[발명의 명칭】

헬리시움 에리나슘 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 렉틴 [기술분야】

본 발명은 신규 헬리시움 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L 균주， 이로부터 생산된 시알산 특이적으로 결합하는 렉틴， 및 상기 렉틴의 용도에 관한 것이다. [배경기술]

렉틴 (Lectin)은 미생물에서 고등동물에 이르기까지 존재하는 당사슬에 결합할 수 있는 단백질의 하나로， 생명체에 있어 당사슬과의 특이적인 결합을 ^' 통해 protein quality control , host -pathogen interact ion, cellᅳ cell communication, inflammation, immune response, cancer progression, development 등 다양한 생명현상에 관여한다고 알려져 있다 (Lam and Ng, 2011. Appl . Microbiol . Biotechnol . 89， 45).

렉틴은 multivalent, 효소의 활성을 포함하지 않고, 항체의 성격을 포함하지 않는 단백질로， 19 세기말 러시아의 SiUmark에 의해 최초로 Ricinus co國 unis에서 분리된 이후， 현재까지 Concanavlain A(ConA)를 비롯하여 40여종의 렉틴이 연구 및 다양한 용도로 사용되고 있다. 최근 분자생물학 및 생화학의 진보로 염기서열 및 단백질 구조에 따라 렉틴을 다양한 그룹으로 분류하기 시작했으며, 원천 (origin)에 따라 크게는 식물 (plant lectin families) 및 동물 (invertebrate/vertebrate lectin families) 렉틴으로 분류하고 있으며， vertebrate lectin은 다시 그 특성에 따라 C— type (만노즈 결합 렉틴 : mannoseᅳ binding lectin, MBL) , S ^~ type(galect in ^' , β -galactoside-binding lectin), P_type(mannoseᅳ 6ᅳ phosphate bindg lectin), I-type (select in) , 그리고 단백질 구조적으로 cyclic pentamer ic 형태를 갖는 Pentraxin으로 분류한다. 이렇게 다양한 렉틴이 존재하지만 세포의 생리학적 대사과정에 작용하는 invertebrate/vertebrate lectin families은 그 양이 작아서 당사슬에 선택적으로 결합하는 특성을 이용한 혈액형 진단 및 웅용에는 자연계에서 추출한 식물 렉틴이 광범위하게 사용되고 있다 (Lehmann et al .， 2006, Cell. Mol. Life Sci. 63， 1331).

식물 렉틴은 식물체의 잎， 줄기, 뿌리, 꽃， 화분 등 거의 식물체의 모든 부분에 존재하며 수확이 가능한 씨와 구근에서도 발견되기 때문에 용이하게 렉틴을 정제할 수 있는 장점으로 많은 정제가 식물체를 대상으로 이루어졌다. 식물체에서의 렉틴은 면역작용 (i睡 une function), 해충으로부터 자기방어, 알레르기를 일으켜 동물로부터 자기방어， 항곰광이성 작용， 항바이러스 작용， 식물 및 미생물간의 세포간 상호작용을 통한 공생미생물의 특정부위로 colonization, 영양분 및 금속이온의 전달 및 저장, 냉온으로부터 식물 조직체의 보호， 세포내 효소의 활성 증대를 위한 파트너로써의 작용， 그리고 당단백질의 trafficking 등 다양한 기능이 알려져 있는데， 이들 모든 작용은 당사슬과의 선택적 결합을 통한 렉틴의 작용으로 이루어진다고 보고되어 있다 (Lehmann et al. , 2006， Cell. Mol. Life Sci . 63, 1331； Singh et al . , 2010 Crit. Rev. Biotechnol. 30, 99). 이러한 당사슬 특이적 결합을 하는 렉틴 특성을 이용하여， 특정 질병 발병 시 세포 표면에 존재하는 당단백질， 당지질， 을리고당의 변화를 다양한 렉틴을 이용하여 조기 측정하고， 질병을 일으키는 핵심 세포 표면의 당사슬이나 바이러스 및 미생물 표면의 당사슬올 렉틴올 이용해 aggregation 시켜 신체 내에 면역시스템에 의해 질병을 퇴치하는 방법이 현재 동물 실험을 통해 연구되고 있다. 또한 최근 광학 현미경 기술의 발전과 다양한 형광 probe 합성과 더불어 렉틴의 당사슬에 대한 선택적 결합 특이성을 이용하여, 특정 세포 및 바이러스, 미생물의 표면에 존재하는 당사슬을 인지하여 세포를 측정하여 조기에 암 세포의 발견， 세포내 특정 단백질의 위치 확인， 세포간와 상호작용， 바이러스 및 미생물의 세포내 침입 등을 관찰하는 이미지 측정의 핵심요소 기술로 사용하고 있다. 현재까지 개발되어 상용화되어 있는 렉틴은 식물， 동물， 미생물 등의 다양한 천연자원으로부터 분리되어 시알산 (Neu5Ac, Neuraminic acid), 갈락토즈 (Gal， galactose), N-아세틸갈락토사민 (N— GalNAc, N—acetylgalactosamine) , 퓨코즈 (Fuc, Fucose) , 만노즈 (Man, Mannose) , 글루코스 (Glc, glucose)의 기본 모노머를 측정할 수 있는 렉틴이 있다 (Lehmann et al. , 2006, Cell. Mol. Life Sci. 63, 1331； Singh et al. , 2010 Crit. Rev. Biotechnol . 30， 99； Kajiwara et al. , 2010， Microbes Environ. 25， 152). 하지만， 당사슬의 구조상 알파 (alpha), 베타 (beta)-결합 (linkage)의 다양성과 당사슬 체인 구성 시 모노머 간의 결합 조합 (combination)의 다양성 또한 α/β linkage 및 combinat ion으로 경우 수백， 수천종 이상의 다양한 당사슬의 구조가 이론적으로 자연계에 존재하며， 실제적으로 현재까지 개발된 렉틴의 경우 그 수가 적어서 다양한 당사슬을 측정하거나 웅용하는데 한계가 있다고 할 수 있다. 특히， 미생물， 바이러스 감염에 직， 간접적으로 관여하면서 암세포 발병시 마커로 인식되고 있는 시알산 (Neu5Ac) 또는 이의 변형체 Nᅳ글라이코릴 뉴라미닉 산 (N-glycolylneuraminic acid, NeuGc)의 경우， 현재까지 개발되어 상업화된 Maackia amurensis (MM), Sambucus nigra (SNA) , Limulus polyphemus 렉틴이 있다고 알려져 있으나， 시알산의 결합 특이성인 α(2,3)-, α(2,6)_, a (2,8)-linkage를 정확하게 구분하지 못할뿐더러 Neu5Ac가 결합하고 있는 Gal, GalNAc 등을 인지하여 결합하기 때문에 nonspecific binding으로 인한 시그널을 보이는 단점을 안고 있다. 이에， 본 발명자들은 시알산 결합이 특이적인 웩틴을 발굴하기 위하여 노력한 결과， 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum, 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP)으로부터 단백질의 정제 과정을 통하여 활성형 신규 렉틴 단백질을 획득하였으며， 상기 신규 렉틴 단백질은 시알산 당사슬을 포함한 당단백질， 당지질， 올리고 당등 다양한 당사슬-구조를 갖는 세포， 단백질， 당사슬 화합물의 측정， 미생물 모니터링 및 당사슬을 매개로 일어나는 생명현상 규명 둥 광범위한 분야에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 _

본 발명의 목적은 신규한 헬리시움 에리나슘 (Her i cium er inaceum, 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 헬리시움 에리나슘 (Her i cium er inaceum , 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L 균주의 자실체로부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 생산하는 방법， 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질, 당펩타이드， 당지질， 당전구체 또는 을리고당의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 이용하여 시알산 당사슬을 갖는 세포주， 박테리아 또는 바이러스의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위해서， 본 발명은 신규한 헬리시움 에리나슘 (Her i cium er inaceum,노루궁뎅이 버섯 ,기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L 균주를 제공한다.

또한， 본 발명은 신규한 헬리시움 에리나슘 (Her i cium er inaceum , 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L균주의 자실체로부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공한다.

또한， 본 발명은 본 발명에 따른 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질， 당펩타이드, 당지질， 당전구체 또는 올리고당의 측정， 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 이용하여 시알산 당사슬을 갖는 세포주， 박테리아 또는 바이러스의 측정， 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드， 당지질， 당전구체 또는 올리고당의 측정 또는 정량용 키트의 용도를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 표면에 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 모니터링， 측정 또는 정량용 키트의 용도를 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명은 신규한 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum, 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L 균주의 자실체로부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공함으로써， 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질， 당펩타이드, 당지질， 당전구체 또는 을리고당의 측정， 검출용 조성물 또는 키트 또는 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 세포주， 박테리아 및 바이러스의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 Her icium er inaceum NEU-Ll 균주의 26S rDNA 염기서열에 기초한 유사 균주와의 유전학적 상관관계를 나타낸 도이다.

도 2는 페투인이 켄쥬게이션된 아가로즈 컬럼을 이용하여 헬리시움 에리나슘 버섯 자실체에서 분리된 텍틴의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도이다;

CL: 세포추출액;

FT: 비결합 통과 여액; MW: 표준 단백질 마커 ;

Wash l : 컬럼 통과 여액 분획 1 ;

Wash W2: 컬럼 통과 여액 분획 2 ;

Wash W3 : 컬럼 통과 여액 분획 3 ;

Elut ion 20： 20 mM 갈락토즈에서 용출된 분획;

Elut ion 40： 40 mM 갈락토즈에서 용출된 분획; 및

Elut ion 200： 200 mM 갈락토즈에서 용출된 분획.

도 3은 DEAD-Sepharose 칼럼， Fetuin-agarose 칼럼， Superose 12 칼럼을 이용하여 헬리시움 에리나슘 버섯 자실체에서 렉틴 단백질을 분리한 후， 각 단계별 단백질 (좌) 및 최종 분리된 HEL1와 HEL2 렉틴 단백질 (우)을 12% SDS-PAGE와 15% SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다;

MW: 표준 단백질 마커 ;.

CL: 세포추출액;

FT: 비결합 통과 여액;

W: DEAE-Sepharose 컬럼 통과 여액 분획;

El : DEAE-Sepharose 컬럼에서 용출된 분획 ;

E2 : Fetuin-agarose 컬럼에서 용출된 분획; 및

E3: Superose 12 컬럼에서 용출된 분획.

도 4는 순수하게 분리된 HEL1 렉틴을 16% Tr icine-PAGE에서 분석한 결과와 MALTI-TOF MS를 이용하여 HEL1 렉틴에 포함된 두 개의 렉틴 단백질 HELla와 HELlb의 분자량을 측정한 도이다;

MW: 표준 단백질 마커 ; 및

HEL: HEL1 렉틴 단백질.

도 5는 Superose 12 칼럼을 이용하여 정제된 HEL1 단백질의 non-denaturing condi t ion에서 단백질의 크기를 나타낸 도 (A)이며 pi 3~7 IEF-gel에서 HEL1 렉틴의 pi 값을 분석한 도 (B)이다;

pi standard protein: 표준 단백질 마커 ; 및

HELl : HEL1 렉틴 단백질. 도 6은 인간， 토끼, 돼지 혈액 적혈구를 이용하여 HEL1 렉틴 단백질의 웅집활성을 확인한도이다; ―

Human(B-type)： 인간 혈액 적혈구 (혈액형 B)；

Rabbit: 토끼 혈액 적혈구;

Porcine: 돼지 혈액 적혈구;

Blank, Control negative: 음성대조군;

Test, HEL1: 실험군， HEL1 렉틴; 및

Positive, SNA-1 positive: 양성대조군， SNA—1 렉틴.

도 7은 렉틴 블롯을 이용하여 헬리시움 에리나슘 버섯 자실체에서 분리한 렉틴의 시알산 당사슬올 포함하는 페투인 (fetuin)과 시알산이 제거된 비시알산화페투인 (asialofetuin)을 기질로 이용하여, 시알화 된 단백질에 대한 결합능을 확인한도이다.

도 8은 헬리시움 에리나슘 버섯 자실체에서 분리한 렉틴을 형광표지한 후， 시알산 당사슬을 포함하는 A549 세포주 표면에서 공초점현미경을 사용하여 관찰한 도이다;

HEL1: 헬리시움 에리나슴 HEL1 렉틴을 이용한 실험군 (Experiment )； SNA: Sambucus nigra (SNA)렉틴을 이용한 양성대조군 (Posit ive control )；

BSA: Bovine Serum Albumin (BSA)를 이용한 음성대조군 (Negative control).

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명은 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴 단백질을 생산하는， 수탁번호 KCTC12499BP로 기탁된 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum) NEU-1L 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 26S rDNA 염기서열 및 서열번호 4로 기재되는 ITS1-5.8S-ITS4 rDNA 염기서열을 가지는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴 단백질은 시알산이 부가되어 있는 페투인 당단백질에서 N-결합 당사슬 구조 또는 0-결합 당사슬 구조에 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 버섯으로부터 생산된 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 규명하기 위하여， 버섯재배 농가에서 구매한 노루궁뎅이 버섯에서 신규 균주를 분리하였고， 상기 분리한 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 26S rDNA와 5.8S rDNA의 염기서열 분석한 결과， 상기 균주의 26S rDNA 염기서열은 서열번호 1과 같은 것을 확인하였다 (표 1참조) . 그런 다음，상기 서열번호 1의 염기서열을 가지는 26S rDNA와 유사종과의 유연관계를 분석한 결과， 노루궁뎅이 버섯 (Hericium er inaceum) 5.8S r ibosomal RNA유전자와 노루궁뎅이 버섯 (Her icium erinaceum) 18S r ibosomal RNA 유전자의 염기서열 유사성 비교를 통해 98%와 98 )의 서열 동일성 (sequence ident i fy)을 확인하였으며 (도 1 참조) , Her icium er inaceum NEU-L1 균주로 명명하고， 2013년 10월 4일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 (Korean Col lect ion ^' for Type Culture , KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 12499BP) . 또한， 본 발명은

(a) 수탁번호 KCTC12499BP로 기탁된 헬리시움 에리나슘 (Hericium er inaceum) NEU-1L의 자실체로부터 세포 추출물을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 세포 추출물에서 사알산화 당사슬을 포함하는 당단백질， 당펩타이드, 당지질， 을리고당 또는 단당이 컨쥬게이션되어 레진이 충진되어 있는 컬럼을 이용하여 상기의 렉틴을 분리하는 단계를 포함하는， 헬리시움 에리나슘 NEU-1L 균주로부터 시알산 당사슬이 특이적으로 결합하는 렉틴의 제조 방법을 제공한다. 상기 단계 b)에서 분리된 렉틴을 당사슬이 컨쥬게이션 되어 있는 레진으로부터 당사슬과 렉틴의 결합을 경쟁적으로 방해하여 해당 렉틴을 선택적으로 용리해 내는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서， 헬리시움 에리나슴 (Her icium erinaceum)자실체에서 렉틴을 분리하기 위하여 추출물을 제조하였으며， 렉틴올 정제하기 위하여 상기 제조된 추출물을 이용하여 Fetuin-agarose 칼럼 크로마토그래피를 수행한 결과, 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질인 페투인에 결합한 단백질을 용출시켰다. 또한， 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 제공한다.

또한， 본 발명은 수탁번호 KCTC12499BP로 기탁된 헬리시움 에리나슘 (Hericium er inaceum) NEIKLL균주에서 생산되고，서열번호 7，서열번호 8 또는 서열번호 9로 기재되는 단백질 N-말단 서열을 가지며， 15 kDa 내지 20 kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는, 시알산 당사슬이 특이적으로 결합하는 렉틴을 제공한다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC12499BP로 기탁된 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum) NEU-1L 균주에서 생산되고， 서열번호 9로 기재되는 단백질 N-말단 서열을 가지며, 50 kDa내지 75 kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는， 시알산 당사슬이 특이적으로 결합하는 렉틴을 제공한다. 상기 렉틴은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 당사슬 구조에 결합하는 갓을 특징으로 하는 렉틴을 제공한다;

NeuAc 또는 NeuGc( a 2→3)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc( α 2→6)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; NeuAc 또는 NeuGc( α2→3)가 GaK 31→4)Glc 잔기 또는 Glc(pi→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→6)가 Gal(pl→4)Glc 잔기 또는 Glc(pi→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→3)가 Gal ( β l→4)GlcNac 잔기 또는

Gal(pi→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→6)가 Gal ( β l→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(1 1→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeliGc( α2→3)가 Gal(P 1→3)[ aFuc(l→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc( a2→6)가 Gal( β 1→3)[ aFuc(l→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc( α2→3)가 GaKP 1→4)[ aFuc(l→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; .

NeuAc 또는 NeuGc( α 2→6)가 GaK β 1→4)[ aFuc(l→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→8)가 NeuAc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→8)가 NeuAc ( a2→3) GaK β l→4)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→8)가 NeuAc( a 2→8)NeuAc( α2→3)

Gal(pi→4)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;

NeuAc 또는 NeuGc(a2→8)가 NeuAc(a2→8)

[NeuAc( a2→8)]nNeuAc( a2→3) GaK β l→4)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; 및

NeuAc 또는 NeuGc( α2→8)가 [NeuAdn잔기에 부가된 시알산화 당사슬. 또한， 본 발명은 본 발명에 따른 렉틴을 포함하는, 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질， 당전구체 또는 올리고당의 측정 또는 정량용 키트를 제공한다.

또한， 본 발명은 본 발명에 따른 렉틴을 포함하는， 시알산 당사슬을 표면에 갖는 세포주， 박테리아 또는 바이러스의 모니터링， 측정 또는 정량용 키트를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질， 당펩타이드， 당지질， 당전구체 또는 을리고당의 측정 또는 정량용 키트의 용도를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 표면에 갖는 세포주， 박테리아 또는 바이러스의 모니터링， 측정 또는 정량용 키트의 용도를 제공한다.

또한， 본 발명은

a) 본 발명에 따른 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및

b) 본 발명에 따른 렉틴에 결합된 당단백질， 당펩타이드， 당지질， 당전구체 또는 올리고당을 분석하는 단계를 포함하는， 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질， 당펩타이드， 당지질， 당전구체 또는 을리고당으로 구성된 시알산화 당사슬 (conjugated)의 측정 또는 정량 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은

a) 본 발명에 따른 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계 ; 및

b) 본 발명에 따른 렉틴에 결합된 세포， 박테리아 또는 바이러스를 분석하는 단계를 포함하는， 시알산 당사슬을 갖는 세포주， 박테리아 또는 바이러스의 측정 또는 정량 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에 있어서， 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 (Amicon®Ul tra Centr i fugal f i l ter 10K)을 이용하여 농축시켰다. 상기 방법을 사용하여 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후， 코마시에 브릴리언트 블루 (Coo國 assie Bri l l i ant Blue)로 염색하였으 ^' 며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA)단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석한 결과, 시알산을 포함한 당사슬이 부가된 당단백질인 페투인에 결합한 렉틴의 크기는 두 종류의 단백질 HEL1 및 HEL2로 측정되었으며 단백질의 크기는 약 15~20 kDa 및 50~75 kDa로 확인되었다 (도 2 참조). HEL1과 HEL2 렉틴 단백질의 분리 최적화한 결과， 이온교환크로마토그래피 (ion chromatography) DEAE-Sepharose 칼럼， 친환성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 페투인 칼럼, 그리고 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) Superose 1210/300 GL 칼럼을 통해 HEL1와 HEL2 렉틴 단백질을 순수하게 분리하였으며， 각각의 단백질의 크기는 약 15~20kDa및 50 ~ 75 kDa로 확인되었다 (도 3참조). 상기 분리된 단백질의 정확한 분자량을 측정하기 위하여 질량분석기 Microflex Maldi-T0F(Bruker Daltonik GmbH. Bremen, Germany)를 수행한 결과， 각각의 렉틴 분자량은 15327.587 Da또는 15536.953 Da와 73253.12 Da으로 분석되었다 (도 4 참조). 상기 렉틴의 Non-denaturing condition에서의 HEL1 렉틴 단백질 크기 및 pi확인한 결과， HEL1렉틴은 약 32 士 5 kDa의 dimer형태의 단백질이고， 약 pi 4.5 단백질로 확인되었다 (도 5 참조). HEL1 렉틴을 이용한 혈액 적혈구의 웅집성 확인한 결과， 양성대조군으로 사용한 SNA-I 렉틴과 동일하게 테스트한 모든 혈액의 적혈구 세포에 대해 웅집성을 나타냈으며, 특히 토끼혈액 적혈구와 인간혈액 적혈구에 비해 돼지혈액 적혈구에 대해 강한 웅집 활성이 확인되었다 (도 6 참조). 또한， 렉틴의 결합능을 확인하기 위하여， 시알산 당사슬을 포함하는 페투인 (fetuin)과 시알산이 제거된 비시알산화페투인 (asialofetuin)을 기질로 이용하여， 렉틴 블랏을 수행한 결과， N-결합 당사슬의 기본 구조인 Neu5Ac α(2,3) Gal β (l,4)GlcNAc와 으결합 당사슬 . Neu5Ac a(2,3)Gali3(l,3)[GalNA,

Neu5Aca(2,3)Ga 3(l,4)Galp(l,6)]의 당사슬을 포함하는 페투인에서는 렉틴 블랏의 시그널을 관찰하였으나， 음성 대조군인 비시알산화페토인의 Gal|3(l,4)GlcNAc의 비시알산화 N-당사슬과 Gali3(l,3), GlcNA, Gai (l,3)[GalNA β(1,6)]의 당사슬을 포함하는 단백질에서는 렉틴 블랏의 시그널이 확인되지 않았다 (도 7 참조). 아울러, 동물 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬올 포함하는 Α549 세포주에 형광표지된 렉틴을 이용하여 세포 표면을 관찰한 결과, 동물 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬을 포함하는

A549 세포주에 형광 라벨된 렉틴을 사용한 결과, 상기 세포주 표면에서 형광 라벨된 렉틴을 확인함으로써， 사알산 당사슬을 확인하였다 (도 8 참조) .

따라서， 본 발명의 신규한 헬리시움 에리나슘 (Her i cium er inaceum , 노루궁뎅이 버섯， 기탁번호: KCTC 12499BP) NEU-1L균주의 자실체로부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공함으로써 , 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질， 당펩타이드， 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정， 검출용 조성물 또는 키트 또는 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 세포주; 박테리아 및 바이러스꾀 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 렉틴 생산 버섯 균주의 분리 및 동정

<1-1> 렉틴 생산 버섯 균주의 분리

돌산 버섯영농조합 (전남 여수시 돌산읍 금봉리 1156)에서 구매한 노루궁뎅이 버섯으로부터 신규 균주를 분리하기 위해 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로， 돌산버섯영농조합에서 구입한 노루궁뎅이 버섯의 포자낭에서 백금이를 사용하여 포자를 획득하였다. 상기 획득한 포자를 고상배지로 제작한 PDA , YDP 및 아미노산 최소배지에 각각 도말하여 22 ^° C 조건에서 정치상태로 배양하였다. 10일 이상 배양 후， 생성된 단일 균체의 균사를 분리하여 상기와 같은 동일한 배지에 다시 도말하여 22 ^° C 조건에서 정치상태로 배양하였다. 그런 다음， 형태적인 확인을 통하여 상기 버섯이 순수하게 분리된 것을 확인하였다.

<1-2> 렉틴 생산 버섯 균주의 동정

상기 실시예 <1-1〉에서 분리한 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 26S rDNA와 5.8S rDNA의 염기서열 분석을 수행하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <1-1>에서 분리한 균주를 125 mL의 플라스크에 10 mLPDA, 10 mL YDP및 10 mL아미노산 최소배지의 각각 액상배지에 접종한 후 , 22 ^° C에서 정치상태로 배양하였다. 15일 이상 배양 후， 균체를 회수하여 원심분리를 하였으며， 액체 배지 성분을 제거하였다. 상기 회수된 균체는 액체질소를 이용하여 완전히 동결 시킨 후, 물리적인 방법으로 균체를 '- 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체에 50 mU/mL 립티케이스 (Lypticase)와 50mM TrisHCKpH 8.0) 및 250 mM NaCl이 포함된 세포 완충용액 (cell lysis buffer)을 첨가한 후， 37 ^° C에서 한 시간 이상 반웅하였다. 반웅 후， 다시 원심분리를 통해 세포를 회수하였고， AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (바이오니아， 대전， 대한민국)를 사용하여 세포내 DNA를 추출하였다. 상기 버섯 균주로부터 추출된 DNA를 주형으로 하여 26S rDNA를 증폭하기 위하여, NL1 프라이머 (서열번호 2)및 LR6프라이머 (서열번호 3)를 이용하여 94 ^° C에서 45초， 55 ^° C에서 1초， 72 ^° C에서 1분 30초 30회 반복의 DNA 폴리머레이즈 중합반웅 (polymerase chain react ion)을 통해 l,146 bp의 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자는 pGEM-T easy 백터 (Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였으며， 상기 균주의 26S rDNA 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1과 같다 (표 1). 그런 다음， 상기 서열번호 1의 염기서열을 가지는 26S rDNA와 유사종과의 유연관계를 분석한 결과， 노루궁뎅이 버섯 (Hericium americanum) 5.8S ribosomal RNA 유전자와 노루궁뎅이 버섯 (Hericium erinaceum) 18S ribosomal RNA유전자의 염기서열 유사성 비교를 통해 98%와 98%의 서열 동일성 (sequence identify)을 확인하였으며 (도 1)， Hericium erinaceum NEU-L1 균주로 명명하고， 2013년 10월 4일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 (Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 12499BP) . 또한， 상기 노루궁뎅이 버섯 (Her i cium er inaceum) NEU-L1 균주의 ITS1-5.8S-ITS4 rDNA 염기서열을 분석하기 위하여， ITS1프라이머 (서열번호 5)및 ITS4프라이머 (서열번호 6， 5 ' - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '；)를 사용하여 94 ^° C에서 45초， 55 ^° C에서 30초， 72 ^° C에서 1분 30회 반복 DNA 폴리머레이즈 중합반웅을 통해 644 bp의 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자는 pGEM-T easy벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 확인하였다 (표 1) .

【표 1】

CCATCTTACACCTGTGCACCOTGCGTGGGTCCGTCGGCITTGCGGTCGATG

GGCTOCGTTTTTCATAAACTCTTATGTATGTAACAGAATGTCAT TGCTA TAAACGCATCnATACAACTTTCAACAACGGATCTOTGGCTCTCGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAAnGCAGAAnCAGTGAA TCATCGMTCTTTGAACGCACOTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCACGC CTGmGAGTGTCGTGAAAnCTCAACTCAATCCTCnGnATGAGAGGGCT GGGCTTGGACTTGGAGGTCTTGCCGGTGCTCCCTCGGGAAGTCGGCTCCTCT TGAATGCATGAGTGGATCCCTTnGTAGGGTTTGCCCnGGTGTGATAATTA TCTACGCCGCGGGTAGCCnGCGnGGTCTGOTCTAACCGTCnCGGACAA CTTTCATCTCAACTTGACCTCGAATCAGGCGGGACTACCCGCTGAAOTAAG CATATCAATAAGCGGAGGAAATC-3 '

ITS1 프라이머 (서열번호 5) 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ¹

ITS4 프라이머 (서열번호 6) 5 ' -TCCKXGCTTATTGATATGC— 3 '

<실시예 2> 헬리시움 에리나슘 (Hericium erin ceum)으로부터 시알산 당사슬 선택적 결합을하는 렉틴 분리 정제

<2-1> 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum) 자실체에서 렉틴 분리를 위한추출물 제조

헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum) 자실체에서 렉틴 분리를 위한 추출물올 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로， -80 ^° C에서 동결보관 중인 헬리시움 에리나슘 버섯의 자실체 ( frui t ing body)를 막자 사발에 넣고 액체질소를 첨가하면서 동결된 버섯이 해동되지 않도록 유지하면서 막자로 시료를 파쇄하였다. 막자 사발 내에서의 연속적인 파쇄과정을 통해 버섯 자실체를 동결 미세 분말 상태로 제조한 후， 다시 회수하여 사용하기 전까지 -80°C에서 보관하였다. 세포추출물은 상기의 방법으로 제조된 동결 분말상태 자실체의 중량을 확인한 후， 측정 중량의 3배에 해당되는 프로테아제 억제 칵테일 (protease inhibi tor cocktai l , Roche , Switzer land)과 Γ mM PMSF가 포함된 측정 중량의 3배에 해당되는 20 mM Tris HCKpH 8.0) 완충용액을 첨가한 후， 4 ^° C에서 6시간 이상 흔합하였다. 상기 혼합액에서 파쇄되지 않은 버섯 자실체의 입자와 비용해성 단백질을 제거하기 위해 A500S-6N 로터가 장착된 SUPRA 22K 원심분리기 (한일과학， 대한민국)를 4 ^° C에서 7， OOO rpm으로 30분 동안 사용하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액을 A50C-6 로터가 장착된 SUPRA 22K 원심분리기를 4 ^° C에서， 12 ,000 rpm으로 30분 동안 사용하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득하여 렉틴 분리를 위한 최종 세포추출물로 준비하였다.

<2-2> 페투인-아가로즈 (Fetuin-agarose) 칼럼 크로마토그래피를 이용한 렉틴 정제

상기 실시예 <2ᅳ1>에서 기재된 방법으로 제조한 추출물을 사용하여 렉틴을 정제하기 위하여 Fetuin-agarose 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로， 시알산 선택적 결합을 하는 렉틴을 정제하기 위해서 시알산 당사슬을 포함하고 있는 당단백질인 페투인이 고정되어 있는 아가로즈 레진인 페투인-아가로즈 ( fetuin-agarose)을 이용하여 렉틴 분리를 위한 칼럼을 제작하였다. 상기 실시예 <2-1〉에 기재된 방법으로 제조한 헬리시움 에리나슘 버섯 자실체의 세포추출물을 20 mM Tr is-HCl 완충용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 페투인-아가로즈 레진 (Fetuin-agarose resin, Sigma-Aldr ich, USA) 칼럼 ( 1.0 x 10cm)에 상기 세포추출물을 Pump Pᅳ 1 튜브연동식 펌프 (Per i stat ic pump, GE-heal thcare , USA)를 이용하여 주입속도를 분당 1 mL로 하여 주입하였다. 등일 완층용액 10 배 부피로 세척한 다음， 20 mM, 40 mM, 200 mM D-갈락토즈 (D-galactose)가 포함되어 있는 동일 완층용액으로 2배， 4배 및 10배 부피로 갈락토즈의 농도를 증가시키면서 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질인 페투인에 결합한 단백질을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml로 하였으며, 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 (Amicon® Ul tra Centr i fugal f i l ter 1이0을 이용하여 농축시켰다. <2-3> SDS-PAGE분석을 통한 렉틴 단백질 확인

상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 정제하여 수득한 조효소 용액의 단백질을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 정제하여 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후， 코마시에 브릴리언트 블루 (Coo画 assie Bri l l iant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석하였다.

그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이， 시알산을 포함한 당사슬이 부가된 당단백질인 페투인에 결합한 렉틴의 크기는 두 종류의 단백질 HEL1 및 HEL2로 측정되었으며 단백질의 크기는 약 15 20 kDa 및 50 75 kDa로 확인되었다 (도 2) . <2-4>헬리시움 에리나슘 자실체에서 HEL1 렉틴 분리 최적화

상기 실시예 <2-1〉에 기재된 방법으로 제조한 추출물을 사용하여, 상기 실시예 <2-2>에서 확인된 HEL1과 HEL2 렉틴 단백질의 분리 최적화를 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로 상가 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 제조된 동결 분말상태 자실체를 중량 확인한 후， 측정 중량의 2.5배에 해당되는 50 mM Tr i s HCKpH 7.4) 완충용액을 첨가한 후， 4°C에서 12시간 이상 흔합하였다. 상기 흔합액에서 파쇄되지 않은 버섯 자실체의 입자와 비용해성 단백질을 제거하기 위해 4 ^° C에서 20 ,000 X g의 속도로 30분 동안 침전물을 제거하고 상등액올 수득하였다. 미 제거된 입자를 제거하기 위해 4 ^° C에서 25,000 X g의 속도로 45분 동안 침전물을 제거하고 상등액을 재수득하였다. 침전된 자실체에 다시 측정 중량의 1.5배에 해당되는 동일한 완충용액을 넣고 상기의 동일한 방법으로 상등액을 수득한 후， 각각의 수득한 상등액을 합쳐서 최종 세포추출물을 제작하였다. 여기에 포화농도 80%(w/v) 황산암모늄을 넣은 후， 4t에서 천천히 교반하면서 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질은 4°C에서 25, 000 X g의 속도로 60분 동안 원심분리를 통하여 , 침전물을 회수한 후， 1/10 부피의 50 mM Tri s HCl (pH 7.4)완충용액으로 용해시킨 후，동일 완층용액에 투석 또는 PD-10 desalt ing칼럼 (GE heal thcare)을 통과시켜 , 단백질 조효소 액 내에 황산암모늄을 제거하였다. Desalting 된 단백질 조효소 액을 DEAD_Sepharose 칼럼 (1.5 x 17 cm)에 주밉하였으며,조효소 액을 주입한 칼럼을 5배의 컬럼 부피의 50mMTrisHCl(pH 7.4) 완층용액으로 평형화 (equilibrium)시켰다. AKTA purification system(GE healthcare)을 이용하여 CK~0.5 M NaCl이 포함된 50 mM Tris HCKpH 7.4) 완충용액을 step gradient ¾는 linear gradient로 완층용액을 홀려주어 DEAD-Sepharose 칼럼으로부터 렉틴 단백질을 용리시켰다. 렉틴 단백질이 포함된 분획은 0.5%(v/v) 돼지혈액의 적혈구 웅집실험 (agglutination assay)을 통해 확인하였다. 돼지혈액의 적혈구 응집실험에서 양성반웅을 나타내는 분획을 회수한 후， 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 (Amicon Ultra Centrifugal filter 10K)을 이용하여 단백질 분획을 농축시켰다.

렉틴 활성을 포함한 단백질 분획은 상기 실시예 <2— 2〉에서 기재된 방법으로 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)으로 평형화시킨 페투인-아가로즈 레진 (Fetuin—agarose resin, Sigma-Aldrich, USA) 칼럼 (1.5 x 17cm)에 DEAE-Sepharose 칼럼 분획을 Pump P-l 튜브연동식 펌프 (Per istat ic pump, GE-healthcare, USA)를 이용하여 주입속도를 분당 1 mL로 하여 주입하였다. 동일 완층용액 10 배 부피로 세척한 다음， 0.2~0.5 M D-갈락토즈 (D-galactose)가 포함되어 있는 동일 완충용액으로 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질인 페투인에 결합한 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 (Amicon Ultra Centrifugal filter 10K)을 이용하여 농축시켰다.

렉틴 활성을 포함한 농축된 단백질 용액을 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)으로 평형화시킨 Superose 12 10/300 GL(GE healthcare) 젤 여과 크로마토그래피 칼럼에 주입한 후, AKTA purification system올 이용하여 0.5 mL/min유속으로 단백질을 용출 시켰으며 , 렉틴 활성이 포함된 분획을 상기에서 언급한 돼지혈액의 적혈구 웅집실험을 이용하여 확인하였다. 최종적으로 돼지혈액 적혈구에 대해 양성반웅을 나타내는 분획을 회수한 후， 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 10K을 이용하여 렉틴 단백질 분획을 농축시켰다.

각 단계별에서 수득한 렉틴의 활성이 포함한 단백질 분획올 상기 실시예 <2-3>에서 기재된 방법으로 1 또는 15% SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후， 코마시에 브릴리언트 블루로 염색하였으며 Preci sion Plus ProteinTM Standards 단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석하였다.

그 결과， 도 3에 나타낸 바와 같이， 이온교환크로마토그래피 ( ion chromatography) DEAE-Sepharose 칼럼， 친환성 크로마토그래피 (af f ini ty chromatography) 페투인 칼럼, 그리고 크기 배제 크로마토그래피 (si ze exclusion chromatography) Superose 12 10/300 GL칼럼을 통해 HELl와 HEL2렉틴 단백질을 순수하게 분리하였으며， 각각의 단백질의 크기는 약 15~20 kDa 및 50~75 kDa로 확인되었다 (도 3) .

<실시예 3> 헬리시움 에리나슘 (Hericium erinaceum) 자실체에서 분리된 렉틴 단백질의 N-말단서열 분석

헬라시움 에리나슴 버섯 자실체에서 분리된 시알산에 선택적 결합을 하는 렉틴 단백질의 아미노산 서열을 구명하기 위하여， 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리된 렉틴 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 하기와 같은 방법으로 분석하였다.

구체적으로， 상시 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리된 렉틴 단백질을 16% Tr icin-PAGE를 이용하여 단백질을 전개한 후, Trans-Blot SD Semi -Dry Transfer Cel KBio-Rad, USA)를 이용하여 15 V에서 1시간 동안 Tr icin-PAGE상의 단백질을 PVDF멤브레인으로 이동을 시켰다. Tr icin— PAGE에서 PVDF 멤브레인으로 옮겨진 단백질은 0.1% (w/v) 퐁슈 에스 (Ponceau S)로 염색하였으며， 상기 염색방법으로 확인 된 단백질을 멤브레인으로부터 잘라내어 한국질량분석기술 (서울， 대한민국)에서 단백질의 N—말단서열 분석을 수행하였다.

그 결과， 상기 실시예 <2-4>에서 확인된 약 15 20 kDa 크기의 HEL1 단백질 두 개의 서열 HELla와 HELlb로 분석되었으며， HELla의 강한 시그널로 서열번호 7(NH2-KEPTWGRPES-C0 ₂ — )과 HELlb의 약한 시그널로 서열번호 8(NH2-WPVAPDYPPES-C0 ₂ — )의 N-말단 단백질 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 50 75 kDa 크기의 단백질은 서열번호

9(NH2-GGHSVPLTNF丽 AQYFTEISLGSPPQQFKV-aV )의 N-말단 단백질 서열을 가지는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 질량분석기를 이용한분리 정제된 렉틴 단백질 크기 분석

상기 실시예 <2-4〉에 기재된 방법으로 분리된 단백질의 정확한 분자량을 측정하기 위하여 질량분석기 Microf lex Maldi-TOF(Bruker Daltonik GmbH. Bremen Germany)를 수행하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리 정제된 렉틴 단백질을 PD-10 컬럼 (GE-Healthcare, USA)을 이용하여 증류수로 용출시켜 단백질 용액 내에 있는 염을 제거한 후, 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 (Amicon®Ultra Centr i fugal f i lter ) 10K를 이용하여 1 mg/ml 이상의 농도로 농축시켰다. 그런 다음， 25% 아세토니트릴 (acetoni tr i le)과 0.1% 트리폴루오아세테트산 (tr i f luoroacet ic acid)을 1: 2 비율로 혼합한 용액에 시나피닉산 (sinapinic acid)을 포화농도로 용해시킨 후, 상기 용액을 농축된 단백질과 부피비로 1 : 1로 흔합하여 질량분석기 MALDI-T0F 타깃 위에서 단백질올 결정화시켰다. 상기 결정화된 단백질을 질량분석기 Microf lex Maldi-T0F(Bruker Daltonik GmbH. Bremen, Germany)을 이용하여 분리 정제된 렉틴의 크기를 분석하였다.

그 결과， 상기 실시예 <2ᅳ4>에서 확인된 HELla와 HELlb의 N-말단 단백질 서열을 갖는 HEL1 렉틴 단백질은 5배 정도의 강한 시그널을 나타내는 HELla 렉틴의 분자량은 15327.587 Da으로 약한 시그널을 나타내는 HELlb 렉틴의 분자량은 15536.953 Da으로 분석되었다 (도 4) . HEL2렉틴의 분자량은 73253.12 Da으로 분석되었다.

<실시예 5> Non-denaturing condition에서의 HELl짹틴 단백질 크기 및 pi 확인 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리한 HEL1 렉틴의 non-denaturing condition에서의 HELl 렉틴 단백질 크기를 확인하기 위하여， AKTA purification system에서 Superose 12 10/300 GL 칼럼을 이용하여 HEL1 렉틴의 크기를 확인하였다. 분자 질량 교정 키트 (Molecular weight calibration kit) (GE healthcare)의 표준 단백질로 440 kDa페르니틴 (Ferrtin), 158 kDa 알도즈 (Aldose), 44 kDa 오발부민 (Ovalbumin),. 29 kDa 카르보닐 언하드라아제 (Carbonic anhydrase), 13.7 kDa리보뉴클레이즈 에이 (Ribonuc lease A), 6.5 kDa 아프로티닌 (Aprotinin)을 사용하였다. Superose 12 10/300 GL 칼럼에서 용출되는 HEL1 렉틴 단백질을 포함하는 분획에 존재하는 렉틴의 활성을 돼지혈액 적혈구의 웅집활성으로 확인하였으며 크로마토그램올 표준단백질과 비교하여 상대적인 크기를 확인하였다.

그 결과， 도 5A에 나타낸 바와 같이， non-denaturing condition에서 HELl 렉틴은 약 32 ± 5 kDa의 dimer 형태와 단백질로 확인되었다 (도 5A). 또한， 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법^로 분리한 HEL1 렉틴 단백질의 pi는 등전점 (Iso-ElectroFocusing, IEF) 전기영동 (electrophoresis)을 통하여 확인하였다. Pi 3~7 IEF-gel system (K0MABI0TECH)을 이용하여 음극과 양극 완충용액에서 100 V 1시간， 200 V 1시간， 500 V 30분 간의 IEF-PAG 젤 전개를 통하여 표준단백질의 pi와 비교한 결과， 도 5B에 나타낸 바와 같이， 최종적으로 HEL1 렉틴은 약 pi 4.5 단백질로 확인되었다 (도 5B).

<실시예 6> HEL1 렉틴을 이용한 적혈구의 웅집성 확인

상기 실시예 <2-4〉에 기재된 방법으로 분리한 HEL1렉틴의 혈액 적혈구에 대한 웅집성 활성을 확인하기 위하여， 돼지혈액 (porcine blood), 토끼혈액 (rabbit blood), 인간혈액 (human blood B-type)올 10% (v/v)로 PBS (phosphate buffer saline) 완충용액에 희석한 후， 4 ^° C에서 1000 rpm의 속도로 5분 동안 원심분리하여 적혈구 (red blood cells, erythrocytes)를 침전 시켰으며, 상등액을 제거하고 상기의 방법을 세 번 반복하여, 최종적으로 PBS 완충 용액에 희석하여 2%(v/v) 적혈구 세포 용액을 제작하였다. 웅집실험 (agglut inat ion assay)은 V-형태의 96 wel l plate를 사용하였으며， 실시예 <2ᅳ4>에서 분리한 O. l mg/mL농도의 렉틴 단백질 100 uL을 연속적인 1/2 희석을 하여 동일 부피의 2% 적혈구 세포와 흔합을 한 후， 상온에서 96 wel l plate을 1 시간 정치하여 돼지 혈액 적혈구, 토끼 혈액 적혈구, 인간 혈액 적혈구에 대한 렉틴의 웅집 반웅을 관찰하였다. 이때 양성 대조군으로 시알산 당사슬에 선택적 결합을 하는 SNA-I 렉틴을 동일 농도로 사용하였으며， 음성 대조군으로는 렉틴이 포함되지 않는 PBS 완층용액을 사용하였다.

그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이， HEL1 렉틴은 양성대조군으로 사용한 SNA-I 렉틴과 동일하게 테스트한 모든 혈액의 적혈구 세포에 대해 웅집성을 나타냈으며， 특히 토끼혈액과 인간혈액에 비해 돼지혈액에 대해 강한 웅집 활성이 확인되었다 (도 6) .

<실시예 7>렉틴 블랏을 이용한시알산당사슬포함당단백질의 측정

상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리한 렉틴의 결합능을 확인하기 위하여 시알산 당사슬을 포함하는 페투인 ( fetuin)과 시알산이 제거된 비시알산화페투인 (asialoietuin)을 기질로 이용하여， 렉틴 블랏을 수행하였다. 구체적으로， 페투인과 비실알산 페투인이 포함된 각각의 단백질 용액을 5 X 램리 버퍼 (Lae瞧 l i buffer)와 흔합하여 10분 동안 가열한 후， 8¾ SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리된 SDS-PAGE 겔 상의 단백질을 Trans-Blot SD Semi -Dry Transfer Cel KBio-Rad , USA)를 이용하여 15 V에서 1시간 동안 니트로셀를로스 (ni trocel lulose) 멤브레인에 트랜스퍼 (transfer) 하고, 이를 3%소혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA)이 포함된 포스페이트 식염수 완충액 (phosphate sal ine buffer) , PBST 및 0.5% 트원에 첨가하여 1시간 동안 블로킹 (blocking) 하였다. 그런 다음， 비오틴 (biot in)이 컨쥬게이션된 상기 렉틴 1 mg/mL이 포함되어 있는 3% BSA-PBS에 막을 넣어 상온에서 4 시간 동안 배양하였다. 이때 사용한 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법으로 분리한 렉틴의 바이오틴화 (biot inylat ion) 컨쥬게이션은 항 바이오틴화 키트 (Ant ibody Biot inylat ion Kit , Genomine 대한민국)올 사용하여 수행하였다. 렉틴과 멤브레인을 인큐베이션 한 후， 멤브레인을 PBST로 10 분 동안 6회 세척하였고, 0.2 mg/mL 호스라디시 페록시다제 (horseradish peroxidase, HRP)- 컨쥬게이션된 항-비오틴 항체 (conjugated anti-biotin antibody)(l:500, Sigma— Aldr ich)과 한 시간 동안 반웅시켰다. 반웅 후, 상기와 같은 방법으로 막을 PBST로 10 분 동안 6회 세척하여 , ECL 키트 (GE Healthcare, USA)로 시알화된 단백질을 확인하였다. 그 결과， 도 7에 나타낸 바와 같이 N-결합 당사슬의 기본 구조인 Neu5Ac α(2,3) Gali3(l,4)GlcNAc와 0-결합 당사슬 Neu5Ac a (2,3)Gal 13 (1,3) [GalNA, Neu5Aca(2,3)GaU3(l,4)Gaip(l,6)]의 당사슬을 포함하는 페투인에서는 렉틴 블랏의 사그널을 관찰하였으나， 음성 대조군인 비시알산화페토인의 Ga 3(l,4)GlcNAc의 비시알산화 N-당사슬과 GaU3(l,3), GlcNA, Gal β( 1,3) [GalNA β(1,6)]의 당사슬을 포함하는 단백질에서는 렉틴 블랏의 시그널이 확인되지 않았다 (도 7). <실시예 8> 형광표지된 렉틴을 이용하여 시알산 당사슬을 포함하는 동물 세포 표면 관찰확인

동물 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬을 포함하는 Α549 세포주 (ATCC CCL-185TM, Rockville MD, USA)에 형광표지된 렉틴을 이용하여 세포 표면을 관찰하였다.

구체적으로， 상기 A549 세포주는 무혈청배지에서 배양한 후, 세포를 원심분리하여 수득하였다. 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리된 렉틴은 당업계의 알려진 방법으로 Alexa Fluor ®488 Protein Labeling Kitdnvitrogen, USA)을 이용하여 형광 표지를 하였다. 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 분리 정제한 렉틴이 상기 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬에 대한 결합능을 확인하기 위하여 1 mg/mL 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS 완충용액 (phosphate saline buffer)을 사용하여 상기 세포주를 세척한 후 원심분리를 하여 상기 세포를 다사 수득하였다. 수득된 상기 세포를 소혈청알부민이 포함된 PBS(PBSB) 완충용액 소량에 현탁을 한 후， Alexa Fluor ®488이 컨쥬게이션된 상기의 렉틴을 최종 농도가 0.5 nM 내지 1.0 nM가 되도록 첨가한 후， 렉틴과 반웅하는 세포주를 얼음상에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 1시간 후, 상기 세포주를 원심분리하여 다시 세포주를 수득한 후， PBSB 완충용액을 이용하여 해당 세포주를 3회 이상 세척하고， 최종적으로 1내지 5 x l0 ⁶ 세포 /mL농도가 되도록 동일 완충용액에 현탁 하였다. 현탁된 세포 내의 형광 라벨링 된 렉틴과 결합하는 세포 표면 시알산 당사슬을 Zei ss LSM510 공초점현口]경 (Confocal Laser Scanning Mi croscope , Car 1 Zei ss Germany)을 이용하여 확인하였다.

그 결과， 도 8에 나타낸 바와 같이 동물 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬을 포함하는 A549 세포주에 형광 라벨된 렉틴을 사용한 결과， 상기 세포주 표면에서 형광 라벨된 렉틴을 확인함으로써， 시알산 당사슬을 확인하였다 (도 8) .

【수탁번호】

기탁기관명 ： 한국생명공학연구원

수탁번호 ： KCTC12499BP

수탁일자 ： 20131004

BUDAPEST TREATY ON THE IKTERNATiONAl. RECOGNiTION OF THE DEPOSIT

OF MICROORGANISMS TOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEDURE

INTERNATIONAL FORM

RECEIPT EN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT

issued pursuant to Rule 7.1

O： KHVl Seong hun

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

125 Gwahak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 305-806

Republic of Korea

I . IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM

Identification reference given by the

DEPOSITOR: Accession number given b the

INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY:

Hencium erinaceum EU-L1 CTC 12499BP

Π . SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION

The microorganism identified under I above was accompanied by:

[ x ] a scientific description

[ ] a proposed taxonomic designation

(Mark with a cross where applicable)

DL RECEIPT AND ACCEPTANCE

This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I above, which was received by it on October 04, 2013.

IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION

The microorganism identified under I above was received by ti is International Depositary Authority on and a request to convert the original deposi to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on

V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Signature(s) of person(s) having the power

Name: Korean Collection for Type Cultures to represent the International Depositary

Authority of authorized official(s):

Address: Korea Research Institute of

Bioscience and Biotechnology (KREBB)

125 Gwahak-ro, Yuseong-gu,

Daejeon 305—806 Director

Republic of Korea 2013

Form BP/4 (KCTC Fonn 17) so!e page 번 역 문 특허질 ^상비생클기탁의 국쳬격 ^인에 한 부다페스트 조악 국제 서식

규칙 7.1에 의한

원기탁에 대한수탁증

TO； 김성 ΐ

대한 ¾국 ^* 대전시 유성구 과학 ¾ 125한국생 공학: ¾구원 305-806

BP/4형식 (KCTC 제 17형식 )