本发明涉及医药领域， 尤其是涉及一种葡萄籽多酚提取物及其在制备 老 年性痴呆症药物中的应用。

说

背景技术

老年性痴呆症又称阿尔茨海默病 （Alz书heimer's disease, 以下简称 AD)， 是一种进行性发展的神经退行性疾病。 临床一般表现为认知和记忆功能不断 恶化， 日常生活能力进行性减退， 并有各种神经精神症状和行为障碍。

老年性痴呆症目前仍没有有效的治疗药物， 目前许多国家研究的重点除 在以往主流化学药物的治疗研究之外， 也把更多的关注投向天然产物活性物 质替代医学领域， 公开见诸研究报道的天然物质有银杏、 白藜芦醇及芦丁等， 也有关于葡萄籽的报道， 但对葡萄籽用于治疗 AD的有效活性成分并未有深 入研究。

葡萄籽多酚提取物的主要成分多酚是葡萄精华 所在， 在现代医学中可以 预防衰老、 提高机体免疫力； 具有延缓皮肤衰老和美容作用； 可以缓解部分 过敏症状， 目前主要当作抗氧化、 抗心血管疾病、 延缓衰老等症状使用。

研究表明， 其中葡萄籽多酚提取物中多酚的单体和低聚体 的溶解性更好， 在人体内的生物利用度更高， 但目前的技术制备得到的葡萄籽多酚提取物中 多酚低聚体的含量均较低。 发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较高单体和低 聚体含量的葡萄籽多酚提 取物及其在制备预防或治疗老年性痴呆症药物 中的应用， 解决了现有技术中 制备得到的葡萄籽多酚提取物中单体和低聚体 含量低的问题， 并表明具有较 高单体和低聚体含量的葡萄籽多酚提取物可在 制备预防或治疗老年性痴呆症 药物中应用且具有显著疗效。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是： 一种葡萄籽多酚提取物， 主 要通过膜分离技术制备获得， 包括儿茶素、 表儿茶素、 没食子酸和表儿茶素 没食子酸酯， 所述儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯三者的总质量 百 分比 8%， 所述没食子酸的质量百分比 2%。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中， 所述膜分离技术制备所述葡萄籽多酚 提取物的过程包括：

步骤 A: 将葡萄籽通过极性溶剂 -水溶液进行提取， 得到提取液； 步骤 B: 将提取液浓缩回收极性溶剂， 获得提取浓缩液；

步骤 C: 对提取浓缩液加适量水进行水沉， 对水沉得到的液体进行过滤 或超滤， 得到滤液；

步骤 D: 对滤液采用大孔树脂分离吸附， 采用有机溶剂-水溶液解吸附， 获得解吸液；

步骤 E: 将解吸液超滤或纳滤， 浓缩干燥， 得到所述葡萄籽多酚提取物。 在本发明的葡萄籽多酚提取物中，步骤 A中，所述极性溶剂-水溶液为 75% 的乙醇-水溶液， 所述葡萄籽与 75%乙醇-水溶液之间的质量比为 1 : 4。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中 ， 步骤 C中， 所述提取浓缩液中加入 4-8 倍的水进行水沉。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中 ， 步骤 C中， 水沉所用时间 8小时。 在本发明的葡萄籽多酚提取物中， 步骤 D 中， 所述有机溶剂-水溶液为 65%-75%的乙醇-水溶液。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中 ， 步骤 D中， 所述大孔树脂为 D101大 在本发明的葡萄籽多酚提取物中 ， 步骤 D中，采用 1.5-2倍大孔吸附树脂 的柱体积的有机溶剂-水溶液进行解吸附。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中， 步骤 D中， 每克干燥的大孔树脂上样 量为 0.6g-0.625g步骤 C中得到的滤液。

在本发明的葡萄籽多酚提取物中， 所述儿茶素、 表儿茶素、 没食子酸和 表儿茶素没食子酸酯以单体或相互间形成的低 聚体形式存在于葡萄籽多酚提 取物中。

本发明还提供一种上述葡萄籽多酚提取物在制 备预防或治疗老年性痴呆 症药物中的应用。

实施本发明的葡萄籽多酚提取物及其在制备预 防或治疗老年性痴呆症药 物中的应用， 具有以下有益效果： 本发明的葡萄籽多酚提取物的成分可以预 防或治疗老年痴呆症且疗效显著， 老年性痴呆的主要病因是大脑内 β淀粉 样蛋白的沉积， 直接导致大脑皮质动脉和小动脉的血管淀粉样 变性， 最终导 致脑机能的衰退。 本发明证明了具有较高含量单体和低聚体多酚 的葡萄籽 多酚提取物对 AD双转基因模型 β淀粉样蛋白的沉积小鼠体外及体内试验， 具有良好的作用，因此该葡萄籽多酚提取物可 在制备预防或治疗老年性痴 呆症药物中应用且疗效显著。 附图说明

图 1为本发明葡萄籽多酚提取物制备过程的流程� �意图；

图 2为本发明葡萄籽多酚提取物药效学技术路线� �示意图；

图 3为本发明葡萄籽多酚提取物 ^f 药效学研究中实验实施例 5中 Morris水 迷宫示意图。 具体实施方式

为了解决现有技术中所存在的采用热浓缩传统 工艺制备葡萄籽多酚， 耗 能高， 产品中单体和低聚体含量较低的问题， 本发明的创新点在于： 提供了 一种通过膜分离技术制备得到的具有较高含量 单体和低聚体的葡萄籽多酚提 取物， 并证明具有较高含量单体和低聚体多酚的葡萄 籽多酚提取物在用于制 备预防或治疗 AD药物的应用中疗效显著。

下面结合附图和实施例， 对本发明葡萄籽多酚提取物及其在制备预防或 治疗老年性痴呆症药物中的应用的具体实现作 进一步说明。

本发明的葡萄籽多酚提取物的成分可以有效预 防或治疗老年痴呆症， 老 年性痴呆的主要病因是大脑内 β淀粉样蛋白的沉积，直接导致大脑皮质动脉 和小动脉的血管淀粉样变性， 最终导致脑机能的衰退。 本发明提供了一种葡 萄籽多酚提取物， 并证明了葡萄籽多酚提取物对 AD双转基因模型 β淀粉 样蛋白的沉积小鼠体外及体内试验， 具有良好的作用， 提示该活性物质可 在预防或治疗老年性痴呆症药物中应用且具有 显著疗效。

1、 葡萄籽多酚提取物的成分

葡萄籽多酚提取物中含有一类有着特殊分子结 构的多酚类物质， 包括 儿茶素、 表儿茶素、 表儿茶素没食子酸酯和没食子酸等， 其中儿茶素、 表儿 茶素和没食子酸为单体， 表儿茶素没食子酸酯是由表儿茶素和没食子酸 形成 的二聚体的酯。 上述单体和二聚体相互之间可通过 C4—C8或 C4—C6键的连 接方式缩合成多酚类聚合体物质， 按其聚合度的不同， 又分为低聚体多酚 (OPCs , 聚合度为 2-4)和高聚体多酚 (PPC)。

在本发明中， 采用以膜分离高新技术为主的特殊工艺制备得 到的葡萄籽 多酚提取物产品具有较高的单体和低聚体成分 含量。 其中单体和低聚体的溶 解性更好，在人体内的生物利用度更高， 因此抗 AD的活性更强。其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯三者的总质量 百分比 8%， 没食子酸的质量 百分比 2%。

葡萄籽多酚提取物的主要成分具体如下：

( 1 ) 单体， 包括

Cat)

(2) 二聚体， 主要包括表儿茶素没食子酸酯 （ECG), 还有儿茶素和 儿茶素缩合成的二聚体 B2, 也有表儿茶素缩合成的二聚体 B3, 当然也有儿 一一赘述。

(3) 三聚体、 四聚体及以上结构： 包括儿茶素和表儿茶素缩合形成的三 聚体， 当然还包括儿茶素、 表儿茶素、 表儿茶素没食子酸酯和没食子酸缩合形 成的其它三聚体、 四聚体及以上的结构， 这里不再一一赘述。

2、 制备上述葡萄籽多酚提取物的方法

如图 1所示， 本发明中葡萄籽多酚提取物主要的工艺路线如 下：

1) 将葡萄籽原料用极性溶剂 -水溶液加热提取， 得到提取液；

2) 将提取液浓缩回收极性溶剂， 获得提取浓缩液；

3) 通过水沉以及过滤或超滤得到含葡萄籽多酚提 取物的滤液和因水沉形 成的废弃物；

4) 将滤液用大孔吸附树脂进行层析分离， 葡萄籽多酚提取物被吸附在大 孔吸附树脂上， 不吸附的物质丢弃掉；

5) 用有机溶剂 -水溶液流经大孔吸附树脂进行解吸附，获得� �葡萄籽多酚 提取物的解析液， 非解析的物质丢弃掉；

6) 将解析液超滤或纳滤处理， 将滞留物丢弃掉；

7) 经干燥后， 获得含较高含量单体和低聚体的干燥的葡萄籽 多酚提取 制备实施例 1 :

葡萄籽多酚提取物的制备过程包括：

步骤 A: 将葡萄籽原料放入多功能提取罐里进行动态循 环， 加入 75%乙 醇 -水溶液进行提取， 得到提取液； 葡萄籽原料和 75%乙醇 -水溶液之间的质量 比是 1 : 4；

步骤 B: 将提取液浓缩回收乙醇， 获得提取浓缩液； 步骤 C: 对提取浓缩液加 6倍体积的水进行水沉 8小时， 采用工业板框 对水沉得到的液体进行过滤， 得到滤液；

步骤 D: 对滤液采用 D101大孔树脂分离吸附， 采用 1.5倍柱体积的 65% 乙醇-水溶液解吸附， 获得解吸液， 其中每克干燥的大孔树脂上 0.625克葡萄 籽原料的滤液， 解吸时乙醇-水溶液的流速为 1.5倍柱体积 /小时；

步骤 E: 对解吸液超滤， 滤过分子量 10-20万， 浓缩干燥， 得到葡萄籽多 酚提取物， 其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯总质量百分比 为 8.5%, 没食子酸的质量百分比为 2.1%。

制备实施例 2:

葡萄籽多酚提取物的制备过程包括：

步骤 A: 将葡萄籽原料放入多功能提取罐里进行动态循 环， 加入 75%乙 醇 -水溶液进行提取， 得到提取液； 葡萄籽原料和 75%乙醇 -水溶液之间的质量 比是 1 : 4；

步骤 B: 将提取液浓缩回收乙醇， 获得提取浓缩液；

步骤 C: 对提取浓缩液加 4倍体积的水进行水沉 8小时， 对水沉得到的 液体进行超滤， 滤过分子量 10-20万， 得到滤液；

步骤 D:对滤液采用 D101大孔树脂分离吸附，采用 1.75倍柱体积的 75% 乙醇-水溶液解吸附， 获得解吸液， 其中每克干燥的大孔树脂上 0.615克葡萄 籽原料的滤液， 解吸时乙醇-水溶液的流速为 1.5倍柱体积 /小时；

步骤 E: 对解吸液超滤， 滤过分子量 10-20万， 浓缩干燥， 得到葡萄籽多 酚提取物， 其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯总质量百分比 为 9.12%, 没食子酸的质量百分比为 2.8%。

制备实施例 3 :

葡萄籽多酚提取物的制备过程包括：

步骤 A: 将葡萄籽原料放入多功能提取罐里进行动态循 环里， 加入 70% 甲醇 -水溶液进行提取， 得到提取液； 葡萄籽原料和 70%甲醇-水溶液之间的质 量比是 1 : 4；

步骤 B: 将提取液浓缩回收甲醇， 获得提取浓缩液； 步骤 C: 对提取浓缩液加 8倍体积的水进行水沉 10小时， 对水沉得到的 液体进行超滤， 滤过分子量 10-20万， 得到滤液；

步骤 D: 对滤液采用 D101大孔树脂分离吸附，采用 2倍柱体积的 70%乙 醇-水溶液解吸附， 获得解吸液， 其中每克干的大孔树脂上 0.6克葡萄籽原料 的滤液， 解吸时乙醇-水溶液的流速为 2倍柱体积 /小时。

步骤 E: 对解析液纳滤， 滤过分子量为 1-5万， 浓缩干燥， 得到所述葡萄 籽多酚提取物， 其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯总质量百分比 为 9.8 %, 没食子酸的质量百分比为 2.01%。

制备实施例 4:

葡萄籽多酚提取物的制备过程包括：

步骤 A: 将葡萄籽原料放入多功能提取罐里进行动态循 环里， 加入 70% 甲醇 -水溶液进行提取， 得到提取液。 葡萄籽原料和 70%的甲醇水溶液的质量 比是 1 : 4；

步骤 B: 将提取液浓缩回收甲醇， 获得提取浓缩液；

步骤 C: 对提取浓缩液加 8倍体积的水进行水沉 12小时， 对水沉得到的 液体进行超滤， 滤过分子量 10-20万， 得到滤液；

步骤 D: 对滤液采用 D101大孔树脂分离吸附，采用 2倍柱体积的 70%甲 醇-水溶液解吸附， 获得解吸液， 其中每克干的大孔树脂上 0.6克葡萄籽原料 的滤液， 解吸时甲醇-水溶液的流速为 2倍柱体积 /小时。

步骤 E: 对解析液纳滤， 滤过分子量为 1-5万， 浓缩干燥， 得到所述葡萄 籽多酚提取物， 其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯总质量百分比 为 10.15 %, 没食子酸的质量百分比为 2.1%。

通过上述制备方法得到的葡萄籽多酚提取物中 儿茶素、 表儿茶素和表儿 茶素没食子酸酯三者的总质量百分比可达到 8%， 没食子酸的质量百分比 2%， 比现有技术中的儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯、 没食子酸四 者的总质量百分比仅达到 2-4%左右要高很多。

3、 葡萄籽多酚提取物的药效学研究 现代的研究表明， AD的病理变化主要为弥散性和对称性脑萎缩。 β淀粉 样蛋白的沉积造成神经原纤维缠结 (NFT), 神经细胞外的神经变性斑以及胆碱 能神经元缺失等。

众所周知， 药效学研究， 其疾病动物模型的选择至关重要。 目前， 国内 用于老年性痴呆的主要药效学研究的动物模型 和方法主要有 3类： 1 )胆碱能 损伤致痴呆模型： 造模方法有基底前脑注射鹅蒿蕈氨酸（ΙΒΟ)� �东莨菪碱等 药物， 穹隆一海马伞切等等。 该模型在国内较早出现， 也是目前应用最广的 痴呆经典模型， 主要用于 AD的药物有效性筛选和评价。 2 )老化致痴呆模型： 由于 AD的形成与大脑的老化有直接的关系， 因此， 老化致痴呆模型也是 AD 的重要研究模型： 造模方法有 D-半乳糖皮下等药物注射致脑老化模型， 或快 速老化动物等。 3 ) 慢性脑缺血及高胆固醇致痴呆模型： 由于现代研究认为， AD的形成与慢性脑缺血和高胆固醇血症有一定� ��关系， 因此， 应用慢性脑缺 血致痴呆模型和高胆固醇致痴呆模型进行痴呆 的药物有效性筛选和评价， 也 有一定的意义。

上述的几种模型， 总的来说， 均只是反映 AD的某一部分的病理变化， 不能全面反映和模拟老年性痴呆病理、 生化、行为学等方面的全部特征的 AD 动物模型。 另外， 以注射或介入的方法人为制造类似痴呆的病理 模型， 不能 完全反映 AD疾病发生发展的自然生理病理过程，用于目� ��药物对于 AD的治 疗评价勉为其难。 目前国外的研究多采用转基因小鼠的 AD模型。 如较为常 用的 APP V717F 转基因小鼠， 是根据分子遗传学和胚胎学理论和技术， 利用 显微注射的方法， 将 ΑΡΡ基因或基因片断整合入小鼠的基因组中， 使得小鼠 脑部表达人 ΑΡΡ基因。通过 ΑΡΡ蛋白在大脑中积累， 从而造成小鼠 AD转基 因动物模型。 其病理表现为脑内 ΑΡΡ水平明显增多， 出现明显的海马萎缩， 海马、 皮层出现淀粉样 β蛋白沉积， 斑块密度增加， 胶质细胞增生， 神经炎 斑， 突触丢失等。 行为上表现为学习记忆功能受损。 在病理学、 免疫学、 行 为学等方面均获得了较理想的结果， 明显优于其他非转基因模型。 并且， 存 在一个由认知功能损害向较典型 AD进展的过程， 特别适合发挥中医药多靶 点作用进行早期干预和动态观察。 无疑是一种迄今为止较为理想的、 比较全 面的 AD疾病动物模型。

本发明主要的技术线路如下： （如图 2所示）

1.体外试验

PC12细胞室大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株� �具神经内分泌细胞的一 般特征， 因其具可传代特点， 广泛应用于神经生理和神经药理学研究。 本试 验研究采用 A β _{25 35} 致毒 PC12细胞株进行下述的研究，观察葡萄籽多酚� �取物 的作用：

1) 对细胞活性和细胞凋亡率的影响；

2) 对细胞线粒体跨膜电位的影响；

3) 对细胞乳酸脱氢酶 （LDH) 漏出率的影响。

2.体内试验

采用国际上现时通用的 APP/PS双转基因模型小鼠， 对葡萄籽多酚提取物 的作用进行下述研究观察。 受试药物分别为高含量低聚体的葡萄籽多酚提 取 物（Η组）、 高含量高聚体的葡萄籽多酚提取物（高聚组） ， 阳性对照组 （阳性 药物安理申） 分别以 100mg/kg/d及 10mg/kg/d 的剂量灌胃给药， 空白对照组 (正常组） 及模型对照组 （模型组） 分别以等量的蒸馏水或溶媒给药。 各给 药组动物连续给药 3个月。 实验包括：

1) 行为学的 Morri s水迷宫实验、 跳台实验；

2) 小鼠脑组织的病理形态学观察；

3) 小鼠大脑皮质与海马中 β 淀粉样前体蛋白（ΑΡΡ)的表达；

4) 检测小鼠海马 p_tau (Ser404位点） 的表达；

5) 荧光定量 PCR检测 PS-1的表达。

实验实施例 h 葡萄籽提取物的分离鉴定

采用瓦里安 Polaris Amide-C18色谱柱， 规格 250x4.6mm， 以 5mg/ml 10ul 乙腈-水系统， 能很好的分离儿茶素、 表儿茶素等几个单体物质， 能保证样品 检测的可靠性。

经本发明工艺优选出的试验样品， 其中儿茶素、 表儿茶素、 表儿茶素没 食子酸酯保留时间分别为 25.658分钟， 32.842分钟， 33,237分钟， 三者占质 量百分数为 8.15%, 没食子酸的为 18.560分钟， 质量百分比为 2.2%。 下述的 效果试验研究用药组 H组均以此样品。 高聚组的儿茶素、 表儿茶素、 表儿茶 素没食子酸酯三者占质量百分数为 2.32%, 没食子酸的质量百分比为 0.51%。

实验实施例 2: A β ₂₅ _ ₃₅ 致毒？ 12细胞株体外试验一 111½ ^1¥-?1双染色流式 细胞仪检测细胞调亡率

取对数生长期的 PC12细胞， 用 0.25%胰蛋白酶消化后， 以 5X10 ⁵ /ml细胞密 度接种 10 ml于 25 ml培养瓶中。 24 h后细胞贴壁，弃上清，继续培养 24h。用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞， 吹打成单细胞悬液， 将细胞转入离心管， 在 4°C冰箱预冷后 离心 1000r/min， 5 min, 弃上清液； 加 PBS将细胞打匀， 1000r/min， 2min， 弃上 清， 重复此步骤一次； 收集并调整细胞浓度为 lxl0 ⁶ /ml制备单细胞悬液， 用 4°C 预冷 70%乙醇打匀 1 h _; PBS洗 2次，将等体积的细胞悬液和 PI染液及药物混合， 4°C 放置 30 min; 混合液过 300目尼龙网除去杂质;送流式细胞仪检测， 以激发波长 488 nm测定。

试验分为空白对照组、 模型对照组、 阳性对照组、 H组和高聚组。 细胞培 养 24h后， 模型组加入终浓度为 20 mol/L的八|3 ₂₅₃₅ 继续培养 24h; 葡萄籽 多酚受试药物的配制， 系以儿茶素表儿茶素二聚体 B2为参照计算葡萄籽多酚 提取物的摩尔浓度。 葡萄籽多酚组先加入 20μ M的葡萄籽多酚预处理 1 h， 再加入终浓度为 20 mol/L的 Αβ ₂₅₃₅ 培养 24 h。 阳性对照组同理处理。 空白 对照组不添加 Αβ ₂₅₃₅ 及药物， 结果见表 1:

表 1: 葡萄籽多酚对于 Αβ ₂₅₃₅ 致毒的神经 PC12细胞的细胞凋亡率的影响

高聚组 5 20 μ M 45.62±8.35 说明： 与模型对照组对比， ρ〈0.001。

结果表明， Η组与阳性对照组能降低 Αβ ₂₅₃₅ 致毒的神经 PC12细胞的细胞凋 亡率， 提示对于细胞具有较好的保护作用， 且 Η组明显优于高聚组。

实验实施例 3: Αβ ₂₅ _ ₃₅ 致毒 PC12细胞株体外试验-流式细胞仪检测受试药 对细胞线粒体跨膜电位的影响

取对数生长期的 PC12细胞，用 0.25%胰酶将细胞制成 2 10 ⁵ 个/1^ 悬液， 置于 6孔培养板内， 细胞贴壁后， 齐上清， 按实施例 2处理细胞。 药物 (配制 方法同前)作用 24 h后， 消化， 离心收集， 用 PBS 轻轻重悬细胞， 加入终浓 度为 ΙΟμπιοΙ * L— ¹ 的罗丹明（ Rhl23) 于 20_25°C避光孵育 20 min, 用流式细 胞仪检测荧光强度， 激发波长为 488 nm， 发射波长为 535 nm。 试验分组及用 药同上。 四个组别荧光强度结果见表 2:

表 2: 葡萄籽多酚对于细胞线粒体跨膜电位的影响

说明： 与模型对照组对比， 林， p<0.01； *, ρ<0.05ο

结果表明，相比于 Αβ ₂₅₃₅ 致毒的神经 PC12模型对照组细胞线粒体跨膜电位 的降低， 处理中 10分钟及处理后 10分钟的 Η组与阳性对照组能提高细胞线粒 体跨膜电位， 细胞线粒体具有一定的保护作用。

实验实施例 4: Αβ ₂₅ _ ₃₅ 致毒 PC12细胞株体外试验-受试药对乳酸脱氢酶 (LDH) 漏出率的影响

取对数生长期的 PC12细胞，用 0.25%胰酶将细胞制成 2 10 ⁵ 个/1^悬液， 置于 6孔培养板内。按实施例 2处理细胞， 药物 (配制方法同前)作用 24 h后， 取细胞上清液， 按 LDH测定试剂盒说明书操作， 比色法于 450 nm处测定吸光 度并计算 LDH释放量。 LDH漏出率以细胞培养液吸光值（细胞培养液吸 光度值 +细胞匀桨吸光度值） X 100表示。 试验分组及用药同上。 LDH释放量结果见 表 3。

表 3 : 葡萄籽多酚组对于 A β _{25 35} 致毒的神经 PC12细胞 LDH漏出率的影响

说明： 与模型对照组对比， *， ρ<0. 05

结果表明，相比于 Α β _{25 35} 致毒的神经 PC12模型对照组， Η组能明显降低 LDH 漏出率， 提示能减轻神经细胞损伤， 且 Η组明显优于高聚组。

实验实施例 5 : 体内试验-行为学的 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫水池以四个等距离点均分为 4个象限 （第 I、 II、 III、 IV 象限）， 在第 II象限位于池壁和圆心中间， 放置一个直径为 10cm的平台 （如 图 3 )， 向水池中加水， 水面高出站台表面约 l-2cm， 水温 25士 1 °C， 注入奶 粉 500g， 混匀， 使水成不透明的乳白色， 达到动物视觉无法辨别池内有无平 台的目的， 并使计算机软件系统跟踪小鼠的活动。 实验在隔音的房间内进行， 水池位置、 光源位置及强度等各种实验条件在整个实验过 程中保持不变， 以 供小鼠来定位平台位置。

实验时按照第 I、 III、 IV象限的顺序在如图 3标示处将小鼠面向并靠近 池壁放入水中， 计算机软件系统记录小鼠从入水至爬上平台逗 留 3s以上的游 泳时间， 为逃避潜伏期 （escape latency, EL)。 超过 120s寻找不到平台的小鼠， 潜伏期计为 120s并将其引导至平台停留 10s。 全部小鼠完成 1个象限测试之 后再进行下 1个象限的测试， 直到完成 3个象限的测试， 连续 5d。 第 6d， 将平台撤去， 测量 120s 内： （1)逃避潜伏期： 动物入水初次到达平台所在位置 的时间； （2) 平台穿越次数； （3)上台前游泳路程； （4 )小鼠在中心区域及平台 周围区域游泳路程和时间， 计数比值， 参见表 4。

表 4: 葡萄籽多酚组 Morri s水迷宫实验结果

说明： 与模型对照组对比， *， p〈0. 05， **, p〈0. 01， p〈0. 001。 结果表明， 相比于模型对照组， H 组动物的逃避潜伏期、 平台穿越次数指 标延长， 上台前游泳路程与游泳路程 /时间比缩短， 提示能更好的适应环境， 具 有较好的记忆能力。 高聚组只在游泳路程 /时间比缩短指标与模型组有差异。

实验实施例 6: 体内试验 -行为学的跳台实验

跳台仪实验箱共分为 5室， 实验箱可允许 5只小鼠同时进行实验。 实验 箱底面铺有铜栅， 铜栅通过电线与电源相连， 电流控制在 36V。 实验箱内铜 栅上靠箱内一角置一个圆柱形塑料绝缘台作为 动物回避电击的安全区。 试验 装置与计算机自动记录系统相连。 实验时将小鼠放入跳台仪实验箱内， 适应 环境 5 min， 之后将小鼠轻放于跳台上， 并将铜栅通电， 当小鼠从跳台上跳下 四肢接触铜栅时会受到电击， 正常回避反应是跳上跳台返回安全区， 逃避电 击， 如此学习 5 min， 并记录此 5 min内的触电次数 (；错误次数)， 以此为学习 成绩。 24h后进行记忆能力测试， 将小鼠置于跳台上， 记录小鼠从停留在跳台 上至第一次跳下受电击的时间即潜伏期、 5min内的错误次数 (小鼠四肢同时接 触铜栅触电的次数）， 以此 2个评价指标考察小鼠记忆功能， 参见表 5。

表 5 : 葡萄籽多酚组跳台实验结果

说明： 与模型对照组对比， *， p〈0. 05， **, p〈0. 01。

结果表明， 相比于模型对照组， H 组的动物潜伏期指标延长， 提示能更好 的适应环境， 具有较好的记忆能力， 且 H组效果明显优于高聚组。

实验实施例 7: 体内试验-小鼠脑组织病理形态学观察

取出左侧脑组织， 放入 4%中性多聚甲酸溶液中固定、 切片。

刚果红染色釆用石蜡包埋， 脱蜡染色， 染液染色 20min， 分化液分化至不 再褪色；苏木素淡染细胞核； 0. 5%盐酸酒精适度分化细胞核，水洗返蓝； 100% 乙醇迅速脱水； 透明封片。 结果分析： 光镜 15 X 40倍视野下观察各组 5只小 鼠脑的 5张切片， 以海马 CA1区淀粉样变的观察为主。

HE染色， 将切片固定， 脱水透明， 浸蜡包埋， 脱蜡染色， 苏木精水溶液 中染色数分钟；酸水与氯水中分色；酒精伊红 染色液染色 2-3分钟；脱水透明； 封固。 结果分析： 光镜 15 X 40倍视野下观察各组 5只小鼠脑的 5张切片， 以 海马 CA1区淀粉样变的观察为主。

APP 免疫阳性神经元主要分布于大脑顶叶皮层、 海马周围白质， 神经元 呈锥形、 不规则形等， 光镜下可见 APP阳性反应物呈棕黄色， 定位于胞膜或 胞桨。 模型对照组分布于大脑顶叶皮层、 海马等部位有较多 APP免疫阳性神 经元表达。 H组和阳性对照组大脑顶叶皮层阳性神经元 APP的表达则相对较少， 表 6: 计数五个视野 APP免疫阳性细胞平均个数

说明： 与模型对照组对比， *， ρ<0. 05 ο

结果表明， 相比于模型对照组， Η组动物的 ΑΡΡ免疫阳性细胞平均个数降 低， 提示小鼠脑中具有更少的 ΑΡΡ神经元沉积， 且明显优于高聚组。

实验实施例 8: Western blot 法检测小鼠大脑皮质与海马中 β淀粉样前 体蛋白 (ΑΡΡ)的表达及 p-tau(Ser404位点） 的表达

每组取 4只小鼠处死后取脑组织， 冰块上分离皮质和海马组织， 1： 10 匀桨， BCA法定蛋白后调定各组蛋白浓度统一为 l lO g/ml,加 2x上样缓冲液， 煮沸变性 5 min。每孔中加入 ΙΟμΙ样品， 10%分离胶电泳分离蛋白后湿转到硝 酸纤维素膜上， 膜用 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h， 加入一抗， 4°C过夜， 倾去一 抗， TBST洗膜 3次， 每次 15 min， 分别加入 1： 2 000羊抗兔甘油二抗， 摇 床上摇动， 室温下 l h， 弃去二抗， TBST洗膜 3次， 每次 15 min， 化学发光 法曝光。

每组取 4只小鼠处死后取脑组织， 冰块上分离皮质和海马组织， 用 BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度， 取 lO g进行 SDS-PAGE电泳， 先 100 V电 泳 20 min，然后 150 V电泳至溴酚蓝抵达胶底后 20 min结束电泳，而后在 350 mA的条件下转膜 150 min,将蛋白质转移到 PVDF膜上， 5 %脱脂牛奶室温包 被 2 h， 加入 Anti-p-tau (Ser404)羊抗大鼠多抗 ( 1： 500稀释) 于 4 °C下过 夜； 加入生物素化的二抗室温下孵育 2 h， ECL 显影和图像扫描。 以 β -actin 作为内参照。 试验结果见表 7。

表 7 :葡萄籽多酚组对于小鼠大脑皮质与海马中 β 淀粉样前体蛋白（APP)的表 达及 p-tau (Ser404位点） 的表达的影响

说明： 与模型对照组对比， *， ρ<0. 05 ο

结果表明， 相比于模型对照组， Η组动物的 ΑΡΡ表达水平明显降低， 且优 于高聚组。

实验实施例 9 : 体内试验-荧光定量 PCR检测 PS-1的表达

用 Trizol提取总 RNA, 用 cDNA试剂盒进行逆转录， 以 SYBR Green内 掺式混合染料、 cDNA以及特异性基因引物在 7500快速实时 PCR仪上进行 PCR 反应。 反应共进行三次， 规范化其阈值周期值， 实验结果参见表 8， 其中 PS1 弓 I物对为： 5， -TGGCCACCATCAAATCAG-3 '

5， - TCATGATGGCCGCATTCAG- 3，

表 8 : 葡萄籽多酚组对于荧光定量 PCR检测 PS-1的表达的影响

说明： 与模型对照组对比， *， ρ<0. 05 ο

结果表明， 相比于模型对照组， Η组动物的 PS-1的表达水平没有变化。 结果讨论：

一般认为， 老年性痴呆的主要病因是大脑内 β淀粉样蛋白的沉积， 直接 导致大脑皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性 ， 最终导致脑机能的衰退。 上述 实施例试验结果证实， 本发明具有较高含量的单体和低聚体的葡萄籽 多酚 提取物 Η组对 AD双转基因模型 β淀粉样蛋白的沉积小鼠体外及体内试验， 具有良好的作用， 提示本活性物质可在制备预防或治疗老年性痴 呆症药物 中应用， 且疗效显著。

综上所述， 本发明通过膜分离技术制备获得的葡萄籽多酚 提取物， 包括 儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯， 其中儿茶素、 表儿茶素和表儿茶素 没食子酸酯三者的总质量百分比可以达到 8%， 还包括没食子酸， 没食子酸的 质量百分比 2%， 即具有较高含量的单体和低聚体多酚， 并证明了这种具有较 高含量单体和低聚体的葡萄籽多酚提取物可以 在制备预防或治疗老年痴呆症药 物中应用且疗效显著。

应当理解的是， 上面结合附图对本发明的实施例进行了描述， 但是本发 明并不局限于上述的实施方式， 上述的实施方式仅仅是示意性的， 而不是限 制性的， 本领域的普通技术人员在本发明的启示下， 在不脱离本发明宗旨和 权利要求所保护的范围情况下， 还可做出很多形式， 这些均属于本发明的保 护之内。