Гаптен-специфичес ая хроматография для выделения естественных антител человека к антигену Le ^c

Область техники

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам аффинного выделения естественных антител человека к антигену Le ^c посредством гаптен-специфической хроматографии.

Уровень техники

В крови человека содержатся естественные антитела к гликанам (углеводная цепь, входящая в природные гликопротеины или гликолипиды), они выполняют функцию надзора за проникающими в организм патогенами, а также периодически возникающими трансформированными клетками самого человека [1]. Отсутствие или пониженный уровень таких антител являются фактором риска, а их терапевтическое восполнение, как предполагается, может стать новым направлением в терапии и предотвращении рака [2].

Для около трети больных раком молочной железы наблюдается низкое значение

(значительно меньше, чем у здоровых доноров) титра антител к углеводному антигену Le ^c , представляющего собой дисахарид Gaipi-3GlcNAcp [3,4], и у них же повышен уровень данного антигена в опухоли молочной железы [3]. Считается, что пониженный уровень этих антител является не результатом развития опухоли, а предопределено генетически; и опухоль развивается как результат нескольких причин, одной из которых является дефицит данных естественных антител. Поэтому анти-1_е ^с антитела представляют собой перспективное лекарство.

Современная антительная терапия основана на моноклональных антителах, однако получение моноклональных антител к опухолевому антигену Le ^c представляется чрезвычайно сложно осуществимой задачей, так как специфичность естественных антител определяется не только химической структурой дисахарида, но и его презентацией на опухолевой клетке как антигена - непонятно, что брать в качестве иммуногена и каким образом выполнять отбор необходимых гибридом. Действительно, единственная до сих пор полученная гибридома, узнающая данный антиген [5], отличается по специфичности от естественных антител [6], попытки найти похожие специфичности среди гибридом, полученных иммунизацией мышей опухолеассоциированным гликопротеином, содержащим последовательность Gai i- 3GlcNAcp [6], также дала похожую, но не идентичную человеческим антителам специфичность. Более того, множественность вариантов иммунологического представления данного антигена опухолевыми клетками предполагает, что поликлональные антитела должны быть эффективнее моноклональных. Вышеуказанные факты свидетельствуют в пользу перспективности лечения опухолевых заболеваний поликлональными антителами человека, эволюционно отобранными для предотвращения болезни. Содержание этих антител в крови или в препаратах терапевтических иммуноглобулинов составляет величину менее 0.1 % от общего количества иммуноглобулинов, что делает невозможным применение тотального иммуноглобулина для онкотерапии. В то же время, это вполне достаточное количество для того, чтобы практически приемлемые количества можно было выделять в индивидуальном или значительно обогащенном виде. То есть, возникла необходимость разработки метода выделения специфичных анти-1_е ^с антител из крови человека. Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа выделения естественных антител к антигену 1_е ^с из антитело-содержащего материала посредством гаптен-специфической аффинной хроматографии.

Техническим результатом данного изобретения является разработка нового эффективного способа выделения естественных антител к антигену Le ^c (Galp1-3GlcNAcp) из антитело-содержащего материала посредством гаптен-специфической аффинной хроматографии, который позволяет с высоким выходом (целевые антитела извлекаются практически полностью и без остатка) получать большие количества антител к антигену Le ^c (в том числе многие граммы и более) для применения указанных антител в терапевтических целях, в частности, для лечения онкологических заболеваний, а именно рака молочной железы. При этом важно то, что способ по изобретению позволяет получать антитела, характеризующиеся высокой специфичностью к антигену Le ^c , с минимальным содержанием в полученном продукте других иммуноглобулинов. Помимо этого, способ по изобретению позволяют избежать денатурации иммуноглобулинов в процессе его выделения.

Кроме того, способ по изобретению позволяет минимизировать количество реагентов и материалов, используемых для его осуществления, причем способ по изобретению позволяет выделить за один цикл (один эксперимент) количество продукта, приближающиеся к граммовым.

Указанный технический результат достигается посредством осуществления способа выделения антител человека к углеводному антигену Le ^c из антитело- содержащего материала посредством гаптен-специфической хроматографии, включающий следующие этапы:

- нанесение антитело-содержащего материала в буферном растворе на аффинный сорбент, помещенный в хроматографическую колонку и представляющий собой иммобилизованный на матрице дисахарид Gal 1-3GlcNAc ; - промывка колонки с сорбентом и нанесенным на него антитело-содержащим материалом буферным раствором;

- элюирование антител с помощью буферного раствора, имеющего щелочное или кислое значение величины рН;

- доведение рН полученного раствора элюата до нейтрального значения;

- концентрирование полученного раствора элюата.

В частных вариантах воплощения изобретения указанные этапы проведения процесса осуществляются при температуре 2-8 °С. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения этапы проведения процесса осуществляются при температуре 4 °С.

В частных вариантах воплощения изобретения антитело-содержащий материал представляет собой комплексный иммуноглобулиновый препарат или полупродукт его производства.

В частных вариантах воплощения изобретения полупродукт производства комплексного иммуноглобулинового препарата представляет собой раствор комплексного иммуноглобулинового препарата до лиофилизации.

В частных вариантах воплощения изобретения антитело-содержащий материал представляет собой сыворотку крови человека.

В частных вариантах воплощения изобретения в качестве матрицы используется сефароза.

В частных вариантах воплощения изобретения способ включает проведение дополнительной стадии очистки антител.

В частных вариантах воплощения изобретения дополнительная стадия очистки проводится на матрице без иммобилизованного на ней дисахарида Gal 1-3GlcNAc . В частных вариантах воплощения изобретения в качестве матрицы используется сефароза.

В частных вариантах воплощения изобретения дополнительная стадия очистки проводится перед проведением нанесения антитело-содержащего материала в буферном растворе на аффинный сорбент. В частных вариантах воплощения изобретения в качестве матрицы используется PAA-Sepharose.

В частных вариантах воплощения изобретения дополнительная стадия очистки проводится после проведения основной стадии выделения антител на аффинном сорбенте.

В частных вариантах воплощения изобретения антитело-содержащий материал наносят на сорбент в фосфатно-солевом буферном растворе рН 7.2 - 7.4. в частных вариантах воплощения изобретения в буферный раствор добавляют раствор 0.3% масс. /об. бычьего сывороточного альбумина если антитело-содержащий материал представляет собой полупродукт производства комплексного иммуноглобулинового препарата. В частных вариантах воплощения изобретения концентрация белка в растворе антитело-содержащего материала составляет 30 - 40 мг/мл.

В частных вариантах воплощения изобретения концентрация белка в растворе антитело-содержащего материала составляет 35 мг/мл.

В частных вариантах воплощения изобретения линейная скорость нанесения антитело-содержащего материала на аффинный сорбент, помещенный в хроматографическую колонку, составляет 10 - 20 мг/мл.

В частных вариантах воплощения изобретения линейная скорость нанесения антитело-содержащего материала на аффинный сорбент, помещенный в хроматографическую колонку, составляет 15 см/час.

В частных вариантах воплощения изобретения нагрузка общего белка антитело- содержащего материала составляет 450 - 500 мг на 1 мл сорбента.

В частных вариантах воплощения изобретения нагрузка общего белка антитело- содержащего материала составляет 500 мг на 1 мл сорбента.

В частных вариантах воплощения изобретения нанесенный на колонку материал, после промывки буфером раствором до базовой линии на хроматограмме, нужно затем промывать 0.14 М фосфатно-солевым буфером. В частных вариантах воплощения изобретения буфер для промывки используют в объеме, равным 20-30 объемам колонки.

В частных вариантах воплощения изобретения скорость потока при промывке составляет 30 - 100 см/час.

В частных вариантах воплощения изобретения скорость потока при промывке составляет 70 см/час.

В частных вариантах воплощения изобретения элюирование антител осуществляют 0.2М Трис с 0.5М NaCI буфером рН 10.2.

В частных вариантах воплощения изобретения скорость потока при элюировании составляет 20 - 50 см/час.

В частных вариантах воплощения изобретения скорость потока при элюировании составляет 30 см/час.

В частных вариантах воплощения изобретения концентрирование полученного раствора элюата осуществляется после доведения рН раствора элюата до нейтрального значения. В частных вариантах воплощения изобретения концентрирование осуществляется с помощью системы с ультрафильтрационными мембранами MWCO100.

В частных вариантах воплощения изобретения дисахарид иммобилизован на матрицу в виде гликозида Gai i -3GlcNAc -OCH2CH2CH ₂ NH ₂ . Краткое описание чертежей

Фигура 1. Прямой иммуноферментный анализ (ИФА). Связывание анти-1_е ^с антител (1) и модифицированных биотином анти-1_е ^с антител (2) с Le ^c -PAA. Отрицательный контроль - связывание с Glucitol-PAA (3 и 4). Антитела были помечены биотином, но в данном варианте теста все первичные антитела были проанализированы с помощью вторичных антител, узнающих человеческие IgM (результаты приведены на графике) или IgG антитела. ОП - оптическая плотность.

Фигура 2. Прямой ИФА. Связывание анти-Le ⁰ антител, хранившихся в течение двух недель при 4°С в ФСБ, содержащем 0.02% NaN ₃ (1) и анти-Le ⁰ антител, хранившихся при -20°С в течение двух недель в ФСБ (без NaN ₃ ) (2), с 1_е ^с -РАА. Отрицательный контроль: связывание с Glucitol-PAA (3 и 4). ОП - оптическая плотность.

Фигура 3. Прямой ИФА. Взаимодействия анти-1_е ^с антител с 1_е ^с -РАА. Двукратная раститровка антител от 5 мкг/мл (бары - черного цвета). 1 - антитела, полученные из полуфабриката КИП на сорбенте Le ^c -PAA-Sepharose 4FF; 2 - антитела, полученные из полуфабриката КИП на автоклавированном сорбенте Le ^c -PAA-Sepharose 4FF; 3 - антитела, полученные из полуфабриката КИП на сорбенте Le°-PAA-Sepharose 6FF; 4 - антитела, полученные из полуфабриката КИП (диализованного в ФСБ) на сорбенте 1_е ^с - PAA-Sepharose 6FF. ОП - оптическая плотность.

Фигура 4. Ингибиторный ИФА. Ингибирование взаимодействия биотинилированных анти-1_е ^с антител (2 мкг/мл) с 1_е ^с -РАА с добавлением ингибитора LeC дисахарида (двукратная раститровка от 4.5мМ до 0.5 мМ):

- 50% ингибирование биотинилированных анти-1_е ^с антител наблюдается при 1.4 мМ1_е ^с ;

- 50% ингибирование анти-Ье ^с антител (небиотинилированных) наблюдается при 3 мМ Le ^c (данные не приведены).

Определение и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Под термином «матрица» в данном документе понимается гидрофильный пористый материал, используемый в биотехнологии для получения аффинных и других сорбентов. В качестве такой матрицы, в частности, может быть использован сшитый полисахарид агароза (сефароза). Под термином «антитело-содержащий материал» в данном документе понимается, в частности, пулированная цельная плазма или сыворотка крови здоровых доноров, или суммарные иммуноглобулины, полученные из нее с помощью неспецифического фракционирования (без применения аффинной хроматографии), в том числе комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) или полупродукт его производства.

Под термином «комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП)» в данном документе понимается комплексный иммуноглобулиновый препарат, получаемый из пула здоровых доноров (не менее 1000 доноров), состоящий из антител классов IgG, IgM и IgA (к примеру, производитель ИММУНО-ГЕМ ЗАО (Россия)).

Под термином «гаптен» в данном документе понимают иммунологически активный небольшой фрагмент макромолекулы-антигена, а именно Gaipi-3GlcNAcp (антиген Le ^c ).

«ФСБ» в настоящем документе означает фосфатно-солевой буферный раствор.

«БСА» в настоящем документе означает бычий сывороточный альбумин.

«ЧСА» в настоящем документе означает человеческий сывороточный альбумин.

«ИФА» в настоящем документе означает иммуноферментный анализ.

«Буфер А» - ФСБ буфер, рН 7.4.

«Буфер В» - ФСБ, содержащий 0.1 % Твин-20, рН 7.4.

«Буфер С»- ФСБ, содержащий 0.5% Твин-20, рН 7.4.

«Буфер D» - 0,2М Трис, рН=10.4.

«Буфер Е» - 0,2М Трис/0,5М NaCI, рН 10.2.

«Буфер F»- 2М Трис, рН 10.4.

«Буфер G» -0,2М Глицин HCI, рН=2.5.

«Буфер Н» - 2М Глицин HCI, рН=2.5.

Подробное раскрытие изобретения

Единственным методологическим подходом для выделения естественных специфических антител в настоящее время является гаптен-специфическая аффинная хроматография. Она проводится с помощью сорбентов, представляющих собой гаптен (иммунологически активный небольшой фрагмент макромолекулы-антигена), химически иммобилизованный на подходящей матрице-носителе. В качестве такой матрицы, в частности, используют сшитый полисахарид агарозу, который получил название сефароза (Sepharose). В данном изобретении иммобилизовали химически синтезированный дисахарид Gai i-3GlcNAc , в частности, в виде гликозида Gal l - 3Glc Ac -OCH2CH2CH ₂ NI-l2, на коммерческой сефарозе.

Лабораторный вариант выделения (количества около 1 мг антител) анти-1_е ^с антител на таком сорбенте описан авторами ранее [4,7], однако, для выделения антител, предназначенных для терапевтических целей (в частности, многие граммы и больше), с минимальным содержанием других иммуноглобулинов и характеризующихся высокой специфичностью к указанному антигену, описанный в цитированных статьях протокол выделения не подходит и не позволит это осуществить, потому что масштабирование выделения белка не является простым увеличением объема колонки с сорбентом, и количества исходного материала. Поэтому разработка эффективного способа выделения белка для терапевтических целей в больших количествах (многие граммы и больше) является нетривиальной задачей, которую решает настоящее изобретение.

Данное изобретение направлено на достижение в одном протоколе выделения антител следующих результатов: 1) повышение выхода целевых антител, 2) получение продукта с минимальным содержанием посторонних иммуноглобулинов и характеризующегося высокой специфичностью к указанному антигену, 3) минимизирование количества материалов и реагентов, используемых при выделении, 4) получение продукта, который не подвергался денатурации в процессе его выделения, 5) разработка протокола, позволяющего выделять за один цикл количества продукта, приближающиеся к граммовым, и поддающегося дальнейшему масштабированию.

Естественные антиуглеводные антитела человека выделяют из донорской сыворотки или её отдельных фракций. Наиболее доступным и удобным материалом для выделения является КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат, представляющий собой гаммоглобулиновую фракцию сыворотки крови тысячи и более доноров.

В данном документе представлены экспериментальные данные, которые получены по результатам исследований с использованием двух вариантов аминосефарозы, а именно 4FF и 6FF FastFlow.

Способ выделения антител включает следующие этапы:

1 ) нанесение антитело-содержащего материала (например, КИП, сыворотка крови) на аффинный сорбент;

2) отмывка сорбента от неспецифических антител;

3) элюция специфичных антител;

4) концентрирование полученного раствора элюата.

Также способ по изобретению может дополнительно включать этап пред-очистки (в случае КИП), или пост-очистки (в случае сыворотки крови как источника антител) антител на аналогичном сорбенте без углеводного гаптена (PAA-Sepharose), который адсорбирует те антитела, которые могут связаться с материалом сорбента как таковым, а не с пришитым к нему дисахаридом.

На основе общей схемы выделения антител с помощью гаптен-специфического сорбента были проведены две серии экспериментов, которые проводили при разных значениях основных параметров процесса. Ввиду того, что параметров было несколько, и заранее нельзя было предположить, являются ли они независимыми, количество экспериментов было большим.

1 серия: эксперименты с использованием колонки размером 100 мл, заполненной сорбентом Le ^c -PAA-Sepharose 4FF;

2 серия: эксперименты с использованием колонок размером 5 - 20 мл, заполненных сорбентом Le ^c -PAA- Sepharose 4FF или 6FF.

После того, как были обнаружены оптимальные условия процесса на этих небольших колонках, было проведено более масштабное выделение антител на колонке размером 1000 мл. Масштабирование, как правило, проводят пошагово, то есть, увеличивая масштаб не более, чем в 5 раз, в данном случае также были проведены промежуточные эксперименты на колонках 100 и 500 мл, результаты которых позволили продолжить дальнейшее масштабирования процесса. Специфичность и степень активности антител каждый раз подтверждали с помощью иммуноферментного анализа, как сразу после их выделения, так и после хранения. В ряде случаев определяли соотношение классов антител в конечном продукте (то есть, IgG/lgM).

Методика работы.

Перед заполнением колонки сорбент отмывали от консерванта водой, а затем переводили под буфер А и дегазировали в круглодонной колбе с помощью водоструйного насоса в течение 30 минут.

Колонку для хроматографии уравновешивали буфером А. КИП разводили до выбранной концентрации белка буфером А или В. После нанесения материала сорбент промывали буфером А или С. Затем проводили элюцию антител щелочными буферными системами (буфер D, Е) с немедленной нейтрализацией фракций элюции с помощью буфера Н. Фракции концентрировали с помощью концентратора Vivaspin 20 в течение 1 часа 8000 ^χ g, при 4°С. Контроль хроматографических фракций осуществляли с помощью УФ детектора (280 нм).

Определение общего белка в КИПе и проскоке (материале, который не сорбировался на сорбенте) проводили спектрофотометрически при длинах волн 280 и 260 нм методом Варбурга и Христиана. Для вычисления концентрации белка использовали следующую формулу: Концентрация (мг/мл) = [1.55 А ₂₈ о - 0.76 А ₂₆ о], где A ₂ so - поглощение раствора белка при длине волны 280 нм, А _2б о - поглощение раствора белка при длине волны 260 нм.

Определение общего белка в элюате проводили спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Для вычисления концентрации белка использовали следующую формулу: Концентрация (мг/мл) = A ₂ so / E ₂ so1 мг/мл, где Е ₂₈ о1 мг/мл - коэффициент экстинкции для IgM и IgG, равный 1 ,4. Определение концентрации IgM и IgG в элюате проводили методом иммуноферментного анализа. Варианты проведения эксперимента по выделению специфических антител путем хроматографии на Le ^c -PAA-Sepharose

В первой серии экспериментов проводилось 4 опыта. В трех экспериментах бралось равное количество КИП (150 мл), в ещё одном было использовано 500 мл. Отличались условия нанесения, промывки и элюции (табл. 2 и 3). Размер колонки и объём сорбента были одинаковыми (2,5 ^χ 20 см, 100 мл).

Первая серия экспериментов.

Вариант 1

150 мл КИП (1 1.6 г белка) разводили до концентрации по белку 25 мг/мл в буфере В. Полученный раствор наносили на колонку с линейной скоростью 31 см/час. Затем колонку промывали последовательно 400 мл буфером С, 41 см/час и 200 мл буфером А, 41 см/час. Целевые Ig элюировали 150 мл буфером D, 41 см/час. рН полученных фракций был доведен до нейтральных значений буфером Н. В итоге было получено 10.7 мг конечного продукта, а после концентрирования - 4.4 мг. Хроматографию проводили при 22 °С.

Вариант 2

150 мл КИП (1 1.8 г белка) разводили до концентрации 12.5 мг/мл в буфере В. Полученный белковый раствор наносили на колонку с линейной скоростью 10 см/час в течение 18 часов при 4 ^° С. Далее хроматографию проводили при 22°С. Колонку последовательно промывали 400 мл буфером С и 200 мл буфером А, 41 см/час. Элюцию целевых Ig проводили в два этапа: на первом этапе через колонку пропускали 150 мл буфера D, 31 см/час. При этом получили 4 мг антител. На втором этапе через колонку пропускали 150 мл буфера Е, 31 см/час. При этом получили 3 мг антител. рН полученных фракций был доведен до нейтральных значений буфером Н. После концентрирования суммарная фракция антител составила 4.4 мг (2.9 + 1.5 соответственно).

Вариант 3

150мл КИП (10.4г белка) разводили до концентрации по белку 25 мг/мл в буфере В. Полученный раствор наносили на колонку с линейной скоростью 41 см/час. Колонку последовательно промывали 400 мл буфером С и 200 мл буфером А, 41 см/час. Элюцию целевых Ig проводили в два этапа: на первом этапе через колонку пропускали 150 мл буфера D, 41 см/час. При этом получили 6.6 мг антител. На втором этапе через колонку пропускали 150 мл буфера Е, 41 см/час. При этом получили 1.2 мг антител. рН полученных фракций был доведен до нейтральных значений буфером Н. После концентрирования суммарная фракция антител составила 6.6 мг (6 + 0.6 соответственно). Хроматографию проводили при 22 °С.

Вариант 4

500мл КИП (36.9г белка) разводили до концентрации по белку 25 мг/мл в буфере Аи доводили значения рН раствора до нейтральных с помощью 0,1 н NaOH. Полученный раствор наносили на колонку с линейной скоростью 16 см/час. Колонку последовательно промывали 200 мл буфером А, 16 см/час и затем продолжали последовательно промывать буфером А до исчезновения белка, 250 мл буфером С и снова 500 мл буфером А (500 мл), все этапы со скоростью 50 см/час. Элюцию целевых lg проводили в два этапа: на первом этапе через колонку пропускали 150 мл буфера D, 16 см/час. Получили 22.7 мг антител. На втором этапе через колонку пропускали 150 мл буфера Е, 16 см/час. При этом получили 7.4 мг антител. рН полученных фракций был доведен до нейтральных значений буфером Н. После концентрирования суммарная фракция антител составила 26.9 мг (20.6 + 6.3 соответственно). Хроматографию проводили при 4°С.

Таблица 1. Содержание общего белка в исходном материале и конечном продукте.

Таблица 2. Варианты хроматографических параметров: скорости процессов, количество и концентрация белка.

3 41 41 41 104 25

4 16 50 16 369 25

Таблица 3. Варианты хроматографических параметров: буферные системы.

Вторая серия экспериментов.

Методика работы.

Перед заполнением колонки сорбент отмывали от консерванта водой, а затем переводили под буфер А и дегазировали в круглодонной колбе с помощью водоструйного насоса в течение 10 минут.

Колонку для хроматографии уравновешивали буфером А. КИП разводили до выбранной концентрации белка буфером А. После нанесения материала сорбент промывали буфером А до исчезновения белка в смыве (то есть белка, который не адсорбировался на колонке). Затем проводили элюцию антител щелочными и кислыми буферными системами (Е, G) с немедленной нейтрализацией фракций элюции с помощью буферных системН, Рсоответственно. Хроматографию проводили при 22°С. Фракции концентрировали с помощью пробирок Millipore (MWCO 100), 2500 ^χ g, при 4°С. Контроль хроматографических фракций осуществляли с помощью УФ детектора (280 нм).

Все буферные системы содержали консервант 0.02% NaN ₃ . Для ряда клеточных экспериментов антитела переводили в буферные системы без консерванта. Часть антител биотинилировали. Полученные антитела хранили при 4°С до 6 месяцев или в виде небольших аликвот при -20 °С с однократным размораживанием.

Обобщённые различия хроматографических параметров приведены в таблице 4.

Таблица 4. Разные варианты хроматографических параметров и условий

Таблица 5. Результирующая таблица по выделению анти-1_е ^с -антител.

Скорость нанесения 6 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП разводили в буфере А.

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G.

Итоговое количество

2 Вариант анти-Le ⁰ антител;

соотношение IgGilgM

Автоклавированный

Сорбент Le ^c -PAA-Sepharose

4FF

Параметры колонки 1 .1 x 10.9 см

Материал для выделения п/ф КИП 0.1 мг

1 : 16

Общее количество и концентрация 3.6 г

белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 350 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 6 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП разводили в буфере А.

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G

Итоговое количество

3 Вариант

анти-Le ⁰ антител;

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

4FF

Параметры колонки 1 .1 x5.4 см

Материал для выделения п/ф КИП

0.1 мг

Общее количество и концентрация 0.73 г н/д* белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 140 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП диализовали в буфер А;

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G

Итоговое количество

4 Вариант

анти-Le ⁰ антител;

Автоклавированный

Сорбент Le ^c -PAA- Sepharose 0.2 мг

4FF н/д

Параметры колонки 1.1 x5.5 см Материал для выделения п/ф КИП

Общее количество и концентрация 0.73 г

белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 140 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

-Полуфабрикат КИП диализовали в буфер А;

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G

Итоговое количество

5 Вариант анти-Le ⁰ антител;

соотношение IgG.IgM

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

6FF

Параметры колонки 1.1 x5.4 см

Материал для выделения п/ф КИП

0.1 г

Общее количество и концентрация 1.8 г 1 :8 белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 350 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП разводили в буфере А.

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G

Итоговое количество

6 Вариант анти-Le ⁰ антител;

соотношение IgG.IgM

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

6FF

Параметры колонки 1.1 x4.3 см

Материал для выделения п/ф КИП

0.2мг

Общее количество и концентрация 1.4 г 1 :67 белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 350 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП диализовали в буфер А;

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G Итоговое количество

7 Вариант анти-Le ⁰ антител;

соотношение lgG:lgM

Сорбент Le ^c -PAA-Sepharose

6FF

Параметры колонки 1 .1 x4.3 см

Материал для выделения п/ф КИП

0.2 мг

Общее количество и концентрация

1 .4 г 1 :67 белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 350 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

-Полуфабрикат КИП диализовали в буфер А;

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G

Итоговое количество

8 Вариант

анти-Le ⁰ антител

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

6FF

Параметры колонки 1 .1 x 17.8 см

Материал для выделения КИП 0.24 мг

1 .2 г после очистки н/д

Общее количество и концентрация

на PAA-Sepharose

белка при нанесении на сорбент

35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 70 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- КИП растворяли в буфере А, и добавляли 0.3% (масс/об.) БСА.

- Предварительная очистка раствора КИП на сорбенте без углеводного гаптена РАА- Sepharose 6FF.

- Элюция антител щелочным буфером Е.

Итоговое количество

9 Вариант

анти-Le ⁰ антител

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент 0.2 мг

6FF н/д

Параметры колонки 1 .1 x 17.8 см Материал для выделения ИП

Общее количество и концентрация 2.1 г

белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 350 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- КИП растворяли в буфере А, и добавляли 0.3% w/v БСА.

- Предварительная очистка раствора КИП на сорбенте без углеводного гаптена PAASepharose 6FF.

- Элюция антител щелочным буфером Е.

Итоговое количество

10 Вариант

анти-Le ⁰ антител

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

6FF

Параметры колонки 1.1 x10 см

Материал для выделения КИП 1 ) стадия - 1 мг

Общее количество и концентрация 4.5 г 2) стадия - 0.2 мг белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл н/д

Концентрация на 1 мл сорбента 470 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 6 см/час

Комментарии:

- КИП растворяли в буфере А, добавляли 0.3% w/v БСА.

- Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G. -Полученные специфичные антитела пропускали через PAA-Sepharose 6FF (пост-очистка).

Итоговое количество

11 Вариант

анти-Le ⁰ антител

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

6FF

Параметры колонки 2.4x4.7см

Материал для выделения КИП 1) стадия - 1.5 мг

2) стадия - 0.8 мг

Общее количество и концентрация 4.5 г

н/д белка при нанесении на сорбент 35 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 470 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 12 см/час

Комментарии:

- КИП растворяли в буфере А, добавляли 0.3% w/v БСА.

-Элюция последовательно двумя буферными системами: Е и G. - Полученные специфичные антитела пропускали через PAA-Sepharose 6FF с помощью системы AmiconPro.

Итоговое количество

12 Вариант анти-Le ⁰ антител;

соотношение IgG.IgM

Le ^c -PAA-Sepharose

Сорбент

4FF

Параметры колонки 1.1 22 см

Материал для выделения п/ф КИП 1) стадия - 2.33 мг

2) стадия - 1.33 мг

Общее количество и концентрация 9.45 г

1 :4 белка при нанесении на сорбент 31.5 мг/мл

Концентрация на 1 мл сорбента 450 мг/мл сорбента

Скорость нанесения 15 см/час

Комментарии:

- Полуфабрикат КИП разводили в буфере Ав 2 раза.

- Элюция буфером Е.

- Полученные специфичные антитела пропускали через PAA-Sepharose 4FF с помощью системы AmiconPro.

^* н/д - не смотрели соотношение IgG/lgM

Таблица 6. Содержание общего белка и в исходном материале и в конечном продукте.

12 9.5 1.3 0.01

Таблица 7. Хроматографические параметры: скорость процессов, количество и концентрация белка.

Таблица 8. Хроматографические параметры: буферные системы.

N2 Буфер для

Буфер для элюции Стадии выделения и сорбенты варианта разведения КИП

0.2 М Трис/ 0.5 NaCI выделение на Le ^c -PAA-

ФСБ рН 10.2; Sepharose 4FF

1 а стадия выделения - не

(Буфер А) 0.2 М глицин HCI рН 2.5 (одн

проводили пред-очистку или

(Буфер Е и G) пост-очистку) выделение на Le ^c -PAA-

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI

Sepharose 4FF

ФСБ рН 10.2

2 автоклавироанный сорбент

(Буфер А) 0.2 М глицин HCI рН 2.5

(одна стадия выделения - не

(Буфер Е и G)

проводили пред-очистку или пост-очистку)

Диализ в ФСБ 0.2 М Трис/ 0.5М NaCI

3

рН 10.2

(Диализ в буфер выделение на Le ^c -PAA- A) 0.2М глицин HCI рН 2.5 Sepharose 4FF (Буфер Е и G) (одна стадия выделения - не проводили пред-очистку или пост-очистку) выделение на Le ^c -PAA-

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI

Sepharose 4FF рН 10.2

Диализ в ФСБ автоклавированный сорбент

0.2 глицин HCI рН 2.5

(одна стадия выделения - не

(Буфер Е и G)

проводили пред-очистку или пост-очистку)

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI выделение на Le ^c -PAA- рН 10.2 Sepharose 6FF

ФСБ

0.2 глицин HCI рН 2.5 (одна стадия выделения - не

(Буфер Е и G) проводили пред-очистку или пост-очистку)

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI выделение на Le ^c -PAA- рН 10.2 Sepharose 6FF

Диализ в ФСБ

0.2 М глицин HCI рН 2.5 (одна стадия выделения - не проводили пред-очистку или

(Буфер Е и G) пост-очистку)

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI выделение на Le ^c -PAA- рН 10.2 Sepharose 6FF

Диализ в ФСБ

0.2 М глицин HCI рН 2.5 (одна стадия выделения - не проводили пред-очистку или

(Буфер Е и G) пост-очистку)

Пред-очистка КИП на PAA-

0.2 М Трис/ 0. 5М NaCI Sepharose 6FF

ФСБ + 0,3% БСА рН 10.2 выделение на Le ^c -PAA-

(Буфер Е) Sepharose 6FF

(две стадии выделения)

Пред-очистка КИП на PAA-

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI Sepharose 6FF

ФСБ + 0,3% БСА рН 10.2 выделение на Le ^c -PAA-

(Буфер Е) Sepharose 6FF

(две стадии выделения)

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI выделение на Le ^c -PAA- рН 10.2 Sepharose 6FF

ФСБ + 0,3% БСА

0.2 М глицин HCI рН 2.5 Пост-очистка выделенных

(Буфер Е и G) антител на PAA-Sepharose 6FF (две стадии выделения) выделение на Le ^c -PAA-

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI

Sepharose 6FF рН 10.2

11 ФСБ + 0,3% БСА Пост-очистка выделенных

0.2 М глицин HCI рН 2.5

антител на PAA-Sepharose 6FF

(Буфер Е и G)

(две стадии выделения) выделение на Le ^c -PAA-

0.2 М Трис/ 0.5 М NaCI Sepharose 4FF

12 ФСБ + 0,3% БСА рН 10.2 Пост-очистка выделенных

(Буфер Е) антител на PAA-Sepharose 4FF

(две стадии выделения)

Таким образом, в результате проведенных исследований были неожиданно найдены нижеследующие параметры для оптимального проведения процесса выделения естественных антител человека к антигену Le ^c способом по изобретению. Так, температурой, являющейся оптимальной для проведения процесса, является температура 2-8 °С, в частности температура 4 °С для лучшей сохранности антител (предотвращение денатурации в ходе проведения процесса). Вторая стадия очистки (пред- или пост-очистка) увеличивает долю специфичных антител в конечном продукте, что подтверждается данными ИФА.

В некоторых предпочтительных вариантах исходный материал необходимо развести буфером А (ФСБ рН 7.2 - 7.4) до конечной концентрации белка 35 мг/мл. В случае использования в качестве исходного материала полуфабриката КИП, необходимо довести рН раствора до нейтральных значений с помощью 0.1 н NaOH. В случае использования лиофилизованного КИП, необходимо добавлять в буфер разведения 0.3% БСА.

В некоторых вариантах воплощения изобретения линейная скорость нанесения исходного материала на колонку составляет^ см/час, увеличение скорости потока в два раза приводит к возрастанию содержания неспецифических антител в элюате, а уменьшение скорости в два раза не приводит к увеличению содержания специфических антител в элюате. В некоторых вариантах воплощения изобретения максимальная нагрузка составляет 450-500 мг общего белка (например, КИП) на 1 мл сорбента, в частности 500 мг общего белка на 1 мл сорбента. Увеличение нагрузки не приводит к элюции большего количества антител с колонки.

В некоторых вариантах воплощения изобретения нанесенный на колонку материал после промывки исходным буфером до базовой линии на хроматограмме (то есть отсутствие антител в смыве) нужно затем промывать буфером А (в количестве 20-30 объёмов колонки), контролируя выход хроматограммы на базовую линию. Скорость при промывках, в частности, 70 см/час.

В некоторых вариантах воплощения изобретения элюция целевых антител проводится посредством буфера Е, скорость элюции, в частности, 30 см/час. Конечный продукт необходимо немедленно нейтрализовать и концентрировать, предпочтительны системы с ультрафильтрационными мембранами MWCO100. Более концентрированные препараты антител более стабильны при хранении.

Отклонения от приведенных выше оптимальных значений приводят к снижению выхода специфического иммуноглобулина. Тем не менее, при небольших отклонениях от оптимальных значений выход целевых антител останется сопоставимо высоким.

Описанные выше материалы относятся к выделению антител из препаратов КИП. Эти же антитела выделяли также непосредственно из индивидуальной или пулированной сыворотки крови здоровых доноров; методика аналогична таковой для выделения из КИП, сыворотку разводят в ФСБ до 35 мг/мл по общему белку, и наносят на сорбент, с максимальной нагрузкой 450 мг белка на 1 мл сорбента.

Примеры осуществления изобретения.

Приборы и материалы.

Хроматографическая колонка диаметром 25 мм, высотой 20 см, площадью поперечного сечения 4.9 см ² . Хроматографическая колонка диаметром 1 1 мм, высотой 5 - 20 см, площадью поперечного сечения 0.95 см ² .

Перистальтический насос MINIPULS® 3 (Gilson, Франция). Проточный УФ-детектор ЕМ-1 Econo UV monitor (Bio-Rad, США). Регистратор-самописец Gilson N2 (Франция). Автоматический коллектор фракций Fraction Collector Frac 100 (Amersham, Pharmacia by Biosciences, England).

Спектрофотометр Ultrospec 3300 pro UV/Visible Spectrophotometer (Amersham, Pharmacia by Biosciences, England). Настольная многофункциональная центрифуга CR3L Key Write-D™ (Thermo electron corporation, США) с угловым ротором. Устройство для концентрирования Vivaspin 20 (Sartorius Stedim Biotech, Германия), размер пор - 30 MWCO.

Многофункциональный вертикальный спектрофотометр Wallac 1420 Victor ² (Perkin Elmer, США).

Amicon Pro Centrifugal Filters (Millipore, USA). BioRad Biologic LP (BioRAd, USA). Исследуемый материал.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП). Производитель - институт имени Г.Н. Габричевского: полуфабрикат. рН=4, 0+5,2, а также лиофилизованный коммерческий продукт (производитель ИММУНО-ГЕМ ЗАО (Россия)). Сорбент Le ^c -PAA- Sepharose 4FF/6FF (содержание Le ^c - 0.6 мкмоль/мл сефарозы). Сорбент PAA-Sepharose 4FF или 6FF.

Реактивы.

NaCI, USP grade (Helicon, Москва, Россия). KH ₂ P0 ₄ , ч.д.а. (Диа-М, Москва, Россия). Na ₂ HP0 ₄ x12 Н ₂ 0, ч.д.а. (Химмед, Москва, Россия). KCI, хч (Helicon, Москва, Россия). Твин 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), (ICN Biomedicals, Inc., США). Трис(гидроксиметил)аминометан, analyticalgrade (Serva, Германия). Глицин, для электрофореза (Sigma, США). NaOH (Amresco, США), Phosphate buffered saline tablet (Sigma, USA); набор для биотинилирования (СилексМ, Россия). goat anti-human IgG-biotin и goat anti-human IgM-biotin (Southern Biotech, США), стрептавидин-пероксидаза (GE Healthcare, UK). BSA и Tween 20 были получены из Sigma (США), диметилсульфоксид (ДМСО), уксусный ангидрид и триэтиламин из Merck (Германия). Полистирольные 96- луночные планшеты MaxiSorp были получены из NUNC (Дания), амино-SepharoseFF был из Amersham Biosciences.

Буферные растворы:

1. Буфер А: 0.14 М ФСБ (0.14 М NaCI, 1 ,5 мМ КН ₂ Р0 ₄ , 8 мМ Na ₂ HP0 ₄ , 3 мМ KCI, рН 7.4).

2. Буфер В: 0.1 % Твин 20 в ФСБ (рН 7.4).

3. Буфер С: 0.5% Твин 20 в 0.14 М ФСБ (рН 7.4).

4. Буфер D: 0.2 М Трис (рН 10.4).

5. Буфер Е: 0.5 М NaCI в 0.2 М Трис (рН 10.2).

6. Буфер F: 2МТрис (рН 10.4)

7. Буфер G: 0.2 М глицин-HCI (рН 2.5).

8. Буфер Н: 2М глицин-HCI (рН 2.5)

Пример 1. Выделение анти-1_е ^с антител с помощью сорбента Le ^c -PAA- Sepharose 4FF

Исходный материал: КИП полуфабрикат (нелиофилизованный раствор КИП), данные паспорта:

концентрация белка 63 мг/мл,

фракция lg - 97%, альбумин 3%,

IgG - 66.25%,

IgM - 15.82%,

IgA - 17.93%.

Подготовка колонки:

Сорбент промывали от консерванта (50% этиловый спирт) 10 объемами воды (Milli-Q), а затем переводили под буфер А и дегазировали в круглодонной колбе с помощью водоструйного насоса в течение 10 минут. Сорбент в виде густой суспензии переносили в стеклянный цилиндр будущей колонки, с постоянным добавлением буфера А и небольшой скоростью свободного потока, так, чтобы сформировать плотное и равномерное распределение частиц сефарозы. Далее закрывали верхний адаптер и проводили уравновешивание колонки буфером А до выравнивания базовой линии. Финальные параметры сформированной колонки: 1 .1 x22 см, V сорбента = 21 мл.

Подготовка материала для выделения:

150 мл полуфабриката КИП с общим количеством белка 9.45 г развели буфером А до концентрации белка 31.5 мг/мл.

Хроматография. I этап.

На колонку 22x 1 .1 см, содержащую 21 мл сорбента Le ^c -PAA-Sepharose 4FF, промытую и уравновешенную буфером А, нанесли 300 мл раствора КИП в буфере А с линейной скоростью - 15 см/час. Нагрузка на сорбент составила 452 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения КИП сорбент промывали 50 мл буфера А - 15 см/час, а затем ещё 600 мл буфера А - 70 см/час. Антитела, специфично связавшиеся с сорбентом, элюировали с помощью буфера Е , 30 см/час. Полученные фракции нейтрализовали до значений рН 7-8, добавляя буфер Н, затем концентрировали до 1 мл и переводили в буфер А, центрифугируя фракции в пробирках с мембранными фильтрами MWCO 100 (Molecular weight cut-off 100 kDa), 2500 ^χ g при 4 °C.

Общий выход антител на первом этапе составил 2.33 мг.

Хроматография. 2 этап.

Пост-очистка антител была проведена с помощью системы AmiconPro, состоящей из резервуара для сорбента с плотным фильтром и диаметром цилиндра 0.5 см, мембранным фильтром и резервуарами для добавления и сбора растворов. Система AmiconPro позволяет проводить хроматографическое разделение белков на небольших объёмах сорбента и одновременно концентрировать необходимые фракции, используя мембранные фильтр MWCO100.

200 мкл сорбента без углеводного гаптена PAASepharose 4FF были промыты 10 объемами воды (MQ) от консерванта (50% этиловый спирт), и в виде суспензии перенесены в резервуар для сорбентов системы AmiconPro. Далее закрепляли дополнительный мембранный фильтр (MWCO 100) в устройстве, после чего к сорбенту добавили 5 мл буфера А, и центрифугировали ЮООхд, 1 минуту, при 4 °С. К сорбенту, уравновешенному буфером А, добавили и ресуспендировали 2.22 мг анти Le ^c антител, растворённых в 500 мкл буфера А. Полученную суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут с периодическим перемешиванием. Затем дважды добавили 10 мл буфера, А центрифугируя по 15 минут 4000 ^χ g при 4 °С. Фракция антител, не связавшихся с PAA-Sepharose 4FF, является конечным продуктом. Общий выход антител после второго этапа хроматографии 1.33 мг. Если не указано иначе, все этапы хроматографии проводили при 22 °С. Контроль хроматографических фракций осуществляли с помощью УФ детектора (280 нм).

Все буферные системы содержали консервант 0.02% NaN ₃ . Полученные антитела хранили при 4 °С до 6 месяцев или в виде небольших аликвот при -20 °С с однократным размораживанием.

Пример 2. Масштабированное выделение анти-Le ⁰ антител с помощью сорбента Le ^c -PAA-Sepharose 6FF.

Сорбент для предварительной очистки: PAA-Sepharose 4FF, 0.5 л.

Аффинный сорбент: Le ^c -PAA-Sepharose 4FF, 0.5л.

Исходный материал: полуфабрикат КИП (нелиофилизованный КИП).

Буферные системы:

Буфер А: 0.14 М ФСБ (0.14 М NaCI, 1 ,5 мМ КН ₂ Р0 ₄ , 8 мМ Na ₂ HP0 ₄ , 3 мМ KCI (рН 7.4).

Буфер Е: 0.5 М NaCI в 0.2 М Трис, (рН 10.2).

Буфер F: 2МТрис (рН 10.4)

Буфер Н: 2М глицин-HCI (рН 2.5)

Подготовка сорбента и формирование колонки.

1) Промыть сорбент водой от консерванта (не менее 10 объемов воды качества MQ) и перевести в буфер А (3 объема).

2) Дегазировать буферные системы и сорбент (например, с помощью водоструйного насоса, в круглодонной колбе).

3) Сорбент в виде густой суспензии перенести в колонку, с постоянным добавлением буфера А, с небольшой скоростью свободного потока, так, чтобы сформировать плотное и равномерное распределение сефарозы. Закрыть верхний адаптор колонки и продолжать промывать колонку буфером А до выравнивания базовой линии.

Подготовка и нанесение материала:

Диализовать или разбавить полуфабрикат КИП буфером А до концентрации белка 35 мг/мл. Довести рН раствора до нейтральных значений с помощью 0.1 н NaOH. На 0.5 л аффинного сорбента взять 225 г общего белка (6.428 л раствора).

Полуфабрикат КИП содержит до 1-3% сывороточного альбумина (согласно данным паспорта), поэтому добавлять человеческий альбумин в данном случае не нужно. В случае использования лиофилизованного препарата КИП, его разводят буфером А до необходимой концентрации и добавляют альбумин до 0.3% (3 г/л).

Предварительная очистка.

На колонку 6.2x 16 см, содержащую 0.5 л PAA-Sepharose 4FF, промытую и уравновешенную буфером А, нанести 6.5 л раствора КИП в буфере А (40 мг ₀ бщ белка _/ мл), с линейной скоростью 30 см/ч (15 мл/мин). После нанесения раствора КИП дополнительно промыть колонку 500 мл буфера А, 30 см/ч. КИП, пропущенный через колонку, и 500 мл дополнительный промывки буфером А собрать, определить концентрацию белка и подготовить к нанесению на аффинный сорбент.

Первый этап хроматографии.

На колонку 5x20 см, содержащую 0.5 л сорбента Le ^c -PAA-Sepharose 4FF, промытую и уравновешенную буфером А, нанести материал, полученный как описано выше, с линейной скоростью 15 см/час (6.3 мл/мин), в течение 17 часов. После нанесения материала сорбент промыть 0.5 л буфера А на скорости 15 см/час (80 мин), а затем увеличить скорость потока до 75 см/час (31 мл/мин) и промывать до полного исчезновения белка (контролируя выход на базовую линию по показания УФ детектора, обычно объём промывки составляет 20-30 объемов сорбента). Затем проводить элюцию специфических антител с помощью буфера Е, 60 см/час (25 мл/мин). Фракции немедленно нейтрализовать буфером Н, и сразу же партиями концентрировать, используя ультрафильтрационные мембраны с размером пор MWCO 100 кДа. Общий выход антител 35 мг.

Регенерация и хранение сорбента.

По окончании элюции сорбент сразу же промывать 10 объемами воды MQ или буфером А, 75 см/час (до нейтральных значений рН), регенерировать 3 - 5 объемами 0.2М NaOH, 75 см/час, отмывать водой до нейтральных значений рН и консервировать в 50% этиловом спирте, хранить при 4 °С.

Концентрирование.

Конечный продукт необходимо немедленно концентрировать, предпочтительны системы с ультрафильтрационными мембранами MWCO 100. Концентрированные препараты антител стабильнее при хранении.

Пример 3. Биотинилирование антител.

Для биотинилирования антител использовали коммерческий набор для биотинилирования антител (Sileks, Россия) К 0.5 мл анти-1_е ^с антител (2 мг/мл буфера А,без NaN ₃ ) добавляли 0.5 мл буфера для конъюгации (как описано в инструкции производителя набора) и 50 мкл свежеприготовленного раствора реагента для биотинилирования (10 мг/мл буфера - реагента для биотинилирования). Реакционную смесь инкубировали 2 часа при 22 °С, периодически перемешивая для равномерного распределения компонентов смеси. Полученный конъюгат диализовали в буфер А с 0.02% NaN ₃ и одновременно концентрировали, центрифугируя в пробирках с мембранными фильтрами MWCO100 10-20 минут 2500*д при 4 °С. Общий выход биотинилированных анти Le ^c антител 0.6 мг. Пример 4. Определение активности анти-Le ⁰ антител, прямой ИФА

Планшеты сенсибилизировали Le ^c -PAA в 0.05М Na-карбонатном буфере (рН 9.6) (10 мкг/мл, 100 мкл/лунка) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. Планшеты блокировали 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 0.15 М фосфатном буфере (ФСБ), рН 7.2 в течение 1 ч при 37°С и промывали 0.15М ФСБ (рН 7.2), содержащим 0.1% Твин (буфер для промывки). Тестируемые образцы в последовательных двукратных разведениях (100 мкл/лунка) в 0.15 М ФСБ (рН 7.4), содержащие 0.3% БСА, наносили на планшет и инкубировали 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Планшеты инкубировали с конъюгатом goat anti-human IgM-biotin М или goat anti-human IgG-biotin 1 :5000 в 0.15M ФСБ (рН 7.2), содержащем 0.3% БСА, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Затем планшеты инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена 1 :1000 в 0.15 М ФСБ (рН 7.2), содержащем 0.3% БСА, в течение 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Цветная реакция развивается при инкубации в течение 30 мин с буфером, содержащим 0.1 М фосфат натрия, 0.1 М лимонную кислоту, 0.04% о-фенилендиамина и 0.03% Н ₂ 0 ₂ . Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М H ₂ S0 ₄ . Поглощение регистрировали при 492 нм на вертикальном спектрофотометре (Victor ² ; WALLAC). Из полученных величин OD (оптическая плотность) вычитают значение фонового связывания (связывание с БСА). Результаты приведены на фигурах 1 - 3.

Так, на фигуре 1 показано, что анти-1_е ^с антитела специфически связываются с дисахаридом, и не связываются с отрицательным контролем. Модифицированные биотином анти-1_е ^с антитела лишь немного уступают исходным в активности, неспецифического связывания процедура биотинилирования не вызывает. На фигуре 2 показано, что активность анти-1_е ^с антител, хранившихся в течение двух недель при 4 °С в ФСБ, содержащем 0.02% NaN ₃ , выше, чем антител, хранившихся при -20 °С в течение двух недель в ФСБ без NaN ₃ . На фигуре 3 показано, что двукратная раститровка антител приводит к пропорциональному уменьшению сигнала в ИФА. Пример 5. Ингибиторный ИФА для проверки специфичности антител.

Планшеты сенсибилизировали Le ^c -PAA в 0.05 М Na-карбонатном буфере (рН 9.6) (10 мкг/мл, 100 мкл/лунка) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. Планшеты блокировали 3% БСА в 0.15 М ФСБ, рН 7.2 в течение 1 ч при 37 °С и промывали 0.15 М ФСБ (рН 7.2), содержащим 0.1 % Твин 20 (буфер для промывки). Затем добавляли в лунки анти Le ^c антитела (2 мкг/мл 50 мкл на лунку) в 0.15 М ФСБ (рН 7.4) с 0.3% БСА и Le ^c дисахарид в качестве ингибитора (50 мкл/лунка, 0.9 - 2.5 мМ в 0.15М ФСБ (рН 7.4) с 0.3% БСА), инкубировали 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Затем планшеты инкубировали с конъюгатом goat anti- human IgM-biotin или goat anti-human IgG-biotin 1 :5000 в 0.15 M ФСБ (pH 7.2), содержащем 0.3% БСА и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Затем планшеты инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена 1 :1000 в 0.15 М ФСБ (рН 7.2), содержащем 0.3% БСА в течение 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Цветная реакция развивается при инкубации в течение 30 мин с буфером, содержащим 0.1 М фосфат натрия, 0.1 М лимонную кислоту, 0.04% о-фенилендиамина и 0.03% Н ₂ 0 ₂ . Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М H ₂ S0 ₄ . Поглощение регистрировали при 492 нм на вертикальном спектрофотометре (Victor ² ; WALLAC). Из полученных величин OD вычитают значение фонового связывания (связывание с БСА). Процент ингибирования вычисляли как (OD _A - OD|) х 100/С _А где OD _A - среднее значение оптической плотности в отсутствие ингибитора, a OD| - среднее значение оптической плотности в присутствии ингибитора. Результаты показаны на фигуре 4, они свидетельствуют, что выделены действительно антитела к дисахариду Le ^c .

Пример 6. Количественное определение IgG и IgM антител

Иммунологические планшеты сенсибилизировали rabbit anti-human lg, 5 мкг/мл (100 мкл на лунку) в 0.05 М Na-карбонатном буфере (рН 9.6) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, затем блокировали 3% БСА в 0.15 М ФСБ, рН 7.2 при 37 °С в течение 1 ч и промывали три раза ФСБ, содержащем 0.1% Твин-20 (буфер для промывки). Добавляли human IgM или IgG (контроль для калибровочных кривых) или тестируемые образцы - серия двукратных разбавлений в 0.15 М в ФСБ с 0.3% БСА, инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации планшет промывали три раза буфером для промывки. Добавляли goat anti-human IgM-biotin или goat anti-human IgG-biotin (1 :2000 в ФСБ, содержащем 0.3% БСА) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации планшет промывали три раза буфером для промывки. Затем планшеты инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена 1 :1000 в 0.15М ФСБ (рН 7.2), содержащем 0.3% БСА в течение 1 ч при 37 °С. После окончания инкубации планшеты промывали 3 раза буфером для промывки. Цветная реакция развивается при инкубации в течение 30 мин с буфером, содержащим 0.1 М фосфат натрия, 0.1 М лимонную кислоту, 0.04% о-фенилендиамина и 0.03% Н ₂ 0 ₂ . Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М H ₂ S0 _4. Поглощение регистрировали при 492 нм на вертикальном спектрофотометре (Victor ² ; WALLAC). Контрольные лунки не содержали антител. Пример7. Синтез сорбента Le ^c -PAA-Sepharose 4FF

Поли(4-нитрофенилакрилат) (pNPA) (57.9 мг, 0.3 ммоль) растворяли в 3 мл ДМСО при комнатной температуре. Затем добавляли раствор 3-аминопропилгликозида Le ^c - дисахарида (30 мг, 0.06 ммоль) в ДМСО (1 мл) и триэтиламин (10 мл, 0.07 ммоль) и реакционную смесь выдерживали в течение 18 ч при 40 °С (ТСХ как контроль завершения реакции). Полученный раствор разбавляли Д СО (45 мл) и добавляли 100 мл аминосефарозы 4FF. Реакционную смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 18 - 20 ч, добавляли 2-аминоэтанол (1.5 мл), полученную смесь осторожно перемешивали в течение 18 - 20 ч, а затем жидкость удаляли фильтрованием. Адсорбент на стеклянном фильтре промывали ДМСО (3 * 100 мл), водой (5 * 100 мл) и насыщенным раствором NaHC0 ₃ (2x100 мл) с последующим суспендированием в холодном (4 °С) насыщенном растворе NaHC0 ₃ (50 мл). Добавляли уксусный ангидрид (7.5 мл) и реакционную смесь выдерживали в течение 30 мин при 4 °С. Затем адсорбент промывали водой (15 х 100 мл) и хранили при 4 °С в 0.05% водном растворе NaN ₃ или в 30%-ном водном растворе этанола.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:

1. N.V.Bovin. Natural antibodies to glycans. Biochemistry (Moscow), 78, 786-797 (2013). Published in Russian in Biokhimiya, 2013, 78, 1008-1022.

2. Н.Р.Хасбиуллина, Н.В.Бовин. Гипотезы о происхождении естественных антител: взгляд гликобиолога. Биохимия, 80, 980-997 (2015). N.R.Khasbiullina, N.V.Bovin.

Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Moscow), 80, 820-835 (2015).

3. N.N.Tupitsyn, Y.A.Udalova, O.E.Galanina, Z.G.Kadagidze, N.B.Borovkova, V.V.Podolsky, S.A.Shinkarev, N.A.Gadetskaya, V.P.Letyagin, P.S.Obukhova, N.V.Shilova, A.A.Subbotina, N.V.Bovin. Tumor-associated glycan Lewis ⁰ in breast cancer. Hematopoiesis immunology, #2, 45-54 (2009). 4. A.V.Maerle, D.V.Voronina, K.L.Dobrochaeva, O.E.Galanina, L.P.AIekseev, N.V.Bovin, S.K.Zavriev, D.Yu.Ryazantsev. Immuno-PCR technology for detection of natural human antibodies against Le ^c disaccharide. Glycoconj. J, 34, 199-205 (2017). DOI: 10.1007/S10719-016-9751 -6.

5. P.D.Rye, N.V.Bovin, E.V.VIasova, R.A.Walker. Monoclonal antibody LU-BCRU- G7 against a breast tumour-associated glycoprotein recognizes the disaccharide Gal 1- 3GlcNAc. Glycobiology, 5, 385-389 (1995).

6. M.Chugh, V.Piskarev, O.Galanina, N.Khasbiullina, P.Kadam .N.Shilova, G.Pazynina, K.Dobrochaeva, P.Bhanushali, N.Kozlov, N.Tupitsyn, N.Bovin. Glycoprotein CA19.9 specific monoclonal antibodies recognize sialic acid independent glycotope. Tumor Biology, (2017).

7. P.Obukhova, V.Piskarev, V.Severov, G.Pazynina, A.Tuzikov, M.Navakouski, V.Shilova, N.Bovin. Profiling of serum antibodies with printed glycan array: room for data misinterpretation. Glycoconj. J., 8-9, 501-505 (201 1 ). PMID: 22057658.