 8. L'incubation à chaud est typiquement maintenue pendant une durée d'au moins 30 minutes, notamment au moins 1 h, typiquement entre 1 h et 4h, ou entre 1 h et 3h. De préférence, l'incubation est maintenue environ 1 ,5h. La solution tamponnée est typiquement une solution à base de tampon citrate (environ 20 mM) ou tout autre solution tampon équivalente dans le domaine. Après incubation, les fractions soluble et insolubles sont séparées, typiquement par centrifugation, et la fraction insoluble (insoluble a) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Cette étape peut être répétée entre 2 et 4 fois, de préférence 2 fois. La fraction soluble, récupérée à l'issue de cette étape d'hydrolyse à chaud comprend typiquement les phospho-peptidomannanes, non associés de façon forte (typiquement associés de façon non-covalente) aux polysaccharides pariétaux.

[0058] Le procédé comprend de préférence une étape a1 ) d'extraction dans une solution de base forte d'une fraction insoluble, typiquement une étape d'incubation de la fraction insoluble obtenue à l'issue de l'étape a) (dite « fraction insoluble a ») dans une solution de base forte, à l'issue de laquelle la fraction insoluble (appelée « fraction insoluble a1 » est récupérée. Lorsque cette étape intermédiaire est mise en œuvre la fraction (ou composition) incubée dans la solution d'acide faible de l'étape b) décrite ci-dessus est alors la « fraction insoluble a1 ».

[0059] L'étape a1), d'extraction dans une solution de base forte comprend typiquement une étape d'incubation de la fraction insoluble a) dans une solution de base forte. La solution de base forte est typiquement une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) ou tout autre équivalent, de préférence concentrée à environ 1 N. L'incubation dans la solution de base forte est typiquement réalisée à température ambiante, soit de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C. Elle est idéalement réalisée sous agitation pour une durée d'au moins 16h, typiquement entre 16h et 32h et de préférence 24h. Les fractions soluble et insolubles sont ensuite séparée, typiquement par centrifugation, et la fraction insoluble a1) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 5000 à 8000 rpm, de préférence environ 7000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Les étapes d'incubation à chaud suivie de la centrifugation. Les inventeurs estiment que cette étape permet d'éliminer des phospho-peptidomannanes résiduels.

[0060] L'étape b) d'extraction dans une solution d'acide faible comprend typiquement une étape d'incubation de la « fraction insoluble a » ou « a1 » (si l'étape intermédiaire d'extraction dans une base forte a été mise en œuvre) dans une solution d'acide faible. La solution d'acide faible est typiquement une solution d'acide acétique ou tout autre équivalent, de préférence concentrée à environ 0,5 N. L'incubation dans la solution d'acide faible est typiquement réalisée à température d'au moins 70 °C, notamment comprise entre 75 et 130, en particulier entre 75 et 115 °C, en particulier à environ 90 °C. Elle est idéalement réalisée, de préférence sous agitation, pour une durée d'au moins 1 h, typiquement entre 2h et 4h et de préférence 3h. Les fractions soluble et insoluble sont ensuite séparées, de préférence par centrifugation et la fraction soluble (appelée fraction soluble b) est récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Cette étape être répétée au moins 2 fois, notamment au moins 3 fois, 4 fois, 5 fois, 6 fois, 7 fois, 8 fois, en particulier entre 3 et 8 fois.

[0061] Typiquement les étapes de centrifugation du procédé de la présente demande sont réalisées à température ambiante, soit de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C.

[0062] Typiquement la fraction « soluble b » obtenue selon le protocole ici décrit est une fraction enrichie en β-glucanes, notamment en b-6 glucanes et de préférence également en mannanes (tel que défini précédemment). Une telle fraction contient également typiquement des α-glucanes. Ainsi, le procédé de l'invention permet d'obtenir une composition notamment telle que décrite précédemment, et présentant les effets avantageux tels que revendiqués ici.

[0063] Il est à noter qu'une fraction de β3-glucane (i.e.., typiquement enrichie en beta-3 glucanes telles que décrite précédemment) peut être obtenue à partir de fragments pariétaux (écorces) de levure selon la présente divulgation, lorsque la fraction insoluble (également appelée « fraction insoluble b ») est récupérée à l'issue de l'étape (b). De façon similaire cette étape b) peut être répétée au moins 2 fois, notamment au moins 3 fois, 4 fois, 5 fois, 6 fois, 7 fois, 8 fois, en particulier entre 3 et 8 fois.

[0064] Dans certains modes de réalisation, une fraction enrichie de β6-glucanes (contenant de préférence au moins 60 %, notamment au moins 65, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de b6 glucanes) peut être obtenue à partir de la fraction soluble obtenue à l'issue de l'étape (b) (« fraction soluble b »). Ainsi, une fraction isolée de β6-glucanes peut par exemple être obtenue par traitement enzymatique typiquement avec une amyloglucosidase (par exemple d’Aspergillus niger). De façon préférée cependant, la fraction soluble obtenue à l'issue de l'étape (b) (« fraction soluble b ») peut être traitée avec une solution iodée (comme illustré dans les exemples). L'incubation dans la solution iodée est typiquement réalisée à température ambiante (de préférence entre 16 et 24 °C, en particulier à environ 20 °C) (elle est idéalement réalisée sous agitation pour une durée d'au moins 15 min, typiquement entre 20 et 45 min, et de préférence 30 min). Après traitement avec la solution iodée, les fractions solubles et insolubles sont ensuite séparées, typiquement par centrifugation, et la fraction soluble (également appelée « fraction soluble c ») récupérée. Typiquement la centrifugation peut être effectuée à une vitesse de 4000 à 6000 rpm, de préférence environ 5000 rpm pour une durée d'au moins 20 min, notamment entre 20 min et 40 min, de préférence environ 30 minutes. Une solution d'éthanol peut ensuite être ajoutée au surnagent et la solution centrifugée dans les mêmes conditions que précédemment). Au culot est ajoutée une solution concentrée d'acide fort (typiquement une solution d'acide chlorhydrique concentrée à au moins 2N, de préférence à environ 3N), de façon à dissocier les complexes β6-glucane et α-glucane puis précipitée (classiquement avec de l'éthanol ou tout équivalent). Cette seconde méthode permet de récupérer isolément des fractions β6-glucane et a-glucane enrichies (voir également les procédés décrits dans les résultats).

[0065] Comme indiqué précédemment, les données obtenues par les inventeurs ont mis en évidence que la fraction « soluble b », obtenues à partir d'écorces de levure inhibe très significativement l'adhésion des bactéries pathogènes de type AIEC, avec comme conséquence une diminution importante de l'invasion des bactéries AIEC (adhèrent invasive E. coli ) dans les tissus intestinaux et donc de leur pouvoir infectieux. Il a été montré également que les AIEC adhérent aux cellules intestinales en se fixant sur une glycoprotéine riche en mannose connu sous le nom de CEACAM6. Ainsi, des souris transgéniques exprimant la protéine CEACAM6 humaine deviennent très sensibles aux infections à AIEC alors que ce pathotype est généralement peu virulent vis-à-vis des rongeurs. Le traitement des souris infectées avec les souches de levures ou les dérivés de levures identifiés, a permis de diminuer la colonisation du tube digestif par les bactéries AIEC, validant ainsi les données in vitro.

[0066] Sans vouloir être tenu par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la « fraction soluble b », telle que décrite ici comporte des motifs glucosidiques alpha (1-4) et (1-6) ainsi que des motifs mannosidiques qui semblent importants pour la présentation ou la conformation 3D des structures ligantes, de sorte qu'une telle fraction permet d'inhiber efficacement l'adhésion des bactéries sur la paroi intestinale.

[0067] La présente demande se rapporte ainsi à l'utilisation d'une composition présentant une activité avantageuse, telle que décrite ici, et/ou obtenue selon le procédé de la présente divulgation en tant que médicament. En particulier, une composition telle que décrite ici est particulièrement adaptée au traitement ou à la prévention des pathologies ou maladies gastro-intestinales. Ladite composition est typiquement une composition obtenue à partir d'écorces de levure, de préférence du genre Saccharomyces et enrichie en b glucanes (notamment b6 glucanes) et avantageusement également en mannanes. De préférence ladite composition comprend au moins 30 % de β-glucanes et avantageusement au moins 30 % de mannanes.

[0068] Les termes "traitement", ou "traiter" tel qu'ils sont utilisés ici, sont définis comme l'administration d'une composition telle que décrite ici à un patient en ayant besoin, dans le but de guérir, de soulager, de remédier, d'améliorer, et/ou d'affecter la maladie, et/ou tout symptôme de la maladie, notamment une maladie gastrointestinale, un désordre intestinal, ou un trouble fonctionnel intestinal. En particulier, les termes "traiter" ou "traitement" désignent la réduction ou le soulagement d'au moins un symptôme clinique indésirable associé à la maladie, à titre d'exemple la douleur, l'inflammation, les diarrhées, les nausées ou vomissements, la perte d'appétit, ou la fatigue. Les termes « prévenir » ou « prévention » tel qu'utilisés ici sont définis comme l'administration d'une composition telle que décrite ici à un patient en ayant besoin, dans le but d'empêcher l'apparition d'une maladie ou de l'un au moins de ses symptômes et/ou de réduire la gravité de l'un au moins de ses symptômes.

[0069] Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention peuvent être utilisées en nutrition clinique pour le traitement ou la prévention des pathologies décrites ici.

[0070] Par patient on entend typiquement un mammifère et notamment un être humain. Dans certains cas, le patient peut être en rémission et l'administration d'une composition selon la présente demande peut viser à éviter ou limiter les rechutes, notamment réduire la gravité de l'un au moins des symptômes de la maladie ou du trouble fonctionnel en cas de rechute.

[0071] Dans certains modes de réalisation la composition de l'invention est destinée à un usage vétérinaire, typiquement pour la santé animale. Dans de tels modes de réalisation le patient est un mammifère non humain, typiquement choisi parmi les animaux domestiques ou de compagnie (comme le chat ou le chien) ou d'élevage (ruminants, porcs, chèvres, moutons, chevaux, ânes, etc.).

[0072] Les pathologies gastro-intestinales visées par la présente demande peuvent être chroniques ou non, éventuellement associées, ou non, à des diarrhées ou constipations. Elles comprennent typiquement les troubles fonctionnels intestinaux, les maladies intestinales infectieuses, le cancer colorectal et/ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

[0073] Les troubles fonctionnels de l'intestin comprennent notamment le syndrome de l'intestin irritable, la distension abdominale fonctionnelle, la constipation fonctionnelle, la diarrhée fonctionnelle, et tout autre trouble fonctionnel intestinal non spécifié (voir notamment P. de Saussure & D Bertolini ; Rev Med Suisse 2006 ; volume 2.31649, « Troubles fonctionnels intestinaux : apports et limites de la médecine basée sur les preuves »). Les maladies intestinales infectieuses comprennent typiquement les gastroentérites, les toxi-infections alimentaires et/ou les diarrhées, d'origine virale, bactérienne ou parasitaire. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) incluent typiquement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.

[0074] Les compositions de la présente demande sont particulièrement utiles pour lutter contre la colonisation gastro-intestinale par des microorganismes pathogènes, réduire l'adhésion à la muqueuse intestinale, voire renforcer la fonction de barrière de l'intestin vis-à-vis des microorganismes pathogènes. Des tests d'inhibition de l'adhésion de microorganismes pathogènes sur des cultures épithéliales intestinales comme la lignée T84, ou sur des entérocytes obtenus à partir de biopsies intestinales de patients, avec ou sans préincubation avec la composition testée sont notamment décrits dans les résultats de la présente demande ainsi que dans la demande WO 2009/103884 et l'article de Sivignon et al. (IBD, 2015, vol 21 (2) :276-286).

[0075] Comme indiqué précédemment, les pathologies gastro-intestinales infectieuses, mais également les MICI et le cancer colorectal sont généralement associés à la présence de microorganismes pathogènes et/ou à un déséquilibre du microbiote intestinal (dysbiose) lié au caractère invasif d'un microorganisme pathogène spécifique (voir Rahmouni O, Dubuquoy L, Desreumaux P, Neut C. “Enteric microflora in inflammatory bowel disease patients”. Med Sci (Paris). 2016 Nov;32(11):968-973 ; Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H.L. — Pathogenic Escherichia coli), Cuevas-Ramos G et al., « Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells ». PNAS. U S A, 2010, 107, 11537-11542).

[0076] De façon générale, il a été montré dans la présente demande que les compositions ici décrites sont particulièrement utiles pour diminuer l'adhésion et l'invasion des muqueuses gastriques et/ou intestinales et l'inflammation associées, en particulier pour les pathologies listées ci-dessus.

[0077] Les microorganismes pathogènes cibles des compositions ici décrites sont typiquement des pathogènes intestinaux, typiquement des espèces bactériennes de la famille des Enterobacteriaceae (comme Salmonella spp., Klebsiella spp., Serratia spp. ou Escherichia coli ( E . coli), des bactéries de l'espèce Clostridioides difficile ou encore des levures de l'espèce Candida albicans, avantageusement des bactéries dont l'adhésion aux cellules fait intervenir l'adhésine FimH des pili de type 1 . De préférence sont visées les bactéries E. coli associées à la muqueuse coliques (mucosa associated E. coli) et notamment les bactéries E. coli de type AIEC (E. coli adhérents-invasifs), ETEC (E. coli entérotoxigéniques), EIEC (E. coli entéroinvasives), EPEC (E. coli entéropathogènes), EHEC (E. coli entérohémorragiques), EAEC (E. coli entéroaggrégatives), DAEC (E. coli à adhésion diffuse), UPEC (E. coli uropathogènes). Dans certains modes de réalisation, les bactéries E. coli productrices de colibactine sont d'intérêt particulier, notamment chez des patients souffrants d'un cancer colorectal, ayant souffert d'un cancer colorectal, ou à risque de développer un cancer colorectal.

[0078] La présente demande concerne également l'utilisation non thérapeutique d'une composition telle que précédemment décrite sous forme d'un alicament, d'un complément alimentaire ou d'un aliment fonctionnel visant à améliorer ou maintenir le confort intestinal, et/ou à améliorer la flore intestinale (typiquement en limitant la colonisation intestinale par des bactéries commensales pathogènes). Par améliorer ou maintenir le confort intestinal on entend notamment limiter ou prévenir les ballonnements intestinaux, limiter ou prévenir l'aérophagie, et/ou régulariser le transit chez l'homme ou l'animal.

[0079] Une composition selon la présente demande peut comprendre, outre la fraction active extraite d'écorces de levures (constituée par la fraction de polysaccharides pariétaux telle que décrite plus haut et de préférence obtenue selon le procédé décrit), tout excipient, support et/ou adjuvant classiquement utilisé dans le domaine pharmaceutique, ou pour la formulation d'un complément alimentaire, alicament, ou aliment fonctionnel, et qui soit chimiquement compatible avec ladite fraction active (i.e. les β-glucanes, les mannanes et α-glucanes pariétaux de levure, notamment la « fraction soluble b » illustrée en exemple). Par exemple, une composition de l'invention peut comprendre des constituants choisis parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine.

[0080] Par alicament ou nutraceutique ou aliment fonctionnel, on entend un aliment qui contient des ingrédients ayant des effets bénéfiques pour la santé ou capables d'améliorer les fonctions physiologiques en particulier pour la présente, le bien-être digestif. Par complément alimentaire, on entend une denrée alimentaire ayant pour but de compléter le régime alimentaire normal, conformément à la Directive 2002/46/CE. Un complément alimentaire constitue une source concentrée de nutriments ou d'autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique, lorsqu'ils sont pris seuls ou en combinaison, en de faibles quantités. Par denrées alimentaires destinées à une alimentation particulière, on entend un aliment ayant un objectif nutritionnel particulier, destiné à un groupe de population bien défini, tel que les nourrissons, les enfants en bas âge, les sportifs.

[0081] Des adjuvants, véhicules et excipients physiologiquement acceptables sont typiquement décrits dans le "Handbook of Pharmaceutical Excipients", deuxième édition, American Pharmaceutical Association, 1994. Pour formuler une composition pharmaceutique selon la présente invention, l'homme du métier se pourra également avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée européenne ou de la Pharmacopée américaine (USP). Les supports, excipients et adjuvants classiquement utilisés incluent de façon non limitative les solutions salines, les solvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les conservateurs, les agents antibactériens et antifongiques, les agents isotoniques et les agents retardant l'absorption.

[0082] La composition peut être utilisée en tant que médicament ou en tant que principe actif, ou bien dans le cadre d'une utilisation non thérapeutique en tant, typiquement, que complément alimentaire. La formulation et le dosage de la fraction active sont alors adaptés à l'utilisation choisie.

Dans le cadre d'une utilisation thérapeutique, la composition peut être formulée pour une administration par voie orale ou entérale.

Dans le cadre d'une composition pharmaceutique ou d'un complément alimentaire, la composition de l'aliment selon la présente invention peut se présenter sous différentes formes galéniques, telles que la forme liquide ou sous forme de capsule, dragée, pilule, poudre, suppositoire, ou toute autre formulation galénique. En tant qu'aliment fonctionnel, la composition des aliments selon la présente invention peut se présenter sous une grande pluralité de formes d'aliments et de boissons, par exemple des jus ou des préparations à base de lait.

Exemples

[0083] Matériels et Méthodes

[0084] Procédé d'extraction des phospho-peptidomannanes « fraction soluble a » par liqueur de Fehling :

1 . 50 g de levure ont été mis en suspension dans 300 ml_ de tampon citrate 0,02 M (pH 7), stérilisés à l'autoclave à 121 °C, 90 min.

2. Centrifuger à 5000 tours/minute à 4°C, 30 min. Récupérer le surnageant.

3. Mettre le culot en suspension dans 300 ml_ de tampon au citrate 0,02 M, autoclaver à 121 °C, 90 min, encore une fois. Puis, centrifuger à nouveau pour séparer le surnageant et le culot.

4. Combiner les deux surnageants ensemble (X ml_).

5. Mettre le même volume de solution de Fehling (X ml_) dans le surnageant, remuer à 4°C, pendant la nuit entière. Des précipités se forment. Le complexe phospho- peptidomannane-cuivre est gris-bleu. Recueillir le précipité par centrifugation à 5000 tours/minute, 4°C, pendant 30 minutes.

6. Ajouter 100 mL de HCl 3N aux précipités, puis agiter à 4°C jusqu'à dissolution des précipités. Le complexe de cuivre est décomposé, et la solution devient verte.

7. Ajouter 300 mL d'éthanol pour précipiter les phospho-peptidomannanes, remuer à 4°C, pendant la nuit entière. Recueillir le précipité (couleur blanche) par centrifugation à 5000 tours/minute, 4°C, pendant 30 minutes.

8. Les précipités de phospho-peptidomannanes sont dissous dans 50 mL d'eau. Dialyser (MWCO 3500) contre l'eau pendant la nuit entière à 4°C. Ensuite, sécher et lyophiliser les Mannanes dialysés. [0085] Préparation de la solution de Fehling (mélanger les tampons A et B fraîchement utilisés)

Tampon A

1 . 35 g de Cuivre (II) sulfate. 5H2O est dissous dans 300 ml_ de H2O

2. Ajouter 5 ml_ d'acide sulfurique 2 N

3. Ajouter de l'eau à 500 mL Tampon B (Corrosif)

1 . 77 g d'hydroxyde de sodium + 175 g de tartrate de sodium et de potassium 2. Ajouter H2O à 500 mL.

[0086] Reference: Method for Fingerprinting Yeast Cell Wall Mannan (1969) Journal of Bacteriology, v.100, p1175.

[0087] Obtention de la « fraction soluble b » : séparation des b1,3 Glucanes et b1 ,6 Glucanes (avec Glycogène i.e. a-glucanes) par une solution d'acide acétique diluée à chaud :

1 . Récupérer le culot obtenu à partir de 50 g de levures entières ou d'une fraction pariétale de levure(s) (fraction insoluble après extraction au tampon citrate chaud, également appelée « fraction insoluble a ») dans 1 L d'une solution de NaOH 1 N, puis agiter à température ambiante pendant 24 heures, pour éliminer les résidus de phospho-peptidomannanes.

2. Recueillir le culot (fraction insoluble a1 ) après centrifugation à 7000 tours/minute à 4°C pendant 30 minutes. Laver le culot par 1 L d'eau, Centrifuger à nouveau et conservez le culot.

3. Extraire le culot par 800 mL d'acide acétique 0,5 N, agiter à une température de 90°C pendant 3h. Attendre le refroidissement puis centrifuger à 7000 tr/min à 4°C, pendant 20 min. Conserver le surnageant et le culot. Le pellet est extrait à nouveau par 800 mL d'acide acétique 0,5 N, sous agitation à 90°C pendant 3h, suivi d'une nouvelle centrifugation.

4. Répéter l'étape 3 au moins 5 fois jusqu'à ce que 5L de surnageant aient été recueillis (constitué principalement par du glycogène et des bq-Glucanes, également appelé « fraction soluble b »). Neutraliser le surnageant par une solution de NaOH, concentré par évaporateur d'eau. Dialyser ensuite (MWCO 3500) contre de l'eau à 4°C, pendant la nuit entière. La fraction obtenue constitue la fraction soluble b). L'analyse de cette fraction démontre qu'elle comporte des b-6 glucanes, des α-glucanes (glycogène) et des mannanes fortement liés (i.e. non dissociés par l'étape d'extraction à chaud) aux polymères glucaniques.

5. Dialyser le culot (constitué principalement de b3 Glucane) contre de l'eau à 4°C, pendant la nuit entière.

6. Lyophiliser les échantillons dialysés.

[0088] Références :

1 . The structure of b(1->3)-D-glucan from yeast cell walls (1973) Biochem J, v.135, p19.

2. Refinement of the structures of cell-wall glucan of Schizosaccharomyces pombe by Chemical modification and NMR spectroscopy (2004) Carbohydrate Res., v.339, p2255.

[0089] Séparation du glycogène et des β6-glucanes

1 . Une quantité de 500 mg de d'une composition de « fraction soluble b » est ajoutée dans 50 mL d'une solution de travail. Agiter, puis laisser reposer à température ambiante 30 minutes. Des granules rouge-brun se forment (précipités Glycogène- iode).

2. Centrifuger à 5000 rpm, pendant 30 min, à température ambiante. Conserver le surnageant et les granulés. Ajouter 50 mL de solution de travail au surnageant, puis 100 mL d'éthanol, agiter à température ambiante pendant 30 min.

3. Centrifuger à nouveau. Rassembler les granulés (culot 1 , principalement du Glycogène) en une seule fraction. Ajouter 600 mL supplémentaires d'éthanol dans le surnageant, remuer, à température ambiante, pendant 30 minutes. Des granulés jaune-clair se forment.

4. Centrifuger pour recueillir les granulés (culot 2, principalement du b6- glucane).

5. Pour dissocier l'iode du Glycogène, ajouter 100 mL de HCl 3N au culot 1 , remuer jusqu'à ce que le culot 1 soit dissous (solution brune). Ajouter ensuite 300 mL d'éthanol, et remuer pendant 30 min, à température ambiante. Il se forme alors des granulés noir-violet. Centrifuger et conserver le culot. Ajoutez ensuite 100 mL supplémentaire de HCl 3N pour dissoudre la pastille. Ajouter à nouveau 300 mL d'éthanol, et remuer pendant 30 min, à température ambiante de sorte que des boulettes blanches se forment. Centrifuger et conserver les granulés (culot 3, Glycogène).

6. Redissoudre les culots 2 et 3 dans 50 ml_ d'eau, respectivement. Ensuite dialyser contre de l'eau, 4°C, pendant la nuit entière.

7. Lyophiliser les échantillons dialysés.

[0090] Préparation de la solution de travail (iodée) :

1 . 4,35 g d'iode et 43,5 g d'iodure de potassium dans 166,5 mL d'eau 2. Ajouter 10,5 mL d'une solution saturée de CaCl ₂ .

[0091] Reference: Méthodologies of tissue préservation and analysis of the glycogen content of the Broiler chicken liver (2007) Poultry Science, v.86, p.2653.

[0092] Levures utilisées :

CNCM I-3856 : levures vivantes Saccharomyces cerevisiae déposée sous le numéro CNCM I-3856;

LV04 levures entières de distillerie Saccharomyces cerevisiae (collection interne Lesaffre)

Fraction pariétale (écorces) de levure CNCM i-3856 (FP i-3856)

Fraction pariétale (écorces) de levure CNCM I-5268 (FP I-5268).

[0093] Fractions testées, obtenues à partir de compositions de levure(s) entière(s) ou d'écorces (fraction pariétale) de levure(s) : soluble b) β6-glucanes glycogène β3-glucanes phosphates phospho-peptidomannanes (aussi appelée Fehling phospho- peptidomannanes ou « mannanes »). [0094] Protocoles de préincubation (voir figure 2) :

Test d'adhésion : Les essais ont été réalisés sur des cellules T84 ou Caco-2/TC7 ensemencées à 1 ,5x10 ⁵ cellules / puits dans une plaque de 48 puits et incubées pendant 48 heures à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de C02. Les bactéries AIEC LF82 à 1 ,2x10 ⁷ CFU / mL ont été incubées pendant 1 heure, sur un agitateur orbital Stuart® à température ambiante, avec des concentrations croissantes de l'échantillon de levure (rapport 1 :1). Après 48 heures de culture, les cellules ont été infectées par le mélange bactéries/extrait de levure pendant 3 h à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de C02. Les cellules ont été infectées à une multiplicité d'infections de 10 bactéries / cellule. Les taux d'adhésion moyens (provenant d'au moins 3 expériences indépendantes) ont été exprimés sous la forme d'un pourcentage d'adhérence résiduelle, qui est le rapport entre l'adhésion bactérienne en présence de levure et l'adhésion en l'absence de levure est considérée à 100 %. Les barres d'erreur correspondent à l'erreur standard à la moyenne ou SEM.

Test d'invasion : le protocole est identique à celui du test d'adhésion, en revanche après la période d'incubation de 3h, les cellules sont incubées 1 h avec de la gentamycine (100 μg/mL), de façon à éliminer les bactéries extracellulaires et à ne compter que les bactéries invasives.

[0095] Résultats :

[0096] Initialement, toutes les fractions ont été testées dans un protocole d'adhésion sur cellules T84. Des tests complémentaires ont ensuite été effectués sur les cellules Caco-2/TC7 et dans un protocole d'invasion.

[0097] Comme illustré dans la figure 3, la fraction « soluble a » (phospho- peptidomannane) issue de levures entières CNCM I-3856 inhibe significativement l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84. De façon surprenante cependant, la fraction « soluble b » issue de cette même levure entière présente également une activité inhibitrice significative de l'adhésion des bactéries AIEC. [0098] La figure 4 montre que la fraction β3-glucanes phosphorylés, issue de levures entières CNCM I-3856 inhibe également significativement, bien que plus modérément, l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84.

[0099] La figure 5 illustre la comparaison des activités inhibitrices sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84, des fractions « solubles b » obtenues, soit à partir de levures entières (CNCM I-3856), soit à partir de fraction pariétale de cette même levure. Bien que toutes deux présentent une activité inhibitrice significative, la fraction obtenue à partir de la fraction pariétale présente une activité supérieure à celle obtenue à partir de la levure entière (adhésions résiduelles à la dose d'1 mg/mL est de 17% et 42 % respectivement). Ces activités différentes sont corrélées à des compositions différentes de la fraction « soluble b ».

[0100] Afin de vérifier si le résultat obtenu n'était pas lié à une quelconque activité cytotoxique de l'échantillon, un test de cytotoxicité a été mené avec des doses croissantes de la fraction soluble b). Aucun effet cytotoxique n'a été constaté.

[0101] La figure 6 illustre la comparaison des activités inhibitrices sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales T84, des fractions solubles b) obtenues à partir de deux fractions pariétales de levures : CNCM I-5268 ou CNCM I-3856. Une activité inhibitrice très significative est observée pour ces deux fractions. Les pourcentages d'adhésion résiduelle pour des doses égales étant du même ordre, ce résultat suggère très fortement que l'augmentation de l'activité inhibitrice n'est pas directement liée à la souche employée (CNCM I-5268 vs. CNCM I-3856) mais plutôt au procédé d'obtention. Autrement dit, les fractions solubles b) obtenues à partir de fractions pariétales de levures présentent une activité inhibitrice, sur l'adhésion des bactéries AIEC aux cellules épithéliales, fortement supérieure à celle observée pour les fractions solubles b) obtenues à partir de levures entières.

[0102] La figure 7 illustre l'adhésion résiduelle des bactéries AIEC LF82 aux cellules épithéliales T84, en présence de fractions soluble b), glycogène ou bq-glucanes, obtenues à partir de fractions pariétales de levures CNCM I-5268. Les résultats montrent que les bq-glucanes sont moins efficaces que la fraction soluble b) et que la fraction glycogène présente une activité intermédiaire. La fraction soluble b) est la fraction la plus efficace. [0103] La figure 8 montre l'adhésion résiduelle (en pourcentage) des bactéries AIEC LF82 sur les cellules TC7/Caco-2 en présence des fractions de mannanes (fehling mannanes) obtenues à partir de levures entières (CNCM I-3856, ou LV04), solubles b) obtenues à partir de levures entières CNCM I-3856 ou de la fraction pariétale de levure CNCM I-5268. Ces nouveaux résultats confirment les résultats obtenus précédemment avec les cellules T84, à savoir que la fraction soluble b) obtenue à partir d'une fraction pariétale de levure présente l'activité inhibitrice la plus importance.

[0104] La figure 9 illustre des résultats montrant une forte inhibition de l'invasion des cellules TC7/Caco-2 par des bactéries AIEC LF82 pré-incubées avec des doses croissantes de la fraction soluble b) obtenue à partir de fractions pariétales de levures CNCM I-5268.

[0105] Etudes in vivo de l'activité des fractions de levure chez des souris transgéniques CEABAC10 infectées avec la souche de bactéries AIEC LF82.

[0106] La colonisation du tractus intestinal par la souche AIEC LF82 a été réalisée chez des souris transgéniques CEABAC10 exprimant la protéine humaine CEACAM6, agissant en tant que récepteur des bactéries AIEC dans la cadre de la maladie de Crohn.

[0107] Il a été montré précédemment (Sivignon et al. IBD, 2015) que les extraits de levure S. cerevisiae CNCM I-3856 diminuaient la colonisation du colon par la bactérie AIEC LF82 entraînant ainsi une diminution des signes de colite.

[0108] Des résultats préliminaires ont désormais été obtenus avec les nouvelles fractions testées in vitro.

[0109] Le protocole mis en œuvre est illustré en figure 10.

[0110] Brièvement, les fractions de levures ont été administrées oralement une fois par jour du jour -7 au jour 0 et deux fois par jour (à 5 heures d'intervalle) du jour 1 au jour 3. Les fractions ont été solubilisées dans du PBS à une concentration de 25 mg/mL (chaque jour) et une quantité de 0,2mL/souris a été administrée par gavage (5 mg/souris). Du jour -3 au jour +4, les souris ont reçu du DSS 0,5% dans de l'eau de boisson. Au jour -1 , les souris ont été traitées p.o. avec de la streptomycine (5 mg/souris).

[0111] Parallèlement, du milieu de culture LB (Luria Bertani) a été inoculé (au 1/100 ^è ) avec la souche de bactéries AIEC LF82 et incubé à 37°C sous agitation jusqu'à la phase exponentielle de croissance. Après centrifugation, les bactéries ont été concentrées à 2,5x10 ¹⁰ bactéries/mL. Une quantité de 0,2 ml_ a ensuite été administrée par gavage aux souris, soit 5x10 ⁹ bactéries/mL.

[0112] Le poids des souris et les signes de colite ont été suivis les 4 jours suivant l'infection. Les fèces ont été collectées aux jours 1 , 2, 3 et 4 après l'infection pour évaluer la colonisation bactérienne.

[0113] Les souris ont été euthanasiées au quatrième jour après l'infection et l'intestin a été prélevé pour évaluer la colonisation bactérienne associée à la muqueuse (iléon + côlon).

Les fractions testées sont les suivantes :

A : Lot non-traité (n=10) ;

B : Fraction soluble a) de levure entière CNCM I-3856 (n=8);

C : Fraction soluble b) de levure entière CNCM I-3856 (n=8) ;

D : Fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM I-5268 (n=8).

[0114] La figure 11 montre l'estimation du nombre de bactéries dans les fèces de souris 2 et 3 jours post-infection, en fonction de la fraction de levure administrée. Les résultats montrent que la quantité de bactéries dans les fèces est diminuée par 25 en réponse au traitement par la fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM I-5268 par rapport au groupe non traité, ce qui confirme les excellentes propriétés anti-adhésives de cette fraction mises en évidence in vitro en modèle pré-clinique.

[0115] La figure 12 montre la quantification des bactéries AIEC LF82 associées à la muqueuse intestinale chez les souris traitées ou non avec les fractions de levure, 4 jours après infection. Les résultats indiquent l'absence de bactéries chez 100% des souris traitées avec la fraction soluble b) obtenue à partir de fraction pariétale de levure CNCM 1-5268, corroborant ainsi les résultats obtenus dans les fèces.

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