基于表达 HBsAg和 HBcAg的失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫� �� 技术领域

本发明属基因工程领域,涉及疫苗为失活全重� �汉逊酵母细胞表达 HBsAg 和 HBcAg 治疗乙肝疫苗。 背景技术

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世界� �生组 织 (World Health Oganization , WHO)报道， 全球 60亿人口中， 约 20亿人曾感染过 HBV， 其 中 3.5亿人为慢性 HBV感染， 每年约有 100万人死于 HBV感染所致的肝衰竭、 肝硬化和原 发性肝细胞癌 (肝癌)。 全球肝癌患者中， 75 % 以上是由 HBV所致。 我国属 HBV感染地方 性流行区。 我国卫生部于 1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。 2001年 12月国务院正 式批准将乙型肝炎疫苗纳入儿童计划免疫， 要求各省市自治区从 2002年起， 除收取少量手 续费外， 给所有新生儿免费接种乙型肝炎疫苗。 按照 2005年 3月制订的计划免疫条例,自 2005年 6月 1日起， 所有新生儿乙型肝炎疫苗免疫完全免费。 经过近 15年的努力， 我国一般 人群， 尤其是 15岁以下儿童， 乙型肝炎病毒感染率明显下降。 据 2006年全国乙型肝炎血清 流行病学调查表明,全人群乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)携带率己由 1992年 9.75%降至 7.18%,5 岁以下儿童的乙型肝炎表面抗原携带率已由原 来 9.67%降至 0.96%。 据此推算， 我国现有的 慢性 HBV感染者约 9300万人， 其中慢性乙型肝炎患者约 2000万例。每年因 HBV导致的肝硬 化和肝癌死亡 30余万例， 新发乙型肝炎病例 50万 -100万例。 因此， 本病是我国当前和今后 相当长时期内危害人民健康、 阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素， 是一个严重的公 共卫生问题， 也是我国在建立以人为本的和谐社会过程中， 需要优先解决的一个重大健康 问题。我国人群 HBV感染的流行率高,给国家带来了沉重的经济� �担。据调查. 我国每年因 慢性乙肝 (包括肝硬化、肝癌） 的直接和间接医疗费用约 6800亿元。 乙肝疫苗免疫预防与治 疗是降低疾病负担最有效的方法。

基因重组技术是现代生物技术的核心技术； 也是规模化生产乙肝疫苗主要组份一病 毒样颗粒乙肝表面抗原 （HBsAg VLP) 的唯一技术。 本专利权人从 1995年开始从事汉逊 酵母重组乙肝疫苗研发工作。 1998-2002 年在大连高新生物制药有限公司， 主持开发的汉 逊酵母重组 HBsAg adw2乙肝疫苗， HBsAg VLP抗原纯品 （原液） 产率为 40mg /升； 于 2002年起经国家审批上市。 2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公 司协议开发 的重组汉逊酵母 HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗。其 HBsAg VLP抗原纯品（原液）产率为 85mg/ 升以上； 已于 2015 年申报国家新药审评， 以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为

根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下： 人感染 HBV后， 一般可分为免疫耐受期、 免疫清除期和非活动或低 （非）复制期。 免疫耐受期的特点是 HBV复制活跃， 血清 HBsAg 和 HBeAg阳性 ,HBV DNA滴度较高 (〉 10 ⁵ 拷贝 /ml),血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)水平正常， 肝组织学无明显异常。 免疫清除期表现为血清 HBV DNA滴度〉 10 ⁵ 拷贝 /ml , 但一般低于 免疫耐受期,天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)持续或间歇升高， 肝组织学有坏死炎症等表现。 非活动或低 (；非;)复制期表现为 HBeAg阴性， 抗 -HBe阳性, HBV DNA检测不到 (PCR)法或低 于检测下限,水平正常， 肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感 染 HBV, —般无免疫 耐受期， 一开始即为免疫清除期,表现为急性乙型肝炎� � 其中仅 5%-10%发展成慢性。 但其 确切的发病机制仍不了解。

抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者 及乙肝患者的主要治疗手段。 目前抗乙型 肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调 节剂和针对 HBV DNA多聚酶的核苷酸类似物 两大类，虽有一定疗效， 但尚不满意， 多数患者不能被治愈。 干扰素虽可使少数患者 HBsAg消 失或血清学转化， 但费用较高， 需要注射， 且有一定副作用； 核苷酸 类似物则作用于 HBV DNA聚合酶， 只能抑制病毒复制， 不能彻底清除 HBV和 cccDNA, 且长期应用易导致病毒耐药 变异。

因此， 为了彻底清除 HBV和 cccDNA, 亟待开发新的更有效的 HBV治疗乙肝疫苗。 人 体肝脏为一免疫耐受器官;肝脏移植免疫排斥� �应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒 (HBV) 感染人的部位为肝脏； 因此对 HBV的免疫耐受为其主要特征。 逆转 HBV免疫耐受是开发 慢性乙型肝炎患者 （CHB) 免疫治疗疫苗的立足点。 HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部 anti-HBV免疫应答不能有效清除病毒， 导致持续感染； 也体现在 HBV持续存在， 进而诱导 全身性免疫系统对 HBV无应答， 如 HBV耐受期病人对 HBsAg疫苗无应答。 这也是当前治 疗性疫苗在 CHB病人中难以成功的主要原因。肝脏诱导的免 疫耐受及其逆转机制研究将为 研制治疗乙肝疫苗提供了理论依据。

2005年 Bowen提出： 肝内的免疫环境与诱导耐受性相关， 但仍保持了维持对病原体有 效反应的能力。 这种二分法的机制尚不清楚。 最近的数据表明， 初始 CD8+T (CTL)细胞 活化在肝脏内发生， 同时肝脏预先有炎症（即天然免疫活化）； 则存活的 CTLs增多， CTLs 更有效，导致肝脏免疫应答，清除感染的 HBV;而在预先肝脏无炎症（即天然免疫未活化� � 如婴幼儿时） ， 则 CTL功能受损和 CTL半寿命短， 导致肝脏对 HBV免疫耐受。 然而， 初始 HBV抗原相遇免疫诱导高效的主要激活 HBV CTLs存在于肝脏外的淋巴结内， 然后再进入 肝脏， 则也使存活的 CTLs增多， CTLs更有效， 也导致肝脏免疫应答， 清除感染的 HBV。 这一关于两个部位的免疫机制为研制皮下、 肌肉注射治疗乙肝疫苗， 导致肝脏免疫应答、 清除感染的 HB V提供了理论依据。

2014年美国 Thomas H. King报道： "A Whole Recombinant Yeast-Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated, whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease- related antigens"; 为一种由失活、 全重组酿酒酵母细胞-表 达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研 究开创了以胞内重组表达蛋白为抗原， 以酿 酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在此平 台下已有编号为 GS4774为乙型肝炎治疗性 疫苗， 其他表达的 HBV抗原为一种作为融合蛋白的 x-s-core抗原。 这一酵母载体可以提 供多种抗原进入 MHC I类和 II类抗原提呈途径， 剌激强有力的 CD4+和 CD8+细胞反应， 并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该 酵母载体也不容易在体内被中和， 因此适合 于重复用药， 使之获得长期的免疫压力， 理想地清除慢性细胞内感染， 如 HCV禾 P HBV。

2010年 Huang报道： 啤酒酵母细胞壁纯化而得的 β-葡聚糖颗粒 （GPS )， 其中具有 1,3-D-glucan 聚合物 >85%， 2%甲壳素， 1%脂类和蛋白质， 与其余的大部分是灰和水分。 进行的体外 T细胞增殖实验中， 将卵清蛋白 （OVA) 复合至空心 GPS壳内 （GP-OVA) 组成的疫苗， 并采用游离 OVA为对照抗原。 GPS-OVA在从 0.03到 0.5μ克 /毫升的浓度范 围内， 剌激 ΟΤ-Ι或 ΟΤ-Π Τ细胞增殖； 相反， 游离 OVA未能剌激 OT-I或 ΟΤ-Π T细胞性 增殖。 为了实现 GP-OVA相似的剌激效应， 要求游离 OVA浓度提高百倍至数百倍。 这些 结果表明： （1 )病毒样颗粒 GPS是 Dectin-1受体的高效激动剂； （2)病毒样颗粒 GP-OVA 传递的抗原与游离 OVA抗原相比， 能被 DCs (树突细胞） 更高效地处理和提呈。

2003-2005年期间美国科学家报道了： 乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果。 控制疾病 的机制是肝细胞核 HBV池的共价闭合环状 DNA (cccDNA 由于产生 IFN-γ的 HBV特 异性 CD8+ T, 即 CTL细胞， 大量涌入肝内， 靶向感染 HBV的肝细胞； 对 cccDNA的清 除、 肝细胞感染 HBV逆转都与肝脏 CD8+ T细胞产生的 IFN-γ涌入等相关。 集合这些结 果表明， cccDNA的清除是一个由细胞免疫反应介导的两步 的过程： 第一步非细胞损伤地 减少 90%以上 cccDNA分子池， 从而消除 HBV松弛的环状脱氧核糖核酸的前体。第二步 提高了这个过程中损毁受感染的肝细胞， 并触发免疫逆转。

2014年中国科技大学博士曾筑天报道：通过水� �力法建立了 HBV持续携带小鼠来模 拟 HBV慢性感染者的免疫耐受状态， 发现 IL-12预处理与 IL-12同 HBsAg VLP疫苗共注 射的联合治疗方式,称为基于 IL-12的疫苗疗法,可以有效逆转 HBV系统性免疫耐受,进而 导致 HBV清除。发现 HBV小鼠经历过基于 IL-12的疫苗疗法之后,淋巴结内滤泡样辅助 T 细胞 （Tfh)以及生发中心 B细胞 （GC B)都发生显著扩增,与之相对应地，脾细胞中 HBsAg 特异性 IgG生成细胞也显著增加，大部分小鼠在治疗后 期血清中出现保护性抗体 anti-HBs ； 此外 ,Τ细胞体外对 HBsAg剌激的增殖能力在 IL-12联合疫苗治疗之后也得到显著恢复。 这些结果充分证实 HBV耐受小鼠在 IL-12联合治疗过程中,对外周 HBsAg疫苗的应答得 以恢复，从而提示 HBV诱导的系统性免疫耐受已被逆转。基于现有 技术文献可以得出提供 —种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗成为现有技 术中亟待解决的问题。

发明内容

为解决前述技术问题， 提供一种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗， 本发明采用的技术方 案为：

提供一种基于表达 HBsAg和 HBcAg的失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫� ��，其 特征在于： 所述乙肝治疗疫苗以重组汉逊酵母细胞内表达 的 HBsAg及 HBcAg为抗原； 含有 19个 HBsAg特异性 CTL表位和 19个 HBcAg特异性 CTL表位；所述乙肝治疗疫苗 以热灭全重组汉逊酵母细为佐剂。

所述乙肝治疗疫苗， 其特征是所述重组汉逊酵母表达的 HBsAg为 adw亚型， 所述重组 汉逊酵母表达 HBsAg的 DNA序列如 SEQ ID NO: 1所示； 所述重组汉逊酵母表达的 HBsAg的 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征是所述重组汉逊酵母表达 HBcAg的 DNA序列为 SEQ ID NO: 3 所示； 所述重组汉逊酵母表达的 HBcAg的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉 逊酵母表达的 HBsAg为病毒样颗粒结构， 由 HBsAg插入汉逊酵母类脂组成， 所述 HBsAg的 14个半胱酸中有 9~12个形成二硫键； 所述 重组汉逊酵母表达的 HBcAg为病毒样颗粒结构。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征在于的失活重组汉逊酵母的失活条件为 ： 失活温度

52 V -56 °C， 失活时间 1小时 -3小时。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征在于所述重组汉逊酵母表达的 HBsAg共含有如下 19个 CTL表位： VLQAGFFLL^ PFVQWFVGL, FLLTRILTK WYWGPSLYSI、 SLNFLGGSPV、 FLGGSPVCL, LYSIVSPF , LYSIVSPFI, PFIPLLPIF , LLLCLIFLL^ LLCLIFLLV

LLDYQGMLPV 、 LVLLDYQGML^ VLLDYQGML、 WLSLLVPFV LLVPFVQWFV、 GLSPTVWLSA, SIVSPFIPLL、 LLPIFFCLWV。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征在于所述重组汉逊酵母表达的 HBcAg共含有如下 19个 CTL表位： SFLPSDFF、 FLPSDFFPSK DFFPSIRDLL, FFPSIRDLL^ SYVNV MGL, SYVNV MGLKK YVNVNMG、 YVNVNMGLK, WFHISCLTF, CLTFGRETV、

VLEYLVSFGV、 EYLVSFGVW、 EYLVSFGVWK AYRPPNAPI、 AYRPPNAPIL、 APILSTLPE、 ILSTLPETTV、 STLPETTVVRR、 RGRSPRRRTP。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充 式注射液剂、注 射液剂或冻干粉针剂。

所述的乙肝治疗疫苗， 其特征在于还含有 HBsAg原液或铝佐剂 HBsAg中的一种。

本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌， 所述的重组多形汉逊酵母菌中含有 SEQ 11) ^«): 1所示1^ 序列。 优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整 合有 SEQ ID NO: 1 所示 DNA序列。

本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌一种 重组汉逊酵母菌，所述的重组多形汉逊 酵母菌中含有 SEQ ID NO _: 3所示 DNA序列。 优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整 合有 SEQ ID NO :3所示 DNA序列。

以上任一所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵 母细胞株为 HU-11 , 保藏编号为

CGMCC No.1218, 所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷 -5-磷酸脱羧酶基因被破坏的 DNA序 列如 SEQ ID NO: 5所示。

本发明提供的乙肝治疗疫苗， 在一种每 10 ⁸ 细胞中含有 6-10μ _§ ΗΒ ₅ Α _§ 的重组汉逊酵 母菌基础上， 可以在现有的作为佐剂的全重组汉逊酵母细胞 的人体注射上限范围内， 最大 限度提高 HBsAg的注射量， 提高其扭转乙肝患者免疫耐受状态的效果。 失活全重组汉逊 酵母细胞为最主要专职抗原递呈细胞 （DC) 的 Dectin-1受体的高效激动剂。 HBsAg特异 性 CTL细胞靶向感染 HBV的肝细胞释放 IFN-γ: 第一步非肝细胞损伤地减少其 90%以上 cccDNA分子池， 第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞， 并触发 HBV免疫逆转。 同 时我们提供的重组汉逊酵母细胞表达的作为抗 原的 HBsAg中至少含有 19个 CTL表位， 可以提高 HBsAg的免疫原性和反应性。 在优选的技术方案中的通过优选表达 HBsAg的 DNA序列 （SEQ ID NO: 1 )， 优选了 21个 CTL中的 19个 CTL表位， 进一步提高了优选 HBsAg的免疫原性和反应性。

同时采用了能够产生 HBcAg重组汉逊酵母失活细胞与产生 HBsAg的重组汉逊酵母的 失活细胞进行配伍， 采用的 HBcAg (高免疫反应活性）优选码基因与 C2基因型、 亚型双 代表序列 AF100309.1比较； 缺失 59-69位： ILCWGELMNLA共 1 1个氨基酸。 根据冷冻 电镜图像重建技术确定 HBcAg颗粒结构； 显示 HBcAg二聚体各包含 4条 α螺旋,即每个 HBcA 亚基通过两个长 α螺旋形成二聚体界面； 其中位于第 51 78位氨基酸的长 α螺旋， 头尾被第 50和 79位保守的 Pro所限制。 深埋在二聚体内部， 不存在 CTL表位。 01螺旋即 所谓的 3.6螺旋,其中每个氨基酸旋转 100°， 3.6个氨基酸旋转 360°原来的 51~78位共 18 个氨基酸形成旋转 5周的 α螺旋； 缺失 59-69位： ILCWGELMNLA共 1 1个氨基酸后， 剩 余的 7个氨基酸形成旋转 2周的 α螺旋。 而另一个形成 HBcAg二聚体界面的长 α螺旋， 即位于第 82-110位的纽结状 a螺旋,终止于第 111位 Gly没有任何改变。 因此本专利基本 未改变两个长 α螺旋形成二聚体界面，上述缺失 1 1个氨基酸的 HBcAg在重组汉逊酵母细胞 中仍能组装成病毒样颗粒 （VLP ) ; 仍保持其热稳定性。 免疫反应检测结果表明： 上述缺 失氨基酸的重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株 （HC-40-25 , 172个氨基酸） 与全长氨基酸的 重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株（183个氨基酸） HC-43相比： 前者免疫反应原性为后者的 三倍以上。 在优选了 CTL表位、 表达序列及重组汉逊酵母工程菌株的基础上， 本发明还 优选了重组汉逊酵母细胞的失活工艺， 保证了疫苗的疗效与安全性。

预期本发明提供的基于表达 HBsAg和 HBcAg的失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗 疫苗将具有更高的免疫原性， 能够更好的用于乙肝的治疗。

附图说明

图 1为质粒 pMPT-HBS-adw的构建过程示意图；

图 2为 pMPT-HBC质粒的物理图谱；

图 3为筛选得到工程菌株 HS604-5的 PCR扩增产物电泳照片；

图 4为重组汉逊酵母得到的重组 HBsAg的纯品 （原液） 的电镜照片；

图 5为实施例 2中重组汉逊酵母 HBsAg工程菌株的构建中重组汉逊酵母的转化与� ��选步骤 流程图。

具体实施方式

汉逊酵母胞内质粒 pMPT-02的开发：

汉逊酵母表达系统包括两个主要元件：

( 1 )启动外源基因高效表达的载体系统（质粒）� � ( 2)具有特定筛选标记的宿主细胞。 应用基因合成技术， 将汉逊酵母 MOX (甲醇氧化酶） 启动子 1.5kb、 汉逊酵母 MOX (甲醇氧化酶） 终止子 350bp、 汉逊酵母自主复制序列 HARS， 1.0kb、 和酿酒酵母脲嘧啶 基因 ScURA31.1kb ; 将以上 5部分基因元件紧密相连后， 再插入 pBluescrip II质粒中， 构 建成穿梭质粒 pMPT-02。 为本申请人的非独占专有技术。

脲嘧啶营养缺陷型 URA3宿主细胞株 HU-11的开发：

利用同源序列介导的同源整合构建了乳清酸苷 -5-磷酸脱羧酶基因 HURA3 被破坏的 重组多形汉逊酵母菌株 HU-11 ( CGMCC Νο.1218 该菌株与目前国内外所用由诱变产生 的营养缺陷型宿主菌株相比， 具有遗传稳定性高， 回复突变率低的特点； 便于进行遗传转 化和重组菌株的筛选， 并保持了野生型菌株的生理生化特性， 有利于重组菌株培养和外源 蛋白的高效表达， 具有较高的工业应用价值。 汉逊酵母基因被破坏宿主菌 HU11株 URA3 基因的 DNA测序结果表明：基因被破坏结果导致第 31位碱基后，插入 GAAGT五个碱基。 GAAGT五个碱基的插入产生移码突变。移码突变� ��致第 11位后的 254个密码子全部被置 换。 GAAGT五个碱基同时产生回复突变的概率极小， 实验检测也证明宿主菌 HU11株的 回复突变率为零； 这种" 0" 回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。 应用上述基因敲除 技术建立的 υ¾Α3 ·营养缺陷型宿主细胞株 HU-11 ( CGMCC No.1218 )本专利权人已申请 的发明专利为 CN1651570A。宿主汉逊酵母菌 HU-11乳清酸苷 -5-磷酸脱羧酶基因 (//ί/Λ43 ) 被破坏的 DNA序列为 SEQ ID NO ： 5。

重组汉逊酵母 HBsAg-adw2优选码基因浙：

本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原 （HBsAg) 的 DNA序列基于 HBsAg adw2亚型设计， 如 SEQ ID NO : 1所示， 所述 HBsAg的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝核心抗原 （HBcAg)的 DNA序列如如 SEQ ID NO : 3所示， 所述 HBcAg的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 4

汉逊酵母胞内型质粒 pMPT-HBS-adw和 pMPT-HBC的构建：

按照 SEQ ID NO: 1所示序列的合成核苷酸序列 (以下简称 HBsAg adw2基因 并构建成 含 HBsAg adw2基因质粒的甘油菌； 测序正确后的质粒用 EcoR I / BamH I双酶切， 酶切产物 切胶回收 701bp的目的片段 DNA。

将酶切鉴定正确的质粒 pHMPT- 02用 EcoR 1 1 BamH I双酶切， 切胶回收后所得到的载 体 DNA连接后得到汉逊酵母胞内型质粒 pMPT-HBS-adw, 将质粒 pMPT-HBS-adw热转化 至 E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中， 涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑 选单菌落， 提取质粒 DNA后用 EcoR I / BamH I双酶切， 酶切结果表明均为阳性克隆。 测序 证明质粒 pMPT-HBS-adw结果正确。

HBsAg adw2基因插入汉逊酵母表达系统胞内型质粒 pMPT-02的多克隆位点: EcoR I和 BamH I之间。质粒 pMPT-HBS-adw全长为 7665bp。质粒 pMPT-HBS-adw的构建过程示意图 如图 1所示。

按照与构建质粒 pMPT-HBS-adw同样的的方法， 构建基于 SEQ ID NO : 3所示序列的 质粒 pMPT-HBC。 pMPT-HBC质粒的物理图谱如图 2所示。

重组汉逊酵母 HBsA 工程菌柳重组汉逊酵母 HBcA 工程菌株的构建：

为了构建重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)工程菌株， 应用申请人开发的细 胞电穿孔技术，经 RC脉冲:幅度 1500V,电容 22μ ,时间常数 3-5ms电击 1次，采用 pMPT-HBS- adw质粒， 转化已敲除 URA3-基因的 HU-11株（CGMCC No.1218) 的汉逊酵母细胞。 在 MD 选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子， 转接 MD液体培养基后连续传代培养， 使 adw2 亚型 HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入� ��主汉逊酵母细胞染色体中。经过对一 千余株转化子单菌落进行如下三步筛选：

(1)转化子单菌落大、 细胞生长快的克隆株为多拷贝的机率大。

(2)应用 PCR技术对比 HBsAg基因和单拷贝数 MOX (甲醇氧化酶） 基因的电泳条带亮 度， 半定量地确定 HBsAg基因拷贝数。

(3)检测经甲醇诱导、 摇瓶培养 72小时的转化子细胞破碎后释放出 HBsAg的表达水平。 将 PCR技术应用于转化子筛选为本申请的一项新创 造;对确定外源基因 HBsAg多拷贝、 异源整合在汉逊酵母染色体中， 而汉逊酵母染色体中 MOX基因完整存在， 未被破坏， 都具 有重要作用； 它们体现了汉逊酵母表达系统独优势。 为此设计了一对引物可同时扩增汉逊酵 母染色体中 MOX基因 （单拷贝） 和异源整合 HBsAg外源基因 （多拷贝）。 通过比较扩增产 物在琼脂糖凝胶电泳中条带的亮度可大致判断 HBsAg基因是否为多拷贝。此方法用于工程菌 HBsAg基因多拷贝菌株的初步筛选。 所扩增的 HBsAg片段长度为 800bp， 扩增的 MOX片段 长度为 2000bp。

设计使用引物序列： primer forward: 5 '-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-'3

primer reverse: 5 '-TACTGCTGCCAGTGCACGGTG-'3

PCR产物琼脂糖凝胶电泳： 工程菌 HBsAg基因扩增产物大小约 800bp， 汉逊酵母单拷贝 基因 MOX基因扩增产物大小约 2000bp。 最终筛选得到的重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表 面抗 原 (HBsAg)工程菌株编号为 HS604-5。

采用质粒 pMPT-HBC， 以构建重组汉逊酵母 HBsAg adw2亚型工程菌株同样的方法 构建并篩选得到的工程菌株 PCR扩增产物电泳照片如图 3所示， 图 3中 1为 Marke 最 终重组汉逊酵母 HBcA 工程菌株编号为 HBC-40-25。

重组汉逊酵母 HBsAg adw2亚型工程菌株发酵液胞內 HBsAgVLP表达量的测定

以天坛生物提供的 adw2亚型 HBsAg乙肝表面抗原冻干标准品 10μ _§ 用稀释液溶解对 倍稀释成 1024ng/mL、 512ng/mL、 256ng/mL、 128ng/mL、 64ng/mL、 32ng/mL、 16ng/mL、 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 Ong/mL (稀释液） 共 11个标准点， 放免试剂盒检测 HBsAg 反应。

重组汉逊酵母工程菌株进行中试规模发酵，发 酵 87小时取样 10 OD ₆ 。。 _nm lmL,玻璃珠破 碎细胞 （细胞破碎率为 65%) 后， 样品稀释 200倍与标准品同时参与放免试剂盒反应， 由 γ-计数器自动完成拟合曲线得出的 HBsAg抗原表达量为 126.9 (ng/mL)。 以此计算重组 汉逊酵母胞内 HBsAg抗原表达量为：

126.96 (ng/mL) χ200 ÷10><4.0>< 10 ⁷ ><65%/ mL=9.8 g/10 ⁸ 细胞

重组汉逊酵母 HBsAg adw2亚型工程菌株发酵液得到的重组 HBsAg的纯品（原液）的电 镜照片如图 4所示。结果显示重组 HBsAg的高纯度、高浓度和病毒样颗粒（VLP)结构 稳定。 经同样方法测定重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株发酵液胞内 HBcAgVLP的表达量， 为 8~12 g/10 ⁸ 细胞。

重组汉逊酵母 HBcAg细胞内病毒样颗粒 （VLP) 的表达

近代分子生物学的中心法则为： DNA— > RNA— >氨基酸一级序列一 >蛋白分子高级 结构一 >蛋白分子功能； 符号一 >表示： 决定。

不同基因型乙肝病毒核心抗原 HBcAg蛋白分子由 183或 185个氨基酸残基组成一级序列， 从而决定了 HBcAg的二级结构、 三级结构和四级结构。 实验表明： 不管是分离的乙肝病毒 颗粒、还是感染细胞内、 重组大肠杆菌及重组酵母菌分离的 HBcAg均发现其可装配成大小 两种颗粒: T=3型由 180个分子量 21kD的相同蛋白质亚基即 90个同型二聚体构成,直径为 30nm,4表面有 90个剌突; T=4型由 240分子量 21kD的相同蛋白质亚基即 120个同型二聚体构 成,直径为 34nm,表面有 120个剌突。

本专利 HBC-40-25工程菌细胞破碎液粗提液的透射电镜照 片明显可见 HBcAg病毒样 颗粒。 上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株 （HC-40-25 , 172个氨基酸） ， 与 全长氨基酸的重组汉逊酵母 HBcAg ( 183个氨基酸） 的 HBC-17等 6个强阳性株相比 （摇瓶 培养甲醇诱导 3天的 1 0D _6QQnm .ml细胞，经玻璃珠破碎， 1000倍稀释样品），检测免疫反应原 性 （单位为 NCU/mL) 结果如下：

HBC-40-25 HBC-17 HBC-31 HBC-36 HBC-39 HBC-41 HBC-51

35.21 5.83 5.64 5.64 6.34 8.99 5.75

HBC-40-25株的免疫反应原性为其它 6个强阳性株的三倍以上。

优化的失活重组汉逊酵母 HBsA 和 HBcAg细胞条件

为了确定失活重组汉逊酵母的最佳条件， 应满足以下要求： （1 ) 失活重组汉逊酵母 的成活率尽可降低； （ ₂ ) 保持全重组汉逊酵母细胞结构， 酵母细胞内抗原不泄漏； （3 ) 保持重组汉逊酵母细胞内表达 HBsAg病毒样颗粒 （VLP) 和 HBcAg病毒样颗粒 （VLP ) 热稳定， 使其抗原反应活性不下降。 其中失活重组汉逊酵母细胞内 HBsAg和 HBcAg病 毒样颗粒（VLP)的热稳定性成为首次要解决的� �题。为此设计了 16组不同温度（50°C、 52°C、 54°C、 56°C和 58°C )， 及不同时间 （lh、 2h和 3h) 的重组 HBsAg和 HBcAg汉逊 酵母的失活试验， 并设 20°C为对照组。 通过检测： 随着失活温度、 时间的昇高， 导致细 胞壁外层溶解度加大， 细胞破碎率增加， 胞内 HBsAgVLP抗原反应性在 52°C、 lh出现倍 增的峰值； 而 HBcAg抗原反应性在 56°C、 lh出现倍增的峰值。 胞外 HBsAg和 HBcAg 抗原反应性在失活试验的全部温度与时间范围 内均极低， 表明胞内 VLP未外泄， 保持失 活重组汉逊酵母细胞完整。 失活细胞成活率在 56°C、 3h条件下已低至 50,000之 1。 从而 为优化失活重组汉逊酵母细胞的条件提供了依 据。

HBsA 及 HBcAg特异性 CTL T细胞非细胞损伤地触发免疫逆转

乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果表明： HBsAg特异性 CTL T细胞，靶向感染 HBV 的肝细胞释放 IFN-γ; 第一步非肝细胞损伤地减少其 90%以上 cccDNA分子池， 第二步提 高了这个过程中损毁受感染的肝细胞， 并触发免疫逆转。 依据 CTL表位的实验综述、 预 测和专利发明等三篇文报道： HBV衣壳抗原 （Pre-Sl- Pre-S2-HBsAg) 不重复 CTL表位 共 23个。 本申请的 HBsAg氨基酸序列中共含有以下 19个 CTL表位： VLQAGFFLL、 PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、 SLNFLGGSPV、 FLGGSPVCL , LYSIVSPF , LYSIVSPFI , PFIPLLPIF , LLLCLIFLL LLCLIFLL V LLDYQGMLPV 、LVLLDYQGML、 VLLDYQGML、 WLSLLVPFV、 LLVPFVQWFV、 GLSPTVWLSA、 SIVSPFIPLL、 LLPIFFCLWV。本申请的 HBcAg氨基酸序列中共含有以下 19个 CTL表位： SFLPSDFF、 FLPSDFFPSK DFFPSIRDLL、 FFPSIRDLL^ SYVNVNMGL、 SYVNV MGLKK YVNVNMG、 YVNV MGLK、 WFHISCLTF、 CLTFGRETV、 VLEYLVSFGV、 EYLVSFGVW、 EYLVSFGVWI、 AYRPPNAPI 、 AYRPPNAPIL 、 APILSTLPE 、 ILSTLPETTV、 STLPETTVVRR、 RGRSPRRRTPc

本发明提供的乙肝治疗疫苗产品优先为预充式 注射液剂：

实验证明常规分装重组乙肝疫苗（酵母）预充 注射液剂， 37 °C放置 45天的热稳定性 实验表明疫苗的体外相对效力（RP)均符合要求 ,而常规分装乙肝疫苗在相同保存条件下 RP 均不符合要求。预充注射器分装的重组乙肝疫 苗（酵母） 可在短时间内脱离冷链运输、 保存和使用。

预充注射器 1针 1盒， 使用方便、 使用方法和要领易于掌握， 为一次性注射器， 不能 重复使用。疫苗接种时不需另备注射器， 可防止使用玻璃注射器消毒不彻底造成感染或 传 播传染病以及针头选择不当影响接种效果， 避免一次性注射器被重复使用的危险。

预充注射器分装的乙肝疫苗全程接种具有良好 的综合费用效益比。

下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不 能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例 1

基于所述 SEQ ID NO : 1构建的 pMPT-HBS-adw质粒 （即包含所述 SEQ ID NO: 1的表 达载体） 。 质粒 pMPT-HBS-adw的构建工作包含以下内容：

按照我们设计的 SEQ ID NO : 1序列合成了 HBsAg adw2基因； 并构建成含 HBsAg adw2基因质粒的甘油菌， 将其命名为 MC407B-16。

测序正确后的 MC407B-16号质粒用 EcoR I I BamH I双酶切， 酶切产物用 TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit(Code No.D301) 切胶回收 701bp的目的片段 DNA称为 Inset 将酶切鉴定正确的质粒 pHMPT- 02用 EcoR I / BamH I双酶切， 切胶回收后所得到的 载体 DNA称为 Vector DNA6。

使用 TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No. D6022)中的 Solution,将 Inset DNA6与 Vector DNA6连接后，热转化至 E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培 养菌体。从转化平板上挑选单菌落， 提取质粒 DNA后用 EcoR I / BamH I双酶切， 酶切结 果表明： MC407A+B+C+D-77^ 80均为阳性克隆。

将 MC407A+B+C+D-77号质粒分别用引物 RV-M， Ml 3 -47, MC407P1 , MC407P2,

MC407P3， MC407P4， MC407P5， MC407P6， MC407P7， MC407P8， MC407P9， MC407BF 11， MC407BR11测序， 证明质粒 pMPT-HBS-adw结果正确。

以同样的方法， 基于所述 SEQ ID NO: 3构建的 pMPT-HBC质粒。

实施例 2

重组汉逊酵母 HBsAg工程菌株的构建。

重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的转化与筛选图示 说明： 重组汉逊酵母的转化与筛选过程如 图 5所示- 具体包括

1 ) 应用细胞电穿孔法， 将 pMPT-HBS-adw质粒， 转化作为宿主细胞的 URA3-营养缺陷 型汉逊酵母细胞株 HU-11 (CGMCC Νο.1218)。采用选择培养基（MD液体培养基）平 皿培养。 在 MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子� �� 转接 MD液体培养基后连续传代培养， 使 adw2亚型 HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、 外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。

2) 菌株筛选包括以下步骤

( 1 ) 选择尿嘧啶原养型转化子单菌落

挑选菌体生长速度快的菌落， 应用 PCR技术检测 HBsAg基因条带亮度后， 挑选拷贝数 多的菌落， 采用选择培养基对单菌落进行摇瓶培养， 连续传代培养 20 400个世代；

(2)筛选多拷贝异源整合转化克隆株，

经过步骤 （1 ) 传代培养后， 经甲醇诱导培养 72 小时后， 采用 /放射免疫分析 (Radio immunoassay or radioimmunoassay, RIA)测定转化子细胞破碎后释放出 HBsAg的表达水平；

(3)筛选去除游离质粒的高拷贝、 高表达克隆株

将经过步骤（2)筛选的克隆株， 采用 YPD完全培养基培养 48小时后， 转接选择培养基 平皿克隆化培养， 并采用定量 PCR检测 HBsAg基因拷贝数， 以 RIA检测 HBsAg表达水平。

(4)在步骤（3 ) 的检测结果基础上， 选择遗传稳定的重组汉逊酵母 HBsAg工程菌的原 代菌株。

按照同样的方法， 构建并筛选重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株。

实施例 3、 30升中试发酵（重组汉逊酵母 HBcAg工程菌株和重组汉逊酵母 HBsAg工程 菌株采用相同的发酵工艺方法）

主要工艺 和操作要点：

1 ) 以 200ml种子培养基解冻贮存菌种， 接种至培养基中， 均分两个 0.5L摇瓶， 3 C培 养 22小时作为一级种子； '

2)以 1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培 养基中， 均分 6个 1L摇瓶， 3 C 培 20小时作为二级种子；

3 )将 12L发酵培养基调 pH至 5.5加入 30L发酵罐中， 将二级种子接入后， 30-3 C经甘 油、 甲醇两碳源， 生长、 去阻遏和诱导三时相， 共培养 85-96小时， 在停止诱导 2-3小时后 收获细胞。 将冷冻的细胞匀浆。

操作要点：

( 1 ) 生长时相的补料操作要待溶氧有明显下降， 基础培养基消耗时开始进行， 并且随 着基础培养基消耗量的增加逐步提高流加速度 ， 待溶氧回升前 2-3小时流加完毕。

(2) 生长时相的后期要注意溶氧回升， 记录溶氧最低值， 溶氧回升至 70-80% 时开始 流加， 进入去阻遏时相。

(3 ) 去阻遏时相后期， 流加结束后， 溶氧开始回升。 溶氧回升至 70-80%%时开始流加 甲醇诱导溶液， 将甲醇浓度控制在 3-5%。， 由甲醇检测流加控制器控制流加速度。

发酵结束前 2-3小时停止甲醇流加， 以减少细胞收获时甲醇残留。

1. 氯化钙溶液的配制

准确称量 CaCl ₂ 11.33g， 放入洗净的三角瓶中 加适量去离子水溶解后定容至 200ml _t 2. 微量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

(NH ₄ ) ₂ Fe(S0 ₄ ) ₂ '6H ₂ 0 lOOOmg

CuS0 ₄ '5H ₂ 0 80mg

ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 300mg

MnS0 ₄ 'H ₂ 0 400mg

EDTA lOOOmg

将称量后的试剂放入洗净的：：角瓶中， 加适】 ：去离子水溶解后定容至 200ml _t 3. 维生素溶液的配制

准确称量以下试剂：

d-Biotin 6mg

Thiamin HCl 2000mg

将生物素首先溶解在 10ml的 50%异丙醇中， 待溶解后再加入 Thiamin HC1， 然后加适 去离子溶解后水定容至 100ml。

4. 痕量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

NiS0 ₄ *6H ₂ 0 10mg

CoCl ₂ '6H ₂ 0 10mg

Na ₂ Mo0 ₄ *2H ₂ 0 lOmg

KI lOmg

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中， 加适量去离子溶解后水定容至 50ml _t 以上四种溶液分别除菌过滤备用。

5. 种子盐溶液的配制

准确称量以下试剂:

H ₄ H ₂ P0 ₄ 80g

MgS0 ₄ '7H ₂ 0 18g

KC1

NaCl 将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中， 加适量去离子水溶解后定容至 1600ml。

6. 用 2000ml三角瓶称取甘油 27g， 混合盐溶液 360mL， 加去离子水定容至 1800ml,等量 分装于两个 2000ml三角瓶中， 110°C、 30分钟高压蒸汽灭菌。

110°C、 30分钟高压蒸汽灭菌空消 500ml三角瓶 2个， 1000ml三角瓶 6个， 100ml 和 500ml量筒各一个。

7. 一级种子培养基

在超净台中， 无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各 100ml , 分别置于灭菌后

的 2个 500ml三角瓶中， 并分别加入：

氯化钙溶液 1ml

微量元素溶液 1ml

维生素溶液 0.5ml

痕量元素溶液 0.25ml

将加入的溶液摇匀。

8. 二级种子培养基

在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水 溶液 1600ml置于灭菌后的 2000ml三角 瓶中， 并分别加入：

氯化钙溶液 16ml

微量元素溶液 16ml

维生素溶液 8ml

痕量元素溶液 4ml

9. 发酵培养基

准确称量以下试剂并溶解于 2000ml去离子水中。

H ₄ H ₂ P0 ₄ 175g

MgS0 ₄ '7H ₂ 0 40g

KC1 44g

NaCl 4.4g

取一个 500ml小烧杯称取 520g甘油， 加泡敌 10ml在线灭菌， 然后加：

氯化钙溶液 175ml

微量元素溶液 175ml

维生素溶液 88ml

痕量元素溶液 44ml

10. 补料培养基

取一个 1000ml三角瓶， 量取 87g H ₄ H ₂ P0 ₄ 、 260g甘油， 加去离子水 500ml， 加入包裹好 的补料管线， 110°C、 30分钟灭菌。

11 . 去阻遏溶液

用 5000ml三角瓶，量取甘油 1800g，加去离子水 660ml ，加入包裹好的补料管线， 110°C、 30分钟灭菌， 冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液 540ml。

12. 诱导溶液

用 1000ml三角瓶， 量取甘油 400ml， 加入包裹好的补料管线， 110°C、 30分钟灭菌， 冷 却后无菌操作加入甲醇 1600ml。

实施例 4

纯化， HBsAg和 HBcAg采用同样的纯化工艺， 以 HBsAg为例， 工艺如下：

将实施例 3得到的重组汉逊酵母 HBsAg工程菌株发酵液经收获细胞并洗涤细胞， 纯 化的详细步骤可参见参考文献： 李津， 孔艳. 重组乙型肝炎疫苗生产工艺. 见李津， 俞詠 霆，董德祥主编：生物制药设备和分离纯化技 术. 第 1 版. 北京：化学工业出版社， 2003 ： 348-349. 其中可将上述收获的细胞经过匀浆器破碎， 释放出 HBsAg ； 以 0.22μιη 微孔滤 器过滤去除细胞碎片； 再以 300Κ超微滤器超滤去除小分子杂质； 以硅胶吸附处理法提取 HBsAg ； 最后以丁基琼脂糖疏水层析方法精制纯化。

实施例 5

失活重组汉逊酵母细胞最隹条件试验

为了确定失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足 以下要求：

( 1 ) 失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低； 使之小于 5%。

(2) 保持完整的细胞结构； 发挥多价位失活重组汉逊酵母佐剂活性作用；

(3 )保持重组汉逊酵母细胞内表达的病毒样颗粒� �VLP )完整，使其抗原性不下降。 以上三点是失活重组汉逊酵表达 HBsAg和 HBcAg生产工艺主要条件； 将为制定疫 苗制造及检定规程提供依据。其中失活重组汉 逊酵母细胞内病毒样颗粒（VLP)的热稳定 性成为首次要解决的问题。

( 1 )、 优化条件的失活重组汉逊酵母细胞制备。

重组汉逊酵母 HBsAg工程菌 （HS604-5株） 细胞培养经发酵或摇瓶诱导培养结束后。 细胞用离心法在磷酸盐缓冲液（PBS )中洗涤三次， 将沉淀的汉逊酵母悬浮在计算体积的 PBS中。 细胞使用 OD _6()Qnm 计数， PBS稀释为 10 OD _6QQnm /毫升,每支试管 2毫升； 每试验组设 破碎与不破碎 2支试管； 16个试验组共需制备 32支细胞样品试管。

放在设定温度水浴， 经设定间时失活重组汉逊酵母。

失活重组汉逊酵母应在加有氯霉素完全培养基 琼脂皿于 37°C培养 3天； 计数其成活 率。

热灭活汉逊酵母储存在 4摄氏度以供进一步使用。

(2)、 重组汉逊酵母 HBsAg工程菌 （HS604-5株） 细胞热灭活试验组设立：

20°C 室温组一支 （对照）

50°C 1小时组 2小时组 3小时组

52 °C 1小时组 2小时组 3小时组

54 °C 1小时组 2小时组 3小时组

56°C 1小时组 2小时组 3小时组 58°C 1小时组 2小时组 3小时组

共 16个试验组。 热灭活后采用放免 HBsAg试剂检测 HBsAg抗原活性； 1 : 100稀释 和 1 : 1000稀释， 设复管。 检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵 母失活的优化 工艺条件。

(3 )、 重组汉逊酵母 HBcAg工程菌细胞热灭活试验组设立

20°C 室温组一支 （对照）

50°C 1小时组 2小时组 3小时组

52 °C 1小时组 2小时组 3小时组

54 °C 1小时组 2小时组 3小时组

56°C 1小时组 2小时组 3小时组

58°C 1小时组 2小时组 3小时组

共 16个试验组。热灭活后采用放免 HBcAg试剂检测 HBcAg抗原活性； 1 : 100稀释 和 1 : 1000稀释， 设复管。 检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵 母失活的优化 工艺条件。

文献

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16、发明人 吴玉章等； 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原 及其制备方法和用 途； 公开号： CN1483736A。

17、 邓小燕， 人全基因组乙型肝炎病毒基因 （亚） 型间重组体研究， 重庆医科大学博士 学位论文， 2012 年 5 月。

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-3-1 保藏单位名称 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心-3-2 保藏单位地址 中国微生物菌种保藏委员会，中国北京市 2714信箱，邮政 编码: 100080， Beijing (CN)。

-3-3 保藏日期 2004年 9月 13日（13.09.2004)

-3-4 保藏号 CGMCC 1218

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