本发明涉及一种以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗及其制备方法。

背景技术

丙肝是危害人类健康和生命安全的致命杀手， 在发展中国家防控形势尤为严峻， 而丙型肝炎病毒（ Hepatitis C virus, HCV) 是引起慢性肝病的主要病原体， 以血液、 性生活黏膜为主要感染传播途径。 据国家权威机构报告， 全世界约有 1. 7-2. 0亿人为 HCV感染者， 我国 HCV感染者率约在 4000万以上。 HCV感染后， 约 50%-85%转为慢性 肝病， 其中 20%-30% 发展为肝硬化， 部分转为肝细胞肝癌 （HCC)。 目前， 聚乙二醇、 干扰素 -a和利巴韦林联合应用是丙型肝炎治疗的标准� ��案， 其有效率仅为 50%, 且副 作用大， 费用昂贵， 停药后有很高的复发率， 由此许多丙肝患者失去治疗机会， 已成 为全球性的、 严峻的公共卫生问题。

目前， 疫苗接种是预防和控制传染病的最有效措施。

在过去数十年中， 重组乙肝疫苗的广泛应用大大降低了乙肝感染 率和发病率， 为 人类健康作出了巨大贡献。然而， 对于丙型肝炎而言， 至今还没有被批准使用的疫苗， 但对于疫苗的研究一直是国际社会关注的热点 。 当前， HCV 疫苗的研究主要集中在合 成多肽疫苗、 重组多表位疫苗、 核酸疫苗、 病毒载体疫苗等， 已有几个试验疫苗正在 临床前或进入临床研究阶段。 从已有研究结果显示， 至今没有突破性进展， 仍停滞不 前， 有诸多关键技术瓶颈问题亟待解决。 从研究看， 由于 HCV的基因组变异率高， 交 叉免疫保护抗原差， 尚缺乏有效的敏感细胞和动物感染模型， 对其细胞免疫和体液免 疫应答在 HCV感染恢复中的作用仍不十分清楚， 使以诱导保护性抗体产生为目的的预 防性疫苗和 /或治疗性疫苗的研究步履艰难。此外， 已有研究的 HCV疫苗免疫后诱发机 体产生免疫效果差、 免疫保护不全面、 且注射不能产生有效的黏膜免疫和细胞免疫效 果， 给丙肝疫苗的研究提出了挑战。 因此， 发展安全、 有效的丙肝疫苗已成为当今生 命科学亟待解决的重大科学问题。

HCV的基因组结构类似黄病毒属和瘟病毒属， 1991 年国际病毒命名委员会将其归 为黄病毒科（flaviciridae)丙型肝炎病毒属（hepac iviru _S )。 HCV 基因组为单股正链 RNA病毒， 基因组全长 9. 6 kb， 其 5' 端有一个 319— 341 nt结构较为保守的非编码区 (Non-coding region, 5， -NCR), 后面为一个连续的开放阅读框架 (open reading frame, 0RF), 可编码一个多聚蛋白前体， 此多聚蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪 接成 3个结构蛋白 （Core、 El、 E2 ) 和 7个非结构蛋白 （P7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)。 HCV C蛋白由 191个氨基酸残基组成， 是 HCV基因组中较为保守的结构 区域。 5 ' -NCR 区最为保守， 而 3 ' -NCR对于 HCV RNA 的正常复制是不可缺少的。 由 于 HCV病原体复杂的感染致病特点， 给 HCV的免疫防控带来了难题。

HCV 基因序列的高度变异性， 丙肝疫苗的研制面临很多挑战： ① HCV RNA和病 毒蛋白变异性很大， 至少存在 6种基因型及大约 70种基因亚型， 中国主要流行亚型是 lb， 2a， 也有其他亚型感染报道； ② HCV准种的存在也是产生宿主免疫逃逸及容易导 致慢性感染的机制之一， 严重影响了 HCV疫苗发展及 HCV预防和治疗的成功率； ③ HCV 在体外不能大量有效繁殖和缺乏感染的细胞、 动物敏感模型，而黑猩猩是 HCV感染的唯 一动物实验模型， 但黑猩猩受到保护而难以普遍使用； ④ HCV致病的免疫学机制尚未 完全澄清， 且性生活黏膜途径感染对注射疫苗免疫不能产 生交叉免疫保护， 这些都严 重限制了 HCV 疫苗研发的进程。

在过去数年中， HCV疫苗的研究一直是科学家们关注的焦点。在 早期的研究中， 以 真核表达 E1/E2免疫原为主， Ralston等用重组痘苗病毒载体转染哺乳动物细� �表达了 HCV全长结构蛋白， 发现虽可获得高效表达， 所表达的 E1和 E2包膜糖蛋白易形成复合 物，用纯化的包膜糖蛋白 E1/E2复合物免疫黑猩猩可产生高滴度的抗 E1和 E2抗体。而应 用 E1包膜糖蛋白仅能剌激机体产生弱的免疫反应� ��提示 E1/E2包膜糖蛋白形成的异源二 聚体可能对激发强免疫应答与保护是必要的。 另有学者 Lagging等构建了 C基因 （第 1 - 191aa) 重组质粒 pcDNA HCV Core, 0. 2 mg 质粒肌肉注射免疫 BALB /c 小鼠 2-3 次 后， 于第 6周处死小鼠， 可检测到较高水平的抗 C抗体， 免疫 2次或 3次的抗体滴度相似。 以上实验说明， HCV C区构建的重组质粒均能在真核细胞中表达， 且能诱导出特异性体 液免疫和细胞免疫应答， 但未能保护性传播途径的黏膜免疫保护。 也有学者 Duenas-Carrera等运用编码 HCV-C, E蛋白的 DNA疫苗免疫兔子和恒河猴，初次免疫 28周 后， 所有兔子产生了较强的抗 C、 E反应， 免疫 52周后， 恒河猴出现高滴度的抗 HCV结构 区抗原的抗体。 近年来， 人们在临床研究方面也取得了一定成果， Leroux-Roels等在 I期临床中， 用 lb型 El ( aal92 - 326)的共同序列在重组痘苗病毒中表达纯化后� � 20 位志愿者肌肉注射后， 结果提示三次免疫后可以引起明显的 E1抗体反应，通过第 4次加 强免疫后反应增强， 在所有的志愿者中都可以诱发针对 E1的强烈的细胞免疫反应， 在 临床应用中 E1治疗性候选疫苗具有良好的安全性和免疫效� ��方面。 Baryluk等用含有 HCV E1的质粒和重组腺病毒进行的治疗性疫苗的研� ��， 在 I期临床研究证明安全性的基 础上并已进入 II期临床研究。 在 II期临床研究中， 重组的 E1疫苗可激发强烈的针对 E1 的 T细胞反应， 部分病人血清 ALT水平明显下降。 2012年的《科学- -转化医学》杂志上， 英国牛津大学等机构的研究人员报告了他们研 发的一种 HCV疫苗临床试验取得的结果， 该疫苗是以一种黑猩猩腺病毒为载体模仿了其 内部相对长期稳定不变的结构， 临床试 验取得初步成效， 41名志愿者接种疫苗后， 跟踪研究发现疫苗效果至少能持续一年， 并且副作用明显减弱，但 DNA疫苗安全性及全面应答与保护受限。尽管以 上临床前及进 入临床研究的这些 HCV候选疫苗取得了重要进展，但疫苗免疫后诱 发机体产生免疫效果 欠佳、 交叉免疫保护不全面、 注射免疫不能产生有效的黏膜免疫细胞免疫效 应， 并且 腺病毒为载体的 DNA 疫苗存在潜在安全隐患等问题。

近年来， 反向遗传学技术 （Reverse genetics, RG) 在流感病毒领域广泛应用。 美国 Medimmune公司是 RG技术用于疫苗研制领域最成功的典范， 2003年 6月， 该公司生 产的流感三价减毒活疫苗 Flumist被 FDA批准和投入使用， 适用于 2-49岁人群， 通过鼻 腔免疫， 使用简便， 应用广泛， 临床实验结果显示具有安全、 有效和交叉免疫保护效 果， 使得以冷适应流感减毒活疫苗为递送系统表达 外源基因研制其他疫苗带来了新的 契机。 与其他载体如腺病毒， 痘苗病毒等逆转录病毒为载体相比， 流感病毒在复制周 期不会形成 DNA中间产物， 由此不会整合进宿主的染色体， 使得应用更好的安全性。用 于流感病毒基因组操作的策略有： 外源蛋白嵌入表面糖蛋白 NA和 HA， 产生另外的基因 片段， 改造非结构蛋白 NS1， PB2基因缺失等。 目前， 已有大量报道将流感病毒作为病 毒疫苗载体成功制备了能够达到有效免疫保护 的重组嵌合疫苗候选株， 如流感嵌合体 病毒 (A/B)、 副流感、 呼吸道合胞病毒 （RSV)、 衣原体、 结核杆菌、 疟疾、 艾滋、 B. anthracis和肿瘤等均有报道， 为以流感病毒为载体的多价疫苗研究拓宽了发 展空间。 值得我们注意的是， 同样是以血液、 性传播途径为主的 HIV病毒， Anna L. de Goedea 等将 HIV-1 _P 17Gag基因插入流感病毒 NA基因， 成功构建了流感病毒为载体的复制缺陷 型 rFlu-pl7疫苗候选株， 结果表明 rFlu-pl7能够诱导产生较强的特异性体液免疫和� �� 胞免疫反应。 而将流感病毒作为 HCV疫苗研制的载体， 在国内外还未见报道。 所以， 采 用反向遗传技术制备流感病毒为载体的 HCV候选疫苗株将是 HCV疫苗研究领域的新里程 碑。

发明公开

本发明的目的是提供一种以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗及其制备方法。

本发明提供的 SEQ ID No. 1所示的 DNA分子。

一种重组病毒也属于本发明的保护范围， 该病毒按照如下方法制备：

将分别含有冷适应、 减毒流感病毒的 PB2基因、 冷适应、 减毒流感病毒的 PB1基 因、 冷适应、 减毒流感病毒的 PA基因、 冷适应、 减毒流感病毒的 NP基因、 冷适应、 减毒流感病毒的 M基因和冷适应、减毒流感病毒的 NS基因的表达质粒， 以及分别含有 靶标流感病毒的 HA基因和靶标流感病毒的 NA基因的表达质粒共转染宿主细胞， 培养 得到重组流感病毒；

在如下所述基因中的至少一种基因的开放读码 框中的任意位置插入或替换为 HCV 的结构蛋白基因：

( 1 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 PB2基因；

( 2 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 PB1基因；

( 3 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 PA基因；

( 4 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 NP基因；

( 5 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 M基因；

( 6 ) 所述冷适应、 减毒流感病毒的 NS基因；

( 7 ) 所述靶标流感病毒的 HA基因；

( 8 ) 所述靶标流感病毒的 NA基因；

所述冷适应、 减毒流感病毒的 PB2基因、 PB1基因、 PA基因、 NP基因、 M基因和

NS基因， 以及靶标流感病毒的 HA基因和 NA基因位于不同的表达质粒上；

所述 HCV的结构蛋白基因为 HCV的核心蛋白 C全基因、 包膜蛋白 E1/E2全基因、 核心蛋白 C的优势抗原表位基因和 /或包膜蛋白 E1/E2的优势抗原表位基因。

上述病毒中，所述宿主细胞为 MDCK、 Vero、 293T、 COS细胞或 MDCK/293T、 MDCK/COS 共培养的细胞；

所述 HCV 的结构蛋白基因为 HCV 的核心蛋白 C 的优势抗原表位基因和包膜蛋白 E1/E2的优势抗原表位基因的融合基因。

上述任一所述的病毒中， 所述 HCV为 1型 HCV、 2型 HCV、 3型 HCV、 4型 HCV、 5型 HCV 或 6型 HCV;

所述 1型 HCV具体为 lb亚型 HCV。

上述任一所述的病毒中， 所述 HCV的核心蛋白 C的优势抗原表位基因和包膜蛋白 E1/E2的优势抗原表位基因的融合基因的核苷酸� ��列如 SEQ ID No. 1所示。

上述任一所述的病毒中， 所述 HCV的结构蛋白基因插在所述冷适应、 减毒流感病 毒的 NS基因的开放读码框的自 5 ' 末端起第 375位至第 376位核苷酸之间；

所述 HCV的结构蛋白基因与所述冷适应、减毒流感病 毒的 NS基因的开放读码框的 自 5 ' 末端起第 375位核苷酸之间连有 5 ' - UAAUG -3 ' 序列； 和 /或，

所述 HCV的结构蛋白基因是将所述冷适应、 减毒流感病毒的 M基因的开放读码框 的自 5 ' 末端起第 223位核苷酸至第 760位核苷酸替换；

和 /或，

所述 HCV的结构蛋白基因将所述靶标流感病毒的 NA基因的开放读码框的自 5 ' 末 端起第 184位核苷酸至第 1253位核苷酸替换。

上述任一所述的病毒中， 所述冷适应、 减毒流感病毒为冷适应、 减毒 A型流感病 毒或冷适应、 减毒 B型流感病毒；

所述冷适应、 减毒 A型流感病毒具体为羅亚型冷适应、 减毒流感病毒， 再具 体为冷适应、 减毒流感病毒株 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)；

所述靶标流感病毒为 A型流感病毒或 B型流感病毒，所述 A型流感病毒具体为 HI 亚型 -H16 亚型中的任意一种， 再具体为 H1N1 亚型流感病毒， 再具体为流感病毒株 A/Cal ifornia/07/2009 (H1N1 ) ;

所述靶标流感病毒为未经过任何处理的 （如未经过减毒、 未经过冷适应） 的普通 野生型流感病毒。

上述任一所述的病毒中， 所述 HCV的结构蛋白基因插在所述冷适应、 减毒流感病 毒的 NS基因的开放读码框的自 5 ' 末端起第 375位至第 376位核苷酸之间所得序列为 SEQ ID No. 2中第 51-1466位核苷酸所示；

所述 HCV的结构蛋白基因是将所述冷适应、 减毒流感病毒的 M基因的开放读码框 的自 5 ' 末端起第 223位核苷酸至第 760位核苷酸替换所得序列为 SEQ ID No. 3中第 40-1053位核苷酸所示；

所述 HCV的结构蛋白基因将所述靶标流感病毒的 NA基因的开放读码框的自 5 ' 末 端起第 184位核苷酸至第 1253位核苷酸替换所得序列为 SEQ ID No. 4中第 35-944位 核苷酸所示。

构建所述表达质粒时， 上述 PB2基因、 PB1基因、 PA基因、 NP基因、 M基因、 NS 基因、 HA基因或 NA基因， 均在各自的 5 ' 端连接有各自基因的 3 ' NCR序列， 均在各 自的 3 ' 端均连接有各自基因的 5 ' NCR序列；

所述表达质粒的出发质粒为双向转录表达载体 PAD3000;

构建所述表达质粒时，均将各基因插在双向转 录表达载体 PAD3000的 BsnS 位点。 上述任一所述的病毒制备得到的嵌合疫苗也属 于本发明的保护范围。

上述 DNA分子在制备预防和 /或治疗流感病毒和 /或 HCV引起的疾病的产品中的应 用也属于本发明的保护范围；

和 /或，

上述任一所述的病毒在制备预防和 /或治疗流感病毒和 /或 HCV引起的疾病的产品 中的应用也属于本发明的保护范围；

和 /或，

上述嵌合疫苗在制备预防和 /或治疗流感病毒和 /或 HCV引起的疾病的产品中的应 用也属于本发明的保护范围；

所述流感病毒为 A型流感病毒或 B型流感病毒， 所述 A型流感病毒具体为 HI亚 型 -H16亚型中的任意一种；

所述 HCV为 1型 HCV 、 2型 HCV 、 3型 HCV 、 4型 HCV 、 5型 HCV 或 6型 HCV; 所述 1型 HCV具体为 lb亚型 HCV。

附图说明

图 1为构建以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗的重组策略示意图。

实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。

PAD3000在文献 "Hoffmann E， Mahmood K, Yang CF， Webster RG, Greenberg HB， Kemble G. Rescue of influenza B virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci. 2002 ; 99 (17) : 11411 - 6. "中公开过， 公众可从中国人民解放军军事医学科学院获 得。

BALB/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。

10-12周龄的雪貂购自中国无锡 Angora安哥鲁公司。

2012-2013年流感病毒当年流行株 A/Cal ifornia/07/2009 (H1N1 ) 由国家流感中 心提供， 公众可从中国人民解放军军事医学科学院获得 。 分别扩增该病毒株的 HA、 NA 基因， 再分别插入到双向转录 /表达载体 pAD3000的 Bsi 位点，构建得到该病毒株的 重组质粒 pD-HA、 pD-NA。

冷适应、减毒流感病毒株 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) (简写 A/AA/6/60 )在文献 "Yang P, Duan Y, Wang C, Xing L, Gao X, Tang C, Luo D, Zhao Z, Jia W, Peng D, Liu X, Wang X. Immunogenicity and protective efficacy of a l ive attenuated vaccine against the 2009 pandemic A H1N1 in mice and ferrets. Vaccine. 2011 Jan 17 ; 29 (4) : 698-705. " 中公开过， 公众可从中国人民解放军军事医学科学院获得 。 该 病毒株的 6个内部基因 PB2、PB1、PA、NP、NS、M，分别插入到双向转录 /表达载体 pAD3000 的 β¾?βΙ位点， 构建得到该病毒的重组质粒 pD-PB2、 pD-PBU pD-PA、 pD-NP、 pD-NS、 pDi

下述实施例中的 NCR代表非编码区。 实验例 1、 以流感病毒为载体的嵌合 HCV-C/E1/E2优势抗原表位的 HCV嵌合疫苗 rFLU-HCV/NSl的制备

一、 lb亚型的 HCV中 HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如 SEQ ID No. 1所示， 经动 物实验和临床病人血清验证， 符合下一步实验要求。

二、 构建重组质粒 PC/E1/E2-NS1

以冷适应、减毒流感病毒株 A/AA/6/60的 NS1基因片段为插入 HCV-C/ E1/E2优势 抗原表位基因的靶点， 利用分子生物学方法构建重组质粒 PC/E1/E2-NS1 , 具体策略如 图 1A所示。

具体是将上述获得的 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到冷适应、 减毒流感病 毒株 A/AA/6/60的 NS基因开放阅读框 （0RF) 的自 5' 末端起第 375位核苷酸之后， 中间加入 linker (5 ' -UAAUG-3 ' )连接， linker既有终止子作用， 又有启动子作用， 最后是 NS基因开放阅读框的自 5' 末端起第 376位至第 838位核苷酸， 将构建好的重 组质粒命名为 pC/El/E2-NSl。

步骤如下：

(一） 合成 SEQ ID No. 2所示的 DNA分子， SEQ ID No. 2中自 5 ' 端起第 1位至 第 24位为酶切位点， 第 25位至第 51位为 NS基因的 3' NCR, 第 51位至第 425位为 冷适应、 减毒流感病毒株 A/AA/6/60 NS基因开放阅读框 （0RF) 的自 5' 末端起第 1 位至第 375位核苷酸， 第 426位至第 430位为 linker, 第 431 位至第 1003 位为 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因， 第 1004位至第 1466位为 NS基因开放阅读框（0RF) 的自 5' 末端起第 376位至第 838位核苷酸，第 1467位至第 1495位为 NS基因的 5' NCR, 第 1496位至第 1517位酶切位点。

(二） H酶切 SEQ ID No. 2所示的 DNA分子， 得到目的基因片段； BsnS 酶切 PAD3000, 得到载体大片段； 将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒， 将其命名 为 PC/E1/E2-NS1 , 将重组质粒送测序结果正确。

三、将重组质粒 pC/El/E2-NSl与冷适应、减毒流感病毒株 A/AA/6/60的内部病毒 基因骨架 PB2、 PB1、 PA、 NP、 M分别构建的重组质粒 pD-PB2、 pD-PBl、 pD- PA、 pD-NP、 pD-M, 及流感病毒当年流行株 A/California/07/2009 (H1N1 ) 的 HA、 NA基因构建的 重组质粒 pD-HA、pD-NA，共 8种质粒各 0. 2μ _§ ,等量混合加入 1(^L转染试剂（Effectene, 购自 Qiagen公司） 室温作用 10min， 共转染 MDCK细胞， 33°C， 5% C0 ₂ ， 培养 48-60h， 得细胞悬液，将细胞悬液接种 9日龄 SPF鸡胚， 33°C培养 72h，收获鸡胚尿囊液测定 HA 血凝效价， HA血凝效价的检测结果是 1 : 256-512， 获得嵌合 HCV-C/E1/E2优势抗原表 位的 HCV嵌合疫苗株 （rFLU-HCV/NSl )。

四、 对步骤三获得的疫苗株进行鉴定， 电镜观察病毒形态， 结果表明该疫苗株符 合流感病毒典型形态特征， 病毒颗粒大小在 80-120nm之间。

五、 将 rFLU-HCV/NSl接种 9-11日龄 SPF鸡胚 （购自北京实验动物研究中心） 传 代， 取第二代鸡胚尿囊液提取病毒 RNA，经过 RT-PCR, 扩增出 PB2、 PB1、 PA、 NP、 HA、

NA、 M和 NS1共 8个基因片段， 分别将基因片段送公司测序， 结果与预期基因序列一 致。

六、 将 rFLU-HCV/NSl 经鸡胚大量培养， 超滤浓缩、 蔗糖梯度离心纯化后， 跑 SDS-PAGE电泳， 凝胶染色、 脱色后， 可检测到相应大小的 NP、 HA1、 HA2、 NEP蛋白， 表明抗原的主要成分没有丢失。

七、 rFLU-HCV/NSl 的温度敏感 ( Temperature sensitive, ts )、 冷适应 ( Cold adapted, ca) 和减毒 (Attenuated, att ) 表型检测

将 rFLU-HCV/NSl接种 MDCK细胞或 9-11日龄鸡胚， 分别于 25、 33、 37和 39°C条 件下培养 3天， 收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。 结果表明， 该疫苗株具有 ts、 ca表型。 同时， 该疫苗株在 BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。

八、 rFLU-HCV/NSl在小鼠体内的免疫效果

将 rFLU-HCV/NSl经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化 后， 制备该疫苗的减毒活疫 苗剂型。

选用 6-8周龄 BALB/c小鼠， 分为疫苗组和对照组， 每组 20只。

疫苗组： 将该疫苗滴鼻免疫 BALB/c小鼠， 免疫 2次， 间隔 2周， 每次免疫剂量为

10 ⁵ - ⁵ -10 ⁶ - ⁵ TCID ₆₀ , 免疫体积为 20μ1。

对照组： PBS代替疫苗， 同时免疫方式、 免疫体积及免疫时间与疫苗组一致。 将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、 二次免疫后 2周， 经小鼠尾静脉采血， 离 心收集各组小鼠的血清。

采用 HI方法测定血清中针对野生型流感病毒 A/California/07/2009 (H1N1 ) 的 抗体效价， 同时采用微量中和方法检测血清中针对 HCV的特异性抗体产生情况， 结果 如表 1所示。

表 1 rFLU-HCV/NSl的免疫效果检测

组别 流感病毒 HCV

(HI效价） (NT效价）

第一剂 80. 00 30. 00

疫苗组

第二剂 320. 00 120. 00

第一剂 〈10 〈10

对照组

第二剂 〈10 〈10

表 1表明， 以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗 （rFLU-HCV/NSl ) 免疫动物后， 血 清中可检测到针对 HCV和流感病毒的抗体效价， 表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针 对 HCV和流感病毒的双重免疫应答。 实验例 2、 以流感病毒为载体的嵌合 HCV-C/E1/E2优势抗原表位的 HCV嵌合疫苗 rFLU-HCV/M的制备

一、 lb亚型的 HCV中 HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如 SEQ ID No. 1所示， 按照 实施例 1的步骤一的方法经免疫动物验证， 符合下一步实验要求。

二、 构建重组质粒 PC/E1/E2-M

以冷适应、减毒流感病毒株 A/AA/6/60的 M基因片段为插入 HCV-C/ E1/E2优势抗 原表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建 重组质粒 PC/E1/E2-M, 具体策略如图 1B 所示。

具体是将上述获得的 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到冷适应、 减毒流感病 毒株 A/AA/6/60的 M基因开放阅读框（0RF)的前 222位核苷酸和后 222位核苷酸之间， 将构建好的重组质粒命名为 pC/El/E2_M。

(一） 合成 SEQ ID No. 3所示的 DNA分子， SEQ ID No. 3中自 5 ' 末端起第 1位至 第 14位为酶切位点， 第 15位至第 39位为 M基因的 3 ' NCR, 第 40位至第 261位为冷 适应、 减毒流感病毒株 A/AA/6/60 M基因开放阅读框 （0RF) 的自 5 ' 末端起从第 1位 到第 222位核苷酸， 第 262位至第 831位为 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因， 第 832 位至第 1053位为冷适应、 减毒流感病毒株 A/AA/6/60 M基因开放阅读框 （0RF) 的自 5 ' 末端起从第 761位到第 982位核苷酸， 第 1054位至第 1074位为 M基因的 5 ' NCR, 第 1075位至第 1088位为酶切位点。

(二） Bsn& 酶切 SEQ ID No. 3所示的 DNA分子， 得到目的基因片段； Bsn& 酶切 PAD3000, 得到载体大片段； 将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒， 将其命名 为 PC/E1/E2-M, 将重组质粒送测序结果正确。

三、 将重组质粒 PC/E1/E2-M, 与冷适应、 减毒流感病毒株 A/AA/6/60的内部病毒 基因骨架 PB2、 PB1、 PA、 NP和 NS分别构建的重组质粒 pD-PB2、 pD- PB1、 pD- PA、 pD- NP、 pD-NS, 及流感病毒当年流行株 A/Calif ornia/07/2009 (HlNl ) 的 HA、 NA基因构 建的重组质粒 pD-HA、 pD-NA, 按照实施例 1的步骤三的方法将 8种质粒共转染 MDCK 细胞， 37°C， 5%C0 ₂ ，培养 48-60h， 得细胞悬液，将细胞悬液接种 9日龄 SPF鸡胚， 35 °C 培养 72h， 收获鸡胚尿囊液获得嵌合 HCV-C/E1/E2 优势抗原表位的 HCV 嵌合疫苗株 (rFLU- HCV/M)。

四、 对步骤三获得的疫苗株进行鉴定， 电镜观察病毒形态， 结果表明该疫苗株符 合流感病毒典型形态特征。

五、将 rFLU-HCV/M接种 9-11日龄 SPF鸡胚（购自北京实验动物研究中心）传代， 取第二代鸡胚尿囊液提取病毒 RNA，经过 RT-PCR, 扩增出 PB2、 PB1、 PA、 NP、 HA、 NA、 M和 NS1共 8个基因片段， 分别将基因片段送公司测序， 结果与预期基因序列一致。

六、将 rFLU-HCV/M经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯� �离心纯化后，跑 SDS-PAGE 电泳， 抗原的主要成分存在。

七、 rFLU- HCV/M 的温度敏感 （Temperature sensitive, ts )、 冷适应 （Cold adapted, ca) 和减毒 (Attenuated, att ) 表型检测

将 rFLU-HCV/M接种 MDCK细胞或 9-11日龄鸡胚， 分别于 25、 33、 37和 39°C条件 下培养 3天， 收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。结 果表明，该疫苗株具有 ts、 ca表型。 同时， 该疫苗株在 BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。

八、 rFLU-HCV/M在小鼠体内的免疫效果

将 rFLU-HCV/M经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化� �， 制备该疫苗的减毒活疫苗 剂型。

选用 6-8周龄 BALB/c小鼠， 分为疫苗组和对照组， 每组 20只。

按照实施例 1的步骤八的方法对小鼠进行 rFLU-HCV/M的免疫， 同时按照实施例 1 设置对照组。

将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、 二次免疫后 2周， 经小鼠尾静脉采血， 离 心收集各组小鼠的血清。

采用 HI方法测定血清中针对野生型流感病毒 A/California/07/2009 (HlNl ) 的 抗体效价， 同时采用实施例 1中步骤八的方法检测血清中针对 HCV的特异性抗体产生 情况， 结果如表 2所示 ₍

表 2 rFLU-HCV/M的免疫效果检测

流感病毒 HCV

(HI效价） (NT效价）

第一剂 160. 00 32. 00

第二剂 640. 00 320. 00

第一剂 〈10 〈10

第二剂 〈10 〈10 表 2表明， 以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗 （rFLU-HCV/M) 免疫动物后， 血清 中可检测到针对 HCV和流感病毒的抗体效价， 表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对 HCV和流感病毒的双重免疫应答。 实施例 3、 以流感病毒为载体的嵌合 HCV-C/E1/E2优势抗原表位的 HCV嵌合疫苗 rFLU-HCV/NA的制备

一、 lb亚型的 HCV中 HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如 SEQ ID No. 1所示， 按照 实施例 1的步骤一的方法经免疫动物验证， 符合下一步实验要求。

二、 构建重组质粒 PC/E1/E2-NA

以 A/Calif ornia/07/2009 (H1N1 ) 的 NA基因片段为插入 HCV- C/ E1/E2优势抗原 表位基因的靶点， 利用分子生物学方法构建重组质粒 PC/E1/E2-NA, 具体策略如图 1C 所示。

具体是将上述获得的 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到当年流行流� ��病毒株 H1N1亚型 A/Calif ornia/07/2009的 NA基因开放阅读框 （0RF) 的前 183位核苷酸和 后 157位核苷酸之间， 将构建好的重组质粒命名为 pC/El/E2-NA。

(一） 合成 SEQ ID No. 4所示的 DNA分子， SEQ ID No. 4中自 5' 端起第 1位至第 14位为酶切位点，第 15位至第 35位为 NA基因的 3' NCR,第 35位至第 217位为流感 病毒当年流行株 H1N1亚型的 NA基因开放阅读框 (0RF)的自 5' 末端起第 1位至第 183 位核苷酸，第 218位至第 787位为 HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因，第 788位至第 944 位为 NA基因开放阅读框（0RF)的自 5' 末端起第 1254位至第 1410位核苷酸， 第 945 位至第 975位为 NA基因的 5' NCR,第 976位至第 987位为酶切位点。

(二） 酶切 SEQ ID No. 4所示的 DNA分子， 得到目的基因片段； 酶切 PAD3000, 得到载体大片段； 将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒， 将其命名 为 PC/E1/E2-NA, 将重组质粒送测序结果正确。

三、 将重组质粒 PC/E1/E2-NA, 与冷适应、 减毒流感病毒株 A/AA/6/60的内部病 毒基因骨架 PB2、 PB1、 PA、 NP、 M和 NS分别构建的重组质粒 pD-PB2、 pD-PBl、 pD-PA、 pD- NP、 pD-M和 pD-NS， 及流感病毒当年流行株 A/California/07/2009 (H1N1 ) 的 HA 基因构建的重组质粒 pD-HA， 按照实施例 1的步骤三的方法将 8种质粒共转染 MDCK细 胞， 37°C， 5%C0 ₂ ， 培养 48-60h， 得细胞悬液， 将细胞悬液接种 9日龄 SPF鸡胚， 33°C 培养 72h，收获鸡胚尿囊液获得嵌合 HCV-C/E1/E2 优势抗原表位的 HCV 嵌合疫苗株 (rFLU-HCV/NA) ₀

四、 对步骤三获得的疫苗株进行鉴定， 电镜观察病毒形态， 结果表明该疫苗株符 合流感病毒典型形态特征。

五、将 rFLU-HCV/NA接种 9-11日龄 SPF鸡胚（购自北京实验动物研究中心）传代， 取第二代鸡胚尿囊液提取病毒 RNA，经过 RT-PCR, 扩增出 PB2、 PB1、 PA、 NP、 HA、 NA、 M和 NS1共 8个基因片段， 分别将基因片段送公司测序， 结果与预期基因序列一致。

六、将 rFLU-HCV/NA经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯� ��离心纯化后，跑 SDS-PAGE 电泳， 抗原的主要成分存在。

七、 rFLU- HCV/NA 的温度敏感 （Temperature sensitive, ts )、 冷适应 （Cold adapted, ca) 和减毒 (Attenuated, att ) 表型检测

将 rFLU-HCV/NA接种 MDCK细胞或 9-11 日龄鸡胚， 分别于 25、 33、 37和 39°C条 件下培养 3天， 收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。 结果表明， 该疫苗株具有 ts、 ca表型。 同时， 该疫苗株在 BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。

八、 rFLU-HCV/NA在小鼠体内的免疫效果

将 rFLU-HCV/NA经超滤浓缩、 蔗糖密度梯度离心纯化后， 制备该疫苗的减毒活疫 苗剂型。

选用 6-8周龄 BALB/c小鼠， 分为疫苗组和对照组， 每组 20只。

按照实施例 1的步骤八的方法对小鼠进行 rFLU-HCV/NA的免疫， 同时按照实施例 1设置对照组。

将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、 二次免疫后 2周， 经小鼠尾静脉采血， 离 心收集各组小鼠的血清。

采用 HI方法测定血清中针对野生型流感病毒 A/California/07/2009 (H1N1 ) 的 抗体效价， 同时采用采用实施例 1中步骤八的方法检测血清中针对 HCV的特异性抗体 产生情况， 结果如表 3所示。 表 3 rFLU-HCV/NA的免疫效果检测

HCV

(HI效价） ( IgG NT效

价）

_^ . _α 弟一剂 120. 00 30. 00 疫難 第二剂 640. 00 320. 00

〈10 〈10

对讓

第二剂 〈10 〈10 表 3表明， 以流感病毒为载体的 HCV嵌合疫苗（rFLU-HCV/NA)免疫动物后， 血清中可 检测到针对 HCV和流感病毒的抗体效价， 表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对 HCV 和流感病毒的双重免疫应答。

工业应用

本发明的 HCV嵌合疫苗可以覆盖 HCV传染病病原体， 保护更多人群免受流感病毒 和 HCV之害， 为实现 "一苗两用"或 "一苗多用" 目的奠定了基础。