Grüntee-Extrakt, insbesondere zur Verwendung als funktionelles Lebensmittel, Nahrungsergänzungsmittel oder entsprechende Zutat, dessen Verwendung sowie Verfahren zur Herstellung eines solchen Grüntee-Extrakts

Die Erfindung betrifft einen Grüntee-Extrakt, insbesondere zur Verwendung als funktionelles Lebensmittel, Nahrungsergänzungsmittel oder entsprechende Zutat dazu, sowie dessen Verwendung und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Grüntee-Extrakts.

Zum Hintergrund der Erfindung ist festzuhalten, dass ein sich wandelndes Ernährungsverhalten, ein neues Gesundheitsbewusstsein, verknüpft mit dem Wunsch nicht nur wohlschmeckende, sichere Lebensmittel, sondern auch Lebensmittel mit bestimmten positiven ernährungsphysiologischen Eigenschaften zur Verfügung zu haben, feststellen lässt.

Neben bisher allgemein bekannten und beschriebenen Nährstoffen wie z.B. Eiweiß, Fett, Kohlenhydrate, Ballaststoffe, Vitamine, Mineralstoffe etc., spielen neuerdings auch sogenannte sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe (SPS) eine zunehmend wichtigere Rolle. Dabei handelt es sich um eine große Anzahl verschiedenster chemischer Verbindungen, bzw. Verbindungsklassen wie z.B. Carotinoide, Terpene, Phytosterine, Polyphenole etc., wie sie auch von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung (DGE) im Ernährungsbericht 1996 beschrieben worden sind.

Viele Pflanzen, insbesondere auch Kräuter bzw. Tee, sind reich an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen und stellen deshalb ein geeignetes Ausgangsmaterial zur Herstellung von Pflanzenextrakten mit SPS dar. Diese Extrakte können als Lebensmittel oder Lebensmittelzutat zur Herstellung ver-

schiedenster Lebensmittel, wie z.B. Getränke, Milchprodukte, Backwaren, Süßwaren etc., verwendet werden und geben dem verzehrfertigen Lebensmittel gewisse, funktionelle Eigenschaften.

Insbesondere Tee und Grüntee, beides Produkte des Teestrauches (Camel- lia sinensis / Camellia assamica bzw. deren Hybriden) sind reich an SPS, so z.B. an bekannten Stoffen wie Koffein, bzw. Polyphenolen, deren physiologische Wirkungen allgemein bekannt sind. Schwarztee und Grüntee sowie deren Extrakte enthalten darüberhinaus weitere ernährungsphysiolo- gisch hochinteressante Verbindungen, wie z.B. Aminosäuren, Theanin, Theogallin.

Bei Theanin handelt es sich um ein Derivat der Glutaminsäure, dem 5-N- Ethyl-L-Glutamin. Für Theanin sind bestimmte ernährungsphysiologische Wirkungen bereits beschrieben. Im Wesentlichen sind dies relaxierende, stress-inhibierende, beruhigende Eigenschaften. Es existieren jedoch auch Hinweise auf anregende Eigenschaften.

Bei Theogallin handelt es sich um einen Ester der Gallussäure mit China- säure, der 5-Galloyl-Chinasäure. über Theogallin und dessen ernährungsphysiologische Wirkungen im Teegetränk bzw. in Tee-Extrakten ist nichts bekannt.

Zum Stand der Technik lässt sich feststellen, dass die allgemein bekannten anregenden Eigenschaften von Koffein bereits seit langem beschrieben sind. Bei ständigem, insbesondere höherem Koffeingenuss existieren jedoch auch die für Koffein beschriebenen Nachteile wie Schlaflosigkeit, innere Unruhe, Verminderung des zerebralen Blutflusses etc. (siehe Hager- ROM 2004 Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe).

Für Theanin als Reinsubstanz werden einerseits beruhigende (siehe JP 2005 289 948 Al, JP 2005 232 045 Al oder JP 9012454 Al), andererseits auch anregende Eigenschaften (siehe JP 9100230 Al) beschrieben. Dies gilt insbesondere für Theanin in Mischung mit Koffein, Arginin, Rice- Bran-extract (siehe JP 2002 3220 53 Al, KR 10 2005 121 535 Al oder US 2005 0020 627 Al).

Aus der DE 101 06 216 Al ist ein Grüntee- Extrakt bekannt, der entkoffei- niert, gerbstoffarm, jedoch bezüglich L-Theanin angereichert ist. Er wird hergestellt, indem Grünteeblätter, Grünteefannings oder Grünteepulver zunächst entkoffeiniert und anschließend in Wasser extrahiert werden. Der Extrakt wird daraufhin mit Polystyrol in Kontakt gebracht und anschließend aufkonzentriert. Der Extrakt wird verwendet als Zutat zu Getränken oder Getränkekonzentraten.

Aus der EP 10 57 483 Al ist eine pharmazeutisch wirksame Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Symptome, wie Fettsucht, prämenstru- ale Symptome oder Kälteempfindlichkeit bekannt, die Theanin enthält.

Aus der EP 10 74 252 B l ist eine Theanin enthaltende Zusammensetzung zur Unterdrückung von Verhaltensstörungen bei Haustieren bekannt.

In der Patentliteratur werden ferner bereits verschiedenste Pflanzen und Pflanzen-Extrakte beschrieben, die positive Auswirkungen auf den Stoffwechsel eines Menschen haben, so z.B. in der koreanischen Patentanmeldung KR 1020030056987A eine Zusammensetzung mit Grüntee-Catechin als Wirkstoff für die Prophylaxe von Herz- und Gefäßerkrankungen, die mit Diabetes verbunden sind.

Dies ist von Bedeutung, da die Lebensumstände insbesondere in hochzivilisierten Staaten mit einseitiger Ernährung sowie Bewegungsmangel nach allgemeiner Auffassung als wesentliche Ursache für übergewicht, Diabetes sowie weitergehende stoffwechselbedingte Erkrankungen zu sehen sind. Dies spiegelt sich in einer Zunahme von Diabetes-II-Erkrankungen in der Bevölkerung wieder.

Ziel, um dieser Tendenz entgegen zu wirken, muss eine ausgewogene Er- nährung sowie ausreichende Bewegung sein. In diesem Umfeld können funktionelle Lebensmittel im Sinne einer Prophylaxe dazu beitragen oder zumindest dabei helfen, den Blutzuckerspiegel gefährdeter Personen in einem physiologischem Bereich zu halten.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, einen speziellen Grüntee-Extrakt zu entwickeln, der als breitbandig einsetzbares funktionales Lebensmittel beispielsweise eine Steigerung der cognitiven Leistungsfähigkeit bei gleichzeitiger Relaxation bewirkt und der als funktionelles Lebensmittel oder entsprechende Lebensmittelzutat in Getränken, Milchprodukten, Süßwaren, etc. eingesetzt werden kann. Damit wird das Ziel verfolgt, funktionelle Lebensmittel zu entwickeln, die insbesondere geistig arbeitenden Personen eine verbesserte und verlängerte cognitive Leistungsfähigkeit bei gleichzeitiger Relaxation garantieren soll. Eine weitere interessante Aufgabenstellung ist die mögliche positive Beeinflussung des menschlichen Glukose-Haushalts durch einen solchen Grüntee-Extrakt.

Diese Aufgabe wird durch einen Grüntee-Extrakt mit der in Patentanspruch 1 angegebenen Zusammensetzung in produkttechnischer Hinsicht gelöst.

Versuche mit einem entkoffeinierten, Theanin- und Theogallin- angereicherten Grüntee-Extrakt haben überraschender Weise gezeigt, dass bei Applikation eines solchen Extraktes beispielsweise in einem Erfrischungsgetränk eine Steigerung der cognitiven Leistungsfähigkeit bei gleichzeitiger Relaxation festgestellt werden kann.

überraschenderweise haben ferner Studien, wie z.B. ein Screening verschiedenster Pflanzen-Extrakte zum Thema „Blutzuckerregulierung, antidiabetische Eigenschaften von Pflanzenextrakten" ergeben, dass der erfϊn- dungsgemäße Grüntee-Extrakt auch Blutzucker-regulierende Eigenschaften aufweist. Es hat sich herausgestellt, dass dieser Theanin- und Theogallin- angereicherte Grüntee-Extrakt, entkoffeiniert, in der Lage ist, die Glukoseaufnahme durch differenzierte Adipocyten markant zu steigern.

Als bevorzugte Anreicherungsgrade für Theanin und Theogallin haben sich mindestens sechs Prozent bzw. mindestens drei Prozent erwiesen, wobei der Koffeingehalt bei maximal 0,03 Prozent liegen soll.

In verfahrenstechnischer Hinsicht gibt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Grüntee-Extrakts an, das folgende Verfahrensschritte aufweist: a) wässrige Extraktion von Grüntee-Blättern, b) Flüssig-Flüssig-Extraktion des in Schritt a) erhaltenen wässrigen Grüntee-Extraktes, c) absorptive Anreicherung des in Schritt b) gewonnenen Extraktes in einem Absorber, d) Elution des Absorbers, e) Aufkonzentrieren des Eluats zu einem entkoffeinierten, mit Theanin und Theogallin angereicherten Grüntee-Extrakt mit einem Trockensub-

stanz-Gehalt von vorzugsweise mind. 50 %.

Auf der Basis dieser grundsätzlichen Verfahrensschritte, die in den weiteren abhängigen Ansprüchen näher spezifiziert sind, können die oben er- wähnten Anteile von Theanin, Theogallin und Koffein erreicht werden.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich, die sich bezieht auf ein

Ausführungsbeispiel:

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Extraktes wird Grüntee als Rohstoff verwendet. Dieser wird in einem ersten Schritt einer wässrigen Extraktion unterworfen - Schritt a) des Herstellungsverfahrens.

Der so erhaltene wässrige Grüntee-Extrakt wird in einem zweiten Schritt einer Flüssig-Flüssig-Extraktion - Schritt b) - mittels Ethylacetat unterworfen. Hierbei werden Koffein und ein Teil der Polyphenole entfernt, was zu einer Anreicherung an den gewünschten Stoffen Theanin und Theogal- lin führt.

Eine weitere, adsorptive Anreicherung erfolgt in einer dritten Prozessstufe - Schritt c) - über einen mit funktionalisiertem Divinylbenzol befüllten Adsorber. Der dabei anfallende, wässrige Durchlauf ist zu verwerfen. Die Elution - Schritt d) - erfolgt mit demineralisiertem Wasser, wobei zwei separate Teilfraktionen erhalten werden. Insbesondere die zweite Teilfraktion ist reich an Theanin, Theogallin und im Grüntee enthaltenen Aminosäuren.

In einer weiteren Stufe - Schritt e) - wird die betreffende Fraktion auf einen Trockensubstanz-Gehalt von ca. 50% konzentriert und kann bereits als solche verwendet werden. Der so enthaltene konzentrierte Theanin- und Theogallin-angereicherte Grüntee-Extrakt kann in einem weiteren Prozess- Schritt sprühgetrocknet werden.

Der wie oben beschrieben, hergestellte Grüntee-Extrakt weist im Wesentlichen folgende Zusammensetzung bezogen auf Trockensubstanz auf: Wassergehalt 3,2% Aschegehalt 24,1 %

Summe Aminosäuren 3,52% Koffein ≤ 0,01%

L-Theanin 9,71%

Theogallin 4,65%

Der Rest besteht aus einer Vielzahl von Stoffen. Analysen haben als Restanteile Gerbstoffe zu 2,5 % sowie Kohlehydrate, Säuren und Säurederivate zu 52,3 % ergeben.

Verschiedene Tier- als auch eine Humanstudie haben überraschender Weise gezeigt, dass ein nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellter entkoffeinierter, Theanin und Theogallin angereicherter Grüntee-Extrakt die o.g. Eigenschaften aufweist, wobei insbesondere Theogallin, bzw. dessen Metaboliten, wie z.B. Chinasäure, für die Steigerung der cognitiven Leistungsfähigkeit verantwortlich ist. Theanin zeigt in dem beschriebenen Extrakt leicht relaxierende Eigenschaften.

Ferner konnte die Fähigkeit des entkoffeinierten, Theanin- und Theogallin- angereicherten Grüntee-Extraktes zur Steigerung der Glukose- Aufnahmefähigkeit eines Zelltyps, nämlich aus murinen Fibroplasien differenzierte Adipocyten, in einem weiter unten beschriebenen Versuch nach- gewiesen werden. Damit wird die Eignung des Grüntee-Extraktes als funktionales Lebensmittel zur Unterstützung des Glukose-Haushalts eines Menschen belegt.

Folgende experimentelle Studien wurden durchgeführt:

Prüfung des Extraktes mittels eines Getränkes im Humanversuch

Es wurde eine doppelblinde randomisierte, cross-over-placebo- kontrollierte, humanphysiologische Studie mit zwölf Probanden durch- geführt. Das Verumgetränk enthielt 2,57g/500 ml erfindungsgemäßen

Grüntee-Extrakt, das Placebogetränk war frei von diesem Extrakt.

Als Messparameter bzw. Hauptzielgrößen wurde die spektrale EEG- Leistung und das visuell evozierte Potential P300 untersucht. Als Me- thoden wurden das quantitativ-topographische EEG unter Anwendung der sogenannten „Cateem®"-Untersuchung sowie für die P300- Bestimmung das Auswertungsverfahrens „Caterpa" eingesetzt.

Die Kriterien „Konzentrationszunahme", „Zunahme der Relaxation", „Steigerung der mentalen Leistungsfähigkeit" und „verbesserte cogni- tive Funktion" zeigen aufgrund der vorstehenden Auswertungen signifikante Verbesserungen bei Anwendung des Verumgetränkes im Vergleich zum Placebo.

Insgesamt konnte damit eine Verbesserung der cognitiven Funktion bei gleichzeitiger Relaxation nach Aufnahme des Verumgetränkes gezeigt werden.

Prüfung des Gesamt-Extrakts und einzelner Inhaltsstoffe am isolierten Rattenhirn-Hippocampus-Schnitt-Präparat:

Als Präparate wurden Schnittpräparate analog Dimpfel et. al, 1991 verwendet, die einer elektrischen Stimulation unter Aufzeichnung der extrazellulären Feldpotentiale unterworfen wurden. Die gemessenen

Feldpotentiale wurden nach einer Single-Stimuli-Anregung bzw. The- ta-Burst-Stimulation aufgezeichnet.

Es wurden folgende Substanzen untersucht: - entkoffeinierter, Theanin- und Theogallin- angereicherter Grüntee-

Extrakt

- Theogallin 97 %

- Aminosäuremischung analog Grüntee-Extrakt

- Aminosäuremischung analog Grüntee-Extrakt mit Theanin - L-Theanin >90 %

- Chinasäure 98 %

- Gallussäure 98 %

Die in-vitro Hippocampus-Schnitt-Untersuchungsmethode wurde ge- wählt, um den Einfluss des im Humanversuch geprüften Grüntee-

Extraktes und einzelner Inhaltsstoffe davon auf Hippocampus- Nervenzellgewebe zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass der vorliegende Theanin- und Theogallin- angereicherte Grüntee-Extrakt in

der Lage ist, das physiologische Muster der elektrischen Hippocampus- Aktivität zu verändern.

Es konnte auch gezeigt werden, dass mehrere Substanzen des Grüntee- Extraktes die elektrische Aktivität beeinflussen. Glutaminsäure und

Theogallin und dessen Metaboliten wie z.B. Chinasäure, sind als anregende Stoffe aufzufassen. Theanin zeigt gegenteilige Wirkung. Die Wirkung von Theogallin und dessen Metaboliten, wie z.B. Chinasäure als die cognitive Leistungsfähigkeit verbessernde Substanzen wurden bisher nicht beschrieben. Die Ergebnisse zeigen eine konzentrationsabhängige Stimulation am Hippocampus-Schnitt-Präparat, was zu einer Zunahme der Langzeitpotenzierung führt, einem Surrogatpa- rameter für eine Aktivierung des räumlichen und zeitlichen Arbeitsgedächtnisses.

Die Ergebisse ergänzen und unterstützen also die im Humanversuch erhaltenen Ergebnisse, wo ebenfalls eine Steigerung der cognitiven Leistungsfähigkeit bei gleichzeitiger Relaxation festgestellt werden konnte.

Ergänzende in-vivo Experimente an freilaufenden Ratten mittels quantitativer Erfassung der elektrischen Hirntätigkeit (Tele-Stereo-EEG).

Beobachtet wurden adulte, freilaufende Fischer-344-Ratten mit im- plantierten 4-bipolaren konzentrischen Gehirnelektroden. Es wurde eine kontinuierliche in-vivo- Analyse des elektrischen Feldpotentials (Tele-Stereo-EEG) des vorderen Cortex, Hippocampus, Striatum und der reticulären Formation analog Dimpfel et. al 1986 durchgeführt. Ferner

wurde die Mobilität der Ratten mit einem Video Tracking System der GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen gemessen.

Als Substanzen wurden eingesetzt - Theanin- und Theogallin- angereicherter Grüntee-Extrakt

Glutaminsäure

- L-Theanin > 90%

- Theogallin 97%

- Chinasäure 98%

Das Modell „Tele-Stereo-EEG" an freilaufenden Ratten wurde als in- vivo Modell gewählt, um im Anschluss an die im Ratten- Hippocampus-in-vitro-Versuch erhaltene Ergebnisse zu überprüfen, insbesondere die überwindung der Blut-Hirn-Schranke für die be- schriebenen Substanzen.

Die orale Gabe des Gesamt-Extraktes zeigt eine zeitlich abhängige, deutliche Stimulation der Feldpotenziale, gekennzeichnet durch Abnahme der Delta-, Theta- und Alpha-Frequenzen. Von den getesteten, im Extrakt vorliegenden Einzelsubstanzen sind Theanin, Theogallin bzw. Chinasäure die Substanzen, die im Wesentlichen zu den gemessenen Ergebnissen beitragen. Die im Ratten-Tele-Stereo-EEG erzielten in-vivo-Ergebnisse, deuten somit darauf hin, dass der beschriebene Grüntee-Extrakt bzw. die in dem Extrakt enthaltenen Komponenten auch beim Menschen die Blut-Hirn-Schranke überwinden können.

Die Ergebnisse unterstützen damit die im Human- Versuch erhaltenen Daten, wo gezeigt wurde, dass der vorliegende Grüntee-Extrakt zu einer

Steigerung der cognitiven Leistungsfähigkeit bei gleichzeitiger Relaxation fuhrt.

Glukose- Aufnahmetest als in-vitro-Untersuchung:

Für einen Glukose- Aufnahmetest wurden 3T3-L1 Zellen (murine Fibroblasten) in drei Differenzierungsschritten während 8-9 Tagen mit Insulin (lμg/ml), Dexamethasone (40μM) und IBMX (500μM) zu A- dipocyten differenziert. Beim zweiten Differenzierungsschritt wurden die Zellen (60000 Zellen/well) in Zellkulturplatten ausgesät. Für den

Assay wurden die Zellen in Serum-freiem Medium für 3 Std. inkubiert. Nach Vorinkubation der Zellen mit einer 0.16 μM Insulinlösung und den Grüntee-Extrakten für 25 min bei 37°C wurde der Assay mit 2- Desoxy-D-[1- ³ H]-Glukose (0.1 lμCi/ml) gestartet und für 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Menge der von den Zellen aufgenommenen 2-Desoxy-D-[l- ³ H]-Glukose wurde nach diversen Waschschritten und Lysis der Zellen mittels eines Scintillationszählers bestimmt. Die Messungen wurden in einen Tri-Carb 1900 TR Liquid Scintillation Counter (Packard, USA) durchgeführt. Nullkontrollen (t(0)) wurden ohne Zugabe von Insulin durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde

Cytochalasin B (200μM), ein Inhibitor des Insulin-stimulierten Glukosetransporter Systems, verwendet. Das Ergebnis der Untersuchungen zeigt, dass der geprüfte Grüntee-Extrakt die Glukoseaufnahme in der beschriebenen Inkubationszeit im Vergleich zur Kontrolle mehr als verdoppelt. Dies trifft für alle drei eingesetzten Prüfkonzentrationen von 3 μg/ml, 100 ng/ml, sowie 300 pg/ml zu.