本发明涉及辅助生殖技术中接受体外受精治疗 患者胚胎的评估与用于移植的优质胚 胎的选择， 具体是对治疗中经时差成像技术观察的胚胎依 据分裂行为的异常模式进行等 级划分， 筛选胚胎进行移植的方法。

背景技术

体外受精-胚胎移植 （IVF-ET ) 已成为不孕症治疗的常规手段。 传统的方法往往依赖 于同时移植多个胚胎以提高妊娠率， 但多胚胎移植导致多胎妊娠率增高， 使母亲和胎儿 的医源性并发症风险增加， 可行的办法是建立一种有效的胚胎评估方法在 卵裂期选择优 质胚胎进行移植。 传统的卵裂期静态形态学胚胎筛选体系是利用 原核形态， 第三天胚胎 卵裂球数目、 对称性、 碎片多少等对胚胎进行评估和选择。 但该方法存在评估指标单 一， 主观性大， 无法准确判断胚胎发育潜能的缺点。 时差技术 （time-lapse ) 是一种瞬时 曝光连续拍摄的成像技术， 利用该技术能获取胚胎发育各个阶段的形态以 及各事件发生 的特定时间， 并将所有记录照片合并成动态视频， 实现对胚胎发育过程的全程监控。 而 目前已有的利用时差技术的形态动力学胚胎评 估筛选方法是利用胚胎发育过程中的卵裂 时间（如受精至五细胞形成的时间）、 卵裂同步性（如从三细胞形成至四细胞形成的 时间） 等指标对胚胎进行评估。 但是该方法存在如下缺点： 形态动力学指标受多种因素， 如培 养系统、 病人年龄、 卵子成熟情况、 授精方式、 促排方案等的影响。 仅有少数指标得到 一致认可， 且同一指标的范围存在一定波动。 因此形态动力学指标在各实验室无法通 用。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足， 提供一种根据分裂行为对体外受精治疗胚胎进 行评 估的等级分类方法。

为了达到上述目的， 本发明提供的技术方案为；

所述根据分裂行为对体外受精治疗胚胎进行评 估的等级分类方法是将受精后第一天 的胚胎移入胚胎培养基中， 于培养箱的时差系统摄像头下观察受精后第一 至五天的胚胎卵 裂情况， 设置摄像头拍摄频率为 5-15min/次； 然后按如下步骤对胚胎进行等级分类： ( 1 ) 将胚胎分裂行为分为如下八种：

①正常分裂； ②分裂异常； ③不等大； ④卵裂球碎裂； ⑤大碎片； ⑥异常胞质运动； ⑦发育阻滞； ⑧分裂次序紊乱；

( 2) 根据各分裂行为对囊胚形成的影响程度将胚胎 的上述八种分裂行为归纳为如下 两类：

I类分裂行为： 正常分裂、 异常胞质运动、 不等大、 大碎片对囊胚形成的影响程度小 于 50%;

II类分裂行为：发育阻滞、 分裂异常、 分裂次序紊乱、 卵裂球碎裂对囊胚形成的影响 程度大于等于 50%;

( 3) 根据步骤 （1 ) 和步骤 （2) 将胚胎分为 A、 B、 C、 D、 E、 F六个等级：

A级： 第一次 （出现在受精后第一至二天， 从一细胞至二细胞） 、 第二次 （出现在受 精后第二至三天， 从二细胞至四细胞） 、 第三次卵裂 （出现在受精后第三至四天， 从四细 胞至八细胞） 均发生正常分裂行为的胚胎；

B级： 第一、 二、 三次卵裂中至少发生一次除正常分裂行为外的 I类分裂行为 （异常 胞质运动、 不等大、 大碎片） 的胚胎；

C级： 第一、 二次卵裂发生 I类分裂行为， 第三次卵裂发生 II类分裂行为 （发育阻 滞、 分裂异常、 分裂次序紊乱、 卵裂球碎裂） 的胚胎；

D级： 第一次卵裂发生 I类分裂行为， 第二次卵裂时其中一个细胞（部分）发生 II类 分裂行为的胚胎；

E级： 第一次卵裂发生 I类分裂行为， 第二次卵裂时两个细胞（全部）均发生 II类分 裂行为的胚胎；

F级： 第一次卵裂发生 II类分裂行为的胚胎；

其中， A级胚胎为最优选择的用于移植的胚胎； 若没有 A级胚胎则选择 B级胚胎用于 移植； 若没有 A级和 B级胚胎， 则选择 C级胚胎用于移植； D、 E、 F级胚胎不被用于移植。

上述技术方案中， 所述正常分裂是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 一次有 丝分裂形成 2个直径相差 1/5以下的子细胞及占原有细胞体积 10%以下的散在、 无细胞核 碎片；

分裂异常是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 一次有丝分裂形成 3个或 3个 以上直径相差 1/5以下的子细胞；

不等大是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 分裂后形成的 2个子细胞直径相 差 1/5以上；

卵裂球碎裂是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 分裂形成的子细胞碎裂成 4-10 块直径为原有细胞直径 1/3 以下的无细胞核碎片或分裂过程中产生占原有 细胞体积 50%以上的散在、 无细胞核碎片；

大碎片是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 分裂过程中产生两个直径相差 1/5以下的子细胞及 1-2块直径为子细胞直径 1/3至 1/2的无细胞核碎片或占原有细胞体 积 10%至 50%的散在、 无细胞核碎片；

异常胞质运动是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 分裂过程中胞膜出现凹陷 的卵裂沟但卵裂球不分裂现象或出现胞质扭曲 、 旋转等不正常运动；

发育阻滞是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 卵裂球发育停滞， 不再继续进 行有丝分裂形成相应的子细胞；

分裂次序紊乱是指胚胎的分裂情况为： 受精后一至五天内， 分裂的先后顺序发生紊 舌 L; 正常情况下， A细胞经过一次有丝分裂形成 Al、 A2两个子细胞， A1细胞经过有丝分 裂形成 Al l及 A12两个子细胞， A2细胞经过有丝分裂形成 A21及 A22两个子细胞， 以此类 推； 分裂次序紊乱， A细胞经过一次有丝分裂形成 Al、 A2两个子细胞， A1细胞经过有丝 分裂形成 Al l及 A12两个子细胞， 在 A2细胞尚未分裂时， Al l细胞或 A12细胞提前有丝分 裂， 形成相应的两个子细胞， 随后 A2细胞发生有丝分裂形成相应的两个子细胞。

与现有技术相比， 本发明的有益效果为：

( 1 ) 利用时差成像技术对人类胚胎进行动态观察的 数据， 对体外受精的人类卵裂期 胚胎出现的分裂异常行为进行了收集、 描述及分类， 用于对体外受精治疗胚胎进行评估。

( 2 ) 根据分裂行为对胚胎发育潜能影响的严重程度 对分裂行为进行分类， 将对囊胚 形成的影响程度小于 50%的分裂行为归为一类， 定义为 I类分裂行为； 将对囊胚形成的影 响程度大于等于 50%的分裂行为归为一类， 定义为 II类分裂行为。

( 3 ) 结合不同的卵裂时期及分裂行为在胚胎中的涉 及范围， 建立了一种根据分裂行 为对体外受精治疗胚胎进行评估的等级分类方 法。

总之， 本发明的目的在于在不干涉人类胚胎细胞也不 破坏人类胚胎细胞的情况下， 利 用时差成像技术对人类胚胎进行动态观察的数 据， 对体外受精的人类卵裂期胚胎出现的 分裂异常行为进行了收集及详细的描述， 并分为 7种类型。 根据异常分裂的严重程度、 异 常分裂行为累及的卵裂球范围以及异常分裂行 为的发生时期， 建立了一种定性的， 主观 性小的胚胎等级分类方法， 能有效的筛选出具有最佳囊胚发育潜能的卵裂 期胚胎。

具体实施方式

实施例 1 将该方法运用于临床接受体外受精治疗患者胚 胎的评估， 胚胎在体外培养过程中运 用常规内置于培养箱中的时差成像系统进行观 测。 设置拍摄频率为 5min/次， 曝光时间 70ms/次。 受精后第一天将拟选用胚胎均移入备好 G1. 5胚胎培养基的 3x3/4x4W0W培养皿 培养。 将含胚胎的 W0W培养皿置于时差系统摄像头下， 在受精后第五天使用卵裂行为学胚 胎等级分类模型 （图 1 ) 对胚胎进行评估。

在 345个正常受精胚胎中， 第一、 二、 三次卵裂发生正常分裂行为的有 96个， 被评 为 A级胚胎； 第一、 二、 三次卵裂中至少发生一次除正常分裂行为外的 I类分裂行为的有 102个， 被评为 B级胚胎； 第一、 二次卵裂发生 I类分裂行为， 第三次卵裂发生 I I类分裂 行为的有 37个， 被评为 C级胚胎； 第一次卵裂发生 I类分裂行为， 第二次卵裂时其中一 个细胞 （部分） 发生 I I类分裂行为的有 39个， 评为 D级胚胎； 第一次卵裂发生 I类分裂 行为， 第二次卵裂时两个细胞 (全部)均发生 I I类分裂行为的有 19个， 被评为 E级胚胎； 第一次卵裂发生 I I类分裂行为的有 52个， 评为 F级胚胎。 A、 B、 C、 D、 E、 F级胚胎囊胚 形成率 （囊胚形成是评价胚胎发育潜能的指标， 在受精后第五天形成囊胚表明胚胎发育潜 能佳， 未形成囊胚表明胚胎发育潜能差） 分别为 94. 8%、 85. 3%、 48. 6%、 51. 3%、 47. 4%、 21. 2%, 有递减趋势 （P<0. 05， 有统计学意义） ， 能区分胚胎的发育潜能。

实施例 2

将该方法运用于临床接受体外受精治疗患者用 于移植的优质胚胎的选择， 胚胎在体 外培养过程中运用时差技术进行观测。 在受精后第五天使用卵裂行为学胚胎等级分类 模 型 （图 1 ) 对胚胎进行评估及选择。 将入组患者随机分为分裂行为学组及常规形态 学组。 两组培养箱环境均为 37 °C， 6%C0 ₂ 。

分裂行为学组使用本发明所述的方法， 采用临床常规使用的内置于培养箱中的时差 观测系统， 设置拍摄频率为 5min/次， 曝光时间 70ms/次。 受精后第一天将拟选用胚胎均 移入备好 G1. 5胚胎培养基的 3x3/4x4W0W培养皿培养。 将含胚胎的 W0W培养皿置于时差系 统摄像头下， 连续拍摄至移植之前。 在移植当天使用卵裂行为学胚胎等级分类方法 （图 1 ) 对胚胎进行评价及选择。

常规形态学组对胚胎进行常规培养， 受精后第一天将拟选用胚胎均移入备好 G1. 5 培 养基的培养皿培养。 在移植当天使用常规形态学方法对胚胎进行评 价及选择。

分裂行为学组共入选 20名患者， 1人取消移植， 共 19人参与实验分析。 19人共有 194 个正常受精胚胎， 平均每人 10. 2 个正常受精胚胎。 在 194 个正常受精胚胎中， 第一、 二、 三次卵裂发生正常分裂行为的有 54个， 被评为 A级胚胎； 第一、 二、 三次卵裂中至 少发生一次除正常分裂行为外的 I类分裂行为的有 57个， 被评为 B级胚胎； 第一、 二次 卵裂发生 I类分裂行为， 第三次卵裂发生 II类分裂行为的有 33个， 被评为 C级胚胎； 第 一次卵裂发生 I类分裂行为， 第二次卵裂时其中一个细胞 （部分） 发生 II类分裂行为的 有 22个， 评为 D级胚胎； 第一次卵裂发生 I类分裂行为， 第二次卵裂时两个细胞 （全部） 均发生 II类分裂行为的有 10个， 被评为 E级胚胎； 第一次卵裂发生 II类分裂行为的有 18个， 评为 F级胚胎。 每位患者选择 2-3枚最优胚胎进行移植， 选择胚胎时由 A、 B、 C、 D、 E、 F级依次进行， 在没有 A级胚胎的情况下才考虑选择 B级胚胎， 以此类推。 在选择 用于移植的 39枚胚胎中， 29枚为 A级胚胎， 9枚为 B级胚胎， 1枚为 C级胚胎。 在 19名 参与实验分析的患者中， 11人移植的 2-3枚胚胎均为 A级胚胎， 6人移植至少 1枚 A级胚 胎， 2人无 A级胚胎可移植， 移植 B级或 C级胚胎。

常规形态学组共入选 20名患者， 1人取消移植， 共 19人参与实验分析。

胚胎移植后四周评价临床结局。 与常规形态学胚胎选择方式相比， 在每组各 20例 (均 有 1人取消移植）的情况下， 分裂行为学胚胎等级评估方法帮助能提高胚胎 植入率（69.2% vs. 42.1%, P<0.05, 有统计学意义） 与临床妊娠率 ( 78.9% vs. 57.9%, Ρ〉0· 05， 无 统计学意义） 。 两组参与者的基线特征和临床结局见表 1。

表 1 两组参与者的基线特征和临床结局 参数 分裂行为学组 (n=20) 常规形态学组 (η=20) Ρ值 女方年龄 （岁） 28.4±3· 5 28.5±3· 9 0.883 女方 BMI (kg/m ² ) 21.4±2· 3 21.1±1· 8 0.678 不孕年限 （年） 4.3±2· 9 3.8±2· 1 0.524

Mil卵子数 （枚） 15.2±4· 2 12.3±4· 3 0.047 移植胚胎数 2.1±0· 2 2.0±0 0.324 优质胚胎数 2.1±0· 2 1.9±0· 3 0.086 基础 FSH (IU/L) 6.5±1· 5 6.6±1· 5 0.834 基础 LH (IU/L) 4.7±1· 8 4.7±1· 9 0.943 基础 E ₂ (pg/mL) 41.7±13· 9 38.6±11· 5 0.458 取消率 (%) 5.0 (1/20) 5.0 (1/20) 1.000 临床妊娠率 （%) 78.9 (15/19) 57.9 (11/19) 0.163 植入率 (%) 69.2 (27/39) 42.1 (16/38) 0.017 多胎妊娠率 （%) 73.3 (11/15) 45.5 (5/11) 0.149 流产率 (%) 0 (0/15) 9.1 (1/11) 0.234