〔1〕植物乳酸菌
 本発明は、特定の植物乳酸菌の培養上清中� ��抗ピロリ活性が存在することを見出したこ� ��に基づいて完成された。「抗ピロリ活性」� ��、ピロリ菌(Helicobacter pylori)の生育を阻害す る活性が意図され、具体的にはピロリ菌を殺 傷する活性、ピロリ菌の増殖を抑制/阻害す� �活性が意図される。

 植物乳酸菌は、植物由来の乳酸菌をいい� ��例えば穀物、野菜、果物、あるいはこれら� ��原材料に含む醗酵食品やナム等の醗酵食品� ��製造に関係するバナナ等の熱帯植物の葉等� ��ら分離されたものが意図される。本発明者� ��はこれまでに、植物乳酸菌として、ラクト� ��シラス プランタルムSN13T株、ラクトバシラ ス プランタルムSN26T株、ラクトバシラス プ ランタルムSN35N株、ラクトバシラス プラン� �ルムSN35M株、ラクトコッカス ラクティス � �ブスペシース ラクティス SN26N株、エンテ� �コッカス スペシースSN21I株、およびエンテ� ��コッカス ムンヅティSN29N株などを分離して いる。また、他にも多くの植物乳酸菌が知ら れている。しかし、このような多種多様な植 物乳酸菌の中で、その培養上清に抗ピロリ活 性が存在するという優れた効果を有している 乳酸菌が存在することは、全く知られていな かった。

 ラクトバシラス プランタルムSN35M株は、 本発明者らによって分離された菌株であり、 独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許 微生物寄託センター(292-0818 千葉県木更津市� ��ずさ鎌足2-5-8)へ、受託番号NITE BP-5(受託日:2 004年7月6日、移管日:2009年2月16日)として寄託� ��れており、以下の菌学的性質を有する:メロ ンからの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ 型醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、 好気条件下でも培養可、分類学上の位置はLac tobacillus plantarum。

 ラクトバシラス プランタルムSN35N株は、 本発明者らによって分離された菌株であり、 独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許 微生物寄託センター(292-0818 千葉県木更津市� ��ずさ鎌足2-5-8)へ、受託番号NITE BP-6(受託日:2 004年7月6日、移管日:2009年2月16日)として寄託� ��れており、以下の菌学的性質を有する:ナシ からの分離株、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型 醗酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能なし、好 気条件下でも培養可、分類学上の位置は Lact obacillus plantarum。

 ラクトバシラス プランタルムSN13T株は、 本発明者らによって分離された菌株であり、 独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許 微生物寄託センター(292-0818 千葉県木更津市� ��ずさ鎌足2-5-8)へ、受託番号NITE BP-7(受託日:2 004年7月6日、移管日:2009年1月28日)として寄託� ��れており、以下の菌学的性質を有する:タイ 国産のナムというソーセージからの分離株、 グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラー ゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培 養可、分類学上の位置はLactobacillus plantarum。

 ラクトバシラス プランタルムSN26T株は、 本発明者らによって分離された菌株であり、 独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許 微生物寄託センター(292-0818 千葉県木更津市� ��ずさ鎌足2-5-8)へ、受託番号NITE BP-8(受託日:2 004年7月6日、移管日:2009年2月16日)として寄託� ��れており、以下の菌学的性質を有する:タイ 国産のナムというソーセージからの分離株、 グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型醗酵、カタラー ゼ陰性、芽胞形成能なし、好気条件下でも培 養可、分類学上の位置は Lactobacillus plantarum� ��

 近年では、16SリボソームRNA(16S rRNA)の塩� �配列に基づく系統分類により得られるグル� �プ(クラスター)を指標として、細菌の分類お よび識別を行うことが一般的になっている。 一実施形態において、本発明に用いられる植 物乳酸菌の16S rRNAは、配列番号1~4のいずれか 1つに示される塩基配列を含むポリヌクレオ� �ドである。なお、配列番号1~4に示される塩� �配列は、それぞれラクトバシラス プランタ ルムSN35M株、ラクトバシラス プランタルムSN 35N株、ラクトバシラス プランタルムSN13T株� �およびラクトバシラス プランタルムSN26T株� ��16S rRNAの塩基配列である。本発明において� ��上述した植物乳酸菌が単独で用いられても� ��いが、2種以上を組み合わせて用いられても よい。

 本明細書中で使用される場合、用語「ポ� ��ヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」� ��たは「核酸分子」と交換可能に使用され、� ��クレオチドの重合体が意図される。本明細� ��中で使用される場合、用語「塩基配列」は� ��「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」� ��交換可能に使用され、デオキシリボヌクレ� ��チド(A、G、CおよびT(またはU)と省略される)� ��配列として示される。

 なお、配列番号1~4のいずれか1つに示され る塩基配列を含むポリヌクレオチドの変異体 を16S rRNAとして有している植物乳酸菌の中で 、その培養上清中に抗ピロリ活性を示すもの もまた、本発明に用いられるべき植物乳酸菌 である。本明細書中でポリヌクレオチドの観 点で使用される場合、「変異体」は任意の変 異体が意図されるのではなく、配列番号1~4の いずれか1つに示される塩基配列と若干異な� �ていても、配列番号1~4のいずれか1つに示さ� ��る塩基配列とほぼ同一であるまたは非常に� ��似していると当業者が容易に認定し得る範� ��内のポリヌクレオチドが意図され、天然の� ��のであっても人為的に改変されたものであ� ��てもよい。また、当業者は、このようなポ� ��ヌクレオチド変異体を16S rRNAとして有して� ��る植物乳酸菌の培養上清が所望の抗ピロリ� ��性を有しているか否かを、本明細書中の記� ��に従って容易に確認し得る。このようなポ� ��ヌクレオチド変異体としては、(1)配列番号1 ~4のいずれか1つに示される塩基配列に1もし� �は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加さ� �た塩基配列を含むポリヌクレオチド、(2)配� �番号1~4のいずれか1つに示される塩基配列の� ��補配列からなるポリヌクレオチドにストリ� ��ジェントな条件下でハイブリダイズし得る� ��リヌクレオチドが挙げられる。

 ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cl oning:A Laboratory Manual 第3版,J.SambrookおよびD.W. Russll編,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(2001)」(本� �細書中に参考として援用される。)に記載さ� ��ている方法のような周知の方法に従って行� ��ことができる。本明細書中で使用される場� ��、用語「ストリンジェントなハイブリダイ� ��ーション条件」は、ハイブリダイゼーショ� ��溶液(50%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mM� ��クエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナト� �ウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%硫酸デキス� ��ラン、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNA� �含む)中にて42℃で一晩インキュベーション� �た後、約65℃にて0.1×SSC中でフィルターを洗� ��することが意図される。

 このように、本発明に用いられる植物乳� ��菌は、その16S rRNAが、(a)配列番号1~4のいず� ��か1つに示される塩基配列を含むポリヌクレ オチド;(b)配列番号1~4のいずれか1つに示され� ��塩基配列に1もしくは数個の塩基が欠失、置 換もしくは付加された塩基配列を含むポリヌ クレオチド;または(c)配列番号1~4のいずれか1� ��に示される塩基配列の相補配列からなるポ� ��ヌクレオチドにストリンジェントな条件下� ��ハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、� ��ある乳酸菌であるといえる。このような植� ��乳酸菌が用いられることによって、抗ピロ� ��活性を示す画分を容易に取得することがで� ��る。

 〔2〕Helicobacter pyloriの生育阻害剤を製造す� ��ための組成物
 本発明は、ラクトバシラス プランタルムSN 35M株、SN35N株、SN13T株およびSN26T株からなる群 より選択される植物乳酸菌の生菌を生存可能 に含有している組成物を提供する。本発明に 係る組成物を用いれば、Helicobacter pyloriの生� ��阻害剤を製造することができる。

 本発明に係る組成物は、上記植物乳酸菌� ��よって醗酵する醗酵原料をさらに含有して� ��てもよい。また、本発明に係る組成物は、� ��粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽� ��物をさらに含有していてもよい。

 本明細書中で使用される場合、用語「組� ��物」はその含有成分を単一組成物中に含有� ��る態様と、単一キット中に別個に備えてい� ��態様であってもよい。すなわち、本発明に� ��る組成物は培地をさらに含んでいてもよい� ��、上記植物乳酸菌の生菌を生存可能に含有� ��ている組成物と醗酵原料とを別々に備えて� ��るキットの形態であってもよい。また、本� ��明に係る組成物は、麹菌による米醗酵物ま� ��は酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこれら� ��抽出物をさらに含んでいてもよいが、本発� ��に係る組成物と酒粕もしくは焼酎蒸留残渣� ��たはこれらの抽出物とを別々に備えている� ��ットの形態であってもよい。

 本発明に用いられる醗酵原料は、乳、果� ��および野菜汁からなる群より選択されるこ� ��が好ましい。乳としては、動物乳(例えば、 牛乳、ヤギ乳、めん羊乳等)が挙げられ、特� �牛乳が好ましい。乳は、未殺菌乳および殺� �乳の何れであってもよく、また、これらの� �から調製した濃縮乳もしくは練乳、これら� �脱脂乳、部分脱脂乳またはこれらを乾燥し� �粉末にした粉乳等であってもよい。果汁と� �ては、例えば、モモ、ナシ、リンゴ、イチ� �、ザクロ、ブドウ、マンゴー、ミカン、オ� �ンジ、パイナップル等の汁液が挙げられる� �これらに限定されず、果物のピューレであ� �てもよい。また、野菜汁としては、例えば� �ニンジン、トマト、キャベツ等の汁液が挙� �られるがこれらに限定されず、野菜のピュ� �レであってもよい。果汁および野菜汁は、� �物または野菜をミキサー等で摩砕し、必要� �応じて更に搾汁することにより得られる。� �のような果汁および野菜汁は、適宜濃縮さ� �てもよく、濃縮液は、そのままであっても� �蒸留水等で適当な濃度に希釈して用いられ� �もよい。上述した乳、果汁および野菜汁は� �それぞれが単独で用いられても、目的に応� �て組み合わせて用いられてもよい。なお、� �物または野菜のピューレは、超高圧下(例え� ��、100MPa)にて酵素処理を行うことによって得 られ、食物繊維を豊富に含んでいる。この酵 素処理に用いられる酵素は、果物または野菜 の種類に応じて適宜選択され得る。

 本明細書中において、用語「生菌を生存� ��能に含有している」は、目的の菌株が死滅� ��ることなく組成物中に維持されている態様� ��あれば特に限定されない。すなわち、上記� ��成物中では、目的の生菌が増殖していても� ��眠していてもよい。一実施形態において、� ��発明に係る組成物は、ラクトバシラス プ� �ンタルムSN13T株によって醗酵する醗酵原料を さらに含有していることが好ましく、酒粕も しくは焼酎蒸留残渣またはこれらの抽出物を さらに含有していることが好ましい。このよ うな形態であれば、ラクトバシラス プラン� ��ルムSN13T株の生菌の酵素活性を高く保つこ� �ができるので、この生菌を組成物中で生存� �能に含有し得る。他の実施形態において、� �発明に係る組成物は、ラクトバシラス プラ ンタルムSN13T株の生菌を、適切な賦形剤とと� ��に含んでいる。乳酸菌の生存に影響を与え� ��い賦形剤は当該分野において周知であり、� ��えば、デンプン、乾燥酵母、乳糖、白糖な� ��が挙げられ、また、組成物を錠剤に加工す� ��ためのもの(例えば、コーンペプチド、麦芽 糖など)であってもよい。このように、本発� �に係るHelicobacter pyloriの生育阻害剤を製造す るための組成物は、いわゆる「醗酵種」とし て用いられるべきものであることが意図され る。

 〔3〕Helicobacter pyloriの生育阻害剤およびそ� ��製造方法
 本発明は、Helicobacter pyloriの生育阻害剤を� �供する。本発明に係る生育阻害剤には、上� �した植物乳酸菌の培養上清またはその培養� �清の抽出物を含んでいることを特徴として� �る。

 本発明に係る生育阻害剤は、上記植物乳� ��菌の培養上清を得る工程を包含する製造方� ��を用いて製造される。得られた培養上清は� ��そのまま用いられてもその抽出物が用いら� ��てもよい。すなわち、本発明に係る生育阻� ��剤の製造方法は、培養上清のエステル抽出� ��を得る工程をさらに包含してもよい。また� ��本発明に係る生育阻害剤の製造方法は、培� ��培地に酒粕もしくは焼酎蒸留残渣またはこ� ��らの抽出物を添加することをさらに含んで� ��よい。なお、酒粕もしくは焼酎蒸留残渣ま� ��はこれらの抽出物については、本明細書中� ��おいて参考として援用される特許文献3にそ の詳細が記載されており、当業者は容易に理 解し得る。

 本発明に用いられる培養培地としては、� ��汁または野菜汁が挙げられる。果汁として� ��、例えば、モモ、ナシ、リンゴ、イチゴ、� ��クロ、ブドウ、マンゴー、ミカン、オレン� ��、パイナップル等の汁液が挙げられるがこ� ��らに限定されず、果物のピューレであって� ��よい。また、野菜汁としては、例えば、ニ� ��ジン、トマト、キャベツ等の汁液が挙げら� ��るがこれらに限定されず、野菜のピューレ� ��あってもよい。果汁および野菜汁は、果物� ��たは野菜をミキサー等で摩砕し、必要に応� ��て更に搾汁することにより得られる。この� ��うな果汁および野菜汁は、適宜濃縮されて� ��よく、濃縮液は、そのままであっても、蒸� ��水等で適当な濃度に希釈して用いられても� ��い。上述した果汁および野菜汁は、それぞ� ��が単独で用いられても、目的に応じて組み� ��わせて用いられてもよい。なお、果物また� ��野菜のピューレは、超高圧下(例えば、100MPa )にて酵素処理を行うことによって得られ、� �物繊維を豊富に含んでいる。この酵素処理� �用いられる酵素は、果物または野菜の種類� �応じて適宜選択され得る。このような培地� �用いることにより、抗ピロリ活性を含んだ� �養上清を得ることができる。なお、培養上� �中の抗ピロリ活性は、酢酸エチル等のエス� �ル類によって抽出されるものであっても、� �溶性のものであってもよく、エステル類に� �って抽出されるものの活性本体としては、� �テコールおよびチロソールが挙げられる。� �出物は、そのまま利用されてもよく、希釈� �濃縮または凍結乾燥した後に、必要に応じ� �粉末又はペースト状に調製して用いられて� �よい。また、抗ピロリ活性以外の夾雑物を� �去したものや、必要に応じて、公知の方法� �脱臭、脱色等の処理を施したものも、上記� �出物の範囲内であることが意図される。

 なお、本発明に係る生育阻害剤の製造方� ��における培養工程は、醗酵原料を植物乳酸� ��の生菌で醗酵させる醗酵工程であり得る。� ��酵工程は、酸度が0.6~1.5%の範囲内になるま� �醗酵原料を醗酵させることが好ましい。醗� �は、当該分野において公知の手法を用いて� �われればよい。果汁または野菜汁を醗酵原� �として用いる場合、果汁または野菜汁、あ� �いはこれらに他の原料を添加した溶液を65~13 0℃で1秒間~30分間加熱殺菌し、次いで30~45℃� �で冷却し、続いて、この溶液に植物乳酸菌� �0.1~6重量%接種した後、30~45℃の温度で12~72時� ��醗酵させ、醗酵終了後に冷却したものを醗� ��物(醗酵果汁または醗酵野菜汁)として用い� �ばよい。これら醗酵果汁または醗酵野菜汁� �、そのまま飲料としてもよく、さらには希� �または殺菌を行い醗酵果汁飲料または醗酵� �菜汁飲料とすることができる。

 なお、醗酵物を得る際には、醗酵原料以� ��に、ゼラチン、寒天、糖類、香料、果肉な� ��のような醗酵飲料の製造に通常使用されて� ��る原料を添加することもできる。例えば、� ��糖、グルコース、フラクトース、パラチノ� ��ス、トレハロース、等の糖類、ソルビトー� ��、キシリトール、エリスリトール、還元水� ��等の糖アルコール類、アスパルテーム、ア� ��スルファムカリウム等の高甘味度甘味料、� ��糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エス� ��ル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、� ��サンタンガム、グァーガム等の増粘剤、ク� ��ン酸、乳酸、リンゴ酸等の酸味料、レモン� ��汁、オレンジ果汁等の果汁類の他、ビタミ� ��類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等の� ��ネラル類、更には甘草、桂枝、生姜のよう� ��生薬、あるいは香草、グルタミン酸ナトリ� ��ム、クチナシ色素、シリコーン、リン酸塩� ��の食品添加物等を添加することが可能であ� ��。

 本発明に係る生育阻害剤は、ピロリ菌の� ��育を阻害するための試薬であっても、医薬� ��成物または食用組成物を製造する際の添加� ��であってもよく、医薬組成物または食用組� ��物として用いられてもよい。本発明に係る� ��育阻害剤は、ピロリ菌の生育を阻害し得る� ��能性食品を製造するに特に有用である。

 本発明を用いて製造される医薬組成物は� ��製薬分野における公知の方法により製造す� ��ことができる。本発明に係る医薬組成物に� ��ける抗ピロリ活性の含有量は、投与形態、� ��与方法などを考慮し、この医薬組成物を適� ��な量にて投与できるような量であれば特に� ��定されない。本発明に係る医薬組成物は経� ��投与されることが好ましく、経口投与に好� ��しい錠剤、カプセルなどの形態として調製� ��れ得る。経口投与される態様(すなわち経口 剤)の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、� �ンニット、カルボキシメチルセルロース、� �ーンスターチ、無機塩などが医薬用担体と� �て利用される。また経口剤を調製する際、� �に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、� �動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを� �合してもよい。安定化剤、抗酸化剤などの� �うな補助物質もまた、本発明に係る医薬組� �物中に存在し得る。本発明に係る医薬組成� �はそのまま経口投与するほか、任意の飲食� �に添加して日常的に摂取させることもでき� �。投与および摂取は、所望の投与量範囲内� �おいて、1日内において単回で、または数回� ��分けて行ってもよい。

 本発明を用いて製造される食用組成物は� ��ピロリ菌の生育を阻害するための食用組成� ��(すなわち、食品、飲料など)であり、健康� �品(機能性食品)として極めて有用である。本 発明に係る食用組成物の製造法は特に限定さ れず、調理、加工および一般に用いられてい る食品または飲料の製造法による製造を挙げ ることができ、本発明によって得られた抗ピ ロリ活性が、その食品または飲料中に含有さ れていればよい。本発明に係る食用組成物と しては、例えば、乳製品(例えば、ヨーグル� �)、健康食品(例えば、カプセル、タブレット 、粉末)、飲料(例えば、乳飲料、野菜飲料な� ��)、ドリンク剤などが挙げられるがこれらに 限定されない。

 〔4〕カテコールの製造方法
 本発明は、カテコールの製造方法を提供す� ��。本発明に係るカテコールの製造方法は、� ��記植物乳酸菌の培養上清を得る工程を包含� ��、好ましくは、培養上清のエステル抽出物� ��たはクロロホルム抽出物を得る工程をさら� ��包含し得る。また、本発明に係るカテコー� ��の製造方法は、培養培地に酒粕もしくは焼� ��蒸留残渣またはこれらの抽出物を添加する� ��とをさらに含んでもよい。このように、本� ��明に係るカテコールの製造方法は、上述し� ��Helicobacter pyloriの生育阻害剤の製造方法で� �り得ることを、当業者は容易に理解し得る� �

 〔5〕チロソールの製造方法
 本発明は、チロソールの製造方法を提供す� ��。本発明に係るチロソールの製造方法は、� ��記植物乳酸菌の培養上清を得る工程を包含� ��、好ましくは、培養上清のエステル抽出物� ��たはクロロホルム抽出物を得る工程をさら� ��包含し得る。また、本発明に係るチロソー� ��の製造方法は、培養培地に酒粕もしくは焼� ��蒸留残渣またはこれらの抽出物を添加する� ��とをさらに含んでもよい。このように、本� ��明に係るチロソールの製造方法は、上述し� ��Helicobacter pyloriの生育阻害剤の製造方法で� �り得ることを、当業者は容易に理解し得る� �

 〔6〕果汁の利用
 後述する実施例において示すように、ブル� ��ベリー果汁またはザクロ果汁は、植物乳酸� ��による醗酵を経ることなく、Helicobacter pylor iの生育を阻害し得る。すなわち、本発明は� �ブルーベリー果汁またはザクロ果汁の新規� �途を提供する。

 1つの局面において、本発明に係るHelicobac ter pyloriの生育阻害剤は、ブルーベリー果汁� ��たはザクロ果汁をさらに含有していること� ��特徴としている。また、本発明に係るHelicob acter pyloriの生育阻害剤を製造する方法は、� �ルーベリー果汁またはザクロ果汁を得る工� �をさらに包含することを特徴としている。� �らに、本発明に係るHelicobacter pyloriの生育阻 害剤を製造するための組成物は、ブルーベリ ー果汁またはザクロ果汁をさらに含有してい ることを特徴としている。生育阻害剤、生育 阻害剤の製造方法、および生育阻害剤を製造 するための組成物については、植物乳酸菌に よる醗酵の観点を除いて上記を参照すればよ いことを、本明細書を読んだ当業者は容易に 理解する。