本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种地衣芽抱杆菌活菌菌粉和包 含该活菌菌粉的組合物， 以及所述活菌菌粉或組合物的制备方法和用途 。 背景技术

益生菌属于一种微生态制剂，联合国粮农組织 /世界卫生組织将益生菌定 义为： "活的微生物， 当摄入达到足够数量时将对宿主的健康带来益 处"。 在 这个定义包含 3个关键点： 首先是活菌，其次是有效剂量，最后是能产生 有益 健康的作用。 前两点属于质量标准的范畴， 第三点属于健康声称的范畴。 所 有益生菌的立法和指导准则都是围绕这三点进 行细化的。

活性是关键， 益生菌必须是 "活的，，， 才能起到健康作用， 这是益生菌产 生功效的基础； 其次， 益生菌的临床效力与每日摄入量密切相关。 大量的益 生菌生理效应研究（如治疗腹泻、乳糖不耐受 、提高粪酶活性等试验室研究） 证实， 每日有效摄入量为 10 ⁹ -10 ^1G CFU。

对于急性或者慢性胃肠道感染、 免疫或炎性疾病， 益生菌的效果依赖于 菌株选择， 不同的治疗也需要不同的剂量。 不可能制定统一的益生菌剂量标 准， 治疗所需的剂量要依靠大量的研究来确定。 益生菌达到临床效应的活菌 数， 一般小肠中每克内容物的活菌数量≥10 ⁶ CFU， 结肠中每克内容物的活菌 数量≥10 ⁸ CFU。 治疗急性感染性腹泻更需要短疗程、 高剂量的益生菌制剂。 世界胃肠組织临床指南对益生菌、 益生元总结了一些临床状况。 所需益生菌 的剂量因菌株和产品不同而差异很大。 虽然很多非处方产品提供的剂量范围 为 10 ⁹ -10 ^1G CFU /剂， 但是某些产品 现在较低剂量时也有效， 而某些产品 所需的剂量则要多得多。 确定益生菌的普遍剂量是不现实的， 剂量必须是针 对菌株， 来源于提示有健康功效的体内试验。

发明专利 92113318.9公开了一种地衣芽孢杆菌 CMCC63516 ( CGMCC No.0183 )制成的微生态制剂， 即整肠生。 用于治疗成人急性、慢性腹泻及各 种原因引起的肠道菌群失调症， 该专利提供的这种微生态制剂为每克活菌数 9-11亿， 北京协和医院吴梓涛等开展的 II期临床的推荐剂量为每日摄入量 1.5xl0 ⁹ CFU。地衣芽孢杆菌进 道后， 需要快速的生长、增殖成为优势菌 群后才得以实现其药效的发挥， 拮抗葡萄球菌， 酵母样菌等致病菌， 促进双 歧杆菌、 乳杆菌、 拟杆菌、 消化链球菌生长， 从而调整菌群失调达到治疗目 的， 且具有无副作用， 无残留等优点。 但遗憾的是， 目前针对该产品使用剂 量方面的研究较少， 吴铁林等人报道的应用地衣芽抱杆菌调治肠道 菌群失调 的研究，通过动物试验证实了地衣芽抱杆菌 63516极低的生物毒性，亚急性毒 性试验中， 相当于 LDi。十分之一的计量可达 37500亿 /Kg; 李玲等人报道整肠 生常规剂量对于慢性肠炎的治疗， 效果较好。 对于急性腹泻， 冯婉玉等人报 道整肠生大剂量治疗给药具有良好效果， 但均未就其最佳的剂量进行深入的 研究。

^明专利 92113318.9和 201010578718.0公开的数据来看，目前地衣芽 孢杆菌 CMCC63516 ( CGMCC No.0183 ) 菌粉的活菌数均较低， 一般在 250-530亿 /g， 另外， 按发明专利 92113318.9和 201010578718.0公开的以无 ^^酸钩作为稀释剂制备的菌粉， 其流动性较差（休止角为： 45.0° )， 因其 在现有的 10亿 / _g 的地衣芽抱杆菌活菌制剂中添加量有限， 还未影响制剂的 工业化生产，但如果添加量大于产品的 15%， 就会明显降低制剂产品整体的 流动性， 较难实现工业化生产， 所以过去这种以无水碳酸钩作为稀释剂制备 地衣芽抱杆菌菌粉的方法已经不能适用本发明 所涵盖的高剂量范围。

另外， 以往的研究过多的关注每批发酵液菌泥的产量 ， 但这解决不了单 位廣量菌粉中活菌含量不高的现状， 满足不了使用少量的菌粉既可调配高剂 量、 高活菌数成品的目标， 如何在保证菌泥产量的情况下， 提升单位质量菌 泥中的芽孢活菌数， 已成为制约高剂量地衣芽抱杆菌活菌制剂开发 的关键问 题。 因此， 研制开发一种高剂量地衣芽 菌活菌組合物一直是亟待解决的 课题。 发明内容

本发明提供了地衣芽抱杆菌活菌菌粉、 地衣芽孢杆菌活菌組合物、 其 制备方法及用途， 由此完成了本发明， 具体涉及以下几个方面。

本发明第一方面涉及一种地衣芽抱杆菌活菌菌 粉， 其含有地衣芽抱杆 菌活菌和适当的稀释剂， 其中所述地衣芽孢杆菌活菌数为 400 ~ 800亿 /克 菌粉，优选为 450 ~ 750亿 /克菌粉， 更优选为 480 ~ 730亿 /克菌粉， 特别优 选为 570 - 730亿 /克菌粉。

根据本发明第一方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌菌粉， 其中所述适当 的稀释剂选自微晶纤维素、 微晶纤维素与乳糖的混合物、 微晶纤维素与无 水碳酸钙的混合物中的一种。

根据本发明第一方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌菌粉， 其中微晶纤维 素与乳糖的混合物中微晶纤维素与乳糖的重量 比为 1: ( 0.25 ~ 2.3 ) ， 优 选为 1: ( 0·43 ~ 1 )； 和 /或 重量比为 1: ( 0.1 ~ 10 ) ， 优选为 1: ( 0.43 ~ 2.3 ) 。 本发明第二方面涉及一种地衣芽抱杆菌活菌菌 粉， 其含有地衣芽抱杆 菌活菌和适当的稀释剂， 其中所述适当的稀释剂选自微晶纤维素、 微晶纤 维素与乳糖的混合物、 微晶纤维素与无水碳酸钩的混合物中的一种。

根据本发明第二方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌菌粉， 其中微晶纤维 素与乳糖的混合物中微晶纤维素与乳糖的重量 比为 1: ( 0.25 ~ 2.3 ) ， 优 选为 1: ( 0·43 ~ 1 )； 和 /或 重量比为 1: ( 0.1 ~ 10 ) ， 优选为 1: ( 0.43 ~ 2.3 ) 。

根据本发明第二方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌菌粉， 其中所述地衣 芽孢杆菌活菌数为 400 ~ 800亿 /克菌粉，优选为 450 ~ 750亿 /克菌粉，更优 选为 480 - 730亿 /克菌粉， 特别优选为 570 - 730亿 /克菌粉。 本发明第三方面涉及一种地衣芽抱杆菌活菌組 合物， 其包括本发明第 一或第二方面任一项的地衣芽抱杆菌活菌菌粉 和适合的辅料。

根据本发明第三方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌組合物， 其中每克組 合物中含有地衣芽抱杆菌活菌数为 15-200亿， 例如 26 - 200亿， 例如 30 - 200亿， 例如 45 - 100亿。

根据本发明第三方面任一项的地衣芽抱杆菌活 菌組合物， 其中所述适 合的辅料选自稀释剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 包衣剂、 矫味剂、 着色 剂、 助悬剂中的一种或几种。

在本发明的实施方案中， 所述适合的辅料选自稀释剂、 粘合剂、 崩解 剂、 润滑剂、 包衣剂、 矫味剂、 着色剂、 助悬剂的一种或几种。

在本发明中， 其中稀释剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 包衣剂、 矫味 剂、 着色剂、 助悬剂的选择和含量为本领域所公知。

在本发明的实施方案中， 其中各組分的含量（重量百分比）为： 地衣 芽抱杆菌活菌菌粉 1-30%、稀释剂 20-99%、粘合剂 0-18%、崩解剂 0-10%、 润滑剂 0-3%、 包衣剂 0-7%、 矫味剂 0-0.1%、 着色剂 0-0.001%、 助悬剂 0-12%。

根据本发明第一方面或第二方面任一项的地衣 芽抱杆菌活菌菌粉或第 三方面任一项的地衣芽抱杆菌活菌組合物， 其中所述的地衣芽抱杆菌为地 衣芽孢杆菌 BL63516, 所述地衣芽孢杆菌 BL63516已于 1992年 11月 19 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 （CGMCC) ， 保藏号为 No.0183; 该保藏信息已在中国发明专利申请 CN1087523A中公 开。 本发明第四方面涉及一种地衣芽抱杆菌活菌菌 粉或者本发明第一方面 或第二方面任一项的地衣芽抱杆菌活菌菌粉的 制备方法，其包括以下步骤： (1)活化培养地衣芽孢杆菌（例如地衣芽抱杆菌 BL63516)， 获得地 衣芽抱杆菌种子液；

( 2 )将地衣芽抱杆菌种子液接种于发酵罐的灭菌� �养基中， 36 - 38。C 培养 18 ~ 20小时，菌数达到峰值后，改变培养温度至 41~49。C，优选为 43 ~ 4TC， 同时加入 Mn ²⁺ 至终浓度为 0.005 - 0.05% ( g/L ) ,优选为 0.01 - 0.04% (g/L) ， 继续培养（例如继续培养 2-6小时， 例如 4小时）至发酵结束； (3)收集地衣芽抱杆菌菌泥， 将菌泥与适当的辅料混合后进行干燥， 得到地衣芽抱杆菌活菌菌粉；

任选地， 在干燥后还包括研碎和过筛的步骤；

优选地， 所述辅料为稀释剂；

优选地， 所述菌泥与稀释剂的重量比为 1: (3~5)；

优选地， 所述稀释剂选自微晶纤维素、 微晶纤维素与乳糖的混合物、 微晶纤维素与无水碳酸钙的混合物中的一种；

进一步优选地， 其中微晶纤维素与乳糖的混合物中微晶纤维素 与乳糖 的重量比为 1: (0.25-2.3) , 优选为 1: (0.43-1)； 和 /或 重量比为 1: (0.1-10) ， 优选为 1: ( 0.43 - 2.3 ) 。

在本发明的实施方案中， 所述发酵罐培养阶段的罐压为 0.02-0.04MPa。 在本发明的实施方案中， 所述发酵罐培养阶段的通气量为 0.2-1.0 m。 本发明第五方面涉及一种地衣芽抱杆菌活菌組 合物或者本发明第三方 面任一项的地衣芽抱杆菌活菌組合物的制备方 法， 其包括本发明第四方面 任一项的制备方法以及进一步加入适当的辅料 的步骤； 优选地， 所述适当 的辅料选自稀释剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 包衣剂、 矫味剂、 着色剂、 助悬剂中的一种或几种。

在本发明中， 其中稀释剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 包衣剂、 矫味 剂、 着色剂、 助悬剂的选择和含量为本领域所公知。

在本发明的实施方案中， 其中各組分的含量（重量百分比）为： 地衣 芽抱杆菌活菌菌粉 1-30%、 稀释剂 20-99%、 粘合剂 0-18%、 崩解剂 0-10%、 润滑剂 0-3%、 包衣剂 0-7%、 矫味剂 0-0.1%、 着色剂 0-0. 001%、 助悬剂 0-12%。 本发明第六方面涉及本发明第一方面或第二方 面任一项的地衣芽抱杆 菌活菌菌粉或者第三方面任一项的地衣芽抱杆 菌活菌組合物在制备用于预 防或治疗肠道菌群失调或者肠道菌群失调引起 的急、 慢性肠炎或腹泻的药 物中的用途。 本发明第七方面涉及一种预防或治疗肠道菌群 失调或者肠道菌群失调 引起的急、 慢性肠炎或腹泻的方法， 所述方法包括给有需要的哺乳动物以 有效量的本发明第一方面或第二方面任一项的 地衣芽抱杆菌活菌菌粉或者 第三方面任一项的地衣芽抱杆菌活菌組合物的 步骤。 根据本发明第六方面任一项的用途或者第七方 面任一项的方法， 其中 所述地衣芽孢杆菌活菌菌粉或地衣芽孢杆菌活 菌組合物的使用剂量为 0.25 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.43 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.5 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.75 - 1.7亿活菌 /kg/日。 本发明第八方面涉及地衣芽孢杆菌活菌菌粉或 地衣芽抱杆菌活菌組合 物在制备用于预防或治疗肠道菌群失调或者肠 道菌群失调引起的急、 慢性 肠炎或腹泻的药物中的用途， 其中所述地衣芽抱杆菌活菌菌粉或地衣芽孢 杆菌活菌組合物的使用剂量为 0.25 ~ 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.43 ~ 3.4亿活 菌 /kg/曰， 例如 0.5 - 3.4亿活菌 /kg/曰， 例如 0.75 - 1.7亿活菌 /kg/曰。 本发明第九方面涉及一种预防或治疗肠道菌群 失调或者肠道菌群失调 引起的急、 慢性肠炎或腹泻的方法， 所述方法包括给有需要的哺乳动物以 有效量的地衣芽抱杆菌活菌菌粉或地衣芽抱杆 菌活菌組合物的步骤， 其中 所述地衣芽孢杆菌活菌菌粉或地衣芽孢杆菌活 菌組合物的使用剂量为

0.25 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.43 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.5 - 3.4亿活菌 /kg/日， 例如 0.75 - 1.7亿活菌 /kg/日。 根据本发明第八方面任一项的用途或者第九方 面任一项的方法， 其中 所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌 BL63516。 所述地衣芽孢杆菌 BL63516已于 1992年 11月 19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普� �� 微生物中心（CGMCC )， 保藏号为 No.0183; 该保藏信息已在中国发明专 利申请 CN1087523 A中公开。 在本发明中， 所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis )是指芽孢杆 菌属的地衣芽孢杆菌种。 在本发明的实施方案中， 所述地衣芽孢杆菌为 BL63516.

在本发明中， 进行发酵罐培养时可采用适合地衣芽孢杆菌生 长、 繁殖 的培养基； 在本发明的实施方案中， 所述培养基为营养肉汤培养基。

在本发明中， 所述地衣芽孢杆菌的菌泥的制备方法为本领域 所公知； 在本发明的实施方案中， 所述地衣芽孢杆菌的菌泥是指地衣芽孢杆菌发 酵 液经离心， 去掉上清后， 剩余的全部組分。

在本发明中， 所述活菌数是指菌落形成单位 ( Colony-Forming Units, CFU )， 即在活菌培养计数时. 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培 养基上生长繁殖所形成的集落. 称为菌落形成单位， 以其表达活菌的数量。

在本发明中， 所述肠道菌群失调是指肠道内原有微生态平衡 被打破， 以原籍菌为主的正常生理組合被破坏， 而产生以致病菌或条件致病菌为主 的病理性組合。

在本发明中， 所述活化培养地衣芽孢杆菌是指取地衣芽孢杆 菌， 将其 接种于固体培养基（例如斜面培养基）和 /或液体培养基中进行培养， 由此 得到菌液或种子液的过程。

在本发明的实施方案中， 在制备地衣芽孢杆菌活菌組合物时， 其中所 述的稀释剂选自乳糖、 微晶纤维素、 淀粉、 甘露醇、 糊精、 交联聚维酮中一 种或几种； 粘合剂选自羟丙基甲基仟维素、 微晶纤维素、 聚维酮、 甲基纤维 素、 羟丙基仟维素中的一种或几种； 崩解剂选自甲基仟维素、 聚维酮、 变性 淀粉、 羟乙基甲基纤维素、 交联欺甲基纤维素钠低取代羟丙基纤维素的一 种 或几种； 润滑剂选自硬脂酸、 硬脂酸镁、 滑石粉中的一种或几种； 包衣剂选 自甲基仟维素、 聚乙二醇、 聚维酮、 欧巴代系列， 肠溶衣包衣剂中的一种或 几种； 矫味剂包括^ ^剂和芳香剂，甜味剂选自甘露糖、甜菊糖苷� �甜蜜素、 葡萄糖、 糖精钠、 阿司帕坦等中一种或几种；芳香剂选自拧檬香 精、 薄荷油、 橘味香精等中的一种或几种；着色剂拧檬黄、 日落黄、 苋菜红、 拧檬黄色淀、 日落黄色淀等中的一种或几种;助悬剂选自聚� �酮、聚乙烯醇、 葡萄糖、 丙烯 酸钠、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 羟丙基纤维素、 羟乙基纤维素、 硅酸盐 类等中的一种或几种。各組分的含量为：地衣 芽抱杆菌活菌菌粉 1-30%、稀 释剂 20-99%、粘合剂 0-18%、崩解剂 0-10%、润滑剂 0-3%、包衣剂 0-7%、 矫味剂 0-0.1%、 着色剂 0-0. 001%、 助悬剂 0-12%。 发明的有益效果

本发明首先提供了一种高剂量地衣芽孢杆菌活 菌組合物及治疗方案， 动 物实验结果表明， 其比现行常规剂量起效更快， 疗程更短， 能够迅速恢复肠 道定植抗力， 并且不影响肠道内正常菌群比例， 在停 可以迅速的从肠道 菌群中消失， 对小鼠肠道无任何不良影响。

同时， 本发明针对现有的地衣芽抱杆菌单位质量菌粉 中活菌含量不高， 较难实现工业化生产的现状问题， 研究了各种影响芽抱形成的因素， 通t^" 稳定期的发酵液进行升温和添加 Mn ²⁺ 处理，大幅度提高了单位菌泥中的 芽孢活菌数。

另外， 针对现有的以无水碳酸钩作为稀释剂制备的地 衣芽孢杆菌菌粉， 其流动性较差， 增大添加量会明显降低制剂产品整体的流动性 等问题， 本发 明进行了大量的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法 研究，发现在菌粉制造过程中， 活菌数量的损失最多是发生在高温干燥过程中 ， 如果菌泥中成熟的芽孢比例 增加， 且选用的稀释剂能够在该过程对菌体起到保护 作用， 那将大幅度提升 菌粉中的活菌数， 减少损失， 降低成本。 本发明重新系统地筛选了替代无水 碳酸钩的稀释剂，并优化了混合比例，大量保 留了高温干燥后的芽孢活菌数， 并且大幅度改善了菌粉的流动性， 实现了高剂量的地衣芽抱杆菌活菌制剂的 工业化生产。 附图说明

图 1是本发明的 5.3-31.5m _g /k _g 五个治疗組停药后各治疗組小鼠粪便中地 衣芽抱杆菌 BL63516变化图。

图 2是本发明的 34.5-207m _g /k _g 五个治疗組停药后各治疗組小鼠粪便中 地衣芽抱杆菌 BL63516变化图。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是本领域技 术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明 的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件 进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规 产品。 实施例 1 不同剂量地衣芽抱杆菌治疗肠道菌群失调 ( 1 )

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

SPF级 Balb/c小鼠， 鼠龄 6-8周， 体重 20±2g， ^^-, 由东北制药 集团沈阳第一制药厂动物房提供， 实验动物使用许可证 ( SYXK (辽) 2009-0007 )。

1.1.2药物

注射用氨苄西林钠（中诺药业（石家庄）有限 公司， 0.5 _g /瓶） ， 地衣芽 抱杆菌 BL63516菌粉 (东北制药集团沈阳第一制药厂， 批号： YJ12018, 294 亿 /g)

1.1.3主要试剂

双歧杆菌选择性培养基 ( BBL ) , 肠球菌选择性培养基（胆汁 -七叶苷- 叠氮钠琼脂）， 乳杆菌选择性培养基（ MRS )， 肠杆菌培养基（EMB )， 产 气荚膜梭菌培养基（TSC )均购自北京陆桥技^ T限责任公司。 牛肉會， 蛋 白胨均购自北京奥博星生物技术有限责任公司 ， 氯化钠购自天津市博宇化工 有限公司。

1.2 方法

1.2.1地衣芽 忤菌 BL63516菌悬液配制 取 2g菌粉溶解于 1600ml生理盐水中，配制成 1.25mg/ml的高浓度菌液， 取 1000ml高浓度菌¾ 入 500ml生理盐水，配制成 0.83 mg /ml菌液，将 0.83 mg /ml菌液进行 2倍系列稀释成 0.42 mg /ml和 0.21mg /ml菌液。 每次灌胃 前都需现配现喂。

1.2.2试验动物分組

参考赵伟等《不同种实验动物间用药量换算》 中的" ^^表面积直接换算 法"， A为每日每千克体重的菌粉剂量。

由： A x60Kg÷1.6246m ² = A 小鼠 x0.02Kg÷0.0067m ² ，得到： A = A 小鼠 /12.37 地衣芽抱杆菌活菌制剂现行剂量为每天 15亿， 按 60K _g 体重计算， 应 为 0.25亿 /kg'd, 换算为小鼠即为 3.09亿 /kg'd, 使用地衣芽抱杆菌 BL63516 菌粉 YJ12018, 约合 10.5mg/kg'd。

选用健康 Balb/c小鼠 72只， 体重 20±2g。 用鼠饲料及清水适应饲养 1 周后， 按随机分組的方法将小鼠分成 6組， 每組 12只， 雌雄各半。 1組为空 白对照組， 其余 5組模型組用氨苄西林钠制成肠道菌群失调腹� �模型， 然后 分为自然恢复組、 治疗 I組（每日灌胃 5.3m _g /k _g ) 、 治疗 II組（每日灌胃 10.5mg/kg )、治疗 ΠΙ組 (每日灌胃 21mg/kg )、治疗 IV組 (每日灌胃 31.5mg/kg )。 治疗 I至 IV組分别对应的人用剂量为每日 7.5亿、 15亿、 30亿和 45亿活菌。

1.2.3给药

空白对照組每日灌胃等体积 0.85 %生理盐水； 自然恢复組在造模成功后 灌胃等体积 0.85 %生理盐水， 治疗組分别灌服等体积不同浓度的菌悬液。 灌 胃方法： 在自由采食和饮水的基^ I上， 于每日上午 9时， 采取灌胃方式， 分 别对各組小鼠按要求给药， 每次 0.5ml， 共计灌服 7天。

1.2.4 抗生素诱导的肠道菌群失调的腹泻小鼠造模

参照李佳荃等文献（肠道菌群失调动物模型的 研制，广西医科大学学报， 2000， 17 ( 6 )： 1C 40 1041 )方法， 用氨苄西林钠制造肠道菌群失调的腹泻 小鼠模型。 造模前 6小时开始禁食， 自由饮水。 注射用氨苄西林钠临用前用 0.85%的生理盐水配制成浓度为 0.5g/ml的溶液备用， 每次灌胃氨苄西林钠 0.5ml, 每天 2次，连续 5天， 小鼠单只单笼饲养， 鼠笼笼底垫有滤纸， 观察小 鼠活动现象。 选用腹泻率作为造模成功的观察指标。

1.2.5 小鼠肠道菌群检测

分别在给予抗生素第 5天， 灌胃地衣芽抱杆菌菌粉第 3、 5、 7天和停 第 3、 5、 10、 15、 20、 25天， 采用光冈氏法无菌采取空白对照組， 自然恢复 組及各不同剂量治疗組粪便各 1.0 _g ， 置于灭菌的硫酸纸上称重后放入装有玻 璃珠的无菌瓶内， 加入 9ml无菌生理盐水， 振荡使粪便均质化并进行 10倍系 列稀释。 根据预实验结果， 选择 2个适合菌落计数的稀释度， 分别取 ΙΟΟμΙ于 选择性培养基上， 均匀涂布后， 分别于需氧、 厌氧环境中按相应培养^^进 行培养。待培养好后，按照表 1所标注的鉴定方法进行菌落鉴定，计数各培� � 基菌 W：。对所需分析 6种菌进行菌群分析，表中结果以每克湿便中� �落对数 值表示（ lgCFU/ _g ) 。 表 1 肠道菌种选择培养及鉴定

1.3 统计分析

肠道菌群实验数据采用 SPSS 13.0软件进行统计学分析， 结果以 ±s表 示， 不同实验組之间的差异分析采用 t检验， P>0.05为差异无显著性统计 学意义， P<0.05为差异有显著性统计学意义， P<0. 01为差异有极显著性统 计学意义。

2 结果

2.1 Balb/c小鼠造模结果

Balb/c小鼠连续灌胃氨苄西林钠 5天后，模型組所有小鼠均出现进食量 减小， 活动减少，精神萎靡不振， 毛色无光泽， 竖毛换背， 水样稀便等现象， 各組腹泻率均为 100%， 表明肠道菌群失调腹泻小鼠模型造型成功。

2.2 Balb/c 小鼠灌胃不同剂量地衣芽孢杆菌菌粉后几种肠 道菌群检 测结果

分别在给予抗生素第 5天， 灌胃地衣芽孢杆菌菌粉第 3、 5、 7天和停服 后第 3、 5、 10、 15、 20、 25天， 分别检测各組小鼠粪便中几种肠道菌群的变 化情况。 表 2造模后第 0天正常組与自然恢复組小鼠肠道菌群变化（ lgCFU/ _g

X±s ) 表 3灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X±s )

表 4灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 5天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X±s )

組别 双歧杆菌 乳杆菌 麻杆菌 肠球菌 产气荚膜梭菌 正常对照組 8.52±1.16 9.23±0.53 7.21±0.68 7.02±1.34 5.48±1.47 自然恢复組 7.85±0.29 5.37±0.78 9.11±0.23 8.11±0.56 7.03±0.59 治疗 I組 7.64±0.51 7.78±0.64 8.32±1.26 7.63±0.86 6.12±0.67 治疗 Π組 8.30±0.48 7.86±0.55 8.64±0. 89 8.05±0.41 6.45±0.10 治疗 m組 8.69±1.03 8.97±0.03 7.29±1.60 7.16±0.25 5.38±0.26 治疗 IV組 9.08±1.21 9.22±0.40 7.16±1.37 6.24±0.57 5.64±1.42 表 5灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 7天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X±s )

表 6停 Jlg^第 3天各組小鼠肠道菌群变化（lgCFU/ _g ， X±s )

由表 2可以看出， 造模后自然恢复組双歧杆菌和乳杆菌含量明显 降低， 与正常对照組存在明显统计学差异（P<0.01 )； 肠球菌、 肠杆菌和产气荚膜 梭菌异常增殖， 与正常对照組存在明显统计学差异（ P<0.01 )； 由表 6得出 结论，造模成功后第 10天， 自然恢复組双歧杆菌和乳杆菌含量大幅上升， 肠 球菌和产气荚膜梭菌数量明显下降， 但仍与正常对照組略有差异， 这说明由 氨苄西林造成的小鼠腹泻短时间不能自愈。

由表 3至表 5可以看出， 治疗 I組与治疗 II組小鼠肠道内 杆菌在灌 胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后明显回升， 与自然恢复組相比有明显统计学差异

( P<0.05 )， 有害菌中只有肠球菌含量下降到正常水平； 在灌胃地衣芽抱杆 菌菌粉 5 天后乳杆菌才开始显著增殖， 但仍与正常对照組存在明显差异

( P<0.01 )； 在灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 7天后小鼠肠道内菌群恢复平衡， 厌 氧菌与需氧菌比例增大， 肠道微生物定植抗力恢复。

治疗 m組在灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后小鼠肠道内双歧杆菌含量与治 疗 II組无明显区别， 乳杆菌含量比治疗 II組显著升高， 存在明显统计学差异 ( P<0.05 )， 肠杆菌和产气荚膜梭菌含量比治疗 II組显著降低； 在灌胃地衣 芽抱杆菌菌粉 5天后， 肠道内各菌群均与正常对照組无明显差异， 肠道内菌 群恢复平衡， 肠道微生物定植抗力恢复， 在灌胃地衣芽孢杆菌菌粉 7天后双 歧杆菌比正常对照組略有增加， 其他菌群无明显变化。

治疗 IV組在灌胃地衣芽孢杆菌菌粉 3天后双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌和产 气荚膜梭菌数量都与正常对照組无明显统计学 差异， 只有肠杆菌数量比正常 对照組高（P<0.05 )， 具有显著统计学差异， 但与自然恢复組相比也明显降 低， 存在显著统计学差异， 肠道内菌群基本恢复平衡； 在灌胃地衣芽孢杆菌 菌粉 5天后， 双歧杆菌和乳杆菌与正常对照組比都明显增加 ， 肠球菌与正常 对照組相比存在统计学显著下降差异； 在灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 7天后， 双 歧杆菌数量与正常对照組比较显著增多 （PO.05 )， 肠球菌和产气荚膜梭菌 显著降低 ( P<0.05 )， 肠道微生物定植抗力显著提高。

由表 6可以看出， 在停止灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后， 各治疗組小鼠 肠道内菌群与正常对照組都无显著统计学差异 ， 表明地衣芽抱杆菌菌粉没有 改变肠道内菌群数量及比例， 对小鼠肠道没有任何不良影响。

2.3 BL63516在 Balb/c小鼠肠道中滞留情况

由图 1可以看出， 治疗 I組及治疗 II組的小鼠在停药 5天后粪便中 BL63516活菌数 lgCFU/g分别为 4.00±1.16及 4.07±0.13，在停药 10天后粪便 中已检测不到；治疗 ΠΙ組小鼠粪便中的 BL63516在停药 10天后菌数 lgCFU/g 为 4.13±1.25， 在停药 15天后消失； 治疗 IV組小鼠粪便中地衣芽抱杆菌菌粉 在停药 20天后检测不到。 实施例 2 不同剂量地衣芽抱杆菌治疗肠道菌群失调 ( 2 )

1材料与方法

1.1材料 同实施例 1

1.2 方法

1.2.1地衣芽 忤菌 BL63516菌悬液配制

取 5g菌粉溶解于 600ml生理盐水中， 配制成 8.33mg/ml的高浓度菌液， 取 500ml高浓度菌¾ 入 250ml生理盐水，配制成 5.56 mg/ml菌液，将 5.56mg /ml菌液进行 2倍系列稀释成 2.78mg /ml、 1.39mg /ml菌液。 每次灌胃前都 需现配现喂。

1.2.2 试验动物分組

选用健康 Balb/c小鼠 72只， 体重 20±2g。 用鼠饲料及清水适应饲养 1 周后， 按随机分組的方法将小鼠分成 6組， 每組 12只， 雌雄各半。 1組为空 白对照組， 其余 5組模型組用氨苄西林钠制成肠道菌群失调腹� �模型， 然后 分为自然恢复組， 治疗 V組（每日灌胃 34.5 m _g /k _g )、 治疗 VI組（每日灌胃 69 mg/kg )、治疗 組（每日灌胃 138mg/kg )、治疗 組（每日灌胃 207mg/kg )。 治疗 V至 VDI組分别对应的人用剂量为每日 50亿、 100亿、 200亿和 300亿活 菌。

其它方法同实施例 1。

1.3统计分析 同实施例 1

2 结果

2.1 Balb/c小鼠造模结果

Balb/c小鼠连续灌胃氨苄西林钠 5天后，模型組所有小鼠均出现进食量 减小， 活动减少，精神萎靡不振， 毛色无光泽， 竖毛换背， 水样稀便等现象， 各組腹泻率均为 100%， 表明肠道菌群失调腹泻小鼠模型造型成功。

2.2 Balb/c 小鼠灌胃不同剂量地衣芽抱杆菌菌粉几种肠道 菌群检测 结果

分别在给予抗生素第 5天， 灌胃地衣芽孢杆菌菌粉第 3、 5、 7天和停服 后第 3、 5、 10、 15、 20、 25天， 分别检测各組小鼠粪便中几种肠道菌群的变 化情况。

表 7造模后第 0天正常組与自然恢复組小鼠肠道菌群变化（ lgCFU/ _g ，

X±s )

組别 双歧杆菌 乳杆菌 麻杆菌 肠球菌 产气荚膜梭菌 正常对照組 8.44±1.16 9.51±0.33 7.12±1.23 7.13±0.36 5.61±1.23 自然恢复組 7.37±1.29 4.34±0.14 9.38±1.15 8.47±1.77 7.38±0.55 表 8灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X± _s )

組别 双歧杆菌 乳杆菌 麻杆菌 肠球菌 产气荚膜梭菌 正常对照組 8.83±1.65 9.36±0.49 7.11±1.82 7.62±1.38 5.45±1.01 自然恢复組 7.31±0.95 4.73±0.70 9.76±1.56 8.23±1.48 7.16±0.47 治疗 V組 8.59±1.12 8.82±0.08 8.73±0.68 7.23±0.89 5.12±1.33 治疗 VI組 9.13±0.41 8.90±0.32 8.71±0.83 7.18±0.63 5.20±0.76 治疗 νπ組 8.83±0.78 8.76±0.64 8.33±0.36 7.76±1.29 5.78±1.09 治疗 νπι組 8.97±0.24 8.65±0.57 8.44±0.52 7.11±0.54 5.17±0.28 表 9灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 5天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X±s )

表 10灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 7天后各組小鼠肠道菌群变化

( lgCFU/g, X±s )

表 11停服后第 3天各組小鼠肠道菌群变化（lgCFU/ _g ， X±s )

由表 8至表 10可以看出， 治疗 V組、治疗 VI組、治疗 W組和治疗 VDI組在 灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 3天后双歧杆菌、 乳杆菌、 肠球菌和产气荚膜梭菌数 量都与正常对照組无明显统计学差异， 只有肠杆菌数量比正常对照組高 ( Ρ<0.05 )， 具有显著统计学差异， 但与自然恢复組相比明显降低， 存在显 著统计学差异，肠道内菌群基本恢复平衡；在 灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 5天后， 杆菌和乳杆菌与正常对照組比都明显增加， 肠球菌与正常对照組相比存 在统计学显著下降差异； 在灌胃地衣芽抱杆菌菌粉 7天后， 双歧杆菌数量与 正常对照組比较显著增多 （P<0.05 ) ， 肠球菌和产气荚膜梭菌显著降低 ( P<0.05 )， 肠道微生物定植抗力显著提高。

由表 11可以看出， 在停止灌胃地衣芽^ f菌菌粉 3天后， V、 VI、 W、 VDI各治疗組小鼠肠道内菌群与正常对照組都无 显著统计学差异， 表明地衣芽 抱杆菌菌粉没有改变肠道内菌群数量及比例， 对小鼠肠道没有任何不良影响。

2.2 BL63516在 Balb/c小鼠肠道中滞留情况

由图 2可以看出， 治疗 V組及 VI組小鼠粪便中地衣芽 菌菌粉在停药 20天时已检测不到；治疗 W組地衣芽抱杆菌菌粉在停药 20天时菌数 lgCFU/g 为 4.05±0.69， 在停药 25天时从小鼠肠道中消失； 治疗 VDI組小鼠肠道中停药 25天时， 粪便中仍有地衣芽^ f菌 BL63516检出， lgCFU/g为 4.30±1.07， 在肠道内的滞留时间较长。

实施例 1、 2的试验结果显示，高剂量的地衣芽抱杆菌活� �制剂比现行常 规剂量起效更快， 疗程更短， 能够迅速恢复肠道定植抗力， 并且不影响肠道 内正常菌群比例， 在停服后可以迅速的从肠道菌群中消失， 对小鼠肠道无任 何不良影响。 但是剂量超过一定范围后， 止泻治愈和恢复肠道微生物定植抗 力的效果无显著差异， 且高剂量地衣芽抱杆菌活菌制剂服用剂量愈多 ， 其在 肠道内滞留时间愈长。 综合考虑试验结果、 制剂成本及用药经济学， 我们选 择治疗 ΠΙ組到治疗 W組的治疗剂量作为人体试用的参照剂量， 即 1.7-11.2 mg/kg d; 其中治疗 IV組到治疗 VI組的治疗剂量更优， 即 2.5-5.6m _g /k _g -d。 实施例 3 锰离子浓度对摇瓶培养的菌泥中芽孢数的影响

MnS0 ₄ 浓度分别取 0%、 0.005%、 0.01%、 0.02%、 0.03%、 0.04%、 0.05%、 0.06%, 0.07%。

无菌钩取一环地衣芽^ f菌 BL63516 (该菌已于 1992年 11月 19曰保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（CGMCC ) ， 保藏 号为 No.0183;该保藏信息已在中国发明专利申请 CN1087523A中公开。：)， 接种营养肉汤培养基， 36-38'C培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种摇瓶 营养肉汤培养基（也称 NB培养基， 其成分为： 牛肉會（粉） 0.3%、 蛋白胨 1.0%, 氯化钠 0·5 ^ο / _ο 、 ρΗ7.0-7.4 )中， 接种量 0.1 ^o / _o ， 装液量 200ml/1000ml， 37。 (：、 200r/min培养 18-20h后向发酵液中添加不同浓度的锰离子， 培养至 22-24h。 离心收集菌泥， 采用 62.5Ό加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍 系列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢数测定， 结果见表 12。 表 12锰离子浓度试验结果（芽孢数单位： 10 ⁷ CFU/mg )

结果证明， 当培养基中 MnS0 ₄ 的浓度为 0.005-0.05%时， 菌泥中芽孢数 较高。 实施例 4 不同培养温度对对摇瓶培养的芽孢数的影响

培养温度分别为： 37。 (：、 39。 (：、 41。C：、 43。 (：、 45。 (：、 47。 (：、 49。 (：、 51°C . 无菌钩取一环地衣芽^ f菌 BL63516,接种营养肉汤培养基， 36-38Ό培 养 9小时，制成种子液。将种子液接种摇瓶营养� �汤培养基中，接种量 0.1%， 装液量 200ml/1000ml， 37。 ( 、 200r/min培养 18-20h后调节发酵液至不同温 度， 培养至 22-24h。 离心收集菌泥， 采用 62.5Ό加热 15min杀死营养体， 再 进行 10倍系列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢数测定， 结果见表 13。 表 13优化培养温度试验结果（芽孢数单位： 10 ⁷ CFU/mg ) 结果证明， 当培养温度为 41-49 'C时， 菌泥中芽孢数较高。

菌体密 影响地衣芽孢杆菌芽孢形成率的主要因素之一 ， 只有当菌体 密度达到一定程度， 信号分子浓度才相应增高， 并启动芽孢形成机制。 地衣 芽孢杆菌属兼性厌氧菌， 在通气量越大的条件下发酵产生的生物量越大 ， 菌 体密度越大。 摇瓶条件下的通气量远低于发酵罐， 因此摇瓶培养的菌体密度 达不到发酵罐水平， 芽孢率也低于发酵罐。 本发明通过摇瓶实验获得了芽孢 增长趋势， 并通过发酵罐培养进一步确定了实验结果。 实施例 5 锰离子浓度对发酵罐培养的芽孢数的影响

MnS0 ₄ 浓度分别取 0.005%、 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%。 无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38'C培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0vvm; 18-20 小时以后向发酵罐中添加不同浓度的锰离子， 培养至 22-24h。离心收集菌泥，进行 10倍系列稀释涂平板法测定总菌数，采用 62.5'C 加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽 孢率测定， 结果见表 14。 表 I ⁴ 锰离子浓度试验结果（活菌数单位： 10 ⁸ CFU/g )

结果证明， 当培养基中 MnS0 ₄ 的浓度为 0.01-0.04%时， 菌泥中芽抱率 最高， 均达到 90%以上。 实施例 6 培养温度对发酵罐培养的芽孢数的影响

培养温度分别为： 41。C：、 43。 (：、 45。 (：、 47。 (：、 49。 (：。

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后调节发酵液至不同温度， 培养至 22-24h。 离 心收集菌泥，进行 10倍系列稀释涂平板法测定总菌数，采用 62.5Ό加热 15min 杀死营养体，再进行 10倍系列稀释涂平板法，对发酵液进行芽孢率� ��定， 结 果见表 15。 表 15优化培养温度试验结果（活菌数单位： 10 ⁸ CFU/ _g )

温度 41 43 45 47 49 活菌数 3080 3160 2750 2970 2660 芽孢率（％) 87 92 92 94 89 结果证明， 当培养温度为 43-47。C时， 效果最好， 菌泥中芽抱率最高， 均达到 90%以上。 实施例 7

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.025%并调节发 酵液培养温度为 45。C， 培养至 24-26h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 3140xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 94%. 实施例 8

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.035%并调节发 酵液培养温度为 43。C， 培养至 24-26h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 3050xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 92 ⁰ / ₀ 。 实施例 9

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.01%并调节发 酵液培养温度为 47。C， 培养至 22-24h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 2880xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 89 ⁰ / ₀ 。 实施例 10

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时， 制成种子液。 将种子液接种至 10L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体½为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38。C，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.04%并调节发 酵液培养温度为 43。C， 培养至 22-24h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 3210xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 91 ⁰ / ₀ 。 实施例 11

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时，制成种子液。将种子液接种至 1000L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.01%并调节发 酵液培养温度为 46。C， 培养至 22-24h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 2860xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 88 ⁰ / ₀ 。 实施例 12

无菌钩取一环地衣芽抱杆菌 BL63516, 接种营养肉汤培养基， 接种量 0.1%, 36-38Ό培养 9小时，制成种子液。将种子液接种至 1000L发酵罐（营 养肉汤培养基）， 扩大培养地衣芽^ f菌 BL63516.

具体过程为： 培养初期维持罐压为 0.02-0.04MPa， 温度为 36-38 ，通气 量 0.2-1.0 m; 18-20小时以后发酵罐中添加 MnS0 ₄ 浓度为 0.02%并调节发 酵液培养温度为 44。C， 培养至 24-26h。 离心收集菌泥， 进行 10倍系列稀释 涂平板法测定总菌数， 采用 62.5'C加热 15min杀死营养体， 再进行 10倍系 列稀释涂平板法， 对发酵液进行芽孢率测定， 单位菌泥活菌数为 3050xl0 ⁸ CFU/g, 芽孢率达到 94 ⁰ / ₀ 。 实施例 13

取菌泥 200 _g ， 分别与 600 _g 甘露醇粉、甘露醇颗粒、 乳糖、 可压性淀粉、 磷酸氢钙、 微晶纤维素、 乳清蛋白、 无^ ^酸钩混匀。

将混匀后菌粉于 50±5。C干燥 2 ~ 5小时，每 30分钟翻动一次。干燥过程 中取 2 _g 左右菌粉在快速水分测定仪中测定含水量 ，在干燥失重低于 3%时停 止干燥。 分别用球磨机研碎菌粉， 以过 60目筛筛上率不超过 3%为标准， 利 用休止角测定仪测定菌粉休止角。 取 3 _g 菌粉进行 10倍梯度稀释涂平板， 进 行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌数。 结果见表 16。 表 16单方稀释剂混合干燥测试结果

结果表明， 微晶纤维素制备的菌粉状态均匀， 便于后续处理， 制备的菌 粉流动性好， 且菌粉单位活菌数最高。 可见， 微晶纤维素对干燥时菌体保护 作用最强。 微晶纤维素作为菌泥稀释剂是该組中最理想的 选择。 另外， 乳糖 制备的菌粉干燥需要的时间最短， 干燥时对菌体保护作用也较强， 但是与菌 泥混合后的状态不均匀， 后续处理困难。 综合上述稀释剂的特点， 我们采用 混合稀释剂进行进一步探索。 实施例 14

取菌泥 200 _g ， 分别与 600g各种比例的微晶纤维素和乳糖混合物混匀 其余操作同实施例十三。 结果见表 17。

结果表明，微晶纤维素和乳糖比例为 9:1-2:8时，与菌泥混合制备的菌粉 都为均匀粉状。 微晶纤维素和乳糖比例为 8:2 -3:7时， 所需干燥时间短， 菌 粉流动性好，活菌数相对较高；微晶纤维素和 乳糖比例为 7:3-5:5时，所需干

殍 ·· ^

燥时间最短， 菌粉流动性最好， 活菌含量也最高。 实施例 15

取菌泥 200 _g ， 分别与 600 _g 各种比例的微晶纤维素和无水碳酸 5混合物 混匀。 其余操做同实施例十三。 结果见表 18。

表 18微晶纤维素与无水碳酸 5混合干燥测试结果

微纤： 微晶

^种类 碳酸 碳酸钙 纤维 项目 钙

9:1 素

均匀 均匀 均匀 均匀 均匀 均匀 均匀 均匀 均匀 混料后状态

粉状 粉状 粉状 粉状 粉状 粉状 粉状 粉状 粉状 所需干燥时间

3.0 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3.0 2.5 ( h )

休止角 34.0。 34.9° 35.4。 37.8。 42.1。 43.5。 44.3。 33.0。 44.5°

BL63516活菌

计数 660 670 690 710 680 640 620 670 590

( 10 ⁸ CFU/ ) 结果表明， 微晶纤维素和无水碳酸钩比例以任意比例混合 后， 与菌泥混 合制备的菌粉都为均匀粉状， 活菌数也均较高。 微晶纤维素和无水碳酸钩比 例为 9:1-8:2时，菌粉流动性比单用无水碳酸钩有较� �改善，但所需干燥时间 与单用微晶纤维素比较没有缩短；在微晶纤维 素和无水碳酸钩比例为 2:8-1:9 时， 干燥时间与单用微晶纤维素相比明显降低， 但是菌粉流动性则与单用无 ^^酸钩相比没有改善；在微晶纤维素和无水碳� ��钩比例为 7:3-3:7时，干燥 时间相比单用微晶纤维素明显缩短， 菌粉流动性相比单用无水碳酸钩也有较 大改善， 同时活菌数量也有一定的提高。 实施例 16

取菌泥 200 _g ， 与微晶纤维素 600 _g 共同混匀。 将混匀后的湿菌粉平铺在 托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 3小时， 每 30分钟翻动一遍， 测定含水量低 于 3%后停止烘干。将干燥后的菌粉在球磨机中研� ��至过 60目筛筛上率不超 过 3%， 即制得菌粉。 测定菌粉的休止角为 32.3°。 取菌粉进行 10倍梯度稀 释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌数。微晶纤维素制备的 菌粉活菌数为 680xl0 ⁸ CFU/g。 实施例 17

取菌泥 200 _g ， 与微晶纤维素 700 _g 共同混匀。 将混匀后的湿菌粉平铺在 托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 3小时， 每 30分钟翻动一遍， 测定含水量低 于 3%后停止烘干。将干燥后的菌粉在球磨机中研� ��至过 60目筛筛上率不超 过 3%， 即制得原菌粉。 测定原菌粉的休止角为 35.1。。 取菌粉进行 10倍梯 度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌数。微晶纤维素和 乳糖制备的原菌粉活菌数为 620xl0 ⁸ CFU/g。 实施例 18

取菌泥 200g， 与微晶纤维素 480g和乳糖 320g共同混勾。 将混勾后的湿 菌粉平铺在托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 2小时， 每 30分钟翻动一遍， 测 定含水量低于 3%后停止烘干。将干燥后的菌粉在球磨机中研� ��至过 60目筛 筛上率不超过 3%， 即制得菌粉。 测定菌粉的休止角为 36.0。。取菌粉进行 10 倍梯度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌数。微晶纤维 素制备的菌粉活菌数为 570xl0 ⁸ CFU/g. 实施例 19

取菌泥 200g， 与微晶纤维素 400g和乳糖 600g共同混勾。 将混勾后的湿 菌粉平铺在托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 2小时， 每 30分钟翻动一遍， 测 定含水量低于 3%后停止烘干。将干燥后的菌粉在球磨机中研� ��至过 60目筛 筛上率不超过 3%， 即制得菌粉。 测定菌粉的休止角为 35.3。。取菌粉进行 10 倍梯度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌数。微晶纤维 素制备的菌粉活菌数为 480xl0 ⁸ CFU/g. 实施例 20

取菌泥 200g， 与微晶纤维素 560g和无水碳酸钩240 _§ 共同混勾。 将混匀 后的湿菌粉平铺在托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 2.5小时， 每 30分钟翻动 一遍， 测定含水量低于 3%后停止烘干。 将干燥后的菌粉在球磨机中研碎至 过 60目筛筛上率不超过 3%， 即制得原菌粉。 测定原菌粉的休止角为 35.1。。 取菌粉进行 10倍梯度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活 菌数。 微晶纤维素和乳糖制备的原菌粉活菌数为 570xl0 ⁸ CFU/ _g 。 实施例 21

取菌泥 200g， 与微晶纤维素 420g和无水碳酸钩280 _§ 共同混勾。 将混匀 后的湿菌粉平铺在托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 2.5小时， 每 30分钟翻动 一遍， 测定含水量低于 3%后停止烘干。 将干燥后的菌粉在球磨机中研碎至 过 60目筛筛上率不超过 3%， 即制得菌粉。 测定菌粉的休止角为 36.3。。 取 菌粉进行 10倍梯度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌 数。 微晶纤维素制备的菌粉活菌数为 620xl0 ⁸ CFU/ _g 。 实施例 22

取菌泥 200g， 与微晶纤维素 300g和无水碳酸钩300 _§ 共同混勾。 将混匀 后的湿菌粉平铺在托盘内， 在烘箱内 50±5'C干燥 2.5小时， 每 30分钟翻动 一遍， 测定含水量低于 3%后停止烘干。 将干燥后的菌粉在球磨机中研碎至 过 60目筛筛上率不超过 3%， 即制得菌粉。 测定菌粉的休止角为 37.8。。 取 菌粉进行 10倍梯度稀释涂平板， 进行菌落计数， 确定菌粉中 BL63516活菌 数。 微晶纤维素和无水碳酸钩制备的菌粉活菌数为 710xl0 ⁸ CFU/ _g 。 实施例 23

取地衣芽孢杆菌活菌粉 50Kg， 糊精 120Kg， 淀粉 130Kg，羧甲基淀粉 钠 54K _g ， 粉碎过 80 目筛混合均匀， 加入 4%羟丙基甲基纤维素适量制软 材， 20目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18目筛整粒， 加入滑石粉 4K _g ， 混合均 匀后， 压片， 包装后即得， 每克組合物含地衣芽抱杆菌 99.7亿。 实施例 24

取地衣芽抱杆菌活菌粉 136.57Kg， 微晶纤维素 160Kg， 乳糖 130Kg， 低取代羟丙基纤维素 20K _g ， 粉碎过 80目筛混合均匀， 加入 10%淀粉浆适 量制软材， 20目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18目筛整粒，加入微粉硅胶 1.92K _g ， 混合均匀后， 压片， 包装后即得， 每克組合物含地衣芽抱杆菌 200亿。 实施例 25

取地衣芽抱杆菌活菌粉 85K _g ，微晶纤维素 150K _g ，甘露醇 123K _g ， 交 联聚维酮 28Kg， 粉碎过 80目筛混合均匀， 加入含有 0.03Kg日落黄的 4% 聚维酮 K30适量制软材， 40 目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 32 目筛整粒， 加 入桔味香精 0.35Kg, 甜菊武 O.lKg, 交联羧甲基纤维素钠 10.5Kg， 硬脂酸 镁 1.65K _g ， 混合均匀后， 压片， 包装后即得， 每克組合物含地衣芽抱杆菌 129.6亿。 实施例 26

取地衣芽孢杆菌活菌粉 23.61Kg， 乳糖 50Kg， 甘露醇 150Kg， 淀粉 70Kg,交联羧甲基淀粉钠 44Kg，粉碎过 80目筛混合均匀，加入含有 0.05Kg 拧檬黄的 3%羟丙基甲基纤维素适量制软材， 40目筛制湿颗粒， 40Ό干燥， 32 目筛整粒， 加入拧檬香精 0.35K _g ， 糖精钠 0.05K _g ， 低取代羟丙基纤维 素 17.5K _g ， 滑石粉 5K _g ， 混合均匀后， 压片， 包装后即得， 每克組合物含 地衣芽抱杆菌 40亿。 实施例 27

取地衣芽抱杆菌活菌粉 30K _g ， 微晶纤维素 110K _g ， 淀粉 95K _g ， 甘露 醇 90Kg，低取代羟丙基纤维素 17.5Kg，粉碎过 80目筛混合均匀，加入 5% 聚维酮 K30适量制软材， 20 目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18 目筛整粒， 加 入硬脂酸镁 2K _g ， 混合均匀后， 压片， 以尤特奇 L100-55为包衣材料， 包 肠溶衣。 包装后即得， 每克組合物含地衣芽抱杆菌 59.8亿。 实施例 28

取地衣芽孢杆菌活菌粉 60Kg， 微晶纤维素 120Kg， 糊精 94Kg， 甘露 醇 85Kg，交联欺甲基纤维素钠 13.5Kg，粉碎过 80目筛混合均匀，加入 3% 羟丙基甲基纤维素适量制软材， 20目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18目筛整粒， 加入硬脂酸镁 2K _g ， 混合均匀后， 压片， 以雅克宜 930为包衣材料， 包肠 溶衣， 包装后即得， 每克組合物含地衣芽孢杆菌 85.3亿。 实施例 29

取地衣芽孢杆菌活菌粉 16Kg，甘露醇 53Kg， 乳糖 32Kg， 低取代羟丙 基纤维素 4Kg， 甜菊试 0.04Kg， 粉碎过 80目筛混合均匀， 加入含有拧檬 黄 O.OlKg的 3%聚维酮 K30适量制软材， 18目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18目筛整粒， 加入硬脂酸镁 1.5K _g ， 混合均匀后， 装袋即得， 每克組合物 含地衣芽孢杆菌 110.2亿。 实施例 30

取地衣芽孢杆菌活菌粉 36Kg， 蔗糖 24.5Kg， 淀粉 45.5Kg， 羧甲基淀 粉钠 24Kg， 阿司帕坦 0.05Kg， 粉碎过 80目筛混合均匀， 加入含有芜菜红 O.OlKg的 8%淀粉浆适量制软材， 18目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 18目筛整 粒， 加入微粉硅胶 0.3Kg, 混合均匀后， 装袋即得， 每克組合物含地衣芽 孢杆菌 156.2亿。 实施例 31

取地衣芽孢杆菌活菌粉 2.45Kg，乳糖 45.5Kg，糊精 32.5Kg，淀粉 28Kg, 粉碎过 100目筛混合均匀后， 以雅克宜 93F为包衣液进行粉末包衣， 向颗 粒中加入硬脂酸镁 1.5K _g ， 甜蜜素 0.05K _g ， 混合均匀后， 装袋即得， 每克 組合物含地衣芽孢杆菌 15亿。 实施例 32

取地衣芽抱杆菌活菌粉 3.85Kg， 粉碎过 200目筛， 山梨醇 20Kg， 乳 糖 45Kg， 羟丙基甲基纤维素 13Kg， 阿拉伯胶 14Kg， 阿司帕坦 0.05Kg， 粉碎过 100目筛， 混合均匀后， 以 2%羟丙基纤维素制软材， 24目筛制湿 颗粒， 40"C干燥， 20目筛整粒后， 加入 0.3K _g 的微粉硅胶， 混合均匀后， 装袋即得， 每克組合物含地衣芽抱杆菌 26亿。 实施例 33

取地衣芽抱杆菌活菌粉 1.60Kg， 乳糖 10.7Kg， 淀粉 12.9Kg， 硬脂酸 镁 0.3K _g ， 粉碎过 80目筛混合均匀后， 装入胶囊， 每克組合物含地衣芽孢 杆菌 45亿。 实施例 34

取地衣芽抱杆菌活菌粉 8Kg， 微晶纤维素 13.2Kg， 乳糖 9. 4Kg， 低取 代羟丙基纤维素 1.2K _g ， 粉碎过 80目筛混合均匀后， 加入 2%羧甲基纤维 素钠适量制软材， 24目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 24目筛整粒后， 向颗粒中 加入微粉硅胶 O.lKg, 混合均匀后， 装入胶囊， 每克組合物含地衣芽孢杆 菌 162.7亿。 实施例 35

取地衣芽抱杆菌活菌粉 0.84Kg， 糊精 10.51Kg， 微晶纤维素 14.6Kg， 硬脂酸镁 0.05K _g ， 粉碎过 80 目筛混合均匀后， 肠溶胶囊， 每克組合 物含地衣芽孢杆菌 20亿。 实施例 36

取地衣芽孢杆菌活菌粉 1.05Kg， 淀粉 18.4Kg， 蔗糖 1.7Kg， 低取代羟 丙基纤维素 0.75K _g ，粉碎过 80目筛混合均匀后，加入 8%淀粉浆适量制软 材， 24目筛制湿颗粒， 40"C干燥， 24目筛整粒后， 向颗粒中加入硬脂酸镁 O.lKg, 混合均匀后， 装入肠溶胶囊， 每克組合物含地衣芽孢杆菌 30亿。 实施例 37

取地衣芽抱杆菌活菌粉 5.35K _g ， 微晶纤维素 14K _g ， 乳糖 8.65K _g ， 交 联聚维酮 0.75K _g ，粉碎过 80目筛混合均匀后，加入 4%羟丙基甲基纤维素 适量制软材， 挤出一滚圆法制微丸， 40"C干燥， 回收 24-32 目的微丸， 以 雅克宜 93 F为包衣材料， 包肠溶衣， 得到肠溶微丸， 装入肠溶胶囊， 每克 組合物含地衣芽孢杆菌 100亿。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 本领域技术人员将 会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那 些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求 及其任何等同物给出。