La presente invención se aplica en el campo de la medicina, específicamente en el proceso de aprendizaje y la formación de la memoria, mediante el uso de los virus adeno- asociados (AAV) que sobre-expresan el factor de transcripción XBP1 en neuronas del sistema nervioso central (SNC) , de preferencia en el hipocampo, recuperando y mejorando el rendimiento de la memoria y aprendizaje. ANTECEDENTES Y DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DEL ARTE

La investigación científica sobre las enfermedades del SNC ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con alteraciones cognitivas. El tratamiento de enfermedades relacionadas con la memoria o el aprendizaje no tiene hoy enfoques terapéuticos para disminuir los síntomas.

En la búsqueda para el tratamiento de estas enfermedades cognitivas, se ha identificado el factor de transcripción llamado XBP1 cuya función está involucrada en los mecanismos biológicos y moleculares de los procesos de la memoria y el aprendizaj e .

Las terapias farmacológicas existentes hoy en día apuntan principalmente al decrecimiento endógeno de XBP1 a través del control de un sensor río arriba, IREl, tal como se presenta en la patente US2013197023. La activación de IREl cataliza la escisión no convencional de un intrón de 26 nucleótidos expresado en el mARN de Xbpl , de una manera mecánica similar a un pre-tRNA de empalme. La eliminación de este intrón provoca un cambio de marco de lectura en la secuencia de codificación de XBPl resultando en la traducción de una proteina de mayor tamaño de 376 residuos, de 54 kDa, denominada XBPls. En la ausencia de la escisión se traduce la proteina de 261 residuos, de 33 kDa, denominada como XBPlu del inglés unspliced. Se ha descrito que la proporción XBPls / XBPlu se correlaciona con el nivel de expresión de los genes regulados por XBPls aumentando la capacidad de plegamiento del retículo endoplasmático (RE) requerida para mantener la homeostasis celular. La regulación negativa de la expresión de XBPl, se ha visto implicada en la generación de neuroprotección en la enfermedad de Huntington y en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , como se presenta en la solicitud de patente WO2010/008860.

Otra patente relevante con respecto a la medición de estrés de RE, en donde está implicado el factor de transcripción XBPl es la patente japonesa JP2007129970.

En general, este desarrollo se refiere al proceso de memoria, a la consolidación y almacenamiento de nueva información en el cerebro. La memoria de corto plazo se define como la retención de información por cortos periodos de tiempo sin generación de conexiones neuronales o síntesis de proteínas. En cambio, la memoria de largo plazo es definida cuando nuevas sinapsis neuronales son producidas y la información recopilada se almacena por semanas, meses o incluso años, con la dependencia de producción de nuevos mARN y proteínas ( 1 ) .

Uno de los tantos componentes implicados en el desarrollo neuronal es el factor neurotrófico derivado del cerebro 00069

3

(BDNF) , el cual es una neurotrofina que regula el desarrollo neuronal, la neuroplasticidad y sinaptogénesis en el SNC (2) . Diversos estudios han asociado a BNDF con mecanismos de aprendizaje y la formación de la memoria (3, 4, 5, 6, 7 y 8) . Los niveles de expresión de BDNF son dinámicamente controlados por el comportamiento, sin embargo su regulación transcripcional es compleja. Se han descrito varios factores de transcripción asociados a la regulación del BDNF, tales como, el factor de transcripción de respuesta a Calcio (CaRF) y la proteina de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB; 9 y 10) . Aunque por el momento los mecanismos del control fino de la expresión de BDNF han sido pobremente estudiados. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La formación de la memoria y el aprendizaje se basa en la inducción de la expresión de nuevos genes distintas regiones del cerebro, aunque mayoritariamente en el hipocampo, donde BDNF ha sido indicado como uno de uno de los factores principales en mediar ésta función dentro de una gran cantidad de otros factores involucrados. En la búsqueda de diferentes reguladores de la expresión de BDNF, se identificó en su región promotora proximal, un sitio de unión funcional para el factor de transcripción XBP1, componente clave de la respuesta frente a proteínas mal plegadas (UPR) . El análisis del perfil de expresión génica que regula el factor XBPl reveló que, además regula un grupo de genes dentro de los cuales se pueden mencionar: GLIA3 (receptor ionotrópico de glutamato, AMPA 3(alfa3)); BDNF (factor derivado de neurotrofina cerebral); y KIF17 (familia de las kinesinas 17), por lo tanto XBPl regula genes implicados en el aprendizaje y la memoria. El análisis del comportamiento de ratones deficientes para el factor de transcripción XBP1 en sus neuronas, reveló la una disminución de la formación de la memoria contextual y el deterioro de la potenciación a largo plazo (17).

Sorprendentemente, el aumento de la expresión de XBPls ya sea por la sobreexpresión en el SNC de XBPls en ratones transgénicos o por medio de la entrega mediada por un virus directamente en el hipocampo, logra mejorar el rendimiento en tareas de memoria. Este resultado revela una nueva función imprevista para XBP1 en los procesos cognitivos. Lo anterior, avalado por el reciente descubrimiento de polimorfismos en el promotor de XBP1, como un factor de riesgo para la enfermedad de Alzheimer y a los trastornos bipolares, han hecho que las estrategias para mejorar la actividad de XBPls en el cerebro, pueden traducirse en efectos beneficiosos para el tratamiento de trastornos de la memoria, cognitivos y del aprendizaje.

Un dato relevante en la presente invención es el grado de homología en las secuencias de XBP1 en ratones y humanos el cual es por sobre el 75%, de preferencia el 83%. Las secuencias XBPls y XBPlu humana pueden verse en las tablas número VIII y IX respectivamente.

Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para mejorar y optimizar la memoria de largo plazo, los procesos cognitivos y de aprendizaje en mamíferos, de preferencia en humanos, utilizando un virus que induce la sobreexpresión neuronal de XBPls en el cerebro, de preferencia en el hipocampo.

Un segundo aspecto de la presente invención provee un método de tratamiento terapéutico para mejorar y optimizar la memoria de largo plazo y sus capacidades cognitivas y de aprendizaje. El método comprende la administración intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier via que introduzca el virus al cerebro pasando la barrera hemato-encefálica de un paciente o sujeto. El virus induce la sobreexpresión neuronal de XBPls en un rango de dosis de l ⁶ a l ³⁰ unidades virales por individuo .

Un tercer aspecto de la presente invención es una forma de composición farmacéutica intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier forma que conduzca el virus que induce la sobreexpresión neuronal de XBPls al cerebro, de preferencia al hipocampo, pasando la barrera hemato-encefálica, con rangos de dosis como los presentados previamente y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en la optimización y mejora de un paciente humano de su memoria a largo plazo, capacidades cognitivas y del aprendizaje. Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un virus que induce la sobreexpresión neuronal de XBPls y sus compuestos derivados proteicos porque sirve para preparar un medicamento útil en la mejora de la memoria, procesos cognitivos y de aprendizaje.

Un quinto aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno-asóciado (AAV) que presenta la misma secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en la Tabla III o cualquiera de sus variantes, contenido en el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, American Type Culture Collection (ATCC) , con el número de depósito PTA-121708, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal XBP1, de preferencia XBPls en el cerebro, principalmente en el hipocampo.

Un sexto aspecto de la presente invención es el plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia nucleotidica descrita en la Tabla III contenido en el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, American Type Culture Collection (ATCC) , con el número de depósito PTA-121708 o cualquier variante de este fragmento, que codifique y sobreexprese el factor de transcripción neuronal XBP1, de preferencia XBPls

La presente patente presenta también, la secuencia del plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia nucleotidica descrita en la Tabla X o cualquier variante de este fragmento, que codifique y sobreexprese el factor de transcripción neuronal XBP1, de preferencia XBPls humano.

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

El plásmido pAAV-XBPls-HA fue depositado con fecha 5 de Noviembre de 2014 en el organismo internacional de depósito biológico, American Type Culture Collection (ATCC) , bajo el número de depósito de PTA-121708.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología particular, compuestos, materiales, técnicas de manufactura, usos y aplicaciones aquí descritas, pues éstas pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada aquí es usada con el solo propósito de describir una representación particular, y no intenta limitar la perspectiva y el potencial del presente invento. Debe notarse que el uso y método, aquí, en el pliego de reivindicaciones y en todo el texto que el singular no excluye el plural, salvo que en el contexto claramente lo implique. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método", es una referencia a uno o más usos o métodos e incluye equivalentes conocidos por quienes conocen de la materia (el arte) . Similarmente, como otro ejemplo, la referencia a "un paso", "una etapa" o a "un modo", es una referencia a uno o más pasos, etapas o modos y que puede incluir sub pasos, etapas o modos, implícitos y/o sobrevinientes.

Todas las conjunciones usadas han de entenderse en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" debe entenderse en su sentido lógico ortodoxo, y no como un "o excluyente", salvo que el contexto o el texto expresamente lo necesite o indique. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos han de entenderse que también se refieren a aquellos equivalentes funcionalmente y así evitar enumeraciones taxativas interminables .

Las expresiones usadas para indicar aproximaciones o conceptualizaciones deben entenderse así, salvo que el contexto mande una interpretación distinta.

Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos aquí empleados tienen el significado común que le otorga una persona común, calificada en estas materias, salvo indicación expresa, distinta.

Los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones son descritos aunque métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos pueden ser usados o preferidos en la práctica y/o pruebas de la presente invención.

Se incorporan todas las patentes y otras publicaciones como referencias, con el propósito de describir y/o informar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones, que puedan resultar útiles en relación con el presente invento. Se incluyen estas publicaciones sólo por su información previa a la fecha de registro de la presente solicitud de patente .

A este respecto nada debe considerarse como una admisión o aceptación, rechazo o exclusión, de que los autores y/o inventores no estén legitimados de serlo, o de estar antefechadas dichas publicaciones en virtud de otras anteriores, o por cualquier otra razón. La presente invención describe vectores basados en los serotipos AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y de virus adeno-asociados capaces de mediar de manera eficiente la transferencia de genes al cerebro, de preferencia al hipocampo cuando se administra localmente. (Fig. 12/17 panel izquierdo)

La administración sistémica de estos vectores también conduce a un suministro de genes eficiente tanto al cerebro como al hipocampo. Aunque la entrega de genes mediada por el vector AAV6 es más eficiente, la entrega en el caso de administración sistémica no está restringida solo al cerebro o hipocampo. La presente invención presenta que el vector de AAV6 con regiones proximales del promotor del factor de transcripción XBPl, permite la generación de una respuesta en un clúster de factores de forma inespecífica de interés en el cerebro y en especifico en el hipocampo. En particular, la administración local del vector AAV6 que comprende un cásete de expresión en el que un gen heterólogo XBPl está bajo el control del promotor PGK, logra una mejora en la memoria y en las capacidades cognitivas en individuos sanos in vivo. (Fig. 12/17 panel derecho y fig. 13/17).

I. Definición de términos y expresiones generales

Los términos "virus adeno-asociado" , "virus AAV", "virión de AAV", "partícula viral AAV", y "partícula de AAV", como se usa en el presente documento son intercambiables, se refieren a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo de AAV en particular) y un polinucleótido del genoma de AAV encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo nativo como un transgén para ser entregado a célula de mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del AAV, que se conoce típicamente como un "vector de partículas de AAV" o "vector de AAV" . AAV se refiere a virus que pertenecen al género Dependovirus de la familia Parvoviridae . El genoma de AAV es de aproximadamente 4,7 kilobases de longitud y está compuesto por ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ssDNA) que puede ser censada como positiva o negativa. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la cadena de ADN, y dos marcos abiertos de lectura (ORFs) : REP y CAP (Replicasa y Cápside) . El marco REP está formado por cuatro genes superpuestos que codifican para proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) requeridas para el ciclo de vida del AAV. El marco CAP contiene nucleótidos de solapamiento de 20 secuencias de proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3, que interactúan entre si para formar una cápside de una simetría icosaédrica (11), tal como se presenta en la fig. 15/17.

El término "virus adeno-asociado IRT" o "AAV ITR", como se usa aquí, se refiere a la terminal invertida que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma de un virus adeno-asociado. Se requieren de las secuencias ITR para la multiplicación eficiente del genoma de AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocopia que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena de ADN. Los IRTs también mostraron ser necesario tanto para la integración del ADN del AAV de tipo nativo en el genoma de la célula hospedera y del rescate de ella, así como para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de su completo ensamblaje (16) .

El término "AAV6", como se usa en la presente invención, se refiere al serotipo 6 del virus adeno-asociado con una secuencia del genoma tal como se define en el número de acceso GenBank AF028704.1, que se encuentra en la página web: http: //www. ncbi . nlm. nih. gov/nuccore/AF028704.1

El término "vector de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere además a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminal de AAV (ITR) . Tales vectores de AAV pueden ser replicados y empaquetados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedera que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes REP y CAP (es decir las proteínas AAV REP y CAP) , y donde la célula hospedera ha sido transfectada con un vector que · codifica y expresa una proteína del marco de lectura del adenovirus E4orf6. Cuando un vector de AAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido utilizado para la clonación o transíección) , entonces el vector de AAV se denomina típicamente como un "pro-vector". El pro-vector puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del AAV y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6.

El término "sitio de unión específico para la región reguladora de transcripción de XBP1" , como se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que sirven como un promotor (es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionado, unido operativamente al promotor) , y que afecta a la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en células de tejidos específicos, tales como las neuronas. El sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción del tejido neuronal puede ser constitutivo o inducible. El término "gen CAP" o "gen CAP de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere a un gen que codifica para una proteína CAP. El término "proteína CAP", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un AAV nativo (VP1, VP2, VP3) . Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1, VP2 y VP3 incluyen la capacidad para inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN de hebra sencilla, facilitar el empaquetamiento del ADN de AAV en la cápside (es decir, la encapsidación) , unirse a receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un hospedero.

El término "cápside", como se usa en la presente invención, se refiere a la estructura en la que se envasa el genoma viral. Un cápside consta de una estructura oligomérica con subunidades estructurales de proteínas CAP. Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3.

El término "composición de células", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material tipo compuesto que comprende las células de la invención y al menos otro componente. La composición puede formularse como una sola formulación o se puede presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para el uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, donde cada uno de los componentes se formula y se empaqueta individualmente.

El término "promotor constitutivo", como se usa en la presente invención, se refiere a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante en todo un organismo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con poca o ninguna consideración a las condiciones ambientales y externas de la célula.

El término "potenciador" , como se usa aquí, se refiere a un elemento de la secuencia de ADN a la que se unen los factores de transcripción para aumentar la transcripción de los genes.

El término "cásete de expresión", como se usa aquí, se refiere a una construcción de ácidos nucleicos, generados por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico en particular, en una célula diana.

El término "genes que proporcionan funciones de ayuda", como se usa aquí, se refiere a genes que codifican polipéptidos, que realizan funciones sobre las que AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen aquellas funciones necesarias para la replicación de AAV, incluyendo estos fragmentos involucrados en la activación de la transcripción de genes AAV, las etapas específicas del empalme (splicing) de mARN de AAV, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de CAP y el ensamblado de la cápside de AAV. Funciones virales accesorias se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, virus herpes, lentivirus y el virus vaccinia. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, lentivirus HV.

El término "unido operativamente", como se describe en el presente documento, se refiere a la relación funcional y localización de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante la cual afecta la transcripción de esa secuencia) . Generalmente, un promotor unido operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

El término "administrado localmente" , como se usa aquí, significa que los polinucleotidos, vectores, polipéptidos, y/o composiciones farmacéuticas de la invención se administran al sujeto en o cerca de un sitio especifico.

Los términos "portadores farmacéuticamente aceptables", "diluyentes farmacéuticamente aceptables", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", son intercambiables en el presente documento, se refieren a un sólido no tóxico, semisólido, o líquido de relleno, diluyente o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional. Un portador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los recipientes empleados en las dosificaciones y concentraciones y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y la naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de administración deseada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. (12). El término "promotor", como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situado aguas arriba de la secuencia del polinucleótido ( s ) , y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para DNA dependiente de la ARN Polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción, y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado a, los sitios de unión de factores de transcripción, represor, y sitios de unión a proteína activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "específico de tejido" sólo se activa en determinados tipos de células o tejidos diferenciados.

El término "polinucleótido" , como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene deoxiribonucleótidos o ribonucleótidos respectivamente. El ácido nucleico puede ser doble cadena, de cadena sencilla, o contener partes tanto de secuencia de doble cadena o de cadena sencilla. El término "polinucleótido" incluye, pero no está limitado a, secuencias de ácidos nucleicos con la capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarios a un polinucleótido endógeno de la célula o el sujeto tratado con la misma de modo que, tras la transcripción del mismo, genera una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN , siARN) capaz de hibridarse e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno.

El término "cadena" en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (incluyendo o no incluyendo nucleótidos naturales modificados o no naturales) . Las dos o más hebras pueden ser, o cada una forma una parte de, moléculas separadas, o pueden ser covalentemente interconectadas , por ejemplo, mediante un enganche, por ejemplo, un enlazador como polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que es suficientemente complementaria a un ARN diana.

Una segunda cadena del agente de dsARN, que comprende una región complementaria a la cadena antisentido, se denomina la "hebra sentido". Sin embargo, un agente siARN también puede formarse a partir de una sola molécula de ARN que es al menos parcialmente auto-complementaria, formando, por ejemplo, una horquilla o estructura de ojal, que incluye una región dúplex. Estos últimos son en lo sucesivo denominadas ARN corto horquilla o shARNs. En tal caso, el término "cadena" se

refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN. El término "región reguladora post-transcripcional", como se usa aqui, se refiere a cualquier polinucleótido que facilita la expresión, estabilización o localización de las secuencias contenidas en el cásete o el producto génico resultante .

El término "genoma viral recombinante", como se usa aquí, se refiere a un genoma de AAV en el que se inserta al menos un cásete de polinucleótido ajeno a la expresión en el genoma de AAV nativo.

El término "gen rep" o "gen rep de AAV", como se usa aqui, se refiere a un gen que codifica una proteina Rep. El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína nativa rep de AAV (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) . Una "actividad funcional" de un proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, incluyendo la facilitación de la replicación del ADN a través del reconocimiento, unión y corte del origen de la replicación del ADN de AAV, así como la actividad helicasa de ADN. Las funciones adicionales incluyen modulación de la transcripción de AAV (u otros heterólogos) promotores y la integración sitio-específica del ADN de AAV en un cromosoma del huésped.

El término "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, tal como un humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpancé u otro simio y especies de monos), un animal (por ejemplo, pájaros, peces, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos) , o un animal de laboratorio (por ejemplo roedores, tales como ratones, ratas, ratones con genes silenciados (ratones knockout) , ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos ) y conejillos de indias) . El término no denota una edad o sexo particular. El término "sujeto" incluye un embrión y un feto. El término "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", como se usa en el presente documento, significa que los polinucleótidos , vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran a un sujeto en una forma no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la invención puede alcanzar varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a nuevos órganos o tejidos del sujeto específicos. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la invención puede dar lugar a la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto.

El término "región regulatoria transcripcional" , como se usa aquí, se refiere a un fragmento de ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la invención incluyen un promotor y opcionalmente un potenciador.

El término "transducción", como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de nucleótidos foráneos es introducida dentro de la célula en un vector viral. término "transfección" , como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucariotas destinatarias .

El término "vector", como se usa aquí, se refiere a un constructo capaz de entregar, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, ADN o vectores de expresión de ARN desnudos, plásmido, vectores cósmidos o fagos, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser auto- replicantes. No hay limitaciones en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y para la obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión incorporados a varios organismos heterólogos. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión procariotas, fagos y vectores lanzadera y vectores de expresión eucariotas basado en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociados asi como retrovirus y lentivirus) , asi como vectores no virales tales como pSilencer 4,1-CMV. El término "BDNF", como se usa aquí, es una neurotrofina que regula el desarrollo cerebral, la neuroplasticidad y la sinaptogénesis en el SNC (2)

El término "Reguladores de la expresión de BDNF" incluye también, los miembros de la familia ATF/CREB, que se unen a las secuencias CRE, además de la descrita en esta patente denominada UPRE's (elementos de respuesta a proteínas mal plegadas) . Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo los métodos y las composiciones del virus AAV con el inserto XBPls-HA, se pueden utilizar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en la presente invención, asi como con cualquier vía de administración descrita en la presente invención .

Los "agentes siARN o siARN" son un término utilizado para describir fragmentos dúplex de ARN de entre 15 y 25 pares de bases, de preferencia de 19 a 21 pares de bases de longitud.

Para el término "optimización y mejora de la memoria, capacidades cognitivas y del aprendizaje", nos referimos a las pruebas cognitivas realizadas en diferentes especies y/o sujetos como está definida en la presente invención.

El término "cADN" o "ADN complementario", se refiere a una secuencia de ADN totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual, se sintetiza por RT-PCR.

La frase "Silenciamiento de un gen diana" se refiere al proceso mediante el cual una célula que contiene y/o expresa un determinado producto del gen diana cuando no esté en contacto con el agente, va a contener y/o expresar, al menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o menos de tal producto del gen cuando entra en contacto con el agente, en comparación con una célula similar que no se ha contactado con el agente. Dicho producto del gen diana puede, por ejemplo, ser un mensajero ARN (mARN) , una proteina, o un elemento regulador.

Como se usa en este documento, el término "complementario" se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que una unión estable y especifica tiene lugar entre un compuesto y una molécula de ARN diana, la unión especifica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no especifica del compuesto oligomérico a secuencias no-objetivo en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que los ensayos se han realizado.

Ligandos

Las propiedades de un virus, incluyendo sus propiedades farmacológicas, se pueden influenciar y hacer a la medida, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. En adición, las propiedades farmacológicas de un agente viral se pueden mejorar mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus. Los ligandos, se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos que se unen a un agente viral, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunidad monomérica conjugada con el ligando. Los ejemplos se describen más adelante en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con ligando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un virus.

Un ligando altera la distribución, dirección, o tiempo de vida de un agente viral en el que se incorpore. En las modalidades preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad para un objetivo seleccionado, por ejemplo una molécula, célula, o tipo de célula, un compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular u órgano, un tejido, región del cuerpo, por ejemplo, como se compare con especie en la que esté ausente este ligando.

Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación, y especificidad de la molécula objetivo, para la presente invención, del virus.

Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes reticulantes; fracciones que confieran resistencia a la reacciones inmunes; y nucleobases naturales o inusuales.

Los ejemplos generales incluyen moléculas lipofílicas, lipidos, lectinas, (por ejemplo, hecigenina, diosgenina) , terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol ) , vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, oligo-lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio) , inulina, ciclodextrina, o ácido hialuronico) , proteínas, agentes de enlace de proteínas, moléculas de dirección de integrina, policationes, péptidos, poliaminas, y miméticos de péptidos. Otros ejemplos incluyen los ligandos receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como transíerrina .

El ligando puede ser una, molécula que se presente naturalmente o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un poli-aminoácido sintético. Los ejemplos de los poli-aminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli-ácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico, copolimero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolimero de poli- (láctico-co-glicólico) , copolimero de diviniléter-anhidrido maleico, copolimero de N- ( 2-hidroxi-propil ) -metacril-amida (HMPA) , polietilenglicol (PEG) , polivinil-alcohol vinilico (PVA), poliuretano, poli- (ácido 2-etil-acrílico) , polímeros de N-isopropil-acril-amida, o polifosfazina . Los ejemplos de las poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL) , espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudo-peptidica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa-helicoidal. Los ligandos también pueden incluir grupos de dirección, por ejemplo un agente de dirección a una célula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteína A de tensoactivo, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glicosilado, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD) , o un mimético de péptido de RGD.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glicoproteínas, lipoproteínas , por ejemplo lipoproteína de baja densidad (LDL) , o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero, o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de célula especificado. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil- glucosamina, mañosa multivalente, o fucosa multivalente. El ligando puede ser una sustancia, . por ejemplo un fármaco, que pueda aumentar la absorción del agente viral dentro de la célula, por ejemplo mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo mediante la alteración de microtúbulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la célula.

En un aspecto, el ligando es un lipido, o una molécula sada en lipido. Este lipido o esta molécula basada en pido, de preferencia, se enlazan con una proteina de suero, r ejemplo suero de albúmina.

En una modalidad alternativa se empacarán los virus.

Para la preparación de las soluciones inyectables de virus se preparan diluyendo la concentración de virus necesaria en PBS (buffer fosfato salino) cuya formulación es la siguiente. PBS lx

1.- Disolver la dosis viral en 800ml de agua destilada con :

8 g of NaCl

0, 2 g of KC1

1,44 g of Na ₂ HP0 ₄

0,24 g of KH ₂ P0 ₄

2. Ajustar el pH to 7,4 con HC1.

3. Ajustar el volume a 1L con agua destilada adicional H20.

4. Esterilizar y autoclavar. Diseño y Selección El control de la síntesis de proteína y la inducción de la expresión del gen es la clave para la formación y mantenimiento de la memoria a largo plazo.

Además de requerir la modulación de la síntesis local de proteínas, la formación de la memoria implica otros aspectos en la ruta secretora incluyendo la síntesis y el tráfico de diversos receptores de membrana y canales iónicos, aumento en la señalización de calcio, la síntesis de membranas y el ensamblaje de complejos de proteínas. Sin embargo, se descubrió una singular función de XBP1 específica en el hipocampo, independiente del control de los genes canónicos asociados a la UPR. Usando la ganancia y pérdida de la función se demostró que XBP1 se requiere para el establecimiento óptimo de la memoria a largo plazo. Esta función inesperada podría tener un origen evolutivo ya que XBP1 es un miembro de la superfamilia de CREB. Este factor de transcripción es conocido por su importancia en el almacenamiento de la memoria a largo plazo. El ejemplo de aplicación, aquí descrito, proporcionó la prueba de que XBP1 modula la expresión de un grupo de genes con actividad demostrada en el aprendizaje y la memoria .

Analizando los alcances biomédicos de la utilización como terapia, se proporcionó un método efectivo e innovador para mejorar la memoria y el aprendizaje, en los que el uso de esta tecnología genera resultados sorprendentes en su aplicación.

Para explorar la participación de XBP1, específicamente XBPls en las funciones cognitivas, sensoriales o motoras del SNC, se realizó una revisión del comportamiento en animales knockout XBP1 neurona-específicos (XBPl ^{Nes_ ~} ) y no se observó ninguna anormalidad motora espontánea obvia o de comportamiento en estos animales ni tampoco se detectaron alteraciones histológicas en el cerebro de estos animales. Sin embargo, los animales mutantes mostraron un deterioro especifico en la prueba de condicionamiento al miedo contextual (Fig. 5/17).

Por otro lado, se evaluó la producción de mARN para un grupo de genes asociados a procesos de memoria y aprendizaje, se determinó que los genes Kifll, Ampa3 y Bdnf disminuyen en la deficiencia de XBP1 (Tabla I) , en el hipocampo y no en la amígdala, regiones cerebrales involucradas en esta tarea (Fig. 1/17 y 2/17 respectivamente) . También se midió la capacidad de aprendizaje de los animales XBPl ^Nes_/~ utilizando el paradigma de la flexibilidad de memoria, una prueba dependiente del hipocampo relacionada con la memoria episódica. Los animales XBPl ^Nes_/" requieren más ensayos que los animales de control para realizar la tarea en el tiempo, lo que indica un deterioro significativo de la memoria (Fig. 6/17). Este fenotipo se produjo en ausencia de alteraciones en la memoria del cerebro corteza-dependiente, en las capacidades motoras, en la ansiedad o en el control reflejo, según la evaluación de estos animales en el hot píate, en el test de reconocimiento de objetos nuevos, el rotarod y en el test de startle response. Para explorar más a fondo los efectos de XBP1 en la plasticidad sináptica y la memoria, se midió la transmisión glutamatérgica evocada por la estimulación de la colateral de Schaffer en cortes de hipocampo y se registraron los potencial postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) en la región CAI para evaluar la potenciación a largo plazo (LTP) con una estimulación de alta frecuencia. La deficiencia de XBP1 en el SNC disminuye la inducción y mantenimiento de la LTP evaluada por la amplitud de los fEPSP en el tiempo (Fig. 7/17) .

En la respuesta de estrés de RE, XBPl ha sido indicado como un componente importante en células secretoras, ya que regula transcripcionalmente un grupo de genes relacionados con el plegamiento y el control de calidad de proteínas (13, 14) . Para identificar los efectos de la deficiencia de XBPl sobre la expresión génica en el hipocampo de los animales, estos fueron sacrificados después del entrenamiento al condicionamiento al miedo contextual y se evaluó los niveles de mARN de genes XBPl-dependientes (por ejemplo: Wfsl y Edeml) y genes XBPl-independientes (gen Bip) . Sorprendentemente, no se observaron cambios en la expresión de genes relacionados con la UPR en el hipocampo de animales XBPl ^{Nes ~ _} en comparación con animales controles (XBPl ^{f f} ) (Fig. 4/17) ) . Sobre la base de los defectos cognitivos identificados en animales XBPl ^Nes-/" , se evaluó la expresión de un grupo de genes conocidos relacionados con el aprendizaje y la memoria (Tabla I)

Tabla I

Esta tabla I muestra el perfil de la expresión génica en el hipocampo de animales XBPl ^Nes_/~ en comparación al animal control. Se muestran los niveles de mARN de genes asociados a procesos de aprendizaje y memoria, evaluados en disecciones de hipocampo a partir de ratones machos utilizando PCR en tiempo real (XBPl ^Nes"/- n=4, XBPl ^f/f n=5 a 6) , se indica el promedio y el error estándar y se realizó el test estadístico de T de Student para obtener el valor de p. Los genes que presentan un valor de p significativo están representados con letras más obscuras . La deficiencia de XBP1 ha conducido a reducciones notables en los niveles de mRNA de un subconjunto de genes (Fig. 1/17). Estas alteraciones en la expresión génica fueron especificas para el hipocampo ya que no se detectaron en la amígdala disectada de los mismos animales XBPl ^{Nes_ "} (fig. 3/17) .

Para probar si el aumento de XBPls en el SNC altera la capacidad de aprendizaje y la memoria de los animales, se generó un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa la forma activa de XBPls en neuronas que utiliza el promotor del prión para conducir su expresión (Tg ^XBPls ) . Estos ^' animales son viables, nacen de acuerdo a los coeficientes mendelianos y no desarrollan ningún fenotipo visible. La expresión restringida del transgén en el SNC se confirmó por Western blot y análisis de PCR en tiempo real (Fig. 8/17, panel izquierdo) . Notablemente, la expresión sostenida de XBPls en el SNC mejora el rendimiento de los animales en las pruebas de flexibilidad de memoria (Fig 8/17, panel derecho). De acuerdo con estos resultados, las rebanadas de hipocampo derivados de animales Tg ^XBPls mostraron una amplitud sostenida y superior de la LTP inducida por estimulación theta-burst (Fig. 9/17), en comparación con animales de control de la misma carnada.

Después de ver el efecto de la manipulación de XBPls en ratones transgénicos y de investigar la función específica en el hipocampo, se desarrolló un virus adenoasociado (AAV) capaz de introducir el gen de XBP1 en diferentes individuos.

Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (AAV) , éste comprende al genoma recombinante viral que comprende un cásete de expresión que incluye una región regulatoria transcripcional tejido especifica hipocampal operativamente unida al polinucleótido de interés. El virus adenoasociado (AAV) de acuerdo a la presente invención incluye cualquier serotipo conocido de los 42 tipos y son derivados de los parvovirus. En general los diferentes serotipos de AAV son secuencias genómicas con una homología significativa a nivel de aminoácidos y ácidos nucleicos, los cuales proveen idénticas funciones genéticas, proveen vibriones que son esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación, ensamblaje utiliza prácticamente los mismos mecanismos.

En particular en la presente invención se utilizó el AAV serotipo 6 (tal como por ejemplo los mencionados en GenBank número de acceso AF028704.1 (AAV 6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) y AX753250.1 (AAV9) ) , tal como se presenta en la Tabla II.

El genoma de los AAV de acuerdo a la presente invención, normalmente comprenden un actuador en cis 5' y una secuencia de repetición terminal invertida en 3" y un cásete de expresión. Las secuencias ITR o LTR tienen 141 pares de bases de largo. Preferiblemente, la secuencia completa de los LTRs es usada en la molécula y solo se permiten leves modificaciones de las secuencias. En una forma preferente del presente invento, el genoma recombinante del AAV comprende los 5" y 3 ^¾ AAV LTRs. En otra forma preferente del presente invento el 5 ^Λ y 3 AAV LTRs deriva desde el AAV serotipo 6. En otra forma más preferente del presente invento el genoma recombinante de los AAV carecen del marco de lectura abierto Rep y Cap.

Por otro lado, los ITRs pueden provenir desde otros serotipos de AAV. El AAV de la presente invención comprende una cápside desde cualquier serotipo. En particular para la presente invención se prefiere la cápside derivada de los serotipos 6, 7, 8 y 9. Aunque se desea de manera preferente la cápside del AAV del serotipo 6.

En algunas realizaciones, una cap del AAV para uso en el método de la invención puede ser generada por mutagénesis (es decir, inserciones, deleciones o sustituciones) de uno de los AAV caps o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la cap de AAV es de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% o más similar a uno o más de los mencionados casquillos de AAV. En algunas realizaciones, el cap de AAV es quimérico, comprende los dominios de dos, tres, cuatro, o más de los mencionados AAV caps. En algunas realizaciones, el cap del AAV es un mosaico de los monómeros VP1, VP2, VP3 y procedentes de dos o tres AAV diferentes o un AAV recombinante (rAAV) . En algunas realizaciones, una composición de rAAV comprende más de uno de los mencionados CAPS.

En algunas realizaciones, un CAP AAV para su uso en una composición de rAAV está diseñado para contener una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, una secuencia de péptido o proteina que confiere focalización selectiva o la evasión inmune puede ser por ingeniería genética en una proteína Cap. Alternativamente, o además, la Cap puede ser modificada químicamente de manera que la superficie de la rAAV presente modificaciones químicas específicas, a modo de ejemplo polietileno glicolado, lo que puede facilitar la evasión inmune. La proteína Cap también puede generarse mutagenizado (por ejemplo, para eliminar su receptor natural de unión, o para enmascarar un epítopo inmunogénico) .

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de al menos una secuencia de XBPl que se pueden seleccionar de las siguientes tablas: Tabla IV {Xbpls) y Tabla V {Xbplu) (NCBI secuencia de referencia N _001271730.1 y NM_013842.3 respectivamente). Las referencias de secuencias fueron obtenidas desde http: //www . ncbi .nlm. nih . gov/nucleotide/411147 50 ?report=genban k&log$=nucltop&blast rank=l&RID=7TM54X2201R {Xbpls) y http: //www . ncbi . nlm. nih . gov/nucleotide/411147449?report=genban k&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=7T 54X2201R {Xbplu) .

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbpls, que se puede seleccionar de la tabla IV, quedando como se presenta en la tabla III.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbplu que se puede seleccionar de la tabla V.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología de 85% con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla IV y tabla V.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología de 70% con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas anteriormente.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que es un equivalente funcional con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas.

La región reguladora de la transcripción puede comprender un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora . Preferiblemente, el promotor es seleccionado del presente listado: PGK1, CAMKII, THY1, entre otros. El potenciador no necesita ser especifico para el tejido neuronal.

En realización, el promotor es específico, por ej emplo, de la proteina fosfoglicerato kinasa 1, también conocido PGK1. En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la Calcio calmodulina kinasa 2, también conocido como CAMKII.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, también conocido como Thyl .

En otra realización, el cásete de expresión que forma parte del AAV de la invención comprende además una región de regulación post-transcripcional . En una realización preferida, la región reguladora post-transcripcional es la marmota Hepatitis Virus región post-transcripcional (WPRE) o variantes funcionales y fragmentos de las mismas y el PPT-CTS o variantes funcionales y fragmentos mismos. En una realización particular, la región regulatoria post-transcripcional es WPRE.

El cásete de expresión que forma parte del AAV de acuerdo con la invención comprende un "polinucleótido de interés". En una realización preferida, el polinucleótido de interés codifica una proteina que actúa sistémicamente . En otra realización, el polinucleótido de interés codifica una proteina que actúa dentro de una neurona. En una realización preferida, la proteina que actúa dentro de dicha neurona es XBPls, incluyendo cualquiera sus isoenzimas que varían en localizaciones subcelulares .

El límite de tamaño de los envases de los vectores de AAV es limitado al tamaño del genoma de AAV de tipo silvestre, que varía en tamaño según el serotipo de AAV (es decir, entre 4087 a 4767) . Por ejemplo, AAV-6 nativo tiene un tamaño de genoma de 4683. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante pueden ser limitados y una secuencia de codificación deseada pueden implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases el genoma del virus. Genes de gran tamaño pueden, por lo tanto, no ser adecuados para uso en un vector de AAV recombinante estándar, en algunos casos. El experto medio apreciará que las opciones están disponibles en la técnica para la superación de una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, el AAV IRT de dos genomas puede hibridar para formar la cabeza a la cola concatámeros, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de empalme permite la remoción del IRT después de la transcripción. Otras opciones para la superación de una capacidad de clonación limitada serán evidentes para el experto en la materia.

Vías de administración

Las vías de administración del virus están supeditadas a que el mismo pueda pasar la barrera hemato-encefálica para infectar las neuronas objetivo. Para lograr este propósito en la presente invención se han definido principalmente 2 vias de administración.

La primera de estas vias es la nasal (18), generalmente los medicamentos administrados por vía nasal pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, puede penetrar al cerebro directamente, o en algunos casos puede seguir ambas vias. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo de fármaco a través de cada una de estas vias no están completamente definidos. En general hay tres rutas por las que un fármaco administrado en la cavidad nasal puede viajar. Estas rutas (18) incluyen la entrada en la circulación sistémica directamente de la mucosa nasal (19), la entrada en el bulbo olfatorio por el transporte axonal a través de las neuronas, y la entrada directa en el cerebro (20) . La evidencia que apoya el papel de cada una de estas rutas para una variedad de sustratos modelo se resume a continuación para diferentes tipos de virus. vias de transporte seguidas por varios solutos virales a través > la administración por via nasal

Modelo Via de

Soluto animal Administración Via seguida

Virus

Virus de la Inoculación

hepatitis Ratón Nasal Nervio olfatorio

Virus del herpes Directa, Sistémica,

Simplex Ratón Gotas nasales Nervio Olfatorio

Virus de la Inoculación

encefalitis Ratón Nasal Nervio olfatorio

Neumococos Ratón Gotas nasales Directa

Esta tabla no pretende ser exhaustiva en la naturaleza, sino más bien para resaltar algunos de los solutos de diferentes clases han demostrado seguir una o más vías.

Otras vías de administración a las células en el SNC han incluido (19) :

La inyección directa en espacios fluidos, como el humor vitreo en el ojo; o en el fluido cerebral de la columna vertebral a través de diferentes rutas, intraventricular o intratecal (**) para su entrega al plexo coroideo, las capas ependimarias/meningeas , y desde allí en el cerebro adyacente a través de procesos que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la barrera sangre-cerebro o barreras sangre-tumorales mediante inyección intra-arterial combinada con una interrupción osmótica o farmacológica temporal.

El término (**) Intratecal (intra + teca, "dentro de una vaina") es un adjetivo que se refiere a algo que ocurre o es introducido en un espacio anatómico o espacio potencial dentro de una funda, más comúnmente la membrana aracnoides del cerebro o la médula espinal.

Cálculo de Dosis Según Ulusoy et al (20), la titulación del vector requiere un rango entre 10 ⁹ a 10 ¹³ copias de genoma (CG) por mi con una dosis probada entre 10 ¹⁰ -10 ¹² gc/ml. Por otra parte, en cualquier tasa de dilución de los vectores a titular tienen que tener un rango bajo-medio de 10 ⁿ gc/ml, lo cual resulta en la desaparición de la toxicidad. Dosis en humanos:

El rango de dosis en humanos se encontraría en el rango de entre 10 ⁹ a 10 ³⁰ unidades virales/Kg de peso, sin restringir este rango a la aplicación en grupos etarios diferentes o con volúmenes de distribución modificados por edad o patología.

La máxima concentración o nivel de una sustancia, hallada experimentalmente o por observación, que no causa alteraciones adversas detectables en la morfología, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguibles de los observados en organismos normales (control) de la misma especie y cepa, bajo condiciones definidas de exposición.

Método de aplicación

Los vectores rAAV6 se inyectaron bilateralmente en el SN usando una jeringa Hamilton de 5μ1 equipada con un capilar de vidrio con un diámetro de la punta de alrededor de 60-80 mieras. Dos microlitros de tampón que contiene las concentraciones apropiadas de partículas virales se inyectó a una velocidad de 0,4 μΐ/minuto. La aguja se retira lentamente 5 minutos después de la finalización de la inyección.

Descripción de Figuras

Figura 1/17 En esta figura se evalúan los niveles de expresión de varios genes relacionados con la memoria medidos en el hipocampo, tales como XBPl ^{f f} (n = 4 ratones) y XBPl ^{Nes_ "} (n = 5 a 6 ratones) usando PCR en tiempo real. Figura 2/17

En esta figura se presentan los niveles de mRNA de los genes relacionados con la memoria indicados en la figura 3/17 se midieron en la amígdala utilizando PCR en tiempo real. En c, d y f se muestran los promedios y se realizó un análisis estadístico mediante t de Student (*: p <0,05, **: p <0,01, *** p <0,001, ns: no significativo). Todas las muestras se normalizaron con los niveles de β-actina.

Figura 3/17

En esta figura se presentan los niveles de proteína BDNF y KIF17 que fueron analizados por Western blot utilizando extractos de hipocampo obtenidos de animales de 6 meses de edad para XBPl ^f/f y XBPl ^Nes_/~ . Los niveles de β-actina o Hsp90 fueron utilizados como control de carga. La media y el error estándar se muestran como las veces de cambio en comparación con animales control (n = 3) . Las bandas fueron empalmadas desde el mismo gel y su exposición a la película.

Figura 4/17 En esta figura se muestran los niveles de mRNA de los genes de la UPR indicados. Dichos genes fueron medidos en el hipocampo disectado de ratones XBPl ^Nes_/~ o de los animales XBPl ^{f f} utilizando PCR en tiempo real. El análisis se realizó a los 6 meses de edad (n = 3 por grupo para XbplA y n = 5 por grupo para Wfsl, Edem y Bip) . Figura 5/17

La presente figura muestra las alteraciones en la memoria a largo plazo y la potenciación a largo plazo de XBPl condicionada en ratones knock-out. ^' Aquí se ve un gráfico de barras donde se presenta los ratones XBPl ^{Nes_ _} y el control de la misma carnada (XBPl ^f/f ) de ratones machos donde se testeó en el ensayo del condicionamiento al miedo contextual. Se calculó el porcentaje de eventos de inmovilidad durante la prueba (XBPl ^{f f} : n = 4 y XBPl ^Nes"/_ : n = 6 por grupo) . Se realizó un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (*: p <0, 05) .

Figura 6/17

Aquí se presenta en paralelo, en otro gráfico de barras, el resultado obtenido cuando los animales fueron entrenados y evaluados utilizando el paradigma de la flexibilidad de memoria. El análisis muestra el número promedio de ensayos para encontrar el criterio de cuatro días consecutivos (n = 4 por grupo) . Se realizó un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (***: p <0,001).

Figura 7/17

Esta figura presenta el registro electrofisiologico de la LTP llevada a cabo en cortes de hipocampo derivados de XBPl ^{Nes" /_} o XBPl ^{f f} de la misma carnada de ratones control (n = 7 por grupo) . Registros representativos de los fEPSP se muestran después de tres trenes de estimulación con 100 Hz en el circuito colateral de Schaffer-CAl . El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de dos vías (***: p <0,001). Figura 8/17

La presente figura muestra que la sobreexpresión de XBPls en las neuronas, mejora la memoria a largo plazo. En esta figura se presenta una cepa especifica transgénica neuronal de XBPls creada usando el promotor del prion para inducir la expresión en el SNC (Tg ^XBPls ) . En el panel izquierdo se observan los niveles de XBPls en hipocampo analizados por Western blot con los niveles de β-actina como control de carga. En el panel derecho, se evaluó el nivel de aprendizaje comparando animales

XBP1s

Tg y la carnada control, mediante la prueba de la flexibilidad de la memoria. El número de ensayos para llegar a este criterio es presentado (n = 5 por grupo) . El análisis estadístico se realizó utilizando una ANOVA de dos vías, seguido de un post-test de Bonferroni (*: p <0,05, ** p <0,01, *** p <0, 001) .

Figura 9/17 La LTP fue medida en cortes de hipocampo _Tg xBPis _{y en} animales control por estímulo teta burhst (n = 7 Por grupo) . Se muestran los registros de los fEPSP. Se realizó un análisis estadístico usando una ANOVA de dos Vías (***: p <0 , 001) . Figura 10/17

La presente figura muestra que la expresión local de XBPls en el hipocampo mejora la memoria de largo plazo probado en ratones de tres meses de edad que fueron inyectados con un virus (AAV) adeno-asociado serotipo 6 para entregar XBPls-HA {AAV/XBPls-HA) o el vector vacío {AAV/MOCK) en el hipocampo utilizando estereotaxis bilateral. 14 días después de la inyección, los animales fueron entrenados y evaluados en el ensayo de la flexibilidad de memoria (n = 6 por grupo) . El análisis estadístico se realizó a través de una ANOVA dos vías seguido de un post-test Bonferroni (*: p <0,05, **: p <0,01, *** p <0, 001) .

Figura 11/17

En este diagrama se presenta en el panel izquierdo, Xbpls y en el panel derecho Bdnf, los niveles de mARN fueron medidos por PCR en tiempo real en el total de cADN obtenido a partir del hipocampo de ratones tipo silvestre inyectados con AAV/XBPls-HA o partículas AAV/MOCK. Los valores de expresión fueron normalizados con los niveles de β-actina (n = 6 por grupo) . Se realizó un análisis estadístico utilizando Prueba t de Student (*: p < 0 , 05 ) .

Figura 12/17

En estos gráficos se evaluaron ratas que fueron inyectadas con partículas de AAV descritos en la fig. 10/17 en el hipocampo mediante dos títulos diferentes de virus (lXrlxlO ⁶ Tüs, 10X: lxlO ⁷ TUS) mediante estereotaxis cerebral bilateral. En el panel izquierdo, se ven imágenes representativas de la inmunohistoquímica de animales inyectados donde se muestran después de la tinción con el anticuerpo anti-HA donde las puntas flecha indican las neuronas positivas para HA. La escala de la barra: 100 μιη.

En el panel derecho, las ratas fueron entrenadas para el ensayo de laberinto de oasis y el porcentaje de éxito en la tarea fue medida en el tiempo (IX título: AAV/MOCK n = 9; AAV/XBPls-HA: n = 10; 10X título: AAV/MOCK n = 5; AAV/XBPls- HA: n = 5) . Se realizó un análisis estadístico mediante una ANOVA de dos vías seguido de un post-test Bonferroni (*: p <0,05, *** p <0,001). El promedio y el error estándar se presenta en todas las figuras. Figura 13/17

Esta figura presenta que la sobreexpresión de XBPls en el hipocampo de ratas mejora el rendimiento en la prueba de Oasis. Las ratas fueron inyectadas por estereotaxis bilateral con el serotipo 6 del virus adeno-asociado (AAV) para entregar XBPls-HA (AAV/XBPls-HA) o partículas de un vector . vacío (AAV/MOCK) en el hipocampo de ratas de tipo silvestre utilizando dos diferentes títulos de virus (IX: lxlO ⁶ TUs, 10X: lxlO ⁷ TUs) . Las ratas fueron entrenadas en el laberinto de oasis (Fig.12/17 panel derecho), y se midió el ensayo la relación de distancias (observada versus la esperada) . El promedio y el error estándar se presentan en la figura. El análisis estadístico se realizó utilizando una ANOVA dos vías seguido de un Post-test de Bonferroni (*: p <0,05, **: p <0 , 01 ) .

Figura 14/17

Esta figura presenta un modelo de trabajo, donde se ve una interacción entre el virus AAV/XBPls-HA y/o el virus AAV/XBPlu-HA y una célula del hipocampo y cómo actúan los mARN de Xbpls y Xbplu sobre el grupo de genes {Ryr3, Ampa 3, Bdnf y Kif 17) en la regulación del aprendizaje y la memoria. Donde la expresión de XBP1 en las neuronas del hipocampo directa o indirectamente (líneas de puntos) controla la expresión de diferentes genes implicados en el establecimiento de la memoria y otros procesos cognitivos. La regulación directa de los genes del clúster y la expresión que se produce a través de la unión de XBP1 a un sitio de unión UPRE B situado en la región promotora proximal de Bdnf.

Figura 15/17

La presente figura muestra un esquema del genoma de AAV. REP: Genes envueltos en el mecanismo de replicación de

AAV.

VP: Genes envueltos en la formación y armado de la cápside .

ITR: Es el equivalente a LTR, secuencia repetida invertida terminal . Figura 16/17

Esta figura presenta el vector del virus AAV con el inserto Xbpls con la siguiente descripción especifica según la tabla VI.

Tabla VI

nserliorrscq /note=pUC origin

Figura 17/17

Esta figura presenta generación del plasmidio adenoviral (pAAV) para XBPls. (A) Descripción de los partidores utilizados en el clonamiento de XBPls con tag HA en el vector de expresión pAAV-PGKl-MCS. Se diseñaron partidores que delimitan la secuencia XBPls murino: el partidor sentido incluye la secuencia del tag HA para el extremo 5' (panel izquierdo) y el partidor anti-sentido incluye la secuencia del tag HA para el extremo 3 ^{^} (panel derecho) indicado por la caja de color gris. a) HA- partidor sentido

b) partidor antisentido

c) partidor sentido

d) HA- partidor antisentido (B) En la figura inferior, los niveles de expresión de HA fueron evaluados a partir de extractos totales de proteínas provenientes de células HEK luego de 48 h de transfección con los distintos constructos. Los extractos de proteínas fueron hechos en solución RIPA y 35 Dg de proteínas fueron analizados mediante Western Blot en geles de acrilamida el 8%. La expresión de HA se determinó utilizando un anticuerpo primario monoclonal destinado contra HA (dilución 1:1000, (Covance. número de catalogo M S-101R) y el anticuerpo secundario anti IgG de ratón conjugado a peroxidasa (dilución 1:3000). Como control de carga se determinó la expresión de CDActina utilizando un anticuerpo primario policlonal (dilución 1:1000, Santa Cruz, número de catálogo sc-1616) y el anticuerpo secundario anti-IgG de cabra conjugado a peroxidasa (dilución 1:3000) .

EJEMPLO DE APLICACIÓN

PRUEBA EXPERIMENTAL 1

Se aplicó el virus transformado AAV/XBPls-HA localmente en cerebros de ratones silvestres para aumentar la expresión de XBPls y su actividad. La expresión selectiva en hipocampo de ratones adultos fue inducida por inyecciones esterotáxicas bilaterales del virus AAV serotipo 6, con el fin de liberar XBPls y por otro lado, un vector de control AW/MOCK, en el área de la región hipocampal CAI.

Dos semanas después de la inyección, los ratones fueron testeados en ensayos de flexibilidad de memoria. Se observaron resultados similares a los observados en los animales Tg ^XBPls , con la expresión local de XBPls en el hipocampo, resultando con un rendimiento mejorado en las tareas cognitivas (Fig. 10/17) .

Para ver si la respuesta cognitiva está correlacionada con sobreexpresión de alguno de los genes del clúster (KIF 17, AMPA 3, BDNF, RYR 3) relacionados con memoria se evaluó la sobreexpresión del mARN de uno de estos genes en el hipocampo. Se observó que existe una correlación entre el aumento de los mARN del grupo de genes mencionados anteriormente y la respuesta cognitiva (Fig. 11/17).

PRUEBA EXPERIMENTAL 2

Para validar los resultados entregados en la prueba experimental 1, el virus fue testeado en otro modelo de roedores utilizando una prueba cognitiva que evalúa la memoria dependiente del hipocampo. Se inyecto bilateralmente en la región CA3 del hipocampo de ratas con dos dosis diferentes de AAV/XBPls-HA (Fig 12/17, panel derecho), y dos semanas después de la cirugía se evaluó su comportamiento en la prueba de Oasis Maze (15) .

Las ratas que expresan XBPls-HA en el hipocampo (Fig. 12/17, panel izquierdo) presentan un aumento significativo en el porcentaje de intentos exitosos para encontrar comida escondida en el laberinto, estos efectos además, fueron dependientes de la dosis (Fig. 12/17, panel derecho y fig. 13/17) .

Material y métodos

Animales y Procedimientos Quirúrgicos :

Para todos los experimentos se utilizaron ratones masculinos de 3-6 meses de edad para XBPl ^{Nes_ ~} , Tg ^XBPls y ratones del tipo silvestre C57BL/6. Los ratones fueron mantenidos en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y tenían acceso libre a comida y agua, a menos que el experimiento lo requiriera

Para todos los experimentos en animales presentados en este desarrollo se utilizaron las directrices establecidas por el comité de cuidado y uso de animales en la Universidad de Chile, Chile.

Generación de ratones transgénicos XBPls.

El cADN Xbpls de ratón se subclonó en el sitio Xhol del vector ² MoPrP.Xho para controlar la expresión bajo el promotor PrP y la microinyección en células CBA-C57BL/6 derivadas de pronúcleos de ratón de oocitos fertilizados. El estado genético de los ratones fue confirmado por PCR de ADN genómico de colas de ratones (3 semanas) utilizando los partidores para XBPls:

Hebra sentido: 5 ' -ACACGCTTGGGAATGGACAC-3 ^*

Hebra antisentido: 5 ' -CCATGGGAAGATGTTCTGGG-3 ¹

Pruebas de comportamiento :

Todos los experimentos se realizaron a ciegas, y distintas cohortes de animales se utilizaron para cada ensayo de comportamiento . Condicionamiento de miedo contextual : En los primeros días los animales se les permitió habituarse en la cámara (Med Associates, Burlington, VT) durante 2 minutos y luego se presentan con un ruido base (80 dB) durante 30 segundos. Después de un intervalo de 2 segundos los animales se expusieron a un choque eléctrico de 0,5 mA, esta es designado como el estimulo no condicionado (US) . Este procedimiento se repitió 5 veces. 24 h después del entrenamiento, los animales se vuelven a colocar en la cámara original y se evalúan los eventos de inmovilidad durante 5 min para determinar las asociaciones del US con el contexto. Los eventos de inmovilidad se automatizan con el software ed Associates (Burlington VT) diseñado para determinar 30 observaciones en 5 min. Este experimento se realizó en ICase Western Reserve University (CWUR) Roedor Behavior Core y luego se repitió en el Neurodiscovery Center Harvard.

La flexibilidad de la memoria

El ensayo de flexibilidad de memoria se realizó según lo descrito por Chen et al, (2000). La capacitación se lleva a cabo hasta diez ensayos por día, hasta que se aprende la ubicación de la plataforma. A través de un criterio a priori de tres-escapes latentes de menos de 20 seg. Tras la finalización de las pruebas, el ratón se retiró del laberinto, se secó y volvió a su cubículo. Los datos relativos al gasto de tiempo en cada cuadrante de la piscina, se reunieron con un sistema de seguimiento de vídeo de laberinto de agua (HVS Imagen, Hampton, Reino Unido) .

Oasis Maze

Se utilizó un protocolo modificado del Oasis Maze que es una versión seca equivalente al laberinto del agua en el requerimiento de navegación espacial hipocampal. El aparato consistía en una arena en campo abierto de 1,4 m de diámetro, que se encuentra a 50 cm desde el suelo con una pared de 20 cm de altura, que se encuentra en una habitación aislada con constantes señales visuales distales. Veintiún pozos espaciados uniformemente (4,5 cm de diámetro, 2 cm de altura) se colocaron en la mesa y uno de los pozos se ceba con 50 mg de alimentos. Después de 14 dias de recuperación de la cirugía, la tarea consistió en 15 ensayos de 1 minuto cada uno por sesión, una sesión por día, durante 4 días consecutivos. Todo el comportamiento de los animales se registró en vídeo, con la ayuda de una cámara de vídeo en posición cenital.

Startle response

Los ratones fueron colocados en un cilindro de plexiglás y se dejó en reposo durante 5 min. Después de la aclimatación, cada sujeto fue presentado a 36 ensayos en una sesión de pruebas de 9 min. Se exponen a nueve niveles diferentes de sonido: 70, 74, 78, 82, 86, 90, 100, 110, y 120 (dB) . Cada estímulo fue de 40 ms y se presentó en cuatro ocasiones con un fin pseudoaleatorio . El intervalo entre ensayos promedio fue de 15 s (osciló de 10 a 20 s) . La respuesta de sobresalto se registró durante 65 ms (cada medición de la respuesta de 1 ms) a partir de la aparición del estímulo de sobresalto. La amplitud máxima del sobresalto fue registrada durante la ventana de muestreo 65 ms que se utilizó como medida dependiente.

Rotarod

Los ratones fueron colocados en una barra que gira a 4 rpm durante un minuto aclimatación. La varilla se aceleró a 0,1 rpm/s hasta 40,0 rpm. La prueba continuó hasta que todos los ratones caen de la varilla. Se registró la latencia en caer y las rpm en el momento de la caída para cada ratón. Se realizaron tres ensayos por ratón y se promediaron.

Plato caliente (Hot Píate) El animal se colocó en el plato a 55°C. Se observó al animal hasta que muestra una respuesta nociceptiva (por ejemplo, lamer sus patas traseras, saltos o chirridos) o hasta que se llegue a la hora de corte (30 seg) . El animal se retiró y la latencia de respuesta se registró. Para los animales que no responden antes de la hora de corte, se registró el tiempo de corte.

Reconocimiento de objetos nuevos Las pruebas de reconocimiento de objetos se llevaron a cabo de la siguiente manera. 24 h antes de la prueba los animales se habituaron a un campo abierto durante 15 min. El ensayo envuelve la presentación de 2 objetos idénticos en un campo abierto de 45 x 45 cm durante 10 minutos. A los animales se les permitió explorar libremente y la frecuencia y duración de las exploraciones fueron cuantificados . Una exploración fue definida por contacto visual directo a 1 cm de distancia o menos, o una interacción directa con el objeto. Después de concluido el entrenamiento, los animales se colocaron de nuevo en su casa-jaula durante 1 h. El nivel de la memoria de reconocimiento de objetos se midió por conmutación de uno de los objetos en el campo abierto y permitiendo que el animal salga a explorar los dos objetos durante 5 minutos. El objeto novedoso fue diferente pero de índice exploratorio similar. La relación de la novedad total a la exploración del objeto se utilizó para determinar la relación de discriminación exploratoria. Se midió la actividad locomotora y la exploración de ambos objetos durante las sesiones de entrenamiento y de prueba para identificar cualquier lado/preferencia objeto o diferencias generales en la actividad locomotora/exploratoria . Campo abierto

La actividad locomotora y las observaciones de comportamiento relacionados con la ansiedad fueron hechas mientras que el ratón estaba en un "campo abierto". El campo abierto consiste en una caja de 40 cm x 40 cm situada en una habitación poco iluminada. Los animales se colocan en el campo abierto y se les permite explorar el recinto libremente durante 15 min. Durante este periodo los parámetros locomotores como la distancia total de movimiento, velocidad, velocidad angular y el rumbo se midieron para determinar la actividad locomotora básica y la presencia de estereotipos.

Producción de vectores Adeno-asociado

Las partículas del virus AAV serotipo 6 (AAV2/6) fueron producidos por la transfección de células 293-AAV (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se purificaron en un gradiente de iodixanol seguido por cromatografía de afinidad en columna. El número de partículas de AAV que contiene el genoma en la suspensión, así como la infectividad de la suspensión del vector en células HEK293T se determinaron mediante ensayos TaqMan qPCR.

Preparación del plásmido adenoviral (pAAV) para XBPls . Para el desarrollo de este objetivo, la secuencia de XBPls murino fue clonada en el plásmido adenoviral pAAV-PGKl-MCS, el cual expresa el transgen bajo el promotor PGK1. Debido a la ausencia de anticuerpos que permitan reconocer XBPls en tejido W

SI murino, se incluyó la secuencia del tag HA en la estrategia de clonamiento (Figura 17/17 A), que luego nos permitirá

identificar las células transducidas y la expresión de XBPls (Sin excluir otras secuencias epitopes como Flag, Gfp, His y Myc, entre otras) . Por lo tanto, generamos la amplificación de XBPls con la secuencia del tag HA en el extremo 5' (panel izquierdo) y con la secuencia HA en el extremo 3' (panel derecho) . Los clones obtenidos fueron confirmados mediante secuenciación de ADN. De esta forma, generamos los constructos pAAV PGK HA-XBPls que codifican para la proteina de fusión XBPls con el tag HA en el extremo amino terminal y pAAV PGK XBPls-HA que codifica para la proteina fusión XBPls con el tag HA en el extremo carboxilo terminal. El plásmido adenoviral vacio pAAV PGK fue utilizado como control.

Para confirmar la expresión de los constructos generados transfectamos células HEK con los distintos constructos, luego de 48 horas de transfección realizamos la extracción de

proteínas que fueron evaluadas mediante WB utilizando un anticuerpo anti-HA.

Como se observa en la Figura 17/17 B, detectamos una banda del peso molecular esperado para XBPls (55 KDa) solamente en las células transfectadas con el plásmido pAAV PGK HA-XBPls y con pAAV PGK XBPls-HA.

El cADN XBPls-HA, que codifica C-terminal HA-etiquetados , la forma activa de ratón XBP1, se generó mediante amplificación por PCR de pCMVsport 6-mXBPls

-partidores sentido

5 ' AGCTATCGATGAGATGATGGTGGTGGTGGCAGCGGCG3

-partidores anti-sentido W

52

5 ' ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGACACTAATCAGCTGG GGGAAAA 3 ' ) y se succionaron en el vector de expresión pAAV-pgkl-MCS, que se deriva a partir del plásmid.o pAAV-CMV-MCS (Clontech) .

Inyecciones estereotáxicas

Los ratones se anestesiaron usando anestesia ketamina/xilazina (Ketamina: 100 mg/kg, xilazina: 10 mg/kg, Vetcom, Chile) , y se colocaron en un estereotáxico con barras de la nariz y de oreja para los ratones (David Kopf Instruments, EE.UU.). Inyecciones bilaterales de AAV/XBPls-HA, AAV/MOCK, AAV/BDNF-GFP o AAV/GFP se realizaron con las siguientes concentraciones: 1 x 10 ⁶ unidades de transducción/μΐ (TU) de AAV/XBPls-HA y -AAV/MOCK; Se inyectaron 1 x 10 ⁹ genomas virales/μΐ (VG) para AAV/BDNF-GFP y AAV/GFP. La expresión de EGFP se controló por PCR en tiempo real después de la inyección de los AAV para corroborar que la eficiencia de la transducción sea igual a la obtenida en estos experimentos para ambas construcciones (datos no mostrados) . La inyección de AAV se realizó en un solo punto, la inyección de 2 o 3 μΐ en la región CAI del hipocampo utilizando una jeringa Hamilton de 5 μΐ (Hamilton, EE.UU.) en las siguientes coordenadas: AP: -0,194 cm, ML: 0,1 cm, DV : -0,17 cm (de acuerdo con el atlas de Paxinos y Franklin, 1997) . La inyección se llevó a cabo a una velocidad de 0,5 μΐ/min y la aguja se deja en su lugar durante 5 min antes de la retracción de la aguja. Para las inyecciones estereotáxica en las ratas, los animales fueron anestesiados usando el anestésico de inhalación de isoflurano (éter halogenado 2-cloro-2- difluorometoxi-1, 1, 1-trifluoro-etano) , y se mantuvieron a 1,0- 2,0% de isoflurano en oxígeno al 100% y se colocan en un marco estereotáxico con la nariz y el oído con barras para ratas. Inyecciones bilaterales de AAV/XBPls-HA o AAV/MOCK se realizaron con las siguientes concentraciones: 1 x 10 ⁶ TU (IX) o 1 x 10 ⁷ TU (10X) . La inyección de AAVs se realizó en un solo punto, la inyección de 2 μΐ en la región CA3 del hipocampo utilizando una jeringa Hamilton de 5 μΐ (Hamilton, EE.UU.) en las siguientes coordenadas: AP: -0,33 cm, L: 0,36 cm, DV: - 0,33 cm (de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson, 1998). La inyección se llevó a cabo a una velocidad de 0,5 μΐ/min y la aguja se deja en su lugar durante 5 min antes de retracción de la aguja.

Preparación de tejidos para el análisis bioquímico

Los ratones fueron sacrificados por narcosis de CO ₂ , los cerebros se retiraron, y la corteza, el hipocampo, el cerebelo y la amígdala de ambos hemisferios se diseccionaron rápidamente en un plato de plástico enfriado con hielo. El tejido se homogeneizó en 100 μΐ de tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,4) suplementado con una mezcla de inhibidores de la proteasa (Roche ciencia aplicada, EE.UU.). El homogeneizado fue dividido para obtener mARN y la extracción de proteínas fue seguida por protocolos de purificación y cuantificación estándar .

Extracción de ARN y PCR en tiempo real

El ARN total fue aislado de hipocampo, la amígdala, el cerebelo y el cerebro total. Después de la homogeneización en PBS hemos seguido el protocolo de extracción de ARN Trizol recomendado por el fabricante. El cADN se sintetizó con un kit de cADN de transcripción reversa de alta capacidad (Applied Biosystems) . SYBR green y un Sistema (Stratagene) Mx3005P QPCR fueron utilizados para el RT-PCR cuantitativo. La cantidad relativa de mARN se calculó por el método de ciclo umbral comparativo con β-actina como control. Los Primers de las secuencias se obtuvieron a partir del PrimerBank (Tabla VII) .

Tabla VII

Western blot de tejido.

La extracción de proteínas a partir del tejido de ratón se llevó a cabo en tampón RIPA (20 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato, 0,5% de Tritón X-100) que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa y una mecía de inhibidores de la fosfatasa (Sigma, EE.UU.). Ejemplo de esta cuantificación se realizó con el kit de ensayo BCA (Pierce, EE.UU.). Extractos celulares totales se separaron por SDS-PAGE y fueron transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno . Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis de inmunoblot: Hsp90 (1:3000, Santa Cruz), anti eIF2a fosoforilado, eIF2 total y Hsp90 (1:1000, Cell Signaling) , BDNF (1:1000, Alomone Labs), KIF17 (1: 1000, Sigma), XBP1 (1: 1000, Poly6195-BioLegend) , β-actina y ATF4 (1: 1000, Santa Cruz) . Preparación del tejido y el análisis histológico

Los ratones fueron anestesiados con la mezcla de anestesia ketamina/xilazina y se fijaron con paraformaldehido al 4%. Las ratas fueron profundamente anestesiadas con 7% de hidrato de cloral (350 mg/kg, ip) y se fijaron con paraformaldehido al 4%. Los cerebros fueron extraídos, después fijados durante la noche a 4°C en la misma solución y posteriormente se colocó al 30% de sucrosa (Merck, EE.UU.) a 4°C durante 48 h. Los cerebros se congelaron en un compuesto óptimo para su corte a temperatura adecuada (Tissue Tek, EE.UU.), secciones coronales: 25 pm para ratones y 50 pm para ratas que conteniendo el hipocampo se cortaron en un criostato (Leica, Alemania) y a continuación, se realizaron tinciones en secciones flotantes libres.

La inmunotinción se realizó a través del kit universal plus ICQ LSAB (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, EE.UU.). Las secciones fueron incubadas con H ₂ 0 ₂ al 3% en PBS durante 30 min y se bloquearon durante 2 h con 0,5% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Tritón X-100. Las secciones se incubaron durante la noche a 4°C en solución de bloqueo, con HA (1:800, Covance) como anticuerpo primario y se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado (1:1000). Después de enjuagar tres veces las secciones fueron tratadas con complejo de avidina-biotina-peroxidasa . Las secciones fueron desarrolladas utilizando 3, 3-diaminobenzidina durante 5 min y se visualizaron en un microscopio invertido Olympus 1X71 o en un DM5500 Leica para la digitalización de las secciones completas .

Preparación y la electrofisiologia de la rebanada de hipocampo

Las rebanadas de hipocampo se prepararon de acuerdo con procedimientos estándar para los ratones a la edad de 4-6 meses. Rodajas transversales de 350 μπι del hipocampo dorsal se cortaron en liquido cefalorraquídeo artificial frío (ACSF, en mM: 124 NaCl, 2,6 NaHC0 ₃ , 10 D-glucosa, 2.69 KC1, 1.25KH ₂ P0 ₄ , CaCl ₂ 2,5, 1.3MgS0 ₄ , y 2,60 NaHP0 ₄ ) usando un vibratome (Leica VT 1000s, Alemania) y se incubaron en ACSF durante más de 1 h a temperatura ambiente. En todos los experimentos, se añadió picrotoxina (10 μΜ) a los medios de perfusión ACSF el fin de suprimir la transmisión inhibidora GABAA-. Para evocar potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSPs), fibras colaterales de Schaffer fueron activadas por la estimulación catódica bipolar, generada por un estimulador (Axon 700b, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) conectado a una unidad de aislamiento (Isoflex, AMPI, Jerusalem, Israel). Para generar LTP, en ratones XBPl ^Nes_/" que utiliza la estimulación de alta frecuencia (HFS) que consta de 3 trenes de estímulo con un inter-intervalo de trenes de 20s. Cada tren constaba de 100 Hz por 500 ms . En los ratones Tg ^XBPls utilizamos la estimulación de theta burst que consta de 5 trenes de estímulo con un intervalo de trenes de de 20s. Cada tren constaba de 8 ráfagas a 5 Hz, cada ráfaga que tiene 4 pulsos a 100 Hz. Las grabaciones se filtraron a 2,0-3,0 kHz, muestreado a 4,0 kHz utilizando un convertidor A/D, y se almacenan con ordenador pClamp 10 (Molecular Devices) . Cultivos y transfecciones neuronales

Las células Neuro2A y. células HEK293T se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino o 5%, respectivamente, y antibióticos (10000 ü/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina), a 37°C y 5% de C0 ₂ . Las neuronas corticales y del hipocampo se obtuvieron al dia embrionario 18 descrito por Goslin y Banker (1991) .

Estadísticas

Los datos se expresan como media y SEM. En función de los experimentos, los resultados fueron comparados estadísticamente utilizando la prueba T de Student o la prueba de Mann-Whitney, de dos vías ANOVA seguido por Holm-Sidack o Bonferroni como prueba post-hoc o Kruskal-Wallis ANOVA de una vía en rangos seguidos por el Método de Dunn o Bonferroni como prueba post-hoc.

Referencias

1. - Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E. & Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron 61, 10-26, doi : 10.1016/j . neuron .2008.10.055 (2009) .

2. - Park, H. & Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nat Rev Neurosci 14, 7-23, doi: 10.1038/nrn3379 (2013). 3. - Cirulli, F. , Berry, A. , Chiarotti, F. & Alleva, E.

Intrahippocampal administration of BDNF in adult rats affects short-term behavioral plasticity in the Morris water maze and performance in the elevated plus-maze. Hippocampus 14, 802- 807, doi: 10.1002/hipo.10220 (2004).

4. - Hall, J., Thomas, K. L. & Everitt, B. J. Rapid and selective induction of BDNF

expression in the hippocampus during contextual learning. Nat Neurosci 3, 533- 535, doi: 10.1038/75698 (2000).

5. - Mizuno, M., Yamada, K., Olariu, A., Nawa, H. & Nabeshima, T. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats. J Neurosci 20, 7116-7121 (2000).

6. - Rattiner, L. M. , Davis, M. & Ressler, K. J. Differential regulation of brain-derived neurotrophic factor transcripts during the consolidation of fear learning. Learn Mem 11, 727- 731, doi: 10.1101/lm.83304 (2004).

7. - Mu, J. S., Li, W. P., Yao, Z. B. & Zhou, X. F. Deprivation of endogenous brainderived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats. Brain Res 835, 259-265 (1999) .

8. - Patterson, S. L. et al. Recombinant BDNF rescues déficits in basal synaptic

transmission and hippocampal LTP in BDNF knockout mice. Neuron 16, 1137- 1145 (1996) . 9. - Tao, X., Finkbeiner, S., Arnold, D. B . , Shaywitz, A. J. & Greenberg, M. E. Ca2+ influx regulates BDNF transcription by a CREB family transcription factor dependent mechanism. Neuron 20, 709-726 (1998) .

10. - Tao, X., West, A. E . , Chen, W. G. , Corfas, G. &

Greenberg, M. E. A calcium responsive transcription factor, CaRF, that regulates neuronal activity-dependent expression of BDNF. Neuron 33, 383-395 (2002) .

11. - Cárter B, asociados-A. deno para la entrega de genes, Lassic D, et al, Eds, "Gene" Thcrapy: Mecanismos y estrategias terapéuticas ".. (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, Estados Unidos, 2000) y Gao et al., J. Virol. 2004; 78 (12): 6381- 6388.

12. - Fauli i Trillo C, "Tratado de Farmacia Galénica" (Ed Luzán 5, SA, Madrid, ES, 1993.) Y Gcnnaro A, Ed ..,

"Remington: The Science and Practice de Farmacia" 20a ed.

(Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia, PA, Estados

Unidos, 2003) .

13 Shintani, A., Ono, Y., Kaisho, Y. & Igarashi, K.

Characterization of the 5'- flanking región of the human brain-derived neurotrophic factor gene. Biochem

Biophys Res Commun 182, 325-332 (1992) . 14 Hetz, C. et al. Unfolded protein response transcription factor XBP-1 does not influence prion replication or

pathogenesis . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 757-762, doi: 10.1073/pnas.0711094105 (2008)

15 Lee, A. H . , Iwakoshi, N. N. & Glimcher, L. H. XBP-1 regulates a subset of

endoplasmic reticulum resident chaperone genes in the unfolded protein response.Mol Cell Biol 23, 7448-7459 (2003) .

16 Product Data Sheet Paav-MCS Expression vector, Catalog Number: VPK- 10.

17 Acosta-Alvear, D. et al. XBP1 controls diverse cell type- and condition-specific transcriptional regulatory networks. Molecular cell 27, 53-66, doi : 10.1016/j .molcel .2007.06.011 (2007) .

18 Candace et al (2005) Journal of Pharmaceutical Sciences, volume 94 number (6), pages 1187-1195.

19 Constantini et al (2000) Gene Therapy volume 7, pages 93- 10.

20 ülusoy et al (1999) Molecular Theraphy volume 17, no 9, pages 1574-1584.