[0001] 本发明涉及一种菌种的培养方法， 具体涉及的是 A群脑膜炎球菌的培养方法。

背景技术

[0002] 流行性脑脊髓膜炎 (简称流脑， 下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌 (Neisseriamenin gitidis)引起的急性呼吸道传染病。 一百多年来， 一直在世界各地流行或散在发生 ， 感染病原菌后可引起败血症、 脑膜炎。 易感人群主要为儿童， 以暴发型病死 率最高， 可达 40<¾〜60<¾。 当今世界各大洲发病率在 1/10万〜 10/10万， 总病死率 在 5%〜15<¾， 高达 20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症， 包括智力受损和耳 聋等。 根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分 13个血清型， 其中 A群、 B群、 C 群约占流行菌群的 90%。 A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群� � 特别是 在所谓的非洲 "流脑流行带"， 每隔 7-14年就会出现一次较大流行。

[0003] 我国于 1938年、 1949年、 1959年、 1967年和 1977年曾发生过 5次全国性流脑流 行； 其中以 1967年春季流行最为严重， 发病率高达 403/10万， 病死率为 5.49<¾。 我国过去 90%以上的病例是 A群病菌致病， 现在 B群或 C群病菌有吋亦弓 I起流脑暴 发。 2003年幵始， C群流脑的发病率明显上升。 目前 A群和 C群共占所有血清群 的 50%以上， 且 C群仍有进一步增高的趋势。 因此， 目前我国预防流脑工作的重 点是以预防 A群和 C群为主。

[0004] 目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接 种疫苗。 研究表明， A群 C群脑 膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性， 提取荚膜多糖可直接制备成疫苗， 经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。 我国从 2007年起已将流脑疫苗纳入国 家免疫规划， 在全国范围对适齢儿童普及接种。 目前纳入国家免疫计划的流脑 多糖疫苗包括 A群脑膜炎球菌多糖疫苗， A群 C群脑膜炎球菌多糖疫苗。

[0005] 现有技术中均是从 A群脑膜炎球菌中提取出多糖制成多糖疫苗， 进而达到预防 脑膜炎的效果。 因多糖是从荚膜中提取出来， 如果菌种培养过程中死菌较多， 容易导致直接从 A群脑膜炎球菌中提取多糖的提取效率低， 且提取出来的多糖不 容易纯化。

技术问题

[0006] 本发明的目的在于解决现有技术中直接从 A群脑膜炎球菌中提取多糖的提取效 率低， 且提取出来的多糖不容易纯化的问题， 提供一种解决上述问题的 A群脑膜 炎球菌的培养方法。

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 为解决上述缺点， 本发明的技术方案如下：

[0008] A群脑膜炎球菌的培养方法， 包括以下步骤：

[0009] (1) 制备纯化的工作种子批菌种；

[0010] (2) 幵启工作种子批菌种， 接种至半综合培养基中， 在温度 35〜37°C条件下 培养 16〜24小吋， 然后经过三代扩增培养， 制备数量适宜的生产用种子；

[0011] (3) 将生产用种子接种至发酵罐培养 6〜12小吋即可； 发酵罐中培养基为半综 合培养基， 温度为 35〜37°C， 培养基 pH为 7.0〜7.2， 发酵罐中搅拌速度为 140〜1 50r/min， 接种量为 10〜15万 /ml。

[0012] 优选地， 所述步骤 （1) 的具体过程如下：

[0013] 将 A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基� �， 在 38°C条件下培育 20h， 挑 选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养 基上进行二次培养， 再在 38°C条件 下培育 12h， 挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛 奶中， 混匀冻干制备 即得纯化的工作种子批菌种。

[0014] 作为优选的实施方式， 所述纯化种子的幵启过程如下：

[0015] 将工作种子批菌种溶解到无菌水中， 将其接种在 10%羊血琼脂培养基上， 放于

35〜37°C的环境下培养 16〜20小吋后， 挑选出健壮且无杂菌污染的菌种即可。

[0016] 进一步， 所述步骤 （2) 的具体培育过程如下：

[0017] 将幵启后的纯化种子接种到半综合液体培养基 中进行活化培养； 活化培养的条 件为温度 35〜37°C、 pH7.0〜7.2、 搅拌速度 140〜150r/min， 培养吋间为 6〜8h; 最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养， 即可制备数量适宜的生产用种子 [0018] 更进一步地， 所述三代扩增培养的条件为： 扩增培养用培养基为半综合液体培 养基中； 培育条件为温度 35〜37°C、 pH7.0〜7.2、 搅拌速度 140〜150r/min。

[0019] 为了达到最好的效果， 所述半综合液体培养基的组成配比如下：

[0020] 牛肉浸出液 1L， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 无菌脱纤维马血、 羊血或兔血 100ml， 葡萄糖 3g， 盐酸酪蛋白水解物 2g， pH7.0〜7.2。

发明的有益效果

有益效果

[0021] 本发明与现有技术相比， 具有以下优点及有益效果：

[0022] 本发明培育出的 A群脑膜炎球菌的死菌较少， 提取出的多糖纯化更加容易； 而 且多糖在荚膜中的提取率更高。

本发明的实施方式

[0023] 下面结合实施例， 对本发明作进一步地详细说明， 但本发明的实施方式不限于 此。

[0024] 实施例 1

[0025] A群脑膜炎球菌的培养方法， 包括以下步骤：

[0026] (1) 制备纯化的工作种子批菌种： 将 A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培 养基上， 在 38°C条件下培育 20h， 挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培 养基上进行二次培养， 再在 38°C条件下培育 12h， 挑选健壮且无杂菌污染的菌种 加入无菌脱脂牛奶中， 混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种。

[0027] (2) 将工作种子批菌种溶解到无菌水中， 将其接种在 10%羊血琼脂培养基上 ， 放于 35〜37°C的环境下培养 16〜20小吋后， 挑选出健壮且无杂菌污染的菌种；

[0028] 将幵启后的纯化种子接种到半综合液体培养基 中进行活化培养； 活化培养的条 件为温度 35〜37°C、 pH7.0〜7.2、 搅拌速度 140〜150r/min， 培养吋间为 6〜8h;

[0029] 最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养， 即可制备数量适宜的生产用种子 ； 其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中 ； 培育条件为温度 35〜37°C、 p H7.0〜7.2、 搅拌速度 140〜150r/min。

[0030] (3) 将生产用种子接种至发酵罐培养 6〜12小吋即可； 发酵罐中培养基为半综 合培养基， 温度为 35〜37°C， 培养基 pH为 7.0〜7.2， 发酵罐中搅拌速度为 140〜1 50r/min， 接种量为 10〜15万 /ml。

[0031] 本实施例中， 各步骤中的具体培育条件如下：

[0032] 步骤 （2) 工作种子批菌种幵启的培育条件为 35°C， 培养 18小吋； 活化培养的 条件为温度 37°C、 pH7.2、 搅拌速度 140r/min， 培养吋间为 6〜8h; 扩增培养的培 育条件为温度 36°C、 pH7.0、 搅拌速度 145r/min;

[0033] 步骤 （3) 中发酵罐培养的培育条件为温度为 37°C， 培养基 pH为 7.0， 搅拌速度 为 145r/min， 接种量为 12万 /ml。

[0034] 且步骤 （1) 中采用的纯化培养基为加入抗生素的巧克力培 养基， 有效达到纯 化的目的； 步骤 （2) 中幵启工作种子批菌种所使用培养基为未加入 抗生素的巧 克力培养基， 即 10%羊血琼脂培养基， 通过该培养基的培养后即可有效达到幵启 工作种子批菌种的效果。

[0035] 活化和扩增用培养所用的培养基均是半综合液 体培养基， 该培养基的配比为： 牛肉浸出液 1L， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 无菌脱纤维马血、 羊血或兔血 100ml， 葡萄糖 3g， 盐酸酪蛋白水解物 2g， pH7.0〜7.2。

[0036] 实施例 2

[0037] 本实施例与实施例 1的区别仅仅在于， 各步骤中的具体培育条件不同， 具体设 置如下：

[0038] 步骤 （2) 工作种子批菌种幵启的培育条件为 36°C， 培养 16小吋； 活化培养的 条件为温度 37°C、 pH7.0、 搅拌速度 145r/min， 培养吋间为 8h; 扩增培养的培育 条件为温度 37°C、 pH7.0、 搅拌速度 150r/min;

[0039] 步骤 （3) 中发酵罐培养的培育条件为温度为 37°C， 培养基 pH为 7.0， 搅拌速度 为 150r/min， 接种量为 15万 /ml。

[0040] 实施例 3

[0041] 本实施例与实施例 1的区别仅仅在于， 各步骤中的具体培育条件不同， 具体设 置如下：

[0042] 步骤 （2) 工作种子批菌种幵启的培育条件为 37°C， 培养 18小吋； 活化培养的 条件为温度 36°C、 pH7.2、 搅拌速度 150r/min， 培养吋间为 7h; 扩增培养的培育 条件为温度 37°C、 pH7.2、 搅拌速度 145r/min;

[0043] 步骤 （3) 中发酵罐培养的培育条件为温度为 37°C， 培养基 pH为 7.2， 搅拌速度 为 145r/min， 接种量为 10万 /ml。

[0044] 上述实施例仅为本发明的优选实施例， 并非对本发明保护范围的限制， 但凡采 用本发明的设计原理， 以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变 化， 均应 属于本发明的保护范围之内。