本发明属于基因工程领域， 涉及一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其 应 用。

背景技术

转基因作物是指通过特定方法将来自于动物、 植物、 微生物等来源的目的 基因转移到天然作物中， 从而使作物定向获得某种特性并使之能稳定遗 传， 例 如抗除草剂、 抗虫、 抗逆、 抗病等。 该技术能克服物种遗传壁垒， 改变传统耕 作方式， 大幅度提升作物产量及品质。 第一种转基因作物于 1983年首次研发成 功， 至今已有 35科 120多种植物成功应用转基因技术， 产生了巨大社会经济效 益并在提高耕地利用效率、 减少农药施用及环境污染、 提高人工效率方面产生 了巨大推动作用。

对于转基因作物的研究早在 20世纪 80年代初期就已经开始， 至今已经有 多种转基因作物的研究报道， 涵盖了大部分粮食作物及经济作物， 如水稻、 玉 米、 棉花、 烟草、 番茄、 辣椒、 大豆、 杨树等， 目的基因大部分为抗虫， 抗除 草剂， 抗病， 抗逆等抗性基因。

草甘膦是一种具有广谱灭生性、 内吸传导型除草剂。 广泛用于果园、 胶园、 非耕地、 免耕地中玉米、 大豆、 棉花播前或播后处理， 以及出苗后定向处理， 是全世界除草剂使用量最大的品种之一。 草甘膦具有独特的除草机理， 草甘膦 是植物莽草酸合成途径关键酶 EPSPS的抑制剂， 从而打断植物的莽草酸合成途 径， 植物中的莽草酸含量增加， 植物体所必需的芳香族氨基酸合成减弱或停止 ， 随之植物失绿而死亡。 草甘膦是一种灭生性除草剂， 直接在田间喷施， 会对作 物产生危害。 随着抗草甘膦 EPSPS基因的发现和抗草甘膦作物的培育， 使草甘 膦在田间大量使用成为可能。

草甘膦化学名称 N-磷酸甲基甘氨酸 （N-(phosphonomethyl)-glyeine) ， 结构 式 H02CCH2NHCH2P03H2分子量为 169.1， 常态为白色固体， 熔点 200°C ,230 °C融化分解， 密度 0.5g/cm3不可燃， 常温能稳定储藏。 草甘膦可与碱 （有机或 无机） 生成极易溶于水的盐， 而且又不损失其母体化合物的除草活性， 草甘膦 异丙胺盐是最常用的易容盐， 溶解度达 500g/L， 且不降低草甘膦的毒性。

目前应用最广泛的抗草甘膦转基因棉花是美国 孟山都公司， 抗农达 （草甘 膦） 棉花 （Roundup ReadyCotton) ， 于 1994 年通过环境释放许可， 1997年开 始在主要产棉区推广种植。 已商业化的抗农达棉花含有 CP4- EPSPS 基因。该基 因是从 Agrobacterium spp 中分离出来的对草甘膦不敏感。 草甘膦对 CP4-EPSPS 作用和结合位点与草甘膦对大多数植物中发现 的敏感型 EPSPS的作用和结合位 点是一致的。 总体来看， 虽然 CP4-EPSPS蛋白有 50.1%与传统玉米的 EPSPS 相 似， 但只有 23.3%是完全一致的。 因此， 通过在草甘膦与 PEP (磷酸稀醇式丙酮 酸） 结合区以外的氨基酸序列变化所引起的构象变 化， 可以有效降低对草甘膦 的亲和性 CP4-EPSPS基因插入后， 避开了植物体内原有的 EPSPS系统， 从而使 莽草酸代谢得以正常进行， 产生了对草甘膦的抗性。 目前商业化的抗草甘膦作 物大都采用了 CP4-EPSPS基因。

发明公开

本发明的目的是提供一种含有草甘膦抗性基因 的表达载体及其应用。

本发明所提供的表达载体， 为同时表达草甘膦抗性基因 1和草甘膦抗性基 因 2的环形载体；

所述草甘膦抗性基因 1 基因） 编码的蛋白质 （GR79蛋白） 可为下述 al) 或 a2) ：

al) 氨基酸序列为序列表中序列 1所示的蛋白质；

a2) 将 al) 所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个 氨基酸残基的取 代和 /或缺失和 /或添加， 且与具有草甘膦抗性的蛋白质；

所述草甘膦抗性基因 2 ( 基因）编码的蛋白质（GAT蛋白）可为下述 bl) 或 b2) ：

bl) 氨基酸序列为序列表中序列 2所示的蛋白质；

b2) 将 bl) 所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个 氨基酸残基的取 代和 /或缺失和 /或添加， 且与具有草甘膦抗性的蛋白质。

为了便于蛋白的纯化， 可在由序列表中序列 1或序列 2的氨基酸残基序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上 如下表所示的标签。

标签的序列

上述 a2) 和 b2) 中的蛋白质可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行 生物表达得到。 上述 a2) 和 b2) 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列 3或序列 4所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子 ， 和 /或进行 一个或几个碱基对的错义突变。

进一步， 所述草甘膦抗性基因 1 基因） 为如下 1) 至 3) 中任一所述 的 DNA分子：

1) 编码序列为序列表中序列 3所示的 DNA分子；

2) 在严格条件下与 1) 限定的 DNA分子杂交且编码 al) 所述蛋白质的 DNA 分子；

3) 与 1) 或 2) 限定的 DNA分子具有 90%以上同源性且编码 al) 所述蛋白 质的 DNA分子； 和 /或

所述草甘膦抗性基因 2 基因） 为如下 4 ) 至 6 ) 中任一所述 DNA分子：

4 ) 编码序列为序列表中序列 4所示的 DNA分子；

5 ) 在严格条件下与 4 ) 限定的 DNA分子杂交且编码 b l ) 所述蛋白质的 DNA 分子；

6 ) 与 4 ) 或 5 ) 限定的 DNA分子具有 90%以上同源性且编码 b l ) 所述蛋白 质的 DNA分子。

上述严格条件可为用 6xSSC，0. 5% SDS的溶液，在 65 °C下杂交，然后用 2xSSC，

0. 1% SDS和 l xSSC, 0. 1% SDS各洗膜一次。

其中， 序列 3由 1338个核苷酸组成， 整个序列 3即为 0RF， 编码序列表中 序列 1所示的 GR79蛋白。 序列 4由 441个核苷酸组成， 整个序列 4即为 0RF， 编码序列表中序列 2所示的 GAT蛋白。

在所述表达载体中， 所述草甘膦抗性基因 1 基因） 存在于表达盒 1 中； 所述草甘膦抗性基因 2 基因） 存在于表达盒 2中。

所述表达盒 1中启动所述草甘膦抗性基因 1 基因） 转录的启动子， 以及所述表达盒 2中启动所述草甘膦抗性基因 2 ( 基因） 转录的启动子均为

35S启动子；

在本发明中， 所述 35S启动子的序列具体为序列表中序列 5的第 1-710位 或第 2863-3572位。

所述表达盒 1中终止所述草甘膦抗性基因 1 基因） 转录的终止子， 以及所述表达盒 2中终止所述草甘膦抗性基因 2 ( 基因） 转录的终止子均为

NosT终止子；

在本发明中，所述 NosT终止子的序列具体为序列表中序列 5的第 2370-2846 位或第 4110-4586位。

所述表达盒 1和所述表达盒 2中， 在所述 35S启动子的下游均还包括 Ω序 列。

在本发明中， 所述 Ω 序列具体为序列表中序列 5 的第 717-787 位或第 3579-3649位。

所述表达盒 1中， 在所述 Ω序列和所述草甘膦抗性基因 1之间还包括叶绿 体前导肽序列。

在本发明中， 所述叶绿体前导肽序列具体为序列表中序列 5的第 792-1018 位。

进一步， 所述表达载体中， 所述表达盒 1 的序列具体为序列表中序列 5的 第 1-2846位； 所述表达盒 2的序列具体为序列表中序列 5的第 2863-4586位。

在本发明中， 所述表达盒 1和所述表达盒 2方向相同。

更加具体的， 在本发明中， 所述表达载体的全序列具体为序列表中序列 5。 其中， 序列 5由 15811个核苷酸组成。 含有所述表达载体的重组细胞系或转基因微生 物也属于本发明的保护范 围。

所述表达载体在培育耐草甘膦转基因植物中的 应用也属于本发明的保护范 围。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐草甘膦 转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐草甘膦转基因植物的方 法， 具体可包括如下 B1) 和 B2) 的步骤：

B1) 向目的植物中导入所述表达载体， 得到同时表达所述草甘膦抗性基因 1 和所述草甘膦抗性基因 2的转基因植物；

B2) 从步骤 B1) 所得转基因植物中得到与所述目的植物相比， 草甘膦抗性 增强的转基因植物。

利用所述方法培育得到的耐草甘膦转基因植物 也属于本发明的保护范围。 以上所述的植物均可为双子叶植物或单子叶植 物。

在本发明中，所述植物为双子叶植物一一棉花 ， 具体为棉花品种棉花品种柯 字 312 (Coker312) 。

本发明的又一个目的是提供如下 DNA分子 1和 /或 DNA分子 2。

所述 DNA分子 1为如下 1) 至 3) 中任一所述的 DNA分子：

1) 编码序列为序列表中序列 3所示的 DNA分子；

2) 在严格条件下与 1) 限定的 DNA分子杂交且编码 al) 所述蛋白质的 DNA 分子；

3) 与 1) 或 2) 限定的 DNA分子具有 90%以上同源性且编码 al) 所述蛋白 质的 DNA分子；

所述 DNA分子 2为如下 4) 至 6) 中任一所述的 DNA分子：

4) 编码序列为序列表中序列 4所示的 DNA分子；

5) 在严格条件下与 4) 限定的 DNA分子杂交且编码 bl) 所述蛋白质的 DNA 分子；

6) 与 4) 或 5) 限定的 DNA分子具有 90%以上同源性且编码 bl) 所述蛋白 质的 DNA分子。

上述严格条件可为用 6xSSC， 0.5% SDS的溶液，在 65°C下杂交，然后用 2xSSC， 0.1% SDS和 lxSSC, 0.1% SDS各洗膜一次。

含有所述 DNA分子 1和 /或所述 DNA分子 2的重组载体、 表达盒、 转基因细 胞系或重组菌都属于本发明的保护范围。

附图说明

图 1 为中间载体 pG4ACGR79禾 P pG4AGAT的表达盒图示。 其中， CTP-2 表示拟南芥基因的叶绿体前导肽序列。

图 2为中间载体 pGBIGAT的表达盒图示。

图 3为双价表达载体 pGBIGRGAT的表达盒图示。 其中， CTP-2表示拟南 芥基因的叶绿体前导肽序列。

图 4为转入双价表达载体 pGBIGRGAT的 T1代转基因棉花植株的 PCR鉴 定结果。 其中， M为 DNA分子量标准 Fermentas l301 ; 1： pGBIGRGAT质粒阳 性对照 （引物 1和引物 2 ) ； 2-4为 T1代转基因棉花植株 （引物 1和引物 2 ) ； 5为转入空载体 pBI121的对照棉花植株 （引物 1、 引物 2、 引物 3、 引物 4 ) ； 6 为 pGBIGRGAT质粒阳性对照 （引物 3和引物 4 ) ； 7-9为 T1代转基因棉花植 株（引物 3和引物 4 ) ； 10为未转基因的对照棉花植株 （引物 1、 引物 2、 弓 I物、 引物 4 ) 。

图 5为转入双价表达载体 pGBIGRGAT的 T1代转基因棉花植株的 Western blot鉴定结果。 M: 蛋白分子量标准； 1 : 阳性对照； 2: 转入空载体 pBI121 的 对照棉花植株； 3 : 未转基因的对照棉花植株； 4和 5 : 两个 T1代转基因棉花植 株。

图 6为转入双价表达载体 pGBIGRGAT的 T1代转基因棉花植株的草甘膦抗 性鉴定结果。 A: T1代转基因棉花植株 （喷施草甘膦后第 7天） ； B : 未转基因 的对照棉花植株 （喷施草甘膦后第 7天） ； C: T1 代转基因棉花植株 （喷施草 甘膦后第 30天） ； D : 未转基因的对照棉花植株 （喷施草甘膦后第 30天） 。 实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 pG4AB载体： 记载于 "李根英， 夏兰芹， 夏先春等. Pina和 Pinb融合基因 表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化. 中国农业科学， 2007年 07期"一文， 公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得 。

PBI 121载体： 记载于 "张俊莲， 王蒂， 张金文等. PBI 121载体酶切位点添 加及拟南芥 Na〜+AT+逆向转运蛋白基因表达载体的构建. 分子植物育种， 2006 年 06期" 一文， 公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得 。

农杆菌 GV3101 : 记载于 "肖卫民， 赵名琛， 邹敏等. 拟南芥受伤和接种根 癌农杆菌 GV3101对转录的影响. 农业生物技术学报， 2013年 05期" 一文， 公 众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。

棉花品种柯字 312 ( Coker312 ) ： 记载于 "倪勇祥. 棉花 GhHB基因克隆和 表达初步分析. 华中师范大学， 2007 年， 硕士论文" 一文， 公众可从中国农业 科学院生物技术研究所获得。 实施例 1、 密码子优化型草甘膦抗性基因 和 的获得

由于 基因、 基因来源于土壤微生物总 DNA， 外源基因在不同宿主 内的表达效率及表达稳定性不同， 本发明中的抗性基因 Gim、 需要进行人 工改造。 改造的中心原则是在不影响基因所编码的氨基 酸组成及氨基酸排列顺 序的基础之上， 按照棉花宿主偏爱密码子表对两个基因进行核 苷酸水平上的编 辑， 而后通过生物信息学工具进一步对编辑后的序 列进行加工， 目的是调整基 因总体 GC水平， 优化限制性酶切位点， 去除可能抑制性负调控元件及优化 mRNA 结构提高 mRNA稳定性等。

按照以上原则经过密码子优化后得到的草甘膦 抗性基因 的核苷酸序列 为序列表中序列 3， 编码序列表中序列 1所示的蛋白质； 经过密码子优化后得到 的草甘膦抗性基因 的核苷酸序列为序列表中序列 4，编码序列表中序列 2所 示的蛋白质。 实施例 2、 基因和 基因双价表达载体的构建

为了提高 GR79基因 （序列 3 ) 和 基因 （序列 4 ) 在受体生物中的表达水 平， 发明人在构建重组表达载体时， 在 GR79基因和（ΜΓ基因的 5'端均添加了 Ω 序列， Ω序列如序列表中序列 5的第 717-787位或第 3579-3649位所示。 Ω序列是 衍生于植物病毒衣壳蛋白基因编码区的翻译增 强序列。 启动子均选用 35S启动子， 其序列如序列表中序列 5的第 1-710位或第 2863-3572位所示。终止子均选用 NosT 终止子， 其序列如序列表中序列 5的第 2370-2846位或第 41 10-4586位所示。 另外， 为了获得更高更稳定的草甘膦抗性， 本发明的发明人在 GR79表达盒中 5'起始密码 子 ATG前引入了拟南芥基因叶绿体前导肽序列 （CTP-2 ) 。 CTP-2的序列如序列表 中序列 5的第 792-1018位所示。

携带有 GR79基因和 C r基因的双价重组表达载体 pBIGRGAT 构建具体程序 如下：

( 1 )扩增改造后的 基因 （序列 3 )和 基因 （序列 4 ) ， 并通过 PCR 方法在两基因 5'端和 3 '端分别引入限制性酶切位点 Pst I和 Xho I， 然后克隆于 T 载体 p-EASY (北京全式金生物技术有限公司） ， 分别构建成 基因和 C r基 因的克隆载体 p-EASY/GR79、 p-EASY/GAT。 如下：

a、 以序列表中序列 3所示的 基因为模板， 采用引物 GR79-F和 GR79-R 进行 PCR扩增， 将所得 PCR产物与 T载体 p-EASY相连， 得到重组质粒。 将经测 序表明在 T载体 p-EASY上连入外源基因 " ggCTGCAGC+序歹 lj 3+CTCGAGgg " 的 重组质粒即为 p-EASY/GR79。

GR79-F : 5'-ggCTGCAGC-ATGTCGCATTCCACTTCGCGGTC-3' (下划线部分 为酶切位点 Pst I的识别序列， -后的序列为序列 3的第 1-23位） ；

GR79-R: 5'-ggCTCGAG-CTAATTGTACTCAACGTGGAT-3' (下划线部分为酶 切位点 Xho I的识别序列， -后的序列为序列 3的第 1318-1338位的反向互补序列）。

PCR体系：模板 DNA 1.0 μL ( 200-300 ng)；上下游引物各 0.2 μL ( 50 pmol/L)； dNTPs 2.0 L ( 2.0 mmol/L ) ； lO Buffer 2.0 Taq酶 0.2 μL ( 2.5 U) ； dd¾0 补充至 20μί。 以上各组分的浓度或用量均为相应组分在 PCR体系中的终浓度或终 PCR程序: 94°C预变性 lO min; 94°C变性 15s， 62°C退火 30s， 72°C延伸 lmin， 30个循环； 72°C补充延伸 lO min; 4°C保存。

b、 以序列表中序列 4所示的 基因为模板， 采用引物 GAT-F和 GAT-R进 行 PCR扩增， 将所得 PCR产物与 T载体 p-EASY相连， 得到重组质粒。 将经测序 表明在 T载体 p-EASY上连入外源基因 " ggCTGCAGC+序歹 ij 4+CTCGAGgg" 的重 组质粒即为 p-EASY/GATo

GAT-F: 5'-ggCTGCAGC-ATGATTGATGTGAACCCTATTAAC-3' (下划线部分 为酶切位点 Pst I的识别序列， -后的序列为序列 4的第 1-24位） ；

GAT-R: 5'-ggCTCGAGTCAAGCAATTCTCTTATACATCAA-3' (下划线部分为 酶切位点 X½ I的识别序列，其后的序列为序列 4的第 418-441位的反向互补序列）。

PCR体系：模板 DNA 1.0 μL (200-300 ng)；上下游引物各 0.2 μL ( 50 pmol/L)； dNTPs 2.0 L (2.0 mmol/L) ； lO Buffer 2.0 Taq酶 0.2 μL (2.5 U) ； dd¾0 补充至 20μί。 以上各组分的浓度或用量均为相应组分在 PCR体系中的终浓度或终 用量。

PCR程序： 94°C预变性 lO min; 94°C变性 15s， 61 °C退火 15s， 72°C延伸 30s，

30个循环； 72°C补充延伸 lO min; 4°C保存。

以上 a和 b中， PCR产物的胶回收采用 DNA回收 Kit法 （Axygen, 用于小量 回收） ：

1)切下含有目的 DNA条带的胶块， 置于一个 1.5mL微量离心管中。

2)加入 500μί溶胶 DE-A (约是胶块体积的 3倍） ， 室温或 70°C溶解胶块。

3)加入 250μί溶胶 DE-B混匀后， 加入柱子中， 8000r/min离心 45s， 弃上清。

4)加入 500μί Wl buffer, 8000r/min离心 45s， 吸弃上清。

5)加入 500μί W2 buffer, 8000r/min离心 45s， 吸弃上清； 重复洗涤 2次。 12000r/min离心 2min， 去除柱子中多余的液体。 置于 37°C温箱干燥 15~20分钟。

6)加入 60°C预热的 30μί无菌 ddH ₂ 0， 60°C水浴 5min， 12000r/min离心 2min， 回收上清备用。

以上 a和 b中， 将回收产物与 T载体连接方法具体如下：

在一灭菌的 1.5mL离心管中， 加入 O. l g载体 DNA及等摩尔量的外源 DNA， 再加入 1μί10χΤ4 DNA Ligase buffer和 1U的 T4 DNA Ligase (MBI公司产品） ， 加适量超纯水， 使总体积为 10μί。 混匀后， 于 16°C连接过夜。

以上 a和 b中， 质粒 DNA转化大肠杆菌方法具体如下：

1) 用无菌吸头取 30μί大肠杆菌 DH50C感受态细胞到 1. 5mL微量离心管中， 加入待转化的 DNA l(Tl00ng， 轻轻混匀， 冰上放置 30min。

2) 42 °C循环水浴中热激 90s。 快速将离心管转移到冰浴中 lmin， 使细胞冷 却。

3) 每管加 500μί LB液体培养基， 37 °C 180rpm预表达培养 45min。

4) 取 200μί上述培养物转移到含相应抗生素的 LB固体培养基上 （如要检 测 cx-互补， 可在菌液中加入适量的 X-Gal和 IPTG) ， 用一无菌的涂布器将菌液 均匀涂满整个平板表面。

5) 将平板置于 37°C培养 16h后可出现菌落，挑取单克隆子在含有相应抗 生 素的 5mLLB液体培养基中 37°C 250rpm过夜培养。 提取培养物的质粒酶切、 PCR 和测序鉴定， 正确的克隆子用 30%甘油 -80°C保存备用。

(2) 中间表达载体的构建

用限制性内切酶 Pst I和 Xho I双酶切步骤 （ 1 ) 获得的 P-EASY/GR79载体， 将切得的目的片段（大小约为 1300bp)与经过同样双酶切的 pG4ACB载体的骨架 大片段相连， 得到重组质粒。 将经/ ¾ l和 ¾oI双酶切初步鉴定正确 （得到大 小约为 1300bp和 3200bp 的两个目的条带） 的重组质粒送样测序。 将经测序表 明将 pG4ACB载体的酶切位点 Pst I和 Xho I之间的小片段替换为 "C+序列 3"所 示的 基因的重组质粒命名为 pG4ACGR79。 中间载体 pG4ACGR79的表达盒图 示如图 1所示。

其中， pG4ACB载体是在 pG4AB载体的基础上通过添加拟南芥叶绿体靶向� �� (CTP-2) ， 经过如下改造获得的：

①人工合成拟南芥叶绿体靶向肽 （CTP-2) ， 其序列来源于 Swiss- Prot P05466 (AR0A_ARATH, 序列 5 的第 792-1018位）， 核酸的人工合成由上海 生物工程有限公司完成。 通过 PCR方法分别向 CTP-2序列上游添加 Nsil酶切位 点， 下游添加 ¾ I与 Xho I酶切位点， 引物序列如下：

CTP-F: 5'-ggATGCATggcgcaagttagcagaatctgc-3' (大写碱基为 Nsil的识别 序列， 该序列的第 7-30位为序列 5的第 792-815位） ；

CTP-R: 5'-ggCTCGAGggCTGCAG-tccgccgtggaaacagaagacatg-3' (大写喊基依 次为 Xho I和 Pst I的识别序列， -后的序列为序列 5的 995-1018位的反向互 补序列） 。

②用限制性内切酶 Nsil和 Xho I双酶切步骤（1)获得的 CTP-2序列 PCR产 物和中间载体 PG4AB, 分别获得大小约为 230bp的酶切片段与 4500bp的载体骨 架大片段。

③将步骤 2获得的两个片段相连， 的到重组质粒中间载体 pG4ACB。

重组质粒中间载体 PG4ACB 的结构描述为： 将 pG4AB载体的酶切位点 Nsil 和 Xho I之间的小片段替换为 "序列 5的第 794-1018位 +CTGCAGcc"所示 DNA片 段的重组质粒。

用限制性内切酶 Pst I和 Xho I双酶切步骤 （ 1 ) 获得的 p-EASY/GAT载体， 将切得的目的片段（大小约为 440bp)与经过同样双酶切的 pG4AB载体的骨架大 片段相连， 得到重组质粒。 将经/ ¾ l和 ¾oI双酶切初步鉴定正确 （得到大小 约为 440bp和 3000bp的两个目的条带） 的重组质粒送样测序。 将经测序表明将 PG4AB载体的酶切位点 和 ¾oI之间的小片段替换为 "C+序列 4"所示的 基因的重组质粒命名为 pG4AGAT。 中间载体 pG4AGAT的表达盒图示如图 1所 不。

其中， 质粒 DNA的小 ：提取具体如下:

所涉及溶液的配制：

Solution I ： 50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tri s-Cl (pH8. 0)

10mmol/L EDTA (pH8. 0)

Solution II 0. 2mol/L NaOH

1% SDS

使用前现配现用

Solution III: 每 lOOmL含： 5 mol/L KAc 60. 0ml

冰乙酸 11. 5mL 蒸熘水 28. 5mL

1) 取单菌落于 5mL带有相应抗生素的液体 LB培养基中， 37 °C、 250r/min 培养过夜 （农杆菌在 YEB培养基中， 于 28 °C、 250r/min振荡培养） 。

2) 将 1. 5mL菌液倒入微量离心管中，用台式冷冻离心机 于 4 °C、 12000r/min 离心 lmin， 弃上清 （可重复一次使菌液总量达到 3mL) 。

3) 加入 ΙΟΟμί用冰预冷的 Solution I， 重悬沉淀。

4) 加入 200μί新配制的 Solution II，快速颠倒离心管 6次，冰上放置 6min。

5) 加入 150μί用冰预冷的 Solution III， 轻轻混匀， 冰上放置 6min。

6) 用台式冷冻离心机于 4°C、 12000r/min离心 10min， 将上清转移到另一 离心管中。

7) 加等体积酚、 酚：氯仿（1 : 1)、 氯仿抽提， 振荡混匀， 用台式冷冻离心机 于 4°C、 12000r/min离心 10min， 将上清转移到另一离心管中， 重复一次。

8) 向上清中加入 2倍体积的无水乙醇， 混匀后室温放置 5min， 用台式冷冻 离心机于 4°C、 13000r/min离心 10min， 弃上清， 用 70%乙醇洗涤 2次， DNA沉 淀空气中干燥 lOmin; 用 20μί dd¾0溶解质粒 DNA， 加入 Ιμί lOmg/mL RNA酶， 37 °C处理 30min后使用或于 _2(TC贮存。

以上进行/ ¾ 1和^¾? 1双酶切， 具体如下：

在一灭菌的 1. 5mL离心管中， 加入以下成分： DNA 1. 0μ _{δ ;} 10χ限制酶缓冲 液 3 μΙ _; 限制性内切酶 Pst \ 2. 5U; 限制性内切酶 ¾o I 2. 5U; 超纯水补充 至 30μί。 轻弹管外壁以混匀反应物， 置于酶反应适当温度并按所需时间进行温 育。 反应完成后， 直接进行凝胶电泳分析。

( 3 ) 基因和 基因双价表达载体的构建

a、 中间载体 pGBIGAT的构建

用限制性内切酶 ^ /^ΠΙ和 ^ oR I酶切步骤 （2 ) 获得的中间载体 pG4AGAT， 将切得的目的片段（大小约为 1700bp )与经过同样双酶切的 pBI 121载体的骨架 大片段相连， 得到重组质粒。 将经^ Λ^ ΙΙΙ和^ oR I双酶切初步鉴定正确 （得到 大小约为 1700bp和 l lOOObp的两个目的条带） 的重组质粒送样测序。 将经测序 表明将 pBI 121载体的酶切位点 Hind III和 ^ oR I之间的小片段替换为序列表中 序列 5 的第 2861-4586位所示 DNA片段的重组质粒命名为 pGBIGAT。 中间载体 PGBIGAT的表达盒图示如图 2所示。

以上进行^ ί III和^ oR l双酶切， 具体如下：

在一灭菌的 1. 5mL离心管中， 加入以下成分： DNA 1. 0μ _{δ ;} 10χ限制酶缓冲 液 3 μΙ _; 限制性内切酶 Pst \ 2. 5U; 限制性内切酶 ¾o I 2. 5U _; 超纯水补充 至 30μί。 轻弹管外壁以混匀反应物， 置于酶反应适当温度并按所需时间进行温 育。 反应完成后， 直接进行凝胶电泳分析。

回收 DNA片段， 与 PBI 121载体连接并转化大肠杆菌， 方法同上。

b、 6^7 基因和 6¾ 基因双价表达载体 pGBIGRGAT的构建

用限制性内切酶 ^ /^ ΠΙ酶切步骤 （2 ) 获得的中间载体 pG4ACGR79， 将切 得的目的片段 （大小约为 2860bp ) 与经过同样酶切的步骤 a中获得的 pGBIGAT 载体的骨架大片段相连， 得到重组质粒 （重组质粒中 基因和 基因的表 达盒方向相同） 。 将经 'Λ^ III酶切初步鉴定正确 （得到大小约为 2860bp 和 13000bp的两个目的条带） 的重组质粒送样测序。 将经测序表明在 pGBIGAT载体 的酶切位点 Hind III处插入序列表中序列 5的第 15810-2846位所示 DNA片段的 重组质粒命名为 pGBIGRGAT。双价表达载体 pGBIGRGAT的表达盒图示如图 3所示。

其中， 回收 DNA片段， 与 pGBIGAT载体连接并转化大肠杆菌， 方法同上。 双价表达载体 pGBIGRGAT的全序列如序列表中序列 5所示。 其中， 基 因（序列 3 )和 基因（序列 4 )存在于两个方向相同的独立的表达盒中。 GR79 表达盒为序列 5的第 1-2846位； 自上游到下游依次由 35S启动子 （序列 5的第 1-710位） 、 Ω序列 （序列 5的第 717-788位） 、 叶绿体前导肽序列 （序列 5的 第 792-1018位） 、 6^7 基因 （序列 5的第 1026-2363位， 即序列 3 ) 禾 P NosT 终止子 （序列 5的第 2370-2846位） 。 GAT表达盒为序列 5的第 2863-4586位； 自上游到下游依次由 35S启动子 （序列 5的第 2863-3572位） 、 Ω序列 （序列 5 的第 3579-3649位） 、 基因 （序列 5的第 3663-4103位， 即序列 4 ) 和 NosT 终止子 （序列 5的第 4110-4586位） 。 实施例 3、 和 6¾Γ转基因棉花的获得及鉴定

一、 转化农杆菌感受态细胞

取 -70 °C保存的农杆菌 GV3101于含有 50μ /ιΛ利福平的 ΥΕΒ固体培养基平 板划线， 28 °C培养 48h。 挑单菌落接种于 5mL YEB液体培养基中， 220rpm， 28 °C 振荡过夜培养。 按照 1/10 (体积比） 的接菌量， 将菌液转接于 lOOmL YEB液体 培养基中 （1L三角瓶） ， 28 °C， 220rpm, 振荡培养至 0D600 =0. 6〜0. 8。 转入无 菌 500mL的离心管， 4500rpm离心 15min， 弃上清液。 加入 50mL预冷的 10% (体 积分数）甘油（高压蒸汽灭菌）， 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min。 4°C， 5000 rpm 离心 15min， 弃上清液， 重复甘油悬浮细胞一次。 加入 200μ1预冷的含 1M山梨 醇 （0. 24μπι过滤除菌） ， 轻轻悬浮。 按照 20μ1体积分装于灭菌的 1. 5mL离心管 中后， 立即用液氮冷冻， -80 °C保存备用。

取 l g左右实施例 2构建得到的双价表达载体 pBIGRGAT加入到 20μ1 GV3101 感受态细胞中混匀， 冰浴 5min; 加入 2mm电击杯 （尽量避免气泡产生） ， 2500V 电击转化； 电击后迅速加入 800μ1 YEB液体培养基， 28 °C， 180rpm诱导培养 5h; 取出后涂在含 50μ /ιΛ卡那霉素和利福平的 ΥΕΒ 固体培养基平板上， 28 °C培养 到形成单菌落。挑取单克隆接种于 5mL含有 50μ /ιΛ卡那霉素和利福平的的 ΥΕΒ 液体培养基， 质粒小量提取后经 PCR鉴定正确 （采用引物为 GR79-F/GR79-R和 GAT-F/GAT-R, 具体序列见上文， 分别得到大小约为 1356bp和 454bp 的目的条 带为阳性） 的重组农杆菌命名为 GV3101/pBIGRGAT。

将重组农杆菌 GV3101/pBIGRGAT的单克隆菌液按照 1/100 的体积比接菌于 20mL含有 50μ /ιΛ卡那霉素和利福平的 ΥΕΒ液体培养基，过夜培养至 0D600=1. 0， 30%甘油保存于 -80 °C备用。

其中， YEB 液体培养基的配方为： 每升培养基含有牛肉浸膏 5g; 酵母浸膏 lg; 蛋白胨 5g; 蔗糖 5g; MgS0 ₄ -H ₂ 0 0. 5g _; pH7. 0。

YEB固体培养基的配方为： 每升 YEB液体培养基添加 12-15g琼脂粉。

采用同上的方法将 PBI 121空载体转入农杆菌 GV3101 ,所得重组农杆菌命名 为 GV3101/pBI 121。

二、 农杆菌介导转化获得棉花转基因植株

1、 农杆菌的培养及转化菌液的准备

挑取步骤一获得的含有 pBIGRGAT载体的重组农杆菌 GV3101/pBIGRGAT的单 克隆子，接种于 50mL 含 50mg/L卡那霉素以及 50mg/L利福平的 YEB液体培养基 中， 28 °C 250rpm过夜培养。 吸取过夜培养菌液 2mL接种于 200mL YEB液体培养 基（含卡那霉素 50mg/L、 链霉素 50mg/L) 中 （置于 1L三角瓶中） ， 28 °C 250rpm 过夜培养， 直至 0D ₆ 。。=0. 8〜1。 采用同上的方法获得重组农杆菌 GV3101/pBI 121 的转化菌液。

2、 植株选择准备与转化

转化受体： 棉花品种柯字 312 ( Coker312 ) 。

选取生长至 2-4 片真叶期的棉花无菌幼苗下胚轴为农杆菌菌液 侵染对象， 将步骤 1 获得的重组农杆菌 GV3101/pBIGRGAT 的转化菌液或重组农杆菌 GV3101/pBI 121 的转化菌液通过根癌农杆菌侵染下胚轴的方法 转入棉花品种柯 字 312 ( Coker312 ) 无菌幼苗下胚轴。

经侵染过的组织置于愈伤组织诱导培养基中培 养至愈伤组织生成， 后将愈 伤组织转入分化培养基上进行分化培养， 最后将分化出的胚性愈伤组织在胚状 体萌发成苗培养基上培养至获得再生植株。

其中， 愈伤组织诱导培养基的配方为： ； MS+ IAA 2. 0 mg/L + KT 0. 1 mg/L， 添加葡萄糖 3%(w/v)， 琼脂粉 5g/L;

分化培养基的配方为： 1/2 MS+IBAO.5mg/L+蔗糖 3%(w/v)，添加琼脂粉 5g/L; 胚状体萌发成苗培养基的配方为 MS + IAA 4. Omg/L + KT 0.1 mg/L, 添加 葡萄糖 3%(w/v)， 琼脂 5g/L。

3、 TO代种子收获及 T1代筛选

种子成熟后将 TO代种子混收， 播种于大田， 使用卡那霉素筛选抗性植株。 卡那霉素筛选三次， 第一次为子叶期， 用毛笔将 lmg/mL的卡那霉素溶液涂抹于 子叶上， 于 3 日后检查子叶是否有黄色斑点出现， 无黄色斑点的植株即为转 基因候选植株。 第二次筛选在 2 片真叶时期， 对第一次筛选获得的候选植株 的真叶涂抹 lmg/mL的卡那霉素溶液， 无黄色斑点出现的植株即为转基因候选植 株。 第三次筛选在 5〜6 片真叶时期， 对第二次筛选获得的候选植株的真叶涂抹 lmg/mL的卡那霉素溶液， 无黄色斑点出现的植株即为转基因候选植株。

4、 T1代转基因阳性植株 PCR检测

对于转入双价表达载体 PBIGRGAT的 T1代转基因植株的卡那霉素抗性苗， PCR 检测 基因 （序列 3) 和 6¾ 基因 （序列 4) 。 以双价表达载体 pBIGRGAT为 模板作为阳性对照。 实验同时设置转入 PBI121空载体的棉花植株， 以及未转基 因的棉花品种柯字 312 (Coker312) 植株作为对照。

(1) 改良 CTAB法提取棉花基因组

1) 提取缓冲液配制

1L提取缓冲液含： Tris-HCl (pH8.0) 0· 1M; EDTA (pH8.0) 0.1M _; NaCl

1.5M; PVP40 (w/v) 2%； CTAB (w/v) 2%。

以上溶液各自溶解后混合， 定容到 1L (121°C高压蒸汽灭菌 20min) ， 临用 前加 2% β-巯基乙醇。

2) 称取 0.3g幼嫩棉花叶片放入 2mL离心管里， 加入 4mm直径的钢珠， 液氮速 冻后， 放置于 SPEX公司 Genegrid geno2000研磨仪上振荡 60s， 加入 lmL预热 70°C 提取缓冲液， 颠倒混匀。

3) 将离心管置于 70°C水浴中 6(Tl20 min; 加等体积氯仿颠倒混匀， 4°C， 12000 rpm离心 10 min, 将上清转移到另一离心管中。

4)加入 0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管 混匀，室温静置 30 min (-20°C冷冻 lh效果更好） 。 用毛细管将絮状 DNA挑出， 用体积分数 70%的酒精 洗涤 2次， 再用体积分数 100%的酒精洗涤 1次， 室温干燥 DNA。

5) 力口 200μί灭菌 dd 0， 65 °C水浴使 DNA完全溶解；

6)加入 20μί无 DNA酶的 RNA酶 (lOmg/mL) ， 37°C保温 1小时， 用等体积的酚： 氯仿： 异戊醇 （25: 24： 1， V/V) 抽提 1〜2次， 将上清转移到另一个离心管中； 7) 加 10% (体积分数） 的 3MNaAc (pH5.2) ， 2倍体积的冰预冷的无水乙醇， 混匀后放置 10分钟。 此时将形成一团粘稠透明的絮状 DNA沉淀， 用毛细管轻轻钩 出转移到 1.5mL的离心管中。 8)力口 lmL70%的酒精洗涤絮状 DNA沉淀 2次， 12000rpm离心 5 min， 去掉上清， 再用体积分数 70%、 100%的酒精各洗沉淀一次， 在空气中使核酸沉淀干燥；

9) 加 50μί灭菌 dd 0， 65°C水浴使 DNA完全溶解， 电泳检测 DNA质量， _20°C 保存备用。

(2) PCR扩增目的片段

以步骤 （1) 获得的基因组 DNA为模板， 采用引物 1和引物 2针对 堪因进 行 PCR扩增， 采用引物 3和引物 4针对 GA 7基因进行 PCR扩增。

基因扩增引物：

引物 1: 5'- CCCTGGAGCAAGGCTACGGAGTAC-3 ' (序列 3的第 25-48位） ； 引物 2: 5'- GTGGTCCCCACTGGCTGGCC TGGGT-3' (序列 3的第 1154-1178位的反 向互补序列） 。

基因扩增引物：

引物 3: 5'- GATGTGAACCCTATTAACGCCGA-3 ' (序列 4的第 7-29位） ； 引物 4: 5'-AATTCTCTTA TACATCAAAA TATGA-3' (序列 4的第 411-435位的反向 互补序列） 。

反应体系 (50μ1)： Taq酶 0· 5μ1; 10χ扩增缓冲液（内含 15mMMg ²⁺ ) 5·0μ1; dNTP (4种 dNTP混合物 lOmMeach) 3. Ομΐ; 上下游引物（ ΙΟμπιοΙ/L) 各 Ι.ΟμΙ; 模板 DNA 2. Ομΐ; 无菌水补充至 50μ1。

PCR扩增程序: 94°C预变性 lOmin; 94°C变性 30s， 70°C退火 30s， 72°C延伸 45s， 15个循环， 每循环退火温度降 1°C _; 94°C变性 30s， 58°C退火 30s， 72°C延伸 45s， 25个循环。

结果显示， 转入双价表达载体 PBIGRGAT的 T1代转基因植株的卡那霉素抗性 苗， 以引物 1和引物 2进行 PCR扩增均可扩增出大小约为 1154bp的目的条带， 以引 物 3和引物 4进行 PCR扩增均可扩增出大小约为 429bp的目的条带， 与预期结果一 致。而转入 PBI121空载体的棉花植株， 以及未转基因的棉花柯字 312 (Coker312) 植株均未扩增出相应的目的条带。 部分植株的鉴定结果如图 4所示。

5、 T1代转基因阳性植株的 Western blot检测

在确定外源抗草甘膦基因稳定整合在棉花基因 组后， 本发明发明人进一步 对选定的目标植株进行了 Western blot分析， 目的是确定该外源基因在植物体 内能够被正确翻译成蛋白质参与植物代谢调控 ， 使转基因植物表现草甘膦抗性。

提取经步骤 4鉴定阳性的 T1代转基因植株的总蛋白， 进行 PAGE电泳， 后进行 Western blot分析， 采用一抗为抗 GR79蛋白的多抗 （采用序列 1所示的 GR79蛋白 作为免疫原， 免疫小鼠后制得的多抗） ， 二抗为羊抗鼠 IgG抗体 （美国 KPL公司 产品， 其产品目录号为 01-18-01) 。 实验同时设置原核表达纯化蛋白 （序列 1 所示的 GR79蛋白） 为阳性对照； 转入 PBI121空载体的棉花植株为空载对照， 未 转基因的棉花品种柯字 312 (Coker312) 作为野生型对照。

结果如图 5所示， GR79蛋白预测分子量 48KD, 经步骤 4鉴定阳性的 T1代转基 因植株在 48KD的位置出现了预期的目的杂交条带， 说明外源基因 6^7^在转基因 棉花植株内可以被正确翻译为目标蛋白质。 而空载对照和野生型对照均未有目 的条带出现。 实施例 4、 和 转基因棉花的草甘膦抗性鉴定

从实施例 3经 PCR和 Western blot鉴定均为阳性的 T1代 和 6¾7ff基因棉花 中随机选取 10个株系 （编号 1-10 ) ， 将种子全部播种于海南南繁基地。 正常培 养至 4-5片真叶期进行田间草甘膦喷施试验。 实验同时设置转入 PBI 121空载体的 棉花植株为空载对照， 未转基因的棉花品种柯字 312 ( Coker312 ) 作为野生型对 照。 每个株系保证样本量不低于 60株。

喷施草甘膦异丙胺盐溶液（农达 ®)稀释至 1/200 (绝对浓度为 0. 205g/100ml 草甘膦异丙胺盐） ， 喷施量为 3升 /亩。 草甘膦处理 7天后， 开始观察各株系的植 株表型， 30天后， 统计各样本植株的存活率。

结果在喷施草甘膦后第 7天， 非转基因棉花 （野生型） 出现叶片变黄失绿、 植株萎蔫、 生长缓慢甚至停滞等现象， 尤其在植株生长点部位出点坏死， 新叶 不能生长 （图 6中 B ) 。 随着时间推移， 受害程度不断加深直至整株死亡 （图 6中 D， 在喷施草甘膦后第 30天） 。 相比较而言， 双价转基因植株中少数植 株不同程度出现叶片失绿和植株萎蔫， 但总体程度较非转基因植株轻， 大部分 转基因植株表现出比较好的草甘膦抗性， 没有出现明显受害症状（图 6中 A和 C) 。 而空载对照与野生型对照结果基本一致。

草甘膦处理 30天后各样本植株的存活率统计结果如表 1所示， 非转基因棉花 (野生型）全部死亡， 而 10个 T1代 和 6¾ 7ff基因棉花株系， 其存活率均在 84% 以上， 远高于野生型对照。 空载对照同野生型对照一样， 植株全部死亡。

表 1 草甘膦处理 30天后各样本植株的存活率统计结果

转基因株系 处理幼苗数 成活幼苗数 成活率 （％) 量 （棵） 量 （棵）

1 65 63 96. 92%

2 63 63 84. 13%

3 66 57 86. 36%

4 62 60 96. 77%

5 66 66 100%

6 60 58 96. 67%

7 68 68 100%

8 63 61 96. 83%

9 61 57 93. 44%

10 63 61 96. 83% 野生型 60 0 0%